INSTRUMENTACIÓN

Centrifugación

OBJETIVOS

•Conocer los fundamentos e importancia de la instrumentación en Bioquímica.

•Conocer el funcionamiento y uso de la Centrífuga en Bioquímica.

Instrumentación es el uso y aplicación de instrumentos o equipos de laboratorio para análisis cuantitativo o cualitativo de sustancias.

Estos equipos sirven como herramientas auxiliares para identificar y cuantificar algunos indicadores bioquímicos en la determinación de enfermedades y aplicación de medicamentos.

Tenemos por ejemplo: La centrífuga, el espectrofotómetro, el potenciómetro, etc.

INSTRUMENTACIÓN

Ejemplos de Instrumentos Analíticos

Balanza pHmetro

RefractómetroEspectrofotómetro

AAIR

CENTRIFUGACIÓN• La centrifugación es un método que utiliza la

propiedad de sedimentación de partículas para la separación de éstas de una solución, ya que una vez obtenido el lisado u homogenizado celular se ha de proceder a su fraccionamiento.

• La centrifugación se basa en la rotación de un objeto alrededor de un eje central el cual genera una fuerza centrífuga sobre el objeto.

• Se aplica al análisis o a la separación de mezclas de partículas, células, orgánulos o moléculas.

CENTRIFUGACIÓN

• Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea.

• En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos: Rotores basculantes o flotantes y rotor de ángulo fijo.

• Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro.

Tipos de rotores en centrífugas

Rotor de ángulo fijoRotor basculante o flotante

• Cuando se centrifuga una solución o suspensión hay que considerar dos fuerzas que se oponen a la sedimentación de las moléculas o partículas suspendidas:

• El empuje hacia arriba que sufren al desplazar las moléculas del soluto y

• La fricción que se genera cuando se mueve a través del soluto.

CENTRIFUGACIÓN

Características de las centrífugas

• Alcanzan velocidades entre 5000 y 16 000 rpm.

• Ultracentrífugas son refrigeradas y al vacío, alcanzando hasta 500 000 g.

• Capacidad de separación de partículas se mide con el nomograma de Dole y Cotziar.

Determinación de capacidad de separación.

• Ecuación de equivalencias:Fcr : 1118 x 10-8 x r x (rpm)2

Nomograma para el cálculo de la fuerza centrífuga relativa (fcr),

según IEC IEC: Comité Internacional Electrotécnico

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Se usa en clínica para separar sedimentos de orina o componentes del plasma.

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

La centrifugación zonal aprovecha el tamaño y la masa de las partículas en lugar de su densidad para la sedimentación.

Por ejemplo, las densidades de los anticuerpos son muy similares, pero las masas son distintas. Así es que la separación en base a la masa separa las distintas clases, mientras que la que se hace en base a la densidad no identifica estas clases de anticuerpos.

CENTRIFUGACIÓN ZONAL

EXPERIENCIA• Aislamiento de fracción de mitocondrias • Se usarán hígados, riñones o corazones de pollo, órganos que se guardarán

congelados. Cortar los órganos en pequeños trozos y colocarlos en un mortero.

• Agregar aproximadamente un gramo de arena y 5 mL de buffer fosfato de sodio pH 7,0.

• Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros 5 mL. de buffer fosfato. Dejar esta mezcla a la temperatura ambiente por unos 15 minutos, revolviendo de vez en cuando para destruir substratos endógenos.

• Vaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a baja velocidad (600g) durante unos 10 minutos para sedimentar la arena, núcleos y células enteras que haya quedado sin destruir. Conservar en hielo el sobrenadante.

• Centrifugar el sobrenadante a 4000g x 15 minutos. Separar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de buffer fosfato. Es en esta suspensión donde se encuentran las mitocondrias.

3000 rpm

7000 rpm

BIBLIOGRAFÍA

• Freifelder, D.(2003). Técnicas de bioquímica y biología molecular. Reverté. Cap. 11.

• Mathews, C.K. y Van Holde, K.E. (2008). Bioquímica. 5° Edición.McGraw-Hill. Interamericana. p 165-166.

• Luque,J y Herráez, A (2001).Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética.Harcourt. p 122-125 ; 136-137.

CUESTIONARIO

1.-Investigue como se clasifica la centrifugación según la velocidad y según el propósito para la que se emplea.

2.-Escriba 02 diferencias entre la centrifugación diferencial y la centrifugación zonal.

3.-¿Cuál es el número de ges alcanzado en un rotor de centrífuga de 6.5 cm de radio, que gira a una velocidad de 15000 rpm?