La Biología Molecular y el diagnóstico de portadores crónicos

de Trypanosoma cruzi Un enfoque desde el banco de

sangre

Analía Toledano Bioq. Especialista en Hemoterapia e Inmunohematologia Departamento de Hemoterapia e Inmunohematología Hospital de Clínicas - Universidad de Buenos Aires Servicio de Infectologia -Hospital de niños “Ricardo Gutierrez” Cátedra de Microbiologia Clinica- Departamento de Bioquimica Clínica-FFyB-UBA

Enfermedad de Chagas Mazza

• También denominada Tripanosomiasis Americana o Mal de Chagas

• Es una PARASITOSIS

• Es una ZOONOSIS

• zoo(animal) nosis (enfermedad)

• Es ENDEMICA desde México hasta el sur de la República Argentina y Chile

Interés de la profundización en en el estudio de la Enfermedad de Chagas de el Banco de sangre

• 45.000 MUERTES/AÑO Wkly Epidemiol Rec 2000;10-2 . Lancet 03;362:1469-80

• Según cifras estimadas por La Organización Mundial de la Salud de 16 a 18 millones de

personas están infectadas y alrededor de 90 a 100 millones se encuentran en riesgo de adquirir la enfermedad, mientras que el 30% de los infectados desarrollara manifestaciones cardiacas y el 10 % manifestara sintomatología digestiva. World Health Organization. Working to overcome the global impact of neglected tropical diseases. First WHO report on neglected tropical diseases. Ginebra: WHO; 2010.

• Afecta de forma endémica a 21 países de América. WHO Technical report series; 905.Control of Chagas Disease: Second report of the WHO expert committee. 2002

• En Argentina hay regiones denominadas de alto bajo y mediano riesgo vectorial,

como asi tambien de riesgo no vectorial: congénito, transplantes de órganos, transfusiones

• En nuestro Hospital se atienden pacientes provenientes de zonas de riesgo de trasmisión vectorial.

• El banco de sangre sirve como un catastro epidemiolágico y como un punto estratégico para el estudio y caracterización poblacional.

METODOLOGÍAS diagnósticas DISPONIBLES

• MÉTODOS DIRECTOS

• gota gruesa

• Strout

• micrométodo INP

• Hemocultivo

• PCR (en vías de estandarización)

• METODOS INDIRECTOS (serológicos)

• De Tamizaje (ELISA-HAI-IFI-AP)

• Suplementarios (no disponibles)

Fundamento del par serológico Normas para el diagnóstico de la infección chagásica Res MSAL 532/97

“Los antígenos son de composición muy variable y

ninguno alcanza por sí solo el 100% de efectividad

diagnóstica… con 2 reacciones serológicas se puede

alcanzar un rango de sensibilidad del 98-99.5%”

Estrategia de 2 métodos en paralelo

HAI/ELISA

IFI/ELISA

HAI/IFI

Normativas y recomendaciones

• OMS 1991: Par serológico (sensibilidad 98-99.5%)

• Normas MT Mercosur (Res 42/00): Par serológico

• OMS 2002 (WHO-TRS 905; 2002: pp30):

– Tamizaje: 1 método de alta sensibilidad (>99%)

– Diagnóstico: Par serológico

• Argentina:

– Tamizaje y diagnóstico por Par serológico

• Brasil:

– Hasta 2002: Tamizaje y diagnóstico por Par serológico

– Desde 2003: Tamizaje por 1 ELISA

– 2005: Diagnóstico con par serológico

El problema del par serológico en paralelo:

Los resultados indeterminados

• 3% en diagnóstico (Gomes YM y col. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009; 104 (Suppl. I): 115-121)

• 4% en donantes (Otani MM y col. Transfusion. 2009;49(6):1076-82)

• 5% en diagnóstico (WHO Tech Report Series 905, año 2002)

• Estudio multicéntrico del Programa de Calidad de la Provincia de BsAs (año 2004; N = 493):

– 6 reactivos en simultáneo

– Criterio de positividad >3 reactivos positivos:

– Muestras indeterminadas

• por par serológico de rutina (Screening inicial en los centros): 8.9%

• ELISA R + ELISA L: 5.2%

• ELISA L + AP: 6.4%

• ELISA R + AP: 7.8%

• ELISA L + HAI: 7.4%-13.6%

• ELISA R + HAI: 8.7%-14.6%

• Detección precoz en neonatos de madres con serologías reactivas para T. cruzi.

• Detección precoz de reactivaciones en pacientes chagásicos inmunosuprimidos.

• Definición de casos de donantes de sangre con serologías discordantes.

• Herramienta de epidemiología.

• Monitoreo de tratamientos.

BIOLOGIA MOLECULAR Utilidades

“ Optimización de un sistema de detección de la infección por Trypanosoma cruzi para

diagnóstico precoz en neonatos, inmunosuprimidos y donantes de sangre.“

Hospital de Clínicas. U.B.A.

