![8609-CAI-201612 · 2017-08-01 · Resultado antes de impostos Impostos Correntes Diferidos Resultado após impostos Do qua]: Resultado após impostos de operações descontinuadas](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5f900f0c304127300e059e74/8609-cai-201612-2017-08-01-resultado-antes-de-impostos-impostos-correntes-diferidos.jpg)
LA PROTEIN-QUINASA DEPENDIENTE DE AMP (AMPK) ACTIVA...
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LA PROTEIN-QUINASA DEPENDIENTE DE AMP (AMPK) ACTIVA eNOS Y nNOS DURANTE EL ESTRÉS HIPEROSMÓTICO PROMOVIENDO LA LIBERACIÓN DE OXIDO NÍTRICO (NO):IMPACTO DEL NO EN LA FUNCIÓN CONTRÁCTIL. Juan I Burgos, Malena Morell, Luis A Gonano y Martín Vila Petroff. Centro de Investigaciones Cardiovasculares Dr. Horacio E Cingolani, CONICET-UNLP La osmolaridad de los tejidos esta finamente regulada bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, en diferentes situaciones patológicas como estados de deshidratación severa, hiperglucemia, hiperlipidemia y diabetes, las células sufren encogimiento osmótico. A nivel cardíaco, esta alteración en el volumen celular, es capaz de promover disfunción contráctil. El Óxido Nítrico (NO), sintetizado por la Oxido Nítrico Sintasa (NOS), ha sido definido (1) como segundo mensajero y regulador de la función cardíaca . Previamente demostramos que el hinchamiento hipotónico de miocitos cardíacos produce liberación de NO (2) promoviendo un soporte contráctil . El objetivo de este trabajo fue evaluar si el estrés hiperosmótico también promueve la liberación de NO y, de ser así, examinar su impacto sobre la función contractil. INTRODUCCIÓN RESULTADOS CONCLUSIONES 5. El NO provee soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico 4. El 1. El estrés hiperosmótico provoca la disminución del volumen celular La perfusión con solución hiperosmótica (SH) disminuye significativamente el volumen de miocitos cardíacos. 3. nNOS y eNOS serían las isoformas de la NOS responsables de la producción de NO durante el estrés hiperosmótico.. El eje NO/GMPc/PKG A: Inhibir las NOS (con L-NAME), la nNOS (con Nitroguanidina), la eNOS (con Wortmanina) o ambas (Nitroguanidina+Wortmanina) previene la producción de NO durante el estrés hiperosmótico. B: El estrés hiperosmótico promueve la fosforilación de nNOS y eNOS sugiriendo que ambas isoformas serían las responsables de la producción de NO. REFERENCIAS 1- Ziolo MT, Kohr MJ, Wang H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Moll Cell Cardiol 2008;45:625-632. 2- Gonano LA, Morell M, Burgos JI, Dulce RA, De Giusti VC, Aiello EA, Hare JM, Vila Petroff M. Hypotonic swelling promotes nitric oxide release in cardiac ventricular myocytes: impact on swelling-induced negative inotropic effect. Cardiovasc Res 2014;104(3):455-466. MÉTODOS Miocitos cardíacos de ratas wistar macho de 3 meses fueron aislados mediante digestión enzimática. Con el objetivo de inducir estrés hiperosmótico las células fueron perfundidas durante 5 minutos con una solución isosmótica (SI: 309 mOsm/L) y luego 20 minutos con una solución hiperosmótica (SH:440 mOsm/L). Para medir producción de NO, los miocitos fueron cargados con el indicador fluorescente DAF-FM y se tomaron imágenes de epifluorescencia en un microscopio invertido. En paralelo, se tomaron imágenes de campo claro donde se midió el cambio en el volumen celular. Con el objetivo de evaluar la contractilidad, se midió el acortamiento celular mediante video detección de bordes. Se estudió el nivel de fosforilación de eNOS y nNOS a partir de anticuerpos específicos para los sitios fosforilables de estas proteínas. A: Imágenes representativas de fluorescencia que muestran un aumento de la fluorescencia de DAF-FM (indicativo de producción de NO) durante la perfusión de miocitos cardíacos con solución hiperosmótica (SH). B: Resultados promedio donde se muestra un aumento gradual de la fluorescencia de DAF-FM durante la perfusión de miocitos con solución hiperosmótica (SH) que es significativo a los 5 minutos comparado a la perfusión con solución isosmótica (SI). 