LAB DE QUIMICA CLINICA II · 2009-10-29 · El principal objetivo del curso es que el alumno se...

Fac. Cs. Qs. Dpto. De ANÁLISIS CLÍNICOS LABORATORIO DE QUÍMICA CLÍNICA II

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

ÁREA ESPECÍFICA DE ANALISIS CLINCIOS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

ASIGNATURA DE: QUIMICA CLINICA II CÓDIGO: LQF 414L FECHA DE ELABORACIÓN MARZO 2006 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: CP PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN M. C. NORMA ELOINA LARA ROSANO M. C..SILVIA GARCIA GONZALEZ Q.F.B.LUCILA JUAREZ PEREZ HORAS PRÁCTICA. 2 TOTAL DE CRÉDITOS: 0


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OBJETIVOS GENERALES.-

El principal objetivo del curso es que el alumno se familiarice con los métodos de control de calidad en el laboratorio clínico y que además sea capaz de medir, analizar y evaluar las constantes funcionales y patológicas con fines diagnósticos y terapéuticos y tome decisiones acerca de la emisión de resultados de laboratorio. SISTEMA GENERAL DE EVALUACIÓN.- Se deberá cumplir con el 100% de asistencia al laboratorio. Participación: 30 % Seminario Desempeño Pre-reportes y Reportes (equipo) 30 % Entrega de problemas Resueltos 40 % Total 100 % NOTA: Una calificación aprobatoria corresponderá al 20% de la calificación final de la materia.


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MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE QUÍMICA CLÍNICA

La seguridad es una parte fundamental en el desempeño de cualquier laboratorio. En el caso de Química Clínica, los especímenes biológicos que se manejan, se consideran potencialmente infecciosos. Es por ello que los alumnos deben cumplir con ciertos requisitos para trabajar en el mencionado laboratorio.

El primer requisito inviolable es que los estudiantes deben trabajar con bata, guantes y perillas de seguridad en cada una de las prácticas.

En las ocasiones en que manejen reactivos tóxicos, también deberán portar cubrebocas.

También será obligatorio que cada equipo cuente con una franela para limpiar la superficie donde trabajen antes y después de realizada la práctica.

La forma de desechar material punzocortante, torundas y muestras biológicas será la siguiente:

El material punzocortante (agujas, lancetas y capilares) se colocarán en los contenedores especiales.

Las torundas, papel y aplicadores que hayan estado en contacto con las muestras biológicas, se colocarán en las bolsas rosas especiales.

La sangre, suero o plasma sobrante se depositará en recipientes plásticos que contengan hipoclorito de sodio, e igualmente este recipiente se desechará en las bolsas rosas especiales.

Los tubos con restos de muestras biológicas se introducirán en una palangana con hipoclorito de sodio, para que después sean lavados por el personal de intendencia.

Todas estas medidas de seguridad se deben seguir rutinariamente, para evitar cualquier accidente que ponga en peligro la salud de los alumnos y personal que labora en los laboratorios del departamento de Análisis Clínicos.


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SESIÓN No. 1

PRECISIÓN

Objetivo: Que el alumno determine su precisión, al realizar una práctica de pipeteo, calculando para ello su Coeficiente de Variación.

Introducción.- En el laboratorio de química clínica se llevan a cabo mediciones cuantitativas para estimar la concentración o actividad de una sustancia en una muestra problema. La medición perfecta no debería desviarse del valor verdadero, por lo que el resultado reportado no debería tener error. En la práctica, existen numerosos factores, algunos inherentes al método y otros a la muesstra que producen desviaciones en el resultado final obtenido. Algunos de los factores que influyen en los resultados de los análisis son entre otros: aparatos, equipo accesorio, muestra problema, estándares, suero control, método y cálculos. En lo referente al método, está implícita la precisión del personal químico principalmente en el pipeteo. Entendiéndose por precisión la concordancia entre los resultados de una serie de mediciones. La imprecisión se determina haciendo análisis replicados del mismo espécimen o de cada uno de los especímenes de un grupo y después calcular la desviación estándar entre replicados del espécimen. Una manera sencilla de evaluar nuestra precisión en el pipeteo es mediante la preparación de una serie de tubos con la misma dilución de un colorante determinado. Al controlar todos los factores que pueden influir en los resultados, obtendremos un resultado exacto y confiable que será de gran ayuda para la prevención, diagnóstico y tratamiento de los pacientes. Material y Método.- Reactivos: Equipo: Dicromato de Potasio al 10% Espectrofotómetros c/celdas Agua Destilada Material por Sección: Material por Persona 2 pizetas con H2O destilada 12 tubos de 13x100 1 pip. 10 ml 1 pip. 1 ml 1/100 1 gradilla


