Jakintza-arloa: Natur Zientziak MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO … · adierazi dugu. Halaber,...

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN

Jakintza-arloa: Natur Zientziak

Egilea: BEÑAT ZALDIBAR ARANBURU Urtea: 2006 Zuzendaria: JUAN ANTONIO MARIGÓMEZ ALLENDE Unibertsitatea: UPV/EHU ISBN: 978-84-8438-190-7

Hitzaurrea Dagoeneko ia bi urte igaro dira tesia aurkeztu nuenetik eta denbora tarte horretan argiak diren zenbait aldaketa nabarmentzen dira. Tesiaren zati teorikoan aipatzen den moduan bi ildo nagusi jorratu dira. Lehendabizi moluskuen eta nagusiki muskuiluen liseri-guruineko zelulen berriztapenaren azterketa burutzen da. Horretarako, gaur egun indarrean dauden zenbait teknika immunohistokimiko erabili dira. Ohikoak eta aski ezagunak ugaztunetan baina zenbait kasutan oraindik ere ornogabeetan guztiz hedatu gabe daudenak (antigorputz espezifikoen faltagatik edota ehunen ezagutza oraindik ere oso sakona ez delako). Bigarren ildoa, moluskuen liseriepitelioan gerta daitezkeen aldaketak ingurumen-osasunaren ebaluaketan erabiltzen diren biomarkatzaileetan nolako eragina duten ikertzea izan da. Biomarkatzaileak antolakuntza maila biologiko sinpleenetan (maila zelular, molekular zein tisularrean) gertatzen diren aldaketak dira eta antolakuntza maila biologiko konplexuagoetan (populazio edo ekosistema) sortaraz daitezkeen alterazioak aurresateko lagungarriak izan daitezke. Ahalik eta erantzun goiztiarragoen bilaketa dela eta, azkenengo urteotan biologia molekularreko tresnak gero eta gehiago nabarmenduz joan dira eta “omics” bezala ezagutzen diren jarduerak (genomics, proteomics, metabonomics…) gero eta pisu zein garrantzi gehiago hartuz joan dira. Egungo biologiaren tendentzia ikusita, zalantzarik gabe gaur berriz ere nire tesiarekin hasiko banintz, tresna molekularren erabilpenak pisu gehiago izango luke. Hau da, zelulen proliferazioa aztertzeko immunohistokimikak egiteaz gain, hau da, proteina jakin bat ehunean lokalizatzeaz gain, proteina hori kodetzen duen RNA mezularia lokalizatzen saiatuko nintzen in situ hibridazioak eginez. Eta, biomarkatzaileen atalari dagokionez, zelula- eta ehun-mailako biomarktzaileak erabiltzeaz gain, ziur aski, maila molekularreko biomarkatzaileren bat ere (gene ezagun baten adierazpen-maila, adibidez) erabiliko nuke. Dena den, ugaztunetan aski garatuak dauden teknologia hauek, ornogabeetan, aldiz, oraindik lehendabiziko urratsak betetzen ari dituzte. Aurretik aipatutako guztia egia bada ere, 2006. urtean Valery Forbes ikertzaileak argitaratutako artikulu batean, gaur egungo biomarkatzaileen erabilpena eta tendentzia (aipatutako “omics” teknologia) zalantzan jartzen ditu. Bertan, biomarkatzaileak, kutsatzaileak nolako mekanismo zelular eta molekularren bitartez eragiten duten ezagutzeko baliogarriak direla esaten du, baina bere izaera prediktiboaren gainean hodei ilun bat ezartzen du. Hori dela eta, ingurumen toxikologian lan egiten dugunoi, epe luzeko esperimentu konplexuak egitera bultzatzen gaitu, beraz, ez dirudi hurrengo urteotan lan falta izango dugunik. Aldaketa klimatikoa ahaztu gabe, noski, baina hori beste historia bat da…

ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO EPITELIOAREN BERRIZTAPEN

ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA INGURUMEN-OSASUNAREN EBALUAKETAN

Beñat Zaldibar AranburuBiologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria

Leioa 2006ko Otsaila

Ikerlan honek hurrengo laguntzak izan ditu:

Euskal Herriko Unibertsitatea (240110) proiektua (1999-2000) etaIkerkuntza-talde kontsolidatuei emandako laguntzak (2001. tik aurrera)

Eusko Jaurlaritza (PI-1999-23) proiektua (2001-2002) eta ETORTEK-BERRILUR proiektua (2004-2005)

ZOOLOGIA ETA ANIMALI ZELULEN BIOLOGIA SAILA

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR ANIMAL

MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO

EPITELIOAREN BERRIZTAPEN

ZELULARRA ETA BERE INPLIKAZIOA

INGURUMEN-OSASUNAREN

EBALUAKETAN

Beñat Zaldibar AranburuBiologian Doktore Gradua lortzeko aurkeztutako memoria

Leioa 2006ko Otsaila

I.- ZATI TEORIKOA.............................................................................................................1

1.- Moluskuen liseri-guruina....................................................................................5

1.1.- Bibalbioak (Mytilus eredua).................................................................5

1.2.- Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua).........................................14

1.3.- Lehorreko gastropodoak (Arion eredua)...........................................171.4.- Liseri-guruinaren plastikotasuna.......................................................21

1.4.1.- Epitelioaren aldaketa morfologikoak..................................211.4.2.- Zelula-moten ordezkapena................................................221.4.3.- Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea.................23

2.- Epitelio-ehunen berriztapena...........................................................................25

2.1.- Epitelioetako zelula amak.................................................................26

2.2.- Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak..........................................272.2.1.- Fluxu-zitometria..................................................................282.2.2.- Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko teknikak..........................................................................................28

3H-timidinaren bitartezko markaketa....................28Bromodeoxiuridina bitartezko markaketa..............29

2.2.3.- Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko teknikak..........................................................................................31

Ki67 antigenoaren immunohistokimika.................31PCNA antigenoaren immunohistokimika...............32Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika.....33Ziklinen immunohistokimika..................................34