1. El estrés hiperosmótico promueve la liberación de NO y las isoformas de la NOS involucradas serían la nNOS y la eNOS. 2. La AMPK estaría sensando el estrés mecánico de la membrana produciendo así la activación de las isoformas de la NOS. 3. El estrés hiperosmótico cursa con un EIN. 4. El NO liberado provee soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico a través de un mecanismo GMPc/PKG dependiente. 5. La liberación de NO podría ayudar a sostener la función contráctil durante diferente situaciones patológicas asociadas con el encogimiento celular como deshidratación severa, hiperglucemia, hiperlipidemia, diabetes, etc. 6. Los resultados sugieren que la disfunción contráctil que ocurre durante la disminución del volumen celular podría estar exacerbada en patologías asociadas con una baja disponibilidad de NO como por ejemplo HTA. c SH SI 50 60 70 80 90 100 110 0 5 10 15 20 25 Tiempo (min) Volumen celular (% del basal isotónico) n=10 n=21 * * * * SI SI 2. Someter a los miocitos cardíacos a una solución hiperosmótica (SH) promueve la liberación de Oxido Nítrico (NO) Tiempo (min) SI SH A B 90 95 100 105 110 115 120 0 5 10 15 20 25 Fluorescencia de DAF-FM (% del basal isotónico) SI n=10 n=22 * * * * SI SI 4. La AMPK promueve la activación de las NOS durante el estrés hiperosmótico 4. El NO liberado durante el hinchamiento hipotónico no 60 70 80 90 100 110 120 SI SH SH+ L-NAME SH+ DORSO Fluorescencia de DAF-FM (% del basal isotónico) Teniendo en cuenta que la protein-quinasa dependiente de AMP (AMPK) puede ser activada por deformación de la membrana en el músculo cardíaco y que puede fosforilar a nNOS y eNOS examinamos si esta quinasa media la activación de las NOS inducida por estrés hiperosmótico. Exponer a los miocitos a SH en presencia de Dorsomorfina (inhibidor de AMPK) previno el aumento en la fluorescencia de DAF-FM, indicativo de producción de NO, sugiriendo que esta quinasa sería la responsable de la activación de las isoformas de la NOS durante el estrés hiperosmótico. 2000 6. El soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico esta dado por vía GMPc/PKG. 4. El NO liberado durante el hinchamiento hipotónico no Esta descripto que el estrés hiperosmótico cursa con un efecto inotrópico negativo (EIN). Teniendo en cuenta que el NO es un importante modulador de la función miocárdica evaluamos si juega algún papel en el EIN inducido por estrés osmótico. A. Perfiles representativos donde se muestra el efecto de la perfusión de miocitos con una solución hiperosmótica en ausencia y presencia de inhibidores (L-NAME y Dorsomorfina). B. Resultados promedios que demuestran que inhibir las NOS, con L- NAME o inhibir la quinasa activadora de las mismas con Dorsomorfina, exacerba el EIN que se produce durante el estrés hiperosmótico sugiriendo que el NO estaría generando un soporte contráctil durante este tipo de estrés. 45 Esta establecido que el NO puede modular la función contráctil a través de mecanismos dependientes e independientes de GMPc. Con el objetivo de evaluar la cascada de señalización por la cuál el NO genera soporte contráctil durante el estrés hiperosmótico realizamos experimentos en presencia y ausencia de ODQ (inhibidor de guanilato ciclasa) y KT5823 (inhibidor de PKG) -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 105 110 Tiempo(seg) SH+L-N SH+L-NAME -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Tiempo(seg) SI+DORSO SH+DORSO SI+D SH+DORSO -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 SH SI SI Acortamiento celular (um) Tiempo(seg) SH