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Técnica.- Precisión en el pipeteo.- La práctica es individual. Efectuar los cálculos necesarios para hacer una dilución 1:50 de dicromato de potasio con agua destilada, considerando un volumen final de 6 ml. Numerar una serie de 10 tubos de 13x100. En cada tubo hacer la dilución 1:50 de dicromato de potasio. Cuidar que todo el procedimiento se efectúe de la misma manera en cada uno de los tubos. Mezclar cuidadosamente cada tubo. Leer la Absorbancia a 505 nm de cada tubo, calibrando el espectrofotómetro con agua destilada. Anote cada una de las lecturas en la carta de control de precisión. Multiplicar previamente las lecturas por 1000, para manejar cifras enteras. Calcular la media, desviación estandar y el coeficiente de variación de sus resultados. Evaluar sus resultados. Bibliografía: Brambila C.E.: Garantía de Calidad en los Laboratorios Clínicos, Facultad de Ciencias Químicas, BUAP, 1996.


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SESIÓN No. 2

RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DE CONTROL DE CALIDAD

Objetivo: Que los alumnos pongan en práctica los conocimientos adquiridos en la teoría, resolviendo problemas de control de calidad que se presentan en la práctica diaria de un laboratorio clínico.


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SESIÓN No. 3

OBTENCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA

Objetivo: Que los alumnos obtengan valores de referencia a partir de una grupo de muestra de referencia. Introducción.- Entre los seres humanos, los diversos compuestos bioquímicos presentan grandes variaciones debidas a diferencias genéticas, procesos fisiológicos, factores ambientales, etc. El laboratorio clínico actualmente juega un papel central en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de un número cada vez mayor de padecimientos, en los que se alteran significativamente los diversos componentes de la sangre y los fluídos biológicos. Los resultados que emite el laboratorio, no obstante, sólo son útiles si se garantiza su confiabilidad y si se cuenta con marcos de comparación que permitan su adecuada interpretación. La confiabilidad de los resultados sólo se logra con la estructuración de un programa integral de control de calidad que asegure su reproducibilidad y exactitud. El marco de comparación que hace posible la interpretación de los resultados, lo constituyen los valores de referencia, los que deben ser obtenidos bajo las más estrictas normas de control, y establecidos en poblaciones con características semejantes a la que pertenece el paciente. Por lo que una tarea importante del químico clínico es la de proporcionar valores de referencia confiables, ya que éstos pueden ser usados para evaluar el estado de salud de individuos o poblaciones, y así identificar a los sujetos con riesgo de padecer una enfermedad, o para ayudar en las decisiones médicas sobre diagnóstico y tratamiento. El Panel de Expertos en Teoría de los Valores de Referencia (EPTRV) fue creado en 1970 por el comité en Estándares de la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC). Su tarea ha consistido en desarrollar una nomenclatura y los procedimientos recomendados para la producción de valores de referencia y su tratamiento, así como la presentación de los valores observados en relación con los datos de referencia. 1. Un individuo de referencia es un individuo seleccionado para compración usando un criterio definido.

1.1. Es importante definir el estado de salud del individuo. 2. Una población de referencia consiste en todos los posibles individuos de referencia.

2.1. La población de referencia generalmente tiene un número desconocido de miembros y, por lo tanto, es una entidad hipotética. 2.2 La ”POBLACIÓN” de referencia puede consistir de sólo un miembro, por ejem.: un individuo puede servir como referencia para él mismo o para otro individuo.

3. Un grupo muestra de referencia es un número adecuado de individuos de referencia tomados para representar la población de referencia.

3.1. Los individuos de referencia en el grupo muestra deben ser extraídos al azar de la población de referencia.

4. Un valor de referencia es el valor obtenido por la observación o medición de un tipo particular de cantidad de un individuo, perteneciente al grupo muestra de referencia.


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4.1. El término valor de referencia no debe ser confundido con el término límite de referencia.

5. Una distribución de referencia es la distribución estadística de los valores de referencia.

6. Un límite de referencia se define como el ámbito de valores que corresponden al 95 % de una subpoblación de referencia en individuos clínicamente sanos.

6.1. Un límite de referencia es deducido de la distribución de referencia y es usado para propósitos descriptivos.

7. Un intervalo de referencia es el intervalo entre dos límites de referencia, incluyendo a éstos.

8. Los valores observados son valores de un tipo particular de cantidad, obtenidos por observación o medición; producidos para obtener una decisión médica. Pueden ser comparados con los valores de referencia, distribuciones de referencia, límites de referencia o intervalos de referencia. La selección de individuos de referencia puede hacerse de dos formas: 1.-Selección a posteriori (retrospectiva) de individuos de una gran muestra de

población obtenida al azar o no al azar, seguida por un agrupamiento y exclusión: de acuerdo a las características del grupo muestra de referencia.