2.2.4.- Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko teknikak..........................................................................................34

2.3.- Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak...................................372.3.1.- Ugaztunen epidermisa.......................................................372.3.2.- Ugaztunen hestea..............................................................402.3.3.- Ugatz-guruina.....................................................................422.3.4.- Krustazeoen hepatoarea....................................................45

2.4.- Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak.....472.4.1.- Area....................................................................................472.4.2.- Listu-guruinak.....................................................................492.4.3.- Ugaztunen gibela...............................................................512.4.4.- Moluskuen liseri-guruina....................................................52

II.- AUZIAREN EGOERA, HIPOTESIA ETA HELBURUAK.............................................69

III.- EMAITZAK ETA EZTABAIDA.....................................................................................75

1.- Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean...............................................................................................................77

2.- Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean eta urdailean........................................................................................103

3.- Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak............................................119

4.- Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean.................................................................139

5.- Liseri-zelulen tberriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten pean esperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan.................................163

6.- Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien artean lekuzaldatze-esperimentuak ...............................................................................187

IV.- ONDORIOAK ETA TESIA.........................................................................................217

Lan honetan, estuki erlazionaturiko bi ildo nagusi jorratu dira. Lehenengoanmolusku desberdinen liseri-epitelioko zelulen berriztapena nola burutzen den, eta zelula-mota desberdinen kopurua eta proportzioa nola eta zein faktoreen arabera aldatzen direnaztertu da. Bigarrenean, moluskuen liseri-epitelioaren osaketa zelularrean zenbait faktorekbultzatutako aldaketek, ingurumen-toxikologian erabiltzen diren parametroen gaineannorainoko eragina duten ikertu egin da. Bi ildo horiek, memoria honetan emaitza etaondorioak aurkeztu dituzteneko 6 kapituluetan behin eta berriro uztartuko dira, jorratutakogaiak honako hauek izanik:

1) Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean.

2) Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean eta urdailean.

3) Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi,adin eta erregimen marealari lotutako aldamoldeak.

4) Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littoreamolusku itsastarraren liseri-guruinean.

5) Liseri-zelulen berriztapena kadmio eta kerosenozko nahasketa baten peanesperimentalki jarritako bareen liseri-guruineko epitelioan.

6) Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina biomarkatzaileen gainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabeko tokien arteanlekuzaldatze-esperimentuak.

Zati teorikoa, bere aldetik, bi atal nagusitan antolatuta dago. Lehenengo atalean,ikerlan honetan erabilitako material biologikoa aurkeztu egin da, Mytilus galloprovincialismuskuilu, Littorina littorea magurio eta Arion ater barearen liseri-guruinen biologia zelulareta tisularrari buruz dakizkigun oinarrizko kontzeptuak azalduz, hain zuzen ere. Halaber,beharrezkoa iruditu zaigunean, beste moluskuen espezieen ezaugarriak ere aintzat hartudira, moluskuen liseri-guruinaren azalpen integratu eta konparatua osatzeko asmoz. Orohar, liseri-guruinaren funtzioak eta bere osagai zelularren deskribapena eta funtzioakazaldu dira. Gainera, moluskuen liseri-epitelioa plastikotasun handikoa denez, zelula-moten osaketa ingurumen-faktoreen eraginaren arabera nola eta noraino alda daitekeenadierazi dugu. Halaber, zelula-moten artean nagusiak ohi diren liseri-zelulen lisosomenedukia eta egitura ingurumen-faktoreen arabera ere alda daitekeenez, eta aldaketa horiekingurumen-toxikologian biomarkatzaile gisa erabiltzen direnez, zelula-moten osaketarenaldaketek biomarkatzaileen gainean eduki dezaketen eraginaz ere aritu gara atal honenazken parrafoetan.

Zati Teorikoa

3

Bigarren atalean, epitelio-ehunetan zelulen berriztapena nola eman daitekeenazaltzen saiatu gara, oso laburki izan bada ere. Arestian, zelula amei buruzko zenbaitoinarrizko orokortasunak adierazi dira. Gero, zelulen proliferazioa detektatzeko gaur arteerabilitako metodo ezagunenak azaldu dira. Azkenik, epitelioen berriztapenerakomekanismoen barianteak azaldu dira, hoberen ezagutzen diren zenbait epitelioren kasuendeskribapena emanez. Barianteak, duten estrategia orokorraren arabera bi taldetansailkatu dira: (a) zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioak, eta (b) zelula amenpartehartze zuzena ez duten epitelioak.

Zati teorikoaren ostean, ikerlan honen hipotesia eta helburuak azaldu dira; emaitzeiburuzko 6 kapituluen ostean, tesia eta ondorioak. Bukatzeko, memoria honen azken atala,erabilitako metodo, prozedura eta protokolo nagusiak zehazten dituen Metodologi-Eranskina dugu.

Zati Teorikoa

4

1.- MOLUSKUEN LISERI-GURUINA

Moluskuen liseri-guruina heste ertaineko egitura da, eta elikagaiak xurgatu egitendireneko adarkatutako dibertikuluz osatuta dago. Nahiz eta molusku talde desberdinenartean aldakortasun handia egon, eskuarki organo handia da oso. Dibertikuluetanliseriketa intrazelularra gauzatzen da. Halaber, liseriketa estrazelularrean parte hartzenduten entzima batzuen sintesia ere bertan burutzen da. Oro har, elikagaien liseriketaz gainbestelako hainbat funtzio betetzen ditu, organismoaren eraenketa metabolikoa etahomeostasiaren arduradun nagusia izatea, besteak beste.

Liseri-guruinak, ikerketa esparru desberdinetan interes handia piztu du. Izan ere,animali talde desberdinen liseri-traktuaren eboluzio orokorra ulertu ahal izateko gako-organoa da. Alde batetik, liseriketa intrazelular (berezkoa izaki primitiboetan) etaestrazelularraren (berezkoa izaki eboluzionatuetan) arteko bidegurutze ebolutiboa da.Bestalde, liseri-traktu ertainari asoziaturiko guruin primitiboenetakoa dugu.