A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 SH SH + L-N Acortamiento celular (% del valor isotónico) SH+DORSO B Resultados promedios que demuestran que inhibir GMPc y PKG exacerba el EIN producido durante el estrés hiperosmótico sugiriendo que el NO estaría generando el soporte contráctil a través de un mecanismo GMPc/PKG dependiente. A 90 95 100 105 110 115 120 0 5 10 15 20 25 Tiempo (min) Fluorescencia de DAF-FM (% del basal isotónico) SH SI SH+L-NAME SH + NG SH+ WT Y NG SI * * * * SH + WORT n=22 n=10 n=7 n=12 n=10 n=6 B 0 50 100 150 200 250 pS1177 GAPDH 0 50 100 150 200 pS1417 GAPDH * * SI SH SI SH SI SI SH SH SI SI SH SH p-nNOS/GAPDH(%) p-eNOS/GAPDH(%) * SI+L-N SI+L-N * * * * * * Tiempo (min) SH SH + ODQ SH + KT5823 Acortamiento celular (% del valor isotónico) 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25
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LA PROTEIN-QUINASA DEPENDIENTE DE AMP (AMPK) ACTIVA eNOS Y nNOS DURANTE
EL ESTRÉS HIPEROSMÓTICO PROMOVIENDO LA LIBERACIÓN DE OXIDO NÍTRICO
(NO):IMPACTO DEL NO EN LA FUNCIÓN CONTRÁCTIL.
Juan I Burgos, Malena Morell, Luis A Gonano y Martín Vila Petroff.
Centro de Investigaciones Cardiovasculares Dr. Horacio E Cingolani, CONICET-UNLP
La osmolaridad de los tejidos esta finamente regulada bajo condiciones fisiológicas. Sin
embargo, en diferentes situaciones patológicas como estados de deshidratación severa,
hiperglucemia, hiperlipidemia y diabetes, las células sufren encogimiento osmótico. A nivel
cardíaco, esta alteración en el volumen celular, es capaz de promover disfunción contráctil.
El Óxido Nítrico (NO), sintetizado por la Oxido Nítrico Sintasa (NOS), ha sido definido (1)como segundo mensajero y regulador de la función cardíaca . Previamente demostramos
que el hinchamiento hipotónico de miocitos cardíacos produce liberación de NO (2)promoviendo un soporte contráctil .
El objetivo de este trabajo fue evaluar si el estrés hiperosmótico también promueve la
liberación de NO y, de ser así, examinar su impacto sobre la función contractil.
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
CONCLUSIONES
5. El NO provee soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico 4. El
1. El estrés hiperosmótico provoca la disminución del volumen celular
La perfusión con solución hiperosmótica (SH) disminuye significativamente el volumen de miocitos cardíacos.
3. nNOS y eNOS serían las isoformas de la NOS responsables de la
producción de NO durante el estrés hiperosmótico.. El eje NO/GMPc/PKG
A: Inhibir las NOS (con L-NAME), la nNOS (con Nitroguanidina), la eNOS (con Wortmanina) o ambas (Nitroguanidina+Wortmanina)
previene la producción de NO durante el estrés hiperosmótico.
B: El estrés hiperosmótico promueve la fosforilación de nNOS y eNOS sugiriendo que ambas isoformas serían las responsables de la
producción de NO.
REFERENCIAS1- Ziolo MT, Kohr MJ, Wang H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Moll Cell Cardiol 2008;45:625-632.
2- Gonano LA, Morell M, Burgos JI, Dulce RA, De Giusti VC, Aiello EA, Hare JM, Vila Petroff M. Hypotonic swelling promotes nitric oxide release in cardiac ventricular
myocytes: impact on swelling-induced negative inotropic effect. Cardiovasc Res 2014;104(3):455-466.
MÉTODOS
Miocitos cardíacos de ratas wistar macho de 3 meses fueron aislados mediante digestión
enzimática. Con el objetivo de inducir estrés hiperosmótico las células fueron perfundidas
durante 5 minutos con una solución isosmótica (SI: 309 mOsm/L) y luego 20 minutos con
una solución hiperosmótica (SH:440 mOsm/L).
Para medir producción de NO, los miocitos fueron cargados con el indicador fluorescente
DAF-FM y se tomaron imágenes de epifluorescencia en un microscopio invertido. En
paralelo, se tomaron imágenes de campo claro donde se midió el cambio en el volumen
celular.