2.-La selección a priori (prospectiva) de una población general usando criterios de exclusión y división establecidos, determinados pro estudios previos sobre la misma población, u obtenidos de la literatura.

Una selección a priori es mucho más conveniente, pero requiere conocer o fijar arbitrariamente los criterios de división y exclusión.

Dentro de esos criterios de exclusión se encuentra el estado fisiológico, ingestión de agentes farmacológicamente activos, estados fisiológicos modificados, y otros factores como obesidad e hipertensión.


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INDIVIDUOS DE REFERENCIA CONSTITUYEN UNA: POBLACIÓN DE REFERENCIA DE LA CUAL ES SELECCIONADO GRUPO MUESTRA DE REFERENCIA

SOBRE EL CUAL SON SELECCIONADOS LOS: VALORES DE REFERENCIA SOBRE LOS CUALES SE OBSERVA UNA: VALORES PROVEEN UNA OBSERVADOS

DISTRIBUCIÓN DE REFERENCIA COMPARACIÓN EN UN PARA LOS: INDIVIDUO SOBRE LA CUAL SON CALCULADOS LOS: LÍMITES DE REFERENCIA QUE PUEDEN DEFINIRSE POR: INTERVALOS DE REFERENCIA Entre los criterios de división se encuentra la edad, el sexo, criterios genéticos, socioeconómicos y ambientales, criterios biológicos como hemodinamia, perfusión renal y balance hormonal por ejemplo, así como estado de referencia.

Para ser apto para el estado de referencia los individuos deben tener de 20 a 30 años de edad, masa corporal ideal, haber ayunado durante 10 horas, no tomar medicamentos, consumir menos de 45 g de alcohol por día, fumar menos de 12 cigarrillos por día y no tener enfermedad aparente.

La información contenida en el conjunto de valores de referencia basados en grupos es comúnmente, por conveniencia, condensada dentro de un intervalo de referencia definido por dos límites de referencia. El procedimiento usado para deducir intervalos de referencia basados puede definir grandemente, desde técnicas estadísticas complejas a una simple e intuitiva evaluación de los datos disponibles.


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PROCEDIMIENTO PARA LA ESTIMACIÓN DE LIMITES DE REFERENCIA

RECOLORES VALORES DE REFERENCIA AGRUPAMIENTO DE LOS VALORES DE REFERENCIA INSPECCIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN CORRECCIÓN O ELIMINACIÓN DE VALORES ABERRANTES SELECCIONAR UN MÉTODO EVALUACIÓN INTUITIVA MÉTODO NO PARAMÉTRICO MÉTODO PARAMÉTRICO: ¿DISTRIBUCIÓN GAUSSIANA?

SI NO

ESTIMACIÓN PARAMÉTRICA TRANSFORMACIÓN DE DATOS

ESTIMACIÓN PARAMÉTRICA

La validez de cualquier intervalo de referencia depende de la adecuada selección de individuos, la recolección de muestras bajo condiciones definidas, y el control y la evaluación de la variación analítica en la producción de valores de referencia.


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Material y método.- Reactivos: Equipo: Equipo para Glucosa Sera-Pak 2 espectrofotómetros Suero Control DC-Trol Celdas espectrofotómetros Centrífugas Material por Sección: Material por Equipo: 2 pizetas con H2O destilada 12 tubos 15x100 2 pipetas de 10 ml 5 pip. 0.1 ml 1/100 2 pip. 0.1 ml 1/100 1 gradilla alcohol y algodón 5 tubos Vacutainer rojos 5 agujas Vacutainer 1 soporte y 1 torniquete 5 pip. Pasteur c/chuzo Técnica.- Cada equipo efectuará la cuantificación de glucosa a 5 individuos que cumplan con los requisitos para pertenecer a un grupo muestra de referencia. Los individuos seleccionados deben tener una edad entre 20 y 30 años, no tener signos o síntomas de enfermedad alguna, sin hábito tabáquico o alcohólico, normotensos y sin obesidad. Ninguno se encontrará ingiriendo drogas o medicamentos, y las mujeres no se encontrarán menstruando, ni recibirán anticonceptivos hormonales. Las muestras de sangre serán obtenidas tras un ayuno de 8-12 hr, entre las 7 y 10 de la mañana, después de 10 minutos de reposo. La extracción deberá realizarse por punción de las venas cefálica y/o basílica a nivel del pliegue flexor del codo, con aplicación de torniquete, mediante el sistema de tubos al vacío. La sangre se recolectará en tubos sin anticoagulante. Glucosa.- Se anexará el inserto del equipo. Se efectuará el análisis de los resultados siguiendo la metodología sugerida en la bibliografía. Bibliografía: Brambila C.E.: Garantía de Calidad en los Laboratorios Clínicos, Facultad de Ciencias Químicas, BUAP, 1996.