Ikerlan honetan zehar erabilitako hiru molusku espezietan liseri-guruinarenantolakuntza morfofuntzionalean hiru eredu desberdin bereiz ditzakegu, zehaztasungehiagoz banan-banan jarraian azalduko direnak.

1.1.- Bibalbioak (Mytilus eredua)

Mytilus galloprovincialis muskuilua bibalbio janari-iragazlea dugu. Iragazibeharreko partikulak, mukiaren bitartez bildu eta ezpai-palpoetarantz, eta ondorenahorantz, garraiatzen dira. Gerora, hestegorri laburra igaro ondoren, iragazitako partikulakkonplexua den urdailera heltzen dira (Salvini-Plawen, 1988). Behin urdailean, partikulakestilo kristalinoaren eraginaren ondorioz birrindu egiten dira, urdailean dauden entzimahidrolitikoek lehendabiziko liseriketa estrazelularra burutuz. Urdaila traktu ziliatudesberdinetan banatuta dago. Bertan, partikulak euren tamainaren arabera sailkatu etabanandu ondoren, liseri-guruineko dibertikuluetarantz bideratzen dira, liseri-konduktuensistematik. Liseri-konduktu primarioak urdailetik abiatzen dira, eta beraietatik adarkatzendiren kalibre txikiagoko liseri-konduktu sekundarioak liseri-guruineko dibertikuluetarairisten dira (Morton, 1983).

Liseri-guruina, anatomikoki bereizgarriak diren bi lobuluz osatuta dago,ezkerraldekoa eta eskubialdekoa, hain zuzen (Owen, 1966). Antolakuntza histologikoaridagokionez, hierarkizatutako antolakuntza lobularra ere antzeman da (1. Ird.; Basalo,

Moluskuen liseri-guruina

5

1998). Ehun konektibo dentsozko kapsula liseri-guruinaren bi lobuluak inguratzen ditu.Kapsula horrek loditze-gune nabarmen batzuk agertzen ditu, zeintzuetatik urdailaenkapsulatzen duen ehun konektibo dentsozko kapsularekin bat egin arte trenkadasendoak proiektatzen baitira. Horrela, dibertikuluen multzoak trenkada sendoen arteanmurgilduta agertu dira (lobulutxo primarioak). Lobulutxo primario bakoitza konduktuprimario baten inguruan antolatuta dago. Lobulutxo primarioen barruan ehun konektibozkoxaflek inguratutako lobulutxo sekundarioen taldekapenak bereizi dira. Horrela lobulutxosekundario bakoitzean 5-10 dibertikulu daude, konduktu sekundario berari lotuta daudenak(Basalo, 1998). Urdaila zein konduktu primarioen inguruan muskulu leuna dago; konduktusekundario eta dibertikuluetan, ordea, gero eta muskulu gutxiago agertzen da. Izatez,dibertikuluetan ez da muskulu leunaren zantzu esangarririk aurkitu (Basalo, 1998).

Gaur egun molusku bibalbioentzat onartuta dagoen liseri-guruinaren ereduaMortonek proposatu zuen 1983. urtean. Eredu horren arabera, liseri-guruina, urdailetikabiatutako konduktu (primario eta sekundario) adarkatuen bitartez konektaturik dauden

Zati Teorikoa

6

1. Irudia: Masson-Golder tindaketatrikromikoaz tindatutako muskuiluaren liseri-guruinaren ebakien irudiak. (A) Muskulu-ehun etaehun konektibozko trenkada bat ikus daiteke. Geziestuek muskulu-zelulak adierazten dituzte. Gezilodiek trenkadaren zatirik zabalena adieraztendute. Izarrek, ehun konektibotan joriak direntrenkadaren zatirik estuenak adierazten dituzte. (B)eta (C) irudiek lagin baten gune beretsuanmikrometro batzuen distantzian hartutako bi ebakinerakusten dituzte. Geziek trenkadak adieraztendituzte. Eskala-marra: 100 μm. (Basalo-tik (1998)hartua).

tubulu itsuz osaturik dago (2. Ird.). Dena den, ebakien gainean interpretazioak egiterakoaneredu tubular honek zenbait arazo sortu ditu. Tubuluak oso adarkatuta baldin baleude, osoluzeak ez balira behintzat, ukondo eta bihurguneen hainbat irudi behatuko liratekeebakietan, eta irudi hauek, berriz, urriak dira. Halaber, tubuluak oso adarkatuta ez baldinbaleude (Salvini-Plawen, 1988), konduktuak oso handiak izan beharko lirateke, etaebakietan agertzen diren konduktuen ebakidurak, berriz, urriak dira. Azkenik, konduktu etatubuluen arteko loturen bi dimentsiotako irudi eskematikoak plazaratu diren arren (Owen,1966; Salvini-Plawen, 1988; Beninger & LePennec, 1991), eskema horiek 3-dimentsiotako(3-D) antolakuntza espaziala ezin dute argiro azaldu. Gainera, liseri-dibertikuluetanematen den fluidoen sarrera- eta irteera-prozesuak eta liseriketa intrazelularrerakodibertikuluen epitelio-zeluletan ematen diren xurgapen-, jariapen- eta iraizpen-prozesukoordinatuak nekez azaldu daitezke eredu tubular honen arabera.

Aitzitik, 3-D berreraiketak eginez, muskuiluen liseri-guruinean unitatemorfofuntzionala liseri-albeoloa dela frogatu da (3. Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b;Quincoces, 1995; Lekube, 1997). Liseri-albeoloak, konduktu sekundariotik irekitzen dira,


7

2. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako muskuiluaren liseri-guruinaren ebakinen irudiak. (A) Liseri-guruinarenikuspegi orokorra, bertan (K) liseri-konduktuak, (G) liseri-albeoloen ganbarak eta (A) ehatz itxurako luzakinak bereizdaitezke. Ehun konektiboak liseri-egiturak inguratzen ditu. (B) Hatz itxurako luzakin baten soslaia xehetasun gehiagozikusten da. Bertan liseri-zelulak (LZ), eta zelula basofilikoak (ZB) bereiz daitezke.

