ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO

CARRERA DE INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

MICROBIOLOGIA II

NOMBRE: Diana M. Martínez U.CURSO: Quinto BFECHA: 2011-04-14.

INFORME No. 1

1.TEMA: ANALISIS MICROBIOLOGICO DE HECES FECALES.

2.INTRODUCCION:

2.1. JUSTIFICACION: El análisis sirve para proporcionar una identificación exacta de los microorganismos, específicamente bacterias que pudieran encontrarse en las vías gastrointestinales y que estén causando algún padecimiento o molestia, prinicpalmente es usado para realizar un diagnostico etiológico en casos de gastroenteritis aguda.

(HOSPITAL DE CLINICAS. 2004)2.2. MARCO TEORICO:

Las heces o materia fecha forman el conjunto de desperdicios de los organismos, es decir, el producto final en el proceso de la digestión. Conforman los restos de los alimentos que no han sido absorbidos en el aparato digestivo, están compuestas por células del epitelio intestinal, agua, nutrientes, uno de los principales componentes de las heces fecales son los microorganismos, los cuales son específicos de esa área, pero de presentarse microorganismos que no han sido identificados para el tracto digestivo, estamos hablando de una contaminación o infección.

(PRUEBAS DE LABORATORIO Y FUNCIONALES. 2011)

El color natural de las heces es marrón, semejando la mezcla de chocolate con leche, las variaciones a este color pueden indicar alguna patología, ya sea seria o leve, por ejemplo, el color negro en las heces indica presencia de sangre o algún problema del hígado; el color verde puede indicar exceso de sales biliares, en tanto que el color amarillo puede indicar

una deficiencia de las sales biliares, las aéreas blanquecinas pueden indicar daño en el hígado o falta de producción de los pigmentos propios del mismo. Cuando se note el cambio de color de las heces hay que hacer un examen microbiológico pues a pesar de tener una explicación para dichas coloraciones, todas podrían ser indicativos de la presencia de algún patógeno.

(www.HemorrhoidsHemroids.com).

Se encuentra varios métodos para el análisis de heces:

Mediante un estudio bioquímico: el cual estudia las características generales de las mismas, como el color, la consistencia, presencia de sangre, mucosas, textura e inclusive podemos conocer los porcentajes de su composición.

Microbiología o también llamado coprocultivo que es exactamente nuestro estudio, dentro del cual por medio del empleo de técnicas de laboratorio, nos permite conocer de la presencia de infección bacteriana y de acuerdo con el resultado obtenido, el respectivo tratamiento con antibióticos para lograr una mayor precisión.

(www. mapfre. com )

La toma de la muestra se realiza en un recipiente, preferible de boca ancha, el cual no es necesario que este esteril pero si libre de detergentes, jabones, desinfectantes, o algún agente que pueda intervenir en el resultado; para traslado, se ha diseñado un hisopo dentro de un tubo esteril que tiene el medio perfecto (solución tamponada) para la conservación de la muestra, estos son llamados Cary Blair.

En caso de que la muestra vaya a demorar en llegar al laboratorio, esta debe ser refrigerada; si llegara en un transcurso de aproximadamente dos horas, no es necesaria la refrigeración ni la utilización del medio.

(HOSPITAL DE CLINICAS. 2004)

El cultivo de las heces permite una adecuada identificación de patógenos. Las enterobacterias representan la mayor parte de la flora microbiana del tracto intestinal del ser humano, incluidas Proteus y bacilos coliformes; y patógenos como Salmonella y Shigella que son las causantes más comunes de la diarrea, también para Campylobacter, cada una con un medio de cultivo especifico. En el caso de Escherichia coli, particularmente en el caso de de la cepa O:157 H:7 un examen debe ser realizado bajo pedido si el paciente responde a la patología (diarrea sanguinolenta).

(ZEPEDA. 2001)

Existen varias pruebas bioquímicas que nos pueden llevar a la identificación de enterobacterias:

Indol. Rojo de metilo. Reacción Voges-proskauer. API 20 E.

Todas estas, determinadas para dferenciar a las enterobacterias de acuerdo con características propias de cada cepa.