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SESIÓN No. 4

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Objetivo: Efectuar la cuantificación de proteínas plasmáticas totales y de albúmina, así como la detección de proteína C reactiva y factor reumatoide, y relacionar los resultados con posibles patologías. Introducción.- Del 93% al 92% de plasma o suero es el agua disolvente; del 7 a 8% del total de solutos presentes, las proteínas son las que están en máxima concentración, aproximadamente de 6.8 a 8.8 g/100 ml de agua del plasma o suero. Las proteínas del plasma tienen diferentes funciones en el organismo. Desempeñan un papel nutritivo, tanto más cuanto que constituyen una porción del fondo común de aminoácidos del cuerpo; así, las proteínas son una forma de almacenamiento de aminoácidos. Las proteínas del plasma actúan también como agentes de transporte; muchos metabolitos vitales, iones metálicos, hormonas y lípidos son transportados por todo el cuerpo, enlazados a proteínas específicas y llevados por ellas. Algunas proteínas desempeñan una función especial propia, como las enzimas, los anticuerpos inmunes entre las globulinas y las diversas proteínas asociadas con la coagulación de la sangre. Otra función importante de las proteínas es que por ser moléculas grandes coloidales, no pueden atravesar las membranas de las finas paredes capilares. Así, quedan atrapadas en el sistema vascular, y ejercen una presión osmótica coloidal, la cual sirve para mantener un volumen normal de sangre y un contenido normal de agua en el líquido intersticial y los tejidos. La fracción de albúmina es la más importante en el mantenimiento de la presión osmótica coloidal normal o presión oncótica, en la sangre. Las proteínas del plasma intervienen también en el mantenimiento del balance ácido-base en la sangre. Como compuestos anfóteros, funcionan como amortiguadores para reducir al mínimo grandes cambios súbitos en el pH de la sangre. A pesar de hallarse presentes juntas, las diversas proteínas del plasma no tienen su origen en la misma fuente. El hígado es el órgano principal para la síntesis de albúminas y globulinas y y quizá de algunas globulinas no inmunes. Las células del sistema reticuloendotelial son la fuente de los anticuerpos, globulinas inmunes y quizá de algunas globulinas . Material y Métodos.- Reactivos: Equipo: Equipo para Proteínas Totales y Espectrofotómetro Albúmina Bioxon Celdas espectrofotómetro Equipo para PCR Lafon Baño María c/termómetro Equipo para Factor Reumatoide Lafon


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Material por Sección: Material por Equipo: Pizetas con H2O destilada 1 tubo Vacutainer rojo 1 pip. 0.1 ml 1/100 aguja, soporte y torniquete 1 pip. 1 ml 1/100 1 pip.Pasteur c/chuzo 3 pip. 10 ml 1 pip. 0.1 ml 1/100 1 pip. 1 ml 1/100 7 tubo 13x100 1 gradilla Técnicas.- Proteínas Totales y Albúmina.- Se anexa el inserto del equipo. PCR.- Se anexa el inserto del equipo. Factor Reumatoide.- Se anexa el inserto del equipo. Bibliografía: Iovine E., Selva A., El Laboratorio en la Clínica, Ed. Panamericana, Buenos Aires. Kawai T., Proteínas Plasmáticas. Aplicación Clínica, Ed. Panamericana, Buenos Aires.


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SESIÓN No. 5

SEMINARIO SOBRE ELECTROFORESIS

Objetivo: Que el alumno se familiarice con conceptos generales sobre la electroforesis, así como con los factores que afectan la movilidad de las macromoléculas, métodos de separación en base al tamaño molecular y la selección de las condiciones óptimas para un corrimiento electroforético de proteínas plasmáticas.


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SESIÓN No. 6

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Objetivo: Que el alumno aplique el método electroforético al estudio de las proteínas plasmáticas.

Introducción.- Se designa como electroforesis a la migración de una micela

coloidal a través de un medio de dispersión, cuando actúa una fuerza electromotriz. Si se usa una solución buffer con un pH superior al punto isoeléctrico de las proteínas a separar, puede obtenerse su fraccionamiento. El primitivo método de electroforesis libre de Tiselius mostró que la movilidad de las fracciones proteicas dependen del tamaño molecular y de la carga eléctrica. Así la albúmina de menor tamaño molecular se mueve con más rapidez siguiendo en orden de velocidad las � globulinas, las � el fibrinógeno (en plasma) y las � globulinas.