UBACYT CM20

Implementación de una prueba de biología molecular para Trypanosoma cruzi en donantes de sangre con

serología reactiva

Métodos serológicos • Hemoaglutinación indirecta, ELISA ag lisado y ELISA ag

recombinante Métodos moleculares • A la muestras con al menos un resultado de serología reactivo

se les realizaron métodos moleculares (PCR real time y convencional)

• Blancos moleculares: • sat DNA (primers Tcruzi1y Tcruzi2) kDNA (primers 32f y 148r) Tipo de muestras; • Sangre entera con EDTA como anticoagulante Población en estudio • Desde 07/2012 hasta 07/2016 se estudiaron muestras de

17729 candidatos a donantes de sangre

Calle 1: 1 par/ml Calle 2: 0,1 par/ml Calle 3: 0.01 par/ml Calee4: 0.001 par/ml Calle 5 :0.0001 par/ml Calle 6 : CN Calle 7: PM

Banda 180 bp

Gel de poliacrilamida 10%

Blanco sat DNA

1 2 3 4 5 6 PM

Calle 1: 10 par /ml Calle 2: 1 par /ml Calle 3: 0,1 par/ml Calle 5: 0.01 para/ml Calle 6: CN

120bp

Gel de poliacrilamida 10%

Blanco K DNA

1 2 PM 3 4 5 6

Curvas real time

Resultados

• Sensibilidad analítica 0,1 parásitos/ml 0,1 fg de ADN /ml

• Se detectaron 122 donantes(DS) con al menos un resultado de serología reactivo (0,7%)

• 94 de 122 fueron reactivos pos dos o más métodos serológicos (0,53%)

Positivo por 1

TS

Positivo

por 2 TS

Pos por 3

TS

DS (n 122) 28 26 68

% ser reactiva 16,39 21,31 55,7

Resultados

• La prevalencia de ADN de T.cruzi fue de 13,11%( 16/122)

• 12/16 fueron detectables por los dos test de biología molecular( sat ADN y KADN)

• 4/16 fueron detectables por un solo test de bioLogía molecular ( sat ADN o KADN)

BLANCOs moleculares ADN T CRUZI

solo sat + 1

solo kdna + 3

los dos blancos + 12

Total de muestras con pcr

pos 16

Resultados

Donantes con serología Rva PCR T. cruzi +

Test N % N %

HAI+ELIS+EREC 68 55,7 14 20,58

HAI+ELIS 3 2,45 0 0

HAI+EREC 0 0 0 0

ELIS+EREC 23 18,85 0 0

HAI 12 9,83 0

REC 9 7,37 1 11,11

LIS 7 5,73 1 14,28

total 122 16 13,11

87,5%(14/16) de los resultados detectables para ADN de T.cruzi presentaban serología reactiva por tres métodos.

Resultados

• Tabla de resultados de marcadores de Biología molecular según test serológicos reactivos

Test N

ADN sat +

solo ADN sat+ ADN kdna + solo Kadn + ADN sat+kdna +

HAI+ELIS+EREC 14 13 1 13 1 12

HAI+ELIS 0 0 0 0

HAI+EREC 0 0 0 0

ELIS+EREC 0 0 0 0

HAI 0 0 0 0

REC 1 0 1 0

LIS 1 0 1 0

total 16 13 15 13

Resultados • Según el lugar de procedencia

País 1 sero pos 2 sero pos 3 sero pos total pcr pos % pcr pos

Argentina 24 23 44 91 9 9,89

Paraguay 3 2 12 17 6 35,29

Bolivia 0 1 11 12 1 8,33

Brasil 1 0 0 1 0 0

Uruguay 0 1 0 1 0 0

Procedencia 1 sero pos 2 sero pos 3 sero pos total pcr pos % pcr pos Sgo del Estero 4 3 12 19 2 1,,52

Misiones 1 0 3 4 2 50

Buenos aires 10 4 7 20 1 5

Chaco 0 5 6 11 1 9,09

Santa fe 0 1 3 4 1 25

Jujuy 0 0 2 2 1 50

CABA 4 0 3 7 0 0

Tucuman 0 4 2 6 0 0

Salta 0 0 1 1 0 0

Cordoba 0 0 1 1 0 0

Entre Rios 0 1 1 2 0 0

Formosa 0 2 1 3 0 0

Mendoza 0 0 1 1 0 0

La Rioja 0 0 1 1 0 0

desconocido 2 0 1 4 0 0

Corrientes 1 1 0 2 1 0

La pampa 1 0 0 1 0 0

San Juan 1 1 0 2 0 0

total 24 22 45 91 9 0 Argentina

Paraguay

Bolivia Brasil y Uruguay

Resultados

procedencia SRV CRV

n=122 31 87

%

PCRPOS 1 15

SAT 1 12

KDNA 1 14

sat+k 1 11

% PCR + 3,12 17,24

P<0.04521

Según procedencia CON RIESGO VECTORIAL O SIN RIESGO VECTORIAL

Resultados

IFI NEG

IFI

POS TOTAL

ANALIZADOS POR IFI 26 32 58

PCR POS O 8 8

% PCR POS 0 25% 13,79

En un grupo de 58 muestras se realizo Inmunofluorescencia indirecta(IFI)