Con el objetivo de evaluar la contractilidad, se midió el acortamiento celular mediante
video detección de bordes.
Se estudió el nivel de fosforilación de eNOS y nNOS a partir de anticuerpos específicos
para los sitios fosforilables de estas proteínas.
A: Imágenes representativas de fluorescencia que muestran un aumento de la fluorescencia de DAF-FM (indicativo de producción de
NO) durante la perfusión de miocitos cardíacos con solución hiperosmótica (SH).
B: Resultados promedio donde se muestra un aumento gradual de la fluorescencia de DAF-FM durante la perfusión de miocitos con
solución hiperosmótica (SH) que es significativo a los 5 minutos comparado a la perfusión con solución isosmótica (SI). 1. El estrés hiperosmótico promueve la liberación de NO y las isoformas de la NOS
involucradas serían la nNOS y la eNOS.
2. La AMPK estaría sensando el estrés mecánico de la membrana produciendo así la
activación de las isoformas de la NOS.
3. El estrés hiperosmótico cursa con un EIN.
4. El NO liberado provee soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico a través
de un mecanismo GMPc/PKG dependiente.
5. La liberación de NO podría ayudar a sostener la función contráctil durante diferente
situaciones patológicas asociadas con el encogimiento celular como deshidratación
severa, hiperglucemia, hiperlipidemia, diabetes, etc.
6. Los resultados sugieren que la disfunción contráctil que ocurre durante la disminución
del volumen celular podría estar exacerbada en patologías asociadas con una baja
disponibilidad de NO como por ejemplo HTA.
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2. Someter a los miocitos cardíacos a una solución hiperosmótica (SH)
promueve la liberación de Oxido Nítrico (NO)
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4. La AMPK promueve la activación de las NOS durante el estrés
hiperosmótico 4. El NO liberado durante el hinchamiento hipotónico no
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Teniendo en cuenta que la protein-quinasa dependiente de AMP (AMPK) puede ser activada
por deformación de la membrana en el músculo cardíaco y que puede fosforilar a nNOS y
eNOS examinamos si esta quinasa media la activación de las NOS inducida por estrés
hiperosmótico.
Exponer a los miocitos a SH en presencia de Dorsomorfina (inhibidor de AMPK) previno el aumento en la fluorescencia de DAF-FM,
indicativo de producción de NO, sugiriendo que esta quinasa sería la responsable de la activación de las isoformas de la NOS durante el
estrés hiperosmótico.
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6. El soporte inotrópico durante el estrés hiperosmótico esta dado por vía
GMPc/PKG. 4. El NO liberado durante el hinchamiento hipotónico no
Esta descripto que el estrés hiperosmótico cursa con un efecto inotrópico negativo (EIN).
Teniendo en cuenta que el NO es un importante modulador de la función miocárdica
evaluamos si juega algún papel en el EIN inducido por estrés osmótico.
A. Perfiles representativos donde se muestra el efecto de la
perfusión de miocitos con una solución hiperosmótica en ausencia y
presencia de inhibidores (L-NAME y Dorsomorfina).
B. Resultados promedios que demuestran que inhibir las NOS, con L-
NAME o inhibir la quinasa activadora de las mismas con
Dorsomorfina, exacerba el EIN que se produce durante el estrés
hiperosmótico sugiriendo que el NO estaría generando un soporte
contráctil durante este tipo de estrés.
45
Esta establecido que el NO puede modular la función contráctil a través de mecanismos
dependientes e independientes de GMPc. Con el objetivo de evaluar la cascada de
señalización por la cuál el NO genera soporte contráctil durante el estrés hiperosmótico
realizamos experimentos en presencia y ausencia de ODQ (inhibidor de guanilato ciclasa) y
KT5823 (inhibidor de PKG)
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Resultados promedios que demuestran que inhibir
GMPc y PKG exacerba el EIN producido durante el
estrés hiperosmótico sugiriendo que el NO estaría
generando el soporte contráctil a través de un
mecanismo GMPc/PKG dependiente.
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