La electroforesis de zona, permitió la generalización de los métodos electroforéticos y su aplicación en el laboratorio de análisis clínicos. En este tipo de electroforesis se utiliza un medio estabilizado como soporte para el buffer. Puede utilizarse como soporte el papel, el acetato de celulosa seco o gelatinizado, el gel de agar, agarosa, almidón, gel de acrilamida, etc.

En la electroforesis de zona por lo común se observan 5 fracciones, la más anódica es la albúmina, luego le siguen , siendo ésta la más catódica. Material y Método.- Reactivos.- Equipo.- Sol’n buffer pH 8.6 Cámara de Electroforesis Ponceau-S Fuente de Poder Ac. Acético 5% Aplicador Metanol Parrilla Ac.acético glacial Membranas de acetato de celulosa Material por Sección.- Material por Equipo: 1 probeta de 100 ml 1 tubo Vacutainer rojo 3 cajas Petri soporte, aguja y torniquete 20 tiras de papel filtro 4x10 cm 1 tubo 7X100 1 pip. Pasteur c/chuzo


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Técnica.- 1) Se principia a remojar la membrana de acetato de celulosa en la sol’n buffer, durante

15 – 60 min., deslizando el borde de la membrana debajo de la superficie de la sol’n poco a poco y sin interrupción hasta que quede sumergida completamente.

2) Verter 70 ml de sol’n buffer en cada electrodo de la cámara, y colocar una tira de papel filtro en cada borde de los electrodos poniéndolas en contacto con la sol’n buffer.

3) Colocar en los pozos de la base toma-muestras el suero, y alimentar el aplicador descendiéndolo en los pozos 3 o 4 veces y eliminar esta primera muestra. Volver a alimentar el aplicador y dejarlo preparado.

4) Quitar el exceso de buffer a la membrana de acetato de celulosa, con ayuda de papel filtro, e inmediatamente aplicar la muestra manteniendo el aplicador firmemente contra la membrana durante 10 seg.

5) Colocar la membrana en la cámara, fijándola con un portaobjetos a cada lado del electrodo. Tapar la cámara y conectar a la fuente de poder 180 Voltios durante 15 min.

6) Retirar la membrana de la cámara y proceder a colorearla con Ponceau-S durante 10 min.

7) Llevar a la membrana a una serie de baños. Primeramente con ac. acético al 5% durante 5 min., para quitar el exceso de colorante.

8) Colocar en baño con metanol durante 5 min, para deshidratar la membrana. 9) Colocar en baño de sol’n aclaradora (metanol-ac. acético) durante 5 min. 10) Secar la membrana a temperatura ambiente o a 70º C por 2 min. Bibliografía: Richterich R., Colombo J:P:, Química Clínica. Teoría, Práctica e interpretación, Ed. Salvat. Barcelona.


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SESIÓN No. 7

SEMINARIO SOBRE VALORACIÓN DE LÍPIDOS

Objetivo: Que el alumno conozca sobre los requisitos de toma de muestra para la cuantificación de lípidos, así como los métodos existentes para la determinación de colesterol total, C-HDL, C-LDL y triglicéridos. Así mismo aprenderá sobre los métodos para la cuantificación de lipoproteínas y apoproteínas.


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SESIÓN No. 8

PERFÍL DE LÍPIDOS

Objetivo: Que el alumno efectúe diversas determinaciones de lípidos que le ayuden a identificar la presencia de dislipoproteinemia. Introducción.-Los lípidos constituyen un grupo heterogéneo de sustancias insolubles o poco solubles en agua, sí en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benzal, éter de petróleo, etc. En general los lípidos del organismo se distribuyen en: las células en el citoplasma y material de reserva. En la sangre circulante están unidos a las proteínas plasmáticas por lo que consstituyen las lipoproteínas. Estas lipoproteínas tienen como función principal posibilitar el desplazamiento de los lípidos exógenos y endógenos entre el hígado, el tejido graso y otros órganos de la economía. Las lipoproteínas se estudiaron separándolas por métodos salinos, precipitación con antisueros específicos, electroforesis, ultracentrifugación o cromatografía. La clasificación más frecuente se basa en el procedimiento electroforético, y reciben diferentes nombres: Quilomicrones (QM) constituídos a partir de TG exógenos en su mayor proporción, y que transportan las grasas del intestino hacia el corazón por medio de los vasos linfáticos. Las pre�LP (VLDL) se constituyen predominantemente a partir de TG endógenos. Las �LP (LDL) transportan la mayor parte del colesterol, y abastecen a todas las membranas celulares delos tejidos periféricos. Las �LP (HDL) en cuya composición predominan las proteínas y los fosfolípidos, y transportan el colesterol al hígado en donde es metabolizado y excretado, de donde se considera un factor de protección contra el acúmulo de colesterol. Debido a lo anterior la cuantificación de lípidos totales, colesterol total, C-HDL, CLDL, triglicéridos y una electroforesis son de gran ayuda para la identificación de las diferentes dislipoproteinemias. Material y Métodos.- Reactivos: Equipo: Equipo para lípidos totales Bioxon Centrífuga Equipo para triglicéridos enzimáticos Boehringer Espectrofotómetro Equipo para colesterol enzimático Boehringer Celdasde espectrofotómetro Equipo para C-HDL Boehringer Baño maría c/termómetro Equipo para C-LDL Boehringer Algodón y alcohol Material por Sección: Material por Equipo: 3 pip. 10 ml 1 gradilla 2 pip. 5 ml 2 tubos de rosca grandes 1 pip. 2 ml 5 tubos 10X100 pyrex 7 pip. 1 ml 7 tubos de 10X100 7 pip. O.1 ml 1/100 2 tubos 16X150 pyrex