Zati Teorikoa

8

3. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-albeoloen plastikotasunaren irudi adierazgarriak. (A) 3D-berreraiketaz lortutako unitate morfofuntzionalaren 3D-modeloa. Bertan konduktua, ganbara eta bertatik ateratzendiren behatz itxurako proiekzioak (zenbakiekin adieraziak) bereizi daitezke. Ikus behatz itxurako proiekzioen tamainaitsasaldi-erregimenaren arabera nola aldatzen den (A-1, marearteko muskuilua; A-2 mareazpiko muskuilua). (B)Liseri-albeoloen morfologia eta tamainaren aldaketak ingurumen-baldintzen arabera. Estres peko egoeretanalbeoloen bolumenaren proportziorik handiena ganbarari dagokio, tendentzia hori estres egoera gogortzen denheinean (gezia) markatuagoa agertzen delarik. (C) Liseriketa-faseak zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzenhartzen duten zentzua (gezia). Zati distalean proiekzioak nagusiki atseden-fasean aurkitzen dira eta ganbara-aldeanberriztapen-fasean, berriz.

eta, Mortonen ereduko liseri-tubuluak ez bezala, estrukturalki konplexuak dira. Konduktutikgertuen dagoen albeoloaren zatia zabalduta agertzen da (ganbara) eta bertatik behatzitxurako luzakin tubularrak (4-10 proiekzio) proiektatzen dira. Zenbait kasutan, luzakinhoriek alde distalean banatuta egon daitezke, eta konduktu sekundario eta ganbararenartean estugunea (lepoa) ere ager daiteke. Ganbara zapalduta dago, eta bere dimentsioriktxikienean ez da behatz-itxurako luzakinen kalibrea baino handiagoa. Hori dela eta,tubuluen ukondo edo adarkatze-gune moduan interpretatu da hainbat lanetan, eta zenbaitkasutan ere gemazio bidez agertutako tubulu berrien sorgune gisa (Palmer, 1979). 3-Dberreraiketak emandako ikuspegi berri hori, kriohausturaz lortutako laginak ekorkuntzazkomikroskopio elektronikoan aztertuz egiaztatu egin da (Basalo, 1998) (4. Ird.).

Aipatutako albeoloen deskribapena muskuiluen kasuan indibiduo helduentzatbaliagarria da, baina muskuilu gazteetan (maskorraren luzera <1 cm) liseri-albeoloadesberdina da oso. Ganbarak oso zabalak dira, eta bertatik dozenaka behatz-itxurakoluzakin ateratzen dira. Dirudienez, muskuilu gazteen liseri-guruinean unitatemorfofuntzional horien kopurua txikia izango litzateke, eta zenbait kasutan konduktuprimario bakoitzetik unitate bakarra aterako litzateke (Lekube, 1997).


9

4. Irudia: Muskuiluen liseri-guruinaren eredu albeolotubularraren irudi eskematikoa (V. Asensioren kortesiaz)

Liseri-albeoloen epitelioan nagusiki 2 zelula-mota aurkitu dira, liseri-zelulak etazelula basofilikoak (Owen, 1972) (2. eta 5. Ird.).

Liseri-zelulak (5. eta 6. Ird.) azidofilikoak dira. Itxurari dagokionez prismatikoak dira,baina kubikoak ere izan daitezke. Erpinaldea, mikrobiloxkez hornituta dago. Mikrobiloxkenkopurua eta garapena oso aldakorra da, zelulen egoera metabolikoaren arabera

Zati Teorikoa

10

6. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako Mytilus galloprovincialis muskuiluaren (A) liseri-zelula (handipena x6000) eta (B) zelula basofilikoaren (handipena x9000) irudiak. Liseri-zelulan sistemaendolisosomiko garatua argiro beha daiteke. (N) nukleoa, (M) muskulua, (BL) xafla basala, (RB) hondakin-gorputza,(HL) heterolisosoma, (HP) heterofagosoma, (JC) lotura-konplexua. Zelula basofilikoa, ordea, elektrodentsoagoa daeta erretikulu endoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatua ditu. (N) nukleoa, (GC) Golgi-konplexua, (CT)ehun konektiboa (LF) lipofuszina. (Cajaraville-tik(1989) birmoldatua).

5. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren ultrastrukturaren irudi eskematikoa. (A) Liseri-zelularen sistemaendo-lisosomiko garatuaren osagaiak bereiz daitezke. (B) Zelula basofikoaren soslaia piramidala da, eta erretikuendoplasmatiko pikortsua eta Golgi sistema oso garatuak ditu. (Owen-tik (1973) birmoldatua).

(Cajaraville et al., 1991). Zelula hauek, sistema endo-lisosomiko oso garatua dute,liseriketa intrazelularra beraien funtziorik nagusiena delako (Robledo & Cajaraville, 1996).Alboetako eta oinaldeko mintzek interdigitazio eta inbaginazioak erakusten dituzte.Endozitosi-besikula, heterofagosoma, heterolisosoma, eta hondakin-gorputz ugari daude.Endozitosi-besikulak mikrobiloxkekin erlazionaturik agertzen dira, zelularen erpinaldean(Owen, 1970; Pal, 1972; Henry et al., 1991). Heterofagosomak, besikula erregularrak etatamaina aldakorrekoak dira, eta, orokorrean, hauek ere erpinaldean deskribatu dira (Owen,1973). Heterolisosomak, zelularen erdialdean agertzen dira, heterofagosomak bainohandiagoak eta esferikoak dira, eta beraien barneko materiala oso heterogeneoa da.Azkenik, hondakin-gorputzak zelularen oinaldean agertzen dira. Hondakin-gorputz horiekargira askatzen dira, konduktu primario eta sekundarioen argietan ere aurkitu direlarik(Cajaraville, 1989).