Estudio de prevalencia de ADN de Trypanosoma cruzi en residentes de áreas con riesgo vectorial y sin riesgo vectorial

• Objetivos: Estudiar marcadores moleculares para Trypanosoma cruzi (TC) en poblaciones con diferente riesgo de trasmisión vectorial (RTV) y serología reactiva para la infección.

Tabla 1:

resultados e DS

Anti TC+ 1 método

n=17

Anti TC+ 2 métodos o más

n=62

TOTAL Anti TC +

n=79

PCR +

(ambas técnicas) 0 9 9

PCR + sólo kDNA 1 0 1

TOTAL PCR + 1 9 10

% PCR + 5.9 14.5 12.7

Tabla 2:

resultados en IR

Anti TC+ 1 método

n=2

Anti TC+ 2 métodos o más

n=20

TOTAL Anti TC +

n=22

PCR +

(ambas técnicas) 0 5 5

PCR + sólo kDNA 0 2 2

PCR+ sólo sat 0 1 1

TOTAL PCR + 0 8 8

%PCR + 0.0 40.0 36,4

Resultados

Toledano AP, Rey R, Gallo Vaulet ML, Fernández Toscano M, Mestre M, Tomeo AJ1, Albornoz , Tapia A, Plebani N, Vellicce AF, Rodríguez Fermepín M, Rey JA.

Estudio de prevalencia de ADN de Trypanosoma cruzi en residentes de áreas con riesgo vectorial y sin riesgo vectorial

• La prevalencia de ADN de T.cruzi fue estadísticamente mayor

en residentes del área con riesgo de transmisión vectorial y podría deberse a la posibilidad de reinfección a diferencia de los que migraron a otras áreas sin vector.

• Las discordancias encontradas entre las dos técnicas de BM justificarían la necesidad de implementar más de un blanco molecular en la detección.

Toledano AP, Rey R, Gallo Vaulet ML, Fernández Toscano M, Mestre M, Tomeo AJ1, Albornoz , Tapia A, Plebani N, Vellicce AF, Rodríguez Fermepín M, Rey JA.

Conclusiones generales

• La presencia de ADN detectada en muestras de donantes con un solo

resultado de serología reactiva justifica y afianza el doble testeo de anticuerpos anti T.cruzi en los bancos de sangre.

• Las discordancias encontradas entre las dos técnicas de BM justificarían la necesidad de implementar más de un blanco molecular en la detección en estas poblaciones.

• La posibilidad de detectar ADN en portadores crónicos permite también la caracterización molecular en unidades discretas de tipificación (UDT)

• La posibilidad de transmisión de infección por transfusión depende de factores de riesgo como la carga parasitaria en el momento de la donación, la cepa de T.cruzi involucrada y la cantidad y tipo de hemocomponente recibido por el paciente. Estos estudios aportan herramientas para una mejor estimación de probabilidad de infección por T.cruzi.

• Nos permite plantear nuevas hipótesis acerca de la infectividad de los hemocomponentes que no presentan pruebas de Biología molecular reactivas para T.cruzi.

Detección de ADN de T. cruzi en pacientes Inmunosuprimidos

Población en estudio:

Se estudiaron muestras de 20 pacientes que presentaban distintos tipos de inmunosupresión y marcadores serológicos reactivos por al menos dos técnicas diferentes

Resultados:

Se pudo detectar la presencia de ADN de T. cruzi en un 20 % (4/20) de los pacientes estudiados.

Ninguno presento manifestaciones clínicas de reactivación.

paciente PA M1 M2 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7

Fecha 06/10/2015 29/10/2015 27/01/2016 15/04/2016 11/04/2016 05/05/2016 12/05/2016 10/06/2016 29/06/2016

Ac anti T.cruzi reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo reactivo

ADN de T.cruzi detectable no

detectable no

detectable no

detectable no

detectable detectable detectable

no detectable

no detectable

PARASITOS/ML 5 p/ml N/A N/A N/A N/A 233 p/ml 1806 p/ml N/A N/A

strout no realizado no realizado no realizado no realizado no realizado no realizado positivo negativo negativo

Paciente inmunosuprimido debido a aplasia medular

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GRACIAS POR SU ATENCIÓN !!!