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1 tubo Vacutainer rojo soporte, aguja y torniquete 1 pip. Pasteur c/chuzo

Técnicas.- Lípidos Totales.-

Se anexa el inserto del equipo Triglicéridos.-

Se anexa el inserto del equipo Colesterol total.- Se anexa el inserto del equipo C-HDL.- Se anexa el inserto del equipo C-LDL.- Se anexa el inserto del equipo Bibliografía: Angel M.G., Angel R.M., Interpretación clínica del laboratorio, Ed. Panamericana, S.A., Bogotá, Colombia.


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SESIÓN No. 9

ESTUDIO DE JUGO DUODENAL

Objetivo: Que el estudiante conozca las diferentes determinaciones que se le efectúan a una muestra de jugo duodenal, y que con los resultados haga un diagnóstico presuntivo. Introducción.- La producción diaria de jugo pancreático varía entre 500 y 800 ml aproximadamente. Su composición, principalmente en cuanto a contenido enzimático cambia en función a la alimentación. Entre las enzimas difestivas producidas y secretadas por las células acinosas se encuentran: tripsinógeno, quimotripsinógeno (A y B), proelastasa, procarboxipeptidasa, aminopeptidasa, amilasa, lipasa, fosfolipasa y esterasa. La secreción pancreática es claramente alcalina, pues contiene mucho bicarbonato producido en las células ductales. El contenido de Cl- varía inversamente con el de bicarbonato y el total de estos dos aniones es constante. Las concentraciones de Na y K son semejantes a las plasmáticas. El estimulante de elección para la producción de jugo pancreático en el estudio de éste, es la secretina administrada por vía endovenosa en 1U/Kg. Se debe tomar una muestra basal (previa a la administración del estimulante) y posteriormente 4 muestras posestímulo a intervalos de 15 o 20 min. El estudio de jugo duodenal se divide en pruebas físicas y químicas. Entre las físicas se determina el volumen y el aspecto y entre las químicas se mide el pH, la concentración de HCO3

- , cuantificación de amilasa y tripsina y en ocasiones también lipasa. Material y Métodos.- Reactivos: Equipo: Papel indicador Espectrofotómetro Reactivos: Equipo: Na2CO3 5% Celdas de espectrofotómetro Sol’n gelatina 7.5% 2 baños maría c/termómetros HCl 0.05 N Refrigerador NaOH 0.01 N Rojo de Fenol Equipo para Amilasa Material por Sección: Material por Equipo: 2 pip. 1 ml 1 gradilla 2 pip. 2 ml 1/100 10 tubos 10X100 3 pip. 5 ml 4 tubos 16X150


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4 pip. 10 ml 2 pip. 0.1 ml 1/100 2 vasos precipitados 150 ml 2 buretas 10 ml 1 probeta 500 ml 1 matraz erlenmeyer 125 ml 1 matraz aforado 100 ml 1 pizeta c/agua destilada Técnicas.- A la muestra posestímulo se le efectúan las siguientes determinaciones: Pruebas físicas: Pruebas químicas: Vol’n pH Aspecto HCO3

-Amilasa Tripsina Determinación volumétrica de HCO3

-.- En 2 tubos en ensayo marcados T y P (testigo y problema), se coloca 1 ml de jugo duodenal en cada uno. Al tubo T se le añaden 2.5 ml de agua destilada. Añadir una gota de rojo de fenol a cada tubo y apreciar el color. Rojo claro indica neutralidad, naranja o amarillo acidez, y púrpura denota alcalinidad. Al tubo P, agregar 1 ml de HCl 0.05 N agitando durante 2 o 3 min. y titulando luego con NaOH 0.01 N, hasta obtener una coloración análoga a la del tubo T. El punto final puede afectarse levemente por la turbidez. Cálculos: ( 5 – ml de NaOH gastados ) X 10 = mEq/l de HCO3