Zelula-basofilikoak (5. eta 6. Ird), liseri-zelulak baino kopuru txikiagotan agertzendira liseri-hodietan. Itxura piramidala dute, eta erpinaldean mikrobiloxkak dituzte. Mintzak,oinaldean zein alboetan, inbaginazio txikiak ditu. Zelula hauen ezaugarri garrantzitsuenabasofilia da, duten erretikulu endoplasmatiko pikortsu ugaria dela eta (Henry, 1987).Horretaz gain, Golgi aparatua ere oso garatua dute. Nukleoa orokorrean zelularenoinaldean agertzen da. Autore batzuk, bigarren zelula basofiliko bat deskribatu dute,Cardium edule (Owen, 1970) edo Mytilus edulis (Thompson et al., 1974) moluskuetan.Bigarren zelula basofiliko hori, flagelatua omen da.

Bibalbioen liseri-epitelioaren morfologia aldakorra da, izan ere liseriketa prozesuaziklikoa eta dinamikoa denez, aurrera doan heinean liseri-albeoloen epitelioek liseriketa-fase desberdinei dagozkien itxura desberdinak erakusten dituzte (7. Ird., Langton, 1975;Robinson & Langton, 1980; Morton, 1983): (a) I mota edo atseden-fasea; (b) II mota edoxurgatze-fasea, (c) III mota edo desegite-fasea; eta (d) IV mota edo berregite-fasea.

Prozesuaren koordinazioa dela eta, eredu tubularrean oinarrituta moluskubibalbioen artean klasikoki bi motatako liseriketa-jarduera bereiztu dira: monofasikoa etabifasikoa. Liseriketa monofasikoan, liseri-guruinean tubulu-mota bakarra izango litzatekenagusi une bakoitzean, fotoperiodo edo eta itsasaldiaren arabera. Jarduera-mota horiDreissena polymorpha, Cardium edule, Ostrea edulis eta Scrobicularia plana espezieetandeskribatu da (Morton, 1969; 1970; 1971; Owen, 1972). Liseriketa monofasikoan liseriketa-ziklo bakoitzean, hau da, itsasaldi-ziklo bakoitzean, II motako tubuluek, I motako tubuluakordezkatzen dituzte, eta amaieran III motako tubuluak dira nagusi. Liseriketa bifasikoan,ordea, aldi berean bi tubulu-mota nagusituko lirateke. Prozesu hau Lasaea rubra, Cardiumedule eta Ostrea edulis espezieetan deskribatu da (McQuiston, 1969; Owen, 1972). Kasu


11

horretan, III motako tubuluen proportzioa liseriketa prozesuan zehar konstante mantentzenda, eta I eta II motako tubuluen artean txandakatzea suertatzen da itsasaldi-zikloan zehar(McQuiston, 1969). Edozein modutan, tubulu guztietara elikagaia aldi berean, neurriberean eta konposizio berarekin heltzen ez denez, liseri-guruinean 4 liseriketa-faseak(tubulu-motak) bereiz daitezke aldi berean, proportzio oso desberdinetan bada ere(McQuiston, 1969; Robinson & Langton, 1980; Robinson, 1983).

Lau tubulu-moten existentzian oinarrituz, liseriketa intrazelularra azaltzeko teoriabat plazaratu zen (Morton, 1983; Henry, 1987; Beninger & Le Pennec, 1991). Elikagaiakheldu bitartean, tubuluak atseden-fasean egongo ziren. Elikagaiak tubuluetarairisterakoan, liseri-zelulek elikagaiak xurgatuko lituzkete (xurgatze-fasea), eta liseriketabukatzearekin batera zelula asko deuseztatuko ziren (desegite-fasea). Azkenik, hurrengoliseriketa-zikloari ekin ahal izateko, epitelioa zelula berriez hornituko zen (berregite-fasea). Teoria horren arabera, liseriketa-zikloa eta epitelioaren berriztapen-zikloa koordinaturikegongo ziren (Morton, 1983), eta zelulen berriztapen masiboa ordu gutxitako epeansuertatu beharko zen. Hau da, liseri-epitelioan zelulen berriztapen-maila izugarri handiaizan beharko litzateke, eta liseri-tubuluetako epitelioa partzialki (liseriketa difasikoa) edoguztiz (liseriketa monofasikoa) berriztatua izango litzateke elikatze-ziklo bakoitzeko,etengabe. Aitzitik, epitelio-zelulen zatiketa ez da batere konspikuoa liseri-epitelioan(Marigómez et al., 1998a).

Zati Teorikoa

12

7. Irudia: Liseriketa prozesuan zehar muskuiluenliseri-epitelioak hartzen dituen morfologia desberdinak.(A) Atseden-fasea, (B) Xurgatze-fasea, (C) Desegite-fasea (D) Berregite-fasea. (Langton-tik (1975)birmoldatua).

Eredu albeolarra aintzat hartzean, tubulu-moten existentziaren eta eurentxandakatze-ereduaren esangura fisiologikoa oso bestelakoa dela frogatu da. Izan ere, M.galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinean egindako 3-D berreraiketek, liseriketa-faseak zati distaletatik ganbara-alderaino bidaiatzen duten eta albeolo bereko luzakinetanzehar modu sinkronikoan aurrera egiten duten uhinen moduan agertzen direla erakutsidute (3C Ird.; Marigómez et al., 1995a; 1995b). Hau da, luzakinen zati distalen epitelioanatseden-fasea nagusitzen den bitartean, hurrengo lakainetan xurgatze- eta desegite-fasetxandakatuak agertzen dira, ustezko berregite-fasea ganbara-alderantz nagusituz doalarik(Quincoces, 1995). Bestalde, entzima- eta lektina-histokimika, eta morfometria aplikatuz,liseri-zelulen ezaugarrietan oinarritutako liseriketa-faseen esangura fisiologikoa berraztertu


