La hepatotoxicidad de fármacos derivados de

piperazina. Comparadas en diferentes modelos in vitro

Vanessa Jaraba Juliana González

OBJETIVO• Evaluar y comparar la hepatotoxicidad

potencial de N-bencilpiperazina (BZP), 1- (3-tri- fluorometilfenil) piperazina (TFMPP), 1-(4-metoxifenil) piperazina (MeOPP) y 1-(3,4- metilendioxibencil) piperazina (MDBP) en diferentes modelos in vitro incluyendo dos celulas hepaticas humanas (HepaRG y HepG2) y en los hepatocitos primarios de ratas.

PIPERZINA FARMACOLOGIA

• Mecanismo de acción:

• Presenta un claro patrón estimulante asociado al comportamiento con el aumento en la liberación de monoaminas.

PIPERZINA

• Taquicardia• Hipertensión • Ansiedad• Vomito• Cefalea• Confusión • Episodios psicóticos

agudos.• E insuficiencia renal

• Severa nefrotoxicidad• Hipertermia• Coagulación

intravascular diseminada

• Rabdomiolisis• Alta/ toxico para el

corazón y células renales de línea.

• Insuficiencia hepática.

RAM RAM

PIPERAZINA • METABOLISMO: Los fármacos diseñadas a partir

de piperzina se metabolizan principalmente en el hígado, donde también se pueden acumular , siendo la (TFMPP) y (MeOPP) mas extensamente metabolizados que las (BZP).

• EXCRESION: por metabolitos en orina.• HEPATOCITOS: tienen un centro funcional en

el destino metabólico y en el proceso de desintoxicación.

MATERIALES Y METODO

CELULAS INMORTALIZADAS

PRODUCTOS QUIMICOS

• Células HepG2 • Células HepaRG

MATERIALES Y METODO

ANIMALES AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HEPATOCITOS PRIMARIOS DE

RATA• El aislamiento de

hepatocitos se realizo por perfusión de colagenasa.

• El aislamiento de hepatocitos se realizó por perfusión de colagenasa.

MATERIALES Y METODO

LOS ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD

• Para la evaluación de la citotoxicidad, el ensayo de reducción de MTT era realizado. El ensayo de deshidrogenasa mide la actividad de la MTT succinato, un indicador de las mitocondrias metabólicamente activo.

INFLUENCIA DEL METABOLISMO CYP SOBRE FARMACOS DERIVADADOS DE PIPERAZINA: CITOTOXICIDAD

MATERIALES Y METODO

LA MEDICIÓN DE OXÍGENO INTRACELULAR REACTIVO (ROS) Y NITRÓGENO (RNS) ESPECIES

MEDICIÓN DE INTRACELULAR GLUTATIÓN REDUCIDO (GSH), Y GLUTATIÓN OXIDADO (GSSG)

MEDICIÓN DE ATP INTRACELULAR

EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL (WM D)

ENSAYO DE ACTIVIDAD CASPASA-3

ANALISIS ESTADISTICO

• Los datos de MTT fueron normalizados e instalados en el dosimetric logit model que fue elegido con base a un principio estadístico de bondad en el ajuste.

• Las comparaciones entre las curvas de concentración-respuesta se realizaron usando el prueba F adicional de suma de cuadrados.

• Los Resultados de ROS / RNS GSH, GSSG, D w m, ATP, y la caspasa-3 ensayos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) a partir de 4 experimentos independientes.

ANALISIS ESTADISTICO

• La normalidad de la distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov prueba de normalidad.

• Las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizo medianete un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por la Prueba de comparación múltiple de Dunn.

• En todos los casos, la significación fue aceptada en p values <0,05. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con Software GraphPad Prism.

RESULTADOS(FARMACOS DERIVADOS DE PIPERZINA CAUSAN HEPATOTXICIDAD IN VITRO)

RESULTADOS(FARMACO DERIVADO DE PIPERZINA CAUSAN HEPATOTXICIDAD IN VITRO)

RESULTADOS• Las graficas representan: concentración vs respuesta de

cada modelo HepG2 y HepaRG y hepatocitos primarios en ratas después de 24 horas de incubación.