(MANUAL DE PRACTICAS DE ANALISIS CLINICOS III. 2009)

2.3. OBJETIVOS:

Realizar el análisis de las heces para la identificación de posibles patógenos.

Obtener un cultivo adecuado para posteriormente realizar pruebas bioquímicas a fin de identificar una bacteria en particular.

Aprender el uso de API 20 E que es una batería de multipruebas de enterobacterias.

2.4. HIPOTESIS:

El paciente presenta en su muestra presencia de Salmonella.

3.MATERIALES Y METODOS:

PRACTICA No. 1: Siembra de la muestra en tres medios de cultivo

MATERIALES: Asas. Hisopos. Mechero y fósforos. Gradilla.

Muestra transportada en Cary-Blair.

Medios de cultivo: MKL, SS, XLD

METODOS:Antes de iniciar la práctica es importante tomar en consideración todas las medidas de bioseguridad, como son el uso de guantes, verificación de

mecheros, y para evitar cualquier confusión el correcto marcaje de las cajas de agares.

1. Cerca del mechero, se tomó el medio Cary-Blair conteniendo la muestra en el hisopo y se realizó el inóculo sobre el medio MKL, y con un asa esteril, se realizó dos o tres estriaciones para completar toda la caja.

2. Se repitió el procedimiento con los otros dos medios de cultivo, primero el SS y luego el XLD.

3. Se colocó las cajas sembradas en la incubadora a 37 °C durante 24 horas.

4. Observamos y anotamos los resultados.

PRACTICA No. 2: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias patógenas.

MATERIALES: Asas. Hisopos. Mechero y fósforos. Gradilla. Marcador.

Jeringuilla. Tubos con: AN, citrato, urea,

TSI, VP, CN, SIM. Medios de cultivo con los

resultados de la practica 1.

METODOS:

PARA LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS:

1. Con el hisopo esteril o un asa esterilizada, se tomó dos colonias seleccionadas que estén aisladas en el medio y se procedió a la siembra en los tubos tomando en cuenta el orden dado en los materiales.

2. Repetir el procedimiento con la otra colonia para las mismas pruebas.3. Se observó mediante las reacciones desprendidas ese momento para

la construcción de una tabla.

PARA LA PRUEBA DE API20E:1. Del cepario, se tomó una muestra con un hisopo esteril, y en un tubo

para realizar diluciones McFarland, se transfirió a 0.5 de concentración, lo cual es ideal para el API.

2. De la dilucion, se tomó con la jeringuilla la solución, y se llenó cada pocillo de API dando a cada prueba las condiciones necesarias para su desarrollo apropiado.

3. Dejar las pruebas de API al aire libre para favorecer las reacciones por al menos 24 horas, que en nuestro caso fueron 48 horas.

PRACTICA No. 3: Análisis de los resultados de API.

MATERIALES: Tabla de identificación de bacterias de API 20 E. Kit para pruebas bioquímicas API 20 E.

METODOS:1. Dependiendo de la presencia de la reacción o no, se marcó como

positivo o negativo, y se asignó una serie de números a cada prueba de API.

2. Realizamos el conteo respectivo de positivos y negativos, obteniendo series de números que nos servirán para la identificación de la bacteria según su código en el banco de datos.

4. RESULTADOS:

PRACTICA No 1:

Luego de 48 horas de siembra, se observa crecimiento en los tres medios:

En el medio MKL (Mac Conkey Lactosa) que es un medio diferencial para el crecimiento de bacterias Gram – inhibiendo las Gram + ya que posee componentes como sales biliares y cristal violeta por lo que de ser Gram + no observaríamos nada; en este caso se observa, por el cambio de color del medio (se torna fucsia alrededor de la colonia), quiere decir que es una bacteria Gram – ya que vemos colonias y es fermentadora de lactosa, es decir, Lac+. De este resultado podemos pensar que podría tratarse de E. coli.

En el medio SS (Salmonella - Shigella) no crecen las bacterias Gram + por lo que nosotros si deberíamos tener crecimiento; las colonias obtenidas presentan un color blanco lo que indica que no hubo producción de H2S, otra característica para añadir a nuestra bacteria a identificar.