13

8. Irudia: ß-Glukuronidasa entzimaren (A) eta WGA lektinaren bidezko N-azetil glukosamina hondarren (B)detektapen histokimikoa liseri-guruineko epitelioan liseriketa-fase desberdinetan. Sailkapen “klasikoaren” arabera: A-1/B-1 atseden-fasea izango litzateke, A-2/B-2 xurgatze-fasea, A-3/B-3 desegite-fasea eta A-4/B-4 berregite-fasea.Jarduera entzimatiko eta lektinen emaitzen arabera, liseriketa-faseen sailkapena aldatu beharko litzateke. Atseden-fasea, xurgatze-fasea izan beharko litzateke (WGA marka bortitza epitelioaren erpinaldean (B-1)), xurgatze-fasea,liseritze-fasea (entzimaren jarduera nabarmena eta WGA markaketa lisosometan (A-2 eta B-2)), desegite-fasea,liseritze-fase berantiarra (oso lisosoma handiak (A-3)) eta berregite-fasea, atseden-fasea (lisosoma txiki eta urriak etaWGA markaketa difuso eta ahula epitelioan zehar barreiatuta (A-4 eta B-4)).

da (8. Ird., Marigómez, argitaratu gabe). Berregite-fase "klasikoa" delakoa seguruenikatseden-faseari legokioke, liseri-zeluletan lisosoma urriak izanik, ezaugarri histokimikoekhori adierazi baitute. Izan ere, marearteko muskuiluak uretatik kanpo nahiko denbora igaroondoren (hau da, elikatzerik ez dutenean), IV-motako tubuluen morfologia nagusitzen da(Cajaraville et al., 1991; 1992). Halaber, datu berriek mantentze-fase "klasikoa" xurgapen-faseari legokiokeela erakutsi dute, eta desegite-fase delakoan dauden albeoloakxurgapen-fase berantiarrari edo liseriketa intrazelularraren fase aurreratuari legozkieke(Marigómez, argitaratu gabe). Interpretazio berri honetan, epitelioaren berriztapena inolazere kontuan hartu ez dena azpimarratzekoa da.

1.2.- Gastropodo itsastarrak (Littorina eredua)

Prosobrankio itsastarretan, urdailetik atera ostean elikagaia liseri-guruinera heltzenda. Liseri-guruina, gonadarekin batera agertzen da, liseri-gurina/gonada konplexuaizeneko organoa osatuz (9. Ird.). Liseri-guruinak normalean erraien parterik handiena

Zati Teorikoa

14

9. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako magurioaren liseri-guruina/gonada konplexuaren ebakinen irudiak.(A)Ikuspegi orokorra, bertan liseri-gurineko dibertikuluak eta gonada-folikuluak tartekatuak ikus daitezke.(B) Liseri-azinobaten soslaia xehetasun gehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ) eta zelula basofilikoak (ZB) bereizi daitezke.

betetzen du; ugalketa garaian izan ezik, noiz gonadaren tamaina asko emendatzen baita.Hala ere, liseri-guruinean tamaina desberdineko 2 lobulu bereiz daitezke, orokorreanezkerreko lobulua handiagoa delarik. Urdaileko aurrealdera 3 konduktu labur etaadarkatugabez lotuta dago liseri-guruina. Liseri-guruina hainbat azino adarkatuez osatutadago (Fretter & Graham, 1962), eta bertan elikagaien xurgapena eta liseriketa zeinhondakinen andeatzea eta iraiztea burutzen dira (Merdsoy & Farley, 1973). Prosobrankioitsastarren liseri-guruinean oinarrizko bi zelula-mota daude, liseri-zelula eta zelulabasofilikoa, alegia (10. Ird.).

Liseri-zelula, (syn., guruin-zelula, xurgapen-zelula, zelula hepatiko, gibel-zelula,bakuolo-zelula, zelula jariatzaile) kolumnarra da, eta erpinaldean mikrobiloxka ugari etaproteinetan joriak diren pikor zitoplasmatikoak dauzka (Lufty & Demian, 1967; Mason1983; Voltzow, 1994). Oinaldean, zenbaitetan errefringentea izan daitekeen edukiheterogeneoa duten besikulak agertzen dira. Tamaina txikiko nukleoa, orokorreanerdialdean edo oinaldean kokatzen da. Zelula-mota honen zeregin nagusia liseriketaintrazelularra burutzea da (Voltzow, 1994).


15

10. Irudia: Liseri-zelula eta zelula basofilikoaren irudi eskematikoak. (A) Zelula basofikoaren soslai piramidala etaerretiku endoplasmatiko garatua ikus daitezke, beste organuluekin batera. (B) Liseri-zelula egitura kolumnarra daukaeta morfologia desberdinak har ditzake liseriketa fasearen arabera. (cl), zilioa; (cr), zilioaren gorputz basala; (mv),mikrobiloxkak; (ps), proteinazko jariapen-pikorrak; (cy), zitosola; (gr), pikor mineralizatuak; (rer), erretikuluendoplasmatiko pikortsua; (mi), mitokondrioa; (sv), iraizte-pikorra (gb), diktiosoma; (lin), tolesdura laterala; (nu),nukleoa; (nue), nukleoloa; (bin), tolesdura basala; (bl), xafla-basala; (m), muskulua; (hae), hemozianina; (lu), lumena;(dv), liseri-bakuoloa; (li), lipidoa, (pv), pinozitosi pikorra; (rb), hondakin-gorputza. (Mason-etik (1983) hartua).