• El TFMPP fue el más cito tóxico en los 3 modelos in Vitro.

• Las células HepaRG demostraron ser más resistentes a la toxicidad provocada por las piperazinas.

• La BZP no presentó diferencia significativa entre HepG2 y HepRG

• Los hepatocitos primarios de rata son los más sensibles para estudiar la hepatotoxicidad del diseño de piperazina.

RESULTADOS(EL METABOLISMO NO CONTRIBUYE A LA CITOTOXICIDAD DE FARMACOS

DERIVADOS DE PIPERZINA EN HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA)

RESULTADOS(EL METABOLISMO NO CONTRIBUYE A LA CITOTOXICIDAD DE FARMACOS

DERIVADOS DE PIPERIZINA EN HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA)

RESULTADOS• El metabolismo de piperzina es dependiente de la

actividad CYP450 (Cataliza la oxidación de gran cantidad de sustancias químicas, activa o desactiva muchos fármacos).

• Todas las curvas menos MDBP indicaron que a medida que hay metabolismo de CYP450 se tiene un efecto desintoxicante y es más probable que los compuestos iniciales sean mas tóxicos que los metabolitos.

RESULTADOS(FARMACOS DERIVADOS DE PIPERAZINA INDUCEN A ESTRÉS OXIDATIVO EN

LAS CELULAS PRIMARIAS DE RATAS)

RESULTADOS(FARMACOS DERIVADOS DE PIPERAZINA INDUCEN A ESTRÉS OXIDATIVO EN

LAS CELULAS PRIMARIAS DE RATAS)

RESULTADOS• En las concentraciones de BZP y MDBP hubo una

disminución significativa del GSH (L-g-glutamil-L-cisteinil-glicina teniendo un rol central en la defensa contra el daño oxidativo) y aumenta para BZP los niveles de GSSG (Disulfuro de glutatión que ayuda a proteger a la célula de radicales libres), este resultado concuerda con la generación de especies reactivas ya que el agotamiento de GSH mas alto se observo en MeOPP que también indujo a la más alta formación de especies reactivas.

RESULTADOS(FARMACOS DERIVADOS DE PIPERAZINA INDUCE AL DETERIORO

MITOCONDIRAL Y PERTURBA EL ESTADO ENERGETICO EN HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA)

RESULTADOS((FARMACOS DERIVADOS DE PIPERAZINA INDUCE AL DETERIORO

MITOCONDIRAL Y PERTURBA EL ESTADO ENERGETICO EN HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA)

RESULTADOS• Se observa una disminución del potencial de

membrana mitocondrial en hepatocitos con todos los medicamentos en todas las concentraciones salvo para TFMPP

• El fármaco con mas alto agotamiento de ATP (intercambio de energía, relacionada con la energía celular y regulación del metabolismo)fue MDBP el cual presento la mayor pérdida de potencial de membrana mitocondrial.

RESULTADOS• La activación de las caspasas (son mediadores

esenciales de los procesos de apoptosis, la muerte celular programada) conducen a la apoptosis (es una destrucción o muerte celular programada provocada por ella misma, con el fin de auto controlar su desarrollo y crecimiento).

• Todas las concentraciones de piperazina produjeron un aumento en la actividad caspasa – 3 y la más alta se observo con MDBP y FFMPP presento la más baja activación.

CONCLUSIONES.• El TFMPP fue el mas

potente de las drogas.• En los hepatocitos

primarios de ratas los fármacos derivados de Piperizina inducen a oxidación, perdida del potencial de la membrana mitocondrial, agotamiento de ATP y la activación de la caspasa-3.

• Se demostró por primera vez los efectos hepatotoxicos del diseño de drogas de piperazina In Vitro.

• el modelo mas sensible a la detección de efectos destructores fue el de los hepatocitos primarios de ratas.