En el medio XLD el cual es especifico para la determinación de bacilos entéricos Gram -, tenemos como carbohidratos fermentables

a la xilosa, lactosa y sacarosa; nuestros resultados muestran una bacteria que es fermentadora de lactosa, ya que el medio cambio del color rojo a un color amarillo donde hubo crecimiento de las colonias.

PRACTICA No. 2:

Se seleccionó una colonia aislada para realizarle las pruebas, en mi caso, la colonia provino del medio XLD, siendo lactosa +. Los resultados se detallan en la siguiente tabla:

TABLA1. Muestra los resultados una vez realizadas las pruebas bioquímicas a la bacteria Gram-, lac+ de la colonia obtenida del agar XLD.

PRUEBA RESULTADO

LACTOSA PositivoTSI Amarillo / amarilloH2S NegativoGAS Negativo

UREA NegativoINDOL Positivo

VP Negativo CITRATO Negativo OXIDASA Negativo

MUG Positivo

TABLA2. Resultados obtenidos de todo el grupo, de donde mediante criterios se selecciono las bacterias para la prueba de API.

Grupo

Lac TSI H2S GAS Urea Indol VP Citrato

Oxidasa

MUG

Carlos

+ A/A - - + - - + - +- A/A - - - + - - -

Andre

+ A/A - + - - - - - +- A/A - - - + - + -

Diany

+ A/A - - - + - - - ++ A/A - - - + - - -

Mayra

Yeshi

+ K/A - - - - - - - +- K/A - - - + - - - +

Eveli - NA - - - + - - - -

nKath

yGaby + A/A - + + - - + - -Daya - A/A - - - - - - -

Stefy+ A/A - - + NA - + - -- A/A + - - - - - -

PRACTICA No. 3: Interpretacion de las pruebas de API20E:

Retiramos la caja con las pruebas de API, una vez realizada la clave, procedemos a verificar mediante las características que exhibe descritas a continuación en la tabla.

TABLA3. Clave para la determinación de la reacción en las pruebas API.

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o

turquesa

H2S Producción de H 2 S sin precipitado

negro precipitado negro

URE Ureasa amarillo rojo o naranja TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo

IND Producción de indol amarillo color rosa o anillo

rosa-rojo

VP Producción de acetoína

(Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo

GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento

GLU Fermentación/oxidación de

glucosa azul o verde amarillo

MAN Fermentación/oxidación de

manitol azul o verde amarillo

INO Fermentación/oxidación de

inositol azul o verde amarillo

SOR Fermentación/oxidación de

sorbitol azul o verde amarillo

RHA Fermentación/oxidación de

ramnosa azul o verde amarillo

SAC Fermentación/oxidación de

sacarosa azul o verde amarillo

MEL Fermentación/oxidación de

melobiosa azul o verde amarillo

AMY Fermentación/oxidación de

amigdalina azul o verde amarillo

ARAFermentación/oxidación de

arabinosa azul o verde amarillo

OX Citocromo oxidasa (http://perso.wanadoo.es/microdominguez/API.htm)

(http://perso.wanadoo.es/microdominguez/API.htm)

GRAFICA 1. Muestra de los dos resultados de API, ya sea totalmente positivos como en la parte inferior o totalmente negativos como en la parte superior.

GRAFICA 2. Hoja de los resultados que viene adjunto con la prueba.

CODIGO:

1044552 1044500 CODIGO DEFINITIVO: 1044502

Mediante la tabla de identificación de bacterias, podemos compara una a una los resultados a las distintas reacciones y su expresión para asi, poder identificar mediante el comportamiento a la bacterias del cultivo.

GRAFICA 3. Fotografía tomada a la tabla de identificación.

5. DISCUSION:

De acuerdo con lo aprendido en clase, podemos notar que la identificación de la bacteria se va produciendo paulatinamente a medida que las pruebas van arrojando los resultados, es asi, si tomamos por ejemplo el agar mas representativo en mi caso, que fue el XLD, observamos que la bacteria es fermentadora de azucares debido al cambio de color en el medio que es producido por la reacción en si, y la precipitación de los excipientes en este caso sales biliares propias de la reacción , por la selectividad del medio, también deducimos que es Gram –.