- Determinación de Tripsina.- Se preparan dil’ns de 1:10 y 1:100 del contenido duodenal en sol’n de carbonato de sodio al 5%. En una serie de 10 tubos se coloca: Tubo Dil’n 1:100 Dil’n 1:10 Na2CO3 5% Dil’n final ml ml ml 1 0.125 -- 1.875 2 0.25 -- 1.75 3 0.5 -- 1.5 4 1.0 -- 1.0 5 --- 0.2 1.8 6 --- 0.4 1.6 7 --- 0.8 1.2 8 --- 1.6 0.4 9 --- 2.0 --- 10 --- -- 2.0


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A cada tubo se añaden 2 ml de sol’n de gelatina al 7.5% (a37ºC); se mezcla cuidadosamente y se incuba a 37º C durante 1 hora. Inmediatamente después de lal incubación, los tubos se llevan al refrigerador. A las 2 horas o al día siguiente si se prefiere, se leen los resultados de la manera siguiente: se inclinan los tubos y se registra la dil’n de contenido duodenal más alta que ha licuado la gelatina. La gelatina no digerida es sólida a la temperatura del refrigerador. Amilasa.- Se anexa el inserto del equipo Valores de Referencia: Vol’n = 3 – 6.6 ml/Kg peso o 100 – 450 ml /hr Aspecto = Opalescente [HCO3

-] = 90 – 140 mEq/l Amilasa = 6.3 – 16.9 U/ml/Kg Somogyi-Nelson Tripsina = dil’n 1:100 Bibliografía: Aiquel, Análisis Clínicos, Ed.Médica-Panamericana, Buenos Aires. Iovine E., Selva A., El Laboratorio en la Clínica, Ed.Médica-Panamericana, Buenos Aires.


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SESIÓN No. 10

PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO PANCREÁTICO

Objetivo: La finalidad de esta práctica es que se conozcan las pruebas más comunes y de mayor utilidad para el diagnóstico de pancreatitis aguda. Introducción: La etiología y la etiopatogenia de las pancreatitis es aún oscura, no conociéndose con exactitud la razón de la repentina liberación de la tripsina en la célula pancreática. Se han señalado varios mecanismos probables, uno sería la repentina disminución de la concentración de los niveles del inhibidor de la tripsina en la glándula. Tal vez la teoría más admitida sea la que indica como factor causal a la obstrucción de los conductos por litiasis biliar, cálculos pancreáticos, espasmo del esfínter o del conducto, proliferación epitelial, edema o parásitos. La acción conjunta de la obstrucción, de la mayor intensidad de los estímulos de la secreción y del aumento de la presión intraductal, llega a producir la ruptura de los ácinos y conductos y la salida de las enzimas digestivas al tejido intersticial donde provocan, al ser activadas, procesos necróticos. Desde ell intersticio, las enzimas pancreáticas llegan a la circulación sanguínea general a través de los vasos linfáticos y del conducto torácico. Por lo dicho, queda claro que demostrar el aumento de los niveles de la lipasa y amilasa en plasma ( y en orina ) es de utilidad en el diagnóstico de la pancreatitis. Investigaciones ulteriores han demostrado que en la pancreatitis no está aafectada la filtración glomerular de la amilasa, pero en cambio se encuentra disminuída su resorción a nivel tubular renal. Por consiguiente la fracción procentual del aclaramiento de amilasa respecto al de creatinina, se registra la resorción disminuída de las pequeñas proteínas por el túbulo renal. Material y Métodos.- Reactivos: Equipo: Equipo para Amilasa Bioxon Espectrofotómetro Equipo para Lipasa Hycel Celdas espectrofotómetro Equipo para Creatinina Sera-Pak Baño maría c/termómetro Algodón y alcohol Material por Sección: Material por Equipo: 2 pip. 0.1 ml 1/100 1 gradilla 7 pip. 1 ml 4 tubos 16X150 2 pip. 2 ml 4 tubos 7X100 1 pip. 5 ml 1 pip.Pasteur c/chuzo 8 pip. 10 ml 1 tubo Vacutainer rojo 2 matraces erlenmeyer 125 ml soporte, aguja y torniquete 1 probeta 50 ml 1 vaso precipitados 150 ml 2 pizetas c/agua destilada


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Técnicas.- Lipasa.- Se anexa el inserto del equipo. Amilasa.- Se anexa el inserto del equipo. Creatinina.- Se anexa el inserto del equipo. Cálculos del Aclaramiento de Amilasa respecto al de Creatinina.- Dep.Amilasa/Creatinina = Amilasa urinaria X Creatinina sérica X 100

Amilasa sérica Creatinina urinaria Bibliografía: Richterich R., Colombo J.P., Química Clínica. Teoría, Práctica e Interpretación, Ed. Salvat, Barcelona. Iovine E., Selva A., El Laboratorio en la Clínica, Ed.Panamericana, Buenos Aires.


