Practica n°7: Numeracion de coliformes totales y coliformes fecales por el método

de numero mas probable (NMP) en muestras ambientales. Numeracion de

enterobacterias por el método de recuento en placa

INTEGRANTES:

Juan Reynaldo Ranilla Yanac

PROFESOR:

Prof. Martin Martínez

Objetivos

Evidenciar la presencia y realizar recuento de coliformes totales y coliformes fecales por el método de números mas probable

Manejar la técnica de (NMP) y su correcta interpretación en el análisis microbiológico de muestras ambientales

Realizar el recuento directo de enterobacterias y coliformes por medio de placas de agar (VRBA)

Introducción

RECUENTO DE COLONIAS EN PLACA Es un método muy utilizado cuando se necesita determinarel tamaño de la población bacteriana de una muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa en que cada uno desarrollará una colonia visible. Pero debido a que una muestra no es totalmente homogénea con respecto a su composición microbiológica, es posible que una colonia se origine de un microorganismo o de cientos de ellos, dando en este último caso un recuento menor del real. También es posible que muchas de las bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en las condiciones elegidas (pH, temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.).En este caso el recuento también será inferior al real. Lo que si se sabe es que cada colonia observada se formó a partir de por lo menosun microorganismo. Esta es una condición necesaria y suficiente. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos de los cálculos. Se admite, por lo tanto, que en los métodos de recuento de microorganismos vivos, son inevitables los errores. Especialmente cuando se examinan muestras pequeñas, es posible cometer grandes errores.

METODO DE NUMEROS MAS PROBABLE

El método del Número más probable (NMP) también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible.

El método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se

incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes.

Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrán tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula, se puede estimar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística.1

La precisión del método del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución se considera como una relación adecuada entre precisión y economía.

Una condición del método es la necesidad de poder reconocer un atributo específico de la población en el medio de crecimiento que se emplee. La estimación de la densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del cálculo probabilístico.2

Hay muchas entidades discretas que son fáciles de detectar pero difíciles de contar. Una aplicación es el de cualquier clase de reacción de amplificación o reacción de catálisis que impide una cuantificación fácil, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microoganismos, acción enzimática, o catálisis química. El método del NMP supone tomar la disolución original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces,o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia en múltiples subdivisiones.

El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentración dada permite una resolución más fina, para usar el número de muestras positivas y negativas que estiman la concentración original dentro del apropiado orden de magnitud.

Medios de cultivo:

Lauril Sulfato Caldo: Medio recomendado por A.P.H.A. para detección y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Es un medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico

Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante.Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.

Materiales y equipos:

Los requisitos mecánicos para la preparación y dilución de la muestra de alimentos y suelos Incubadora 35 – 37 °c / Baño maría 44.5 °c Asa de siembra /inoculación Caldo lauril sulfato triptosa (LST) volumen 10 ml en tubos de 15 x 100 mm, conteniendo tubos de

fermentación invertidos ( campanas dunhan) de 75 x 10 mm Caldo verde brillante bilis (2 %) Lactosa ( caldo BM1LM), volumen de 10 ml en tubos de 15 x 150

mm, conteniendo tubos de germen Agar endo

Procedimiento experimental

Hacer diluciones sucesivas de 10−1,10−210−310−4 ,10−5 Preprar 10−1 en tres tubos que contienen prueba de caldo lst Preparar 3 tubos de igual manera para 10−210−310−4 ,10−5

Incubar 35 – 37 °c /24 – 48 hrs Estriar en agar endo las colonias rojas redondeadas, apreciar el brillo metalico el caldo brila contar tubos positivos y comparar con table de NMP el caldo EC, incubar a 44.5 +0.2°c contar numero de tubos positivos y comparar con tabla MNP Sembrar en agar nutitivo 2 y caldo lactosado y aplicar la pruebas de rojo de metilo sim citrato y en

el caldo lactosado coloración gram

Resultados experimentales

EC

muestra turbiedad + -10−1 3 turbios 3 0

10−2 3 turbios 2 1

10−3 3 turbios 3 0

10−4 1 turbios 0 3

BRILA

muestra turbiedad + -10−1 A, poco gas B, regular 3 0

10−2 A mucho gas , B y C poco gas

3 0

10−3 B y C regular gas 2 1

10−4 B poco gas 3 0

Conteo de colonias

descripción10−1 incontable

10−2 incontable

10−3 incontable

10−4 12 colonias

10−5 nulo

Observaciones / conclusiones

Hay no coliformes expansivos y difunden por bacilos en 10−3

Colonias coliformes roja:o Halo de precipitacióno Son coliformeso Son enterobacterias

Bibliografía

http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/mr-vpmedio.htm http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp5.pdf

Anexos