Zelula basofilikoa, (syn., zelula jariatzailea, kripta-zelula, iraizte-zelula, hartzitze-zelula) liseri-zelula baino urriagoa da (Lufty & Demian, 1967; Mason 1983; Voltzow, 1994).Hematoxilina-eosinaz tindatzerakoan, zitoplasma liseri-zelularena baino askozbasofilikoagoa suertatzen da, izena hortik datorkiolarik. Itxura piramidala edo konokaraizanik, banaka zein 3-4 zeluletako multzoetan ager daiteke, askotan liseri-tubuluen ertzperiferikoei asoziatuta. Nukleolo oso nabarmena daukan nukleo handia ageri da oinaldean.Erretikulu endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta nukleoaren inguruan kokatzenda. Bestalde, mintz-pikor zitoplasmatikoen presentzia nabarmena da. Batez ereerpinaldean dauden pikor batzuk oso elektrodentsoak dira, eta seguruenik jariapen-proteinez osatuta daude. Oinalderagontz sakabanaturik dauden beste pikorretan, ordea,fosfato kaltzikoa dugu osagai nagusi (Mason, 1983; Marigómez et al., 1990). Zelulabasofilikoek, kaltzioaren garraioan eta metaketan parte hartzen dute, eta liseriketaestrazelularrerako entzimak jariatzen dituzte (Owen, 1956; Fretter & Graham, 1962;Merdsoy & Farley, 1973; Mason, 1983).

Magurioen liseri-guruinean, nahiz eta muskuiluetan deskribatzen diren "tubulu-mota" desberdinak ez agertu, liseri-zelulen pikorren kopuru eta morfologiaren araberaliseriketa-prozesuarekin erlazionatutako 3 edo 4 fase bereiztu dira (11. Ird., Sáez et al.,1990). Xurgapen-fasean pikor eosinofilikoak agertzen dira erpinaldeko ertzean, eta apurbat beherago purpura kolorea hartzen duten pikor ilunak. Liseriketa-fase goiztiarrean

Zati Teorikoa

16

11. Irudia: Liseri-zelulek liserike-fase desberdinetan erakusten dituzten morfologia desberdinen irudi eskematikoa.(A) Xurgatze-fasea. Bertan zelularen erpinaldean pikor eosinofilikoak agertzen dira, eta euren azpian pikor ilun etatxikiagoak agertzen dira. (B) Liseriketa-fase goiztiarra. Pikor eosinofilikoak erpinaldean ageri dira eta pikor ilunakoinalderantz zabaltzen dira. (C) Liseriketa-fase berantiarra. Erpinaldean pikor eosinofilikoek darraite eta oinaldeanpikor ilunekin batera lipofuszinen antzeko pikor horiak ageri dira. Pikor horiok fase honen karakteristikoak dira. (D)Iraizte-fasea. Erpinaldean urriak diren pikor eosinofilikoak zenbait kasutan bakuoloen barruan ageri dira. Lipofuszinenantzeko pikorrak oso nabarmenak dira (Sáez et al.-etik (1990) hartuta).

aipatutako pikor ilunagoak zelula osoan zehar barreiaturik agertzen dira. Liseriketa-faseberantiarrean, pikor ilunetaz gain lipofuszinen antzeko pikor horiak oinaldeannabarmentzen hasten dira (Sáez et al., 1990). Azkenik, iraizte-fasean pikor gutxiagoagertzen dira, eta bakuolo txikien zein lipofuszina-pikorren presentzia nabaria da. Prozesuhori, itsasaldien erregimenarekin estuki erlazionatuta dago. Izan ere, liseriketa batez ereitsasbeherako egoeretan gauzatzen da (Sáez et al., 1990).

1.3.- Lehorreko gastropodoak (Arion eredua)

Arion ater barearen liseri-guruina gorputzaren atal handia betetzen du, etaanatomikoki bereizgarriak diren bi guruin-zatitan bananduta dago: aurreko guruin-zatia,normalean txikiena, eta atzeko guruin-zatia. Bi guruin-zati horiek, papoarekin (aurrekoguruin-zatia) eta urdailarekin (atzeko guruin-zatia) bi konduktu bereizien bitartezkomunikatuta daude (Roach, 1968). Guruin-zati horiek, aurrekoa zein atzekoa, hainbatlobulutan daude bananduta (12. Ird., Runham & Hunter, 1970). Lobulu bakoitza,adarkatuak zein multzoka agertzen diren hainbat dibertikuluz osatuta dago. Liseri-dibertikuluak unitate adenomerikoz daude osaturik. Unitate adenomerikoan (13. Ird.), liseri-konduktu izeneko gune zentral zabala dago, eta bertatik azino-itxurako zabalguneakadarkatzen dira (liseri-azinoak).


17

12. Irudia: Arion ater barearen liseri-sistemaren irudi eskematikoa. Bertan elikagaien liseriketan parte hartzenduten organo desberdinak ageri dira eta liseri-guruinaren izaera lobularra bereiz daiteke. (Argaud & Bounoure-tik(1910) birmoldatua).

Liseri-konduktuen zein liseri-azinoen epitelioak berdintsuak dira, eta zelula-motaberdinez osatuta daude (13. eta 14. Ird.). Liseri-konduktuak kalibre txikiko iraizte-kanalizeneko konduktuetara irekitzen dira, gerora papo zein urdailarekin konektatzen dutenkonduktuetara zabaltzen direnak. Iraizte-kanalen epitelioa ziliatua da. Zilioen mugimendueiesker elikagaiak liseri-konduktuetatik kanporantz bultzatzen dira. Bestalde, liseri-guruinaren konduktuen inguruan ehun konektibo eta muskulu-ehun oso garatuak daude.Muskulu horrek, urdaileko uzkurketekin batera, elikagaiak liseri-guruinerantz barneratzendituelarik (Walker, 1972; Luchtel et al., 1997).

Liseri-azino eta -konduktuen epitelioan 3 zelula-mota deskribatu dira: liseri-zelula,iraizte-zelula eta kaltzio-zelula (Walker, 1969; Moya, 1973; Babula & Wielinska, 1988) (15.eta 16. Ird.). Autore batzuen arabera, laugarren zelula-mota bat ere egongo litzateke, estuaeta desberdintzatu gabea, Deroceras reticulatum barearen kasuan beste 3 zelula-motenaitzindaritzat jo dena (Walker, 1972). Aitzitik, Walker-en (1971) arabera, liseri-zelula iraizte-zelula bilaka liteke. Izan ere, beste autore batzuek ere, iraizte-zelulak liseri-zelula helduedo zaharkitutzat hartu dituzte (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002).