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SESIÓN No. 11

PRUEBAS DE ABSORCIÓN.

Objetivo: Realizar diferentes pruebas de absorción que son de utilidad para conocer la posible presencia de insuficiencia pancreática o daño intestinal o renal. Introducción.- Las pruebas de absorción se basan en la teoría de que es esencial la función pancreática para la absorción intestinal normal de ciertas sustancias. Almidón, grasas y proteínas han de ser hidrolizados antes de poder ser absorbidos y el páncreas es la fuente principal de las enzimas amilasa, lipasa y tripsina, las cuales causan estas hidrólisis. El valor máximo de las pruebas de absorción parece estar en el diagnóstico o exclusión de fibrosis quística, en la cual disminuye la función pancreática y por consiguiente también la absorción intestinal. Existen otras pruebas de absorción que son independientes de mal funcionamiento pancreático, y son útiles para conocer otro tipo de alteraciones, como daño intestinal o deficiencia de alguna enzima específica para la hidrólisis de un sustrato particular. Entre las mencionadas pruebas se hallan la de absorción de D-Xilosa, la de Schilling y la de lactasa. Material y Métodos.- Reactivos: Equipo: Alcohol etílico Espectrofotómetros Eter de petróleo Celdas espectrofotómetros Sol’n testigo de �carotenos Baño maría c/termómetro Std. D-Xilosa Reactivo de p-bromoanilina Reactivos: Sol’n ac.acético glacial-tiourea Equipo para Glucosa Alcohol y algodón


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Material por Sección: Material por Equipo: 4 pip. 10 ml 1 matraz erlenmeyer 125 ml 8 tubos 7 X 100 1 tapón # 5 9 pip. 0.1 ml 1/100 8 tubos 10 X 100 2 pizetas c/agua destilada 3 tubos 16 X 150 3 tubos 13 X 100 1 pip. Pasteur c/chuzo 1 pip. 5 ml 1 pip. 0.1 ml 1 tubo Vacutainer rojo aguja, soporte, torniquete Técnicas.- �carotenos.- En un matraz erlenmeyer de 125 ml se colocan 5 ml de suero, se añaden 5 ml de alcohol, gota a gota con agitación lateral continua y 5 ml de éter de petróleo. Se tapa y se agita fuertemente durante 5 min. Se trasvasa a 2 tubos de centrífuga y se procede a centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. Con una pipeta se pasa cuidadosamente la capa sobrenadante de éter de petróleo de ambos tubos a una celda y se efectúa la lectura en el espectrofotómetro a 420 nm, llevando a cero con éter de petróleo. Se efectúa también la lectrua de la sol’n testigo, llevando a cero con agua destilada. Cálculos: APr X 224 = �g de carotenos / 100 ml AStd D-Xilosa.-

Problema Blanco Estándar R.p-bromoanilina 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml Orina 0.02 ml --- --- Agua destilada --- 0.02 ml --- Xilosa estándar --- --- 0.02 ml Calentar en baño maría a 70º C durante 10 min. Dejar reposar de 60 a 120 min. en la obscuridad. Dentro de las 3 horas posteriores al calentamiento, medir la extinción respecto al agua a 546 nm.


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Cálculos: Concentración = EPr EBco X 0.5 g D-Xilosa/100 ml EStd EBco Excreción absoluta en mg = EPr EBco X 5 X vol’n urinario(ml) EStd EBco

Excreción en porcentaje = g D-Xilosa excretada x 100 % DE XILOSA De la cantidad administ. Dosis administrada en g Prueba de lactasa.- Se toma una muestra basal de sangre sin anticoagulante. Posteriormente se administran 50 g de lactosa en sol’n acuosa al 10% por vía oral; Después se vuelven a tomar muestras sanguíneas 15, 30, 45 y 60 min. En todas las muestras se cuantifica glucosa en suero. Se anexa el inserto del equipo para glucosa. Valores de Referencia: �carotenos = 40 – 300 �g/100 ml D-Xilosa = Ad. 4 g/orina 5 hr o 22 – 33 % administrada Niños 15 – 37 % dosis administrada Pba. Lactasa = Aumentos > 25 mg Glucosa/100 ml respecto al basal Bibliografía: Richterich R., Colombo J.P., Química Clínica. Teoría, Práctica e Interpretación. Ed.Salvat, Barcelona

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