Contrastando con conocimientos bibliográficos, con respecto al agar SS del cual obtuvimos su descripción y formula de MCD LABS vemos que es uno de los mejores agares en cuanto al aislamiento de Salmonella y Shigella, donde, las sales biliares y el verde brillante actúan como los inhibidores

principales de los Bacilos Gram+ lo que impide su crecimiento dejando únicamente a expresión los Gram- que en este caso son de nuestro interés; en caso de querer aislar bacterias Gram+, debemos buscar otro tipo de agar.

En cuanto al agar MKL, según el protocolo presentado por MCD LAB, favorece el crecimiento principalmente de Klebsiella, pero de la misma forma, también permite el crecimiento de E. coli ya que ambas son Gram- y cuando las colonias son fermentadoras de lactosa, se tornan de un color fucsia alrededor del crecimiento bacteriano.

Luego de haber identificado las bacterias mediante la tabla de identificación a las reacciones, vemos que tiene sentido los resultados mostrados en la tabla 2, ya que este comportamiento, al menos en mi caso, coincide con la bacteria que yo identifique.

El código que presenta API es variado ya que nosotros cuando respecta a esta prueba no podemos guiarnos por un resultado aislado, en inclusive para poder llegar a la determinación debemos conocer el comportamiento de la bacteria antes de tomar la decisión. Debajo del grafico se detallan los códigos obtenidos, y de preferencia se deberían evaluar cada uno de ellos para en base a esto, obtener un resultado más preciso.

6. CONCLUSIONES:

La bacteria encontrada después del aislamiento y la batería de pruebas bioquímicas realizadas es E. coli 1 por lo que notamos que la hipótesis no se cumplió ya que no encontramos la presencia de Salmonella en la muestra.

Luego de comprobar o desmentir la hipótesis podemos pasar al análisis del procedimiento donde vemos que fue realizado con gran satisfacción pues no se encontró rastros de contaminación de otra bacteria o de otro microorganismo.

Mediante la experimentación comprendimos las pruebas bioquímicas y la combinación de ellas para llegar a un resultado satisfactorio, aprendiendo el procedimiento de API.

7. RECOMENDACIONES:

Yo en lo personal recomendaría dentro de este mismo campo de estudio la siembra de dos bacterias en un mismo medio de cultivo para poder contrastar su comportamiento, crecimiento y perfeccionar nuestra capacidad de siembra al tener una probabilidad de infección mas alta.

8. BIBLIOGRAFIA:

DEPARTAMENTO DE LABORATORIO CLINICO. HOSPITAL DE CLINICAS. MICROBIOLOGIA. FACULTAD DE MEDICINA. MONTEVIDEO. URUGUAY. 2004

PROFESOR LADERO, JOSE MARIA. PRUEBAS DE LABORATORIO Y FUNCIONALES. CAPITULO 11. HECES. PAGINA 191-192. CONSULTADO ABRIL 10.

http://www.hemorrhoidshemroids.com/hemorroides_en_espanol/poop-crap-stools-faeces-and-poos-and-what-they-show-us.html. CONSULTADO ABRIL 10.

MUÑOZ GIL, CRISTINA. ESPECIALISTA EN MEDICINA DE FAMILIA Y COMUNITARIA. MEDICO CONSULTOR DE ADVANCE MEDICAL. http: //www.mapfre.com/ salud/ es/cinformativo /analisis-heces.shtml

ZEPEDA, CARLOS.2001. LABORATORIO EN LA PRACTICA MEDICA. LOS CULTIVOS DE LAS HECES. Rev Med Hond 2001; 69:32-36.

BOLIO SALAZAR, EMILIA. 2009. MANUAL DE PRACTICAS DE ANALISIS CLINICOS III. DIRECCION GENERAL DE EDUCACION MEDIA SUPERIOR. UNIVERSIDAD DE COLIMA. http://www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/archivos/manaclinico3.pdf

SISTEMAS DE IDENTIFICACION MULTIPRUEBAS API20E. http://perso.wanadoo.es /microdominguez/ API.htm

MCD LAB. ESPECIFICACIONES AGAR SS. http://www.mcd.com.mx/pdfs/ AGAR

%20SALMONELLA%20SHIGELLA.pdf