Liseri-zelula kolumnarra da (35-40 μm-ko altuera). Erpinaldean mikrobiloxkak etaendozitosi-besikulak agertzen ditu. Bertan, lisosomak ere aurkitu dira (Bowen, 1970;Triebskorn, 1991), endozitosi-besikulekin fusionatuz gero fagolisosomak ematendituztenak. Fagolisosomek, zenbait tindaketaz kolore berdea hartzen dute, eta horregatikgreen granules (pikor berde) izena eman zaie. Erpinaldeko pikor berde horietan elikagaien

Zati Teorikoa

18

13. Irudia: Liseri-konduktu eta liseri-albeoloen irudi eskematikoa. Bertan egituralobulatuak eta liseri-guruinaren osagaidesberdinak ikus daitezke. 1.- Iraizte-kanala, 2.-Iraizte-kanalaren epitelioa, 3.- Kapilarea, 4.-Kapilarearen zeharkako sekzioa, 5.-Kapilarearen ebakidura ukondo baten altueran,6.- Liseri-konduktu bati atxikitutako eta hainbatazinoz inguratutako kapilarea, 7.- Liseri-konduktua 8.- Aktibo dagoen epitelioaren irudieskematikoa, 9.- Inaktibo dagoen epitelioarenirudi eskematikoa, 10.- Azinoen gainazalekoikuspegi orokorra (Marigómez).

eskurapena eta liseriketa burutzen dira. Oinalderagontz askoz handiagoak diren etaliseriketaren hondakinak diren lipofuszinez osatuta dauden yellow granules (pikor hori)agertzen dira (Walker, 1972). Nukleoa oinaldean kokaturik dago, eta bere inguruanerretikulu endoplasmatikoa, Golgi aparatua eta zenbait kasutan glukogenoa eta lipido-tantak ere agertzen dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Ezaugarriutrastruktural berezia manosoma izeneko mintz-egitura dugu (Baumforth et al., 1998).Manosomek, sei hodiko errosetatan antolatuta daude, eta hornidura entzimatikoaespezifikoa (manitol oxidasa) dute (Moya & Rallo, 1975; Czarna et al., 1985; Baumforth etal., 1998). Dirudienez, manosomak gastropodo lurtarren liseri-zeluletan arruntak dira(David & Götze, 1963). Oinaldeko zitoplasman, ioi-garraioarekin erlazionatutako fosfatasaalkalino jarduera behatu da (Bowen & Davies, 1971). Liseri-zelulek liseriketa-prozesuanzehar itxura desberdina erakutsi dezakete, altueraz zein mikrobiloxken eta pikorzitoplasmatikoen kopurua aldatuz (Sumner, 1965).

Kaltzio-zelulak (syn., kripta-zelula; zelula jariatzailea) itxura piramidala dutenzelulak dira (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Erpinaldean mikrobiloxkak dituzte,


19

14. Irudia: Hematoxilina-eosinaz tindatutako barearen liseri-guruinaren ebakien irudiak. (A) Liseri-guruinarenikuspegi orokorra, bertan liseri-azino (A) eta -konduktuak (K) ikus daitezke. (B) Liseri-azino baten soslaia detailegehiagoz beha daiteke. Bertan liseri-zelulak (LZ) , iraizte-zelulak (IZ) eta kaltzio-zelulak (KZ) bereizi daitezke.

eta horien azpian mitokondrioak, erretikulu endoplasmatiko leuna eta hainbat besikulapleomorfiko agertzen dira. Zelularen erdialdean proteinetan joriak diren besikulak paraturikdaude. Oinaldean, nabarmenki handia den nukleoa aurkitu da. Lipido-tantak xaflabasalaren gaineko zitoplasmaren eremuan ager daitezke. Zelulan zehar materialheterogeneoa duten pikor biribilak ageri dira tipikoki. Pikor horiek, geruza kontzentrikozparatutako matrizea dute, X-izpien mikroanalisia eta beste metodoen bitartez, behintzatHelix aspersa barraskilo eta Arion rufus barearen kasuetan frogatu denez, kaltzio,

Zati Teorikoa

20

16. Irudia: Transmisiozko mikroskopio elektroniko bidez lortutako bareen (A) liseri-zelula (handipena x 2500), (B)kaltzio-zelula (handipena x31400) eta (C) iraizte-zelularen (handipena x3500) irudiak. Liseri-zelulan sistema endo-lisosomiko garatua beha daiteke. Kaltzio-zelulan, pikorren geruza kontzentrikoak bereiz daitezke. Iraizte-zelularenerpinaldean dagoen bakuolo handian izaera desberdineko pikorrak ikus daitezke. (Luchtel et al-tik (1997)birmoldatua).

15. Irudia: Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelularen (A) eta (B) Liseri-zelularen egitura kolumnarra etasistema endo-lisosomiko garatua bereiz daiteke. (C) Kaltzio-zelularen soslaia piramidala da eta kaltzio pikorrak errezbereiz daitezke. (D) Iraizte-zelularen bakuolo handia da zelula-mota honen egiturarik bereizgarriena. (Walker-tik(1972) birmoldatua).

magnesio eta fosforoz (CaMgP2O7 moduan) osatuta dagoena (Howard et al., 1981; Mason& Simkiss, 1982; Janssen, 1985). Horregatik, pikor horiei kaltzio-esferula izena eman zaie,eta zelulei kaltzio-zelularena. Hala ere, beste zenbait elementu ere badaudela egiaztatuda, manganesoa, burdina, kobaltoa eta zinka, besteak beste (Simkiss, 1981; Mason &Simkiss, 1982, Recio et al., 1988). Kaltzio-zelularen funtzioari dagokionez, proposamenezberdinak plazaratu dira. Ikertzaile batzuen arabera, barne-medioaren pH-a orekatzekoindargetzaile gisa funtzionatuko luke kaltzioak (Krigjsman, 1928). Beste autore batzuenaburuz, kaltzio-zelulek metabolismo orokorrean eta muki-ekoizpenean ezinbestekoa denkaltzio kantitate handien biltegi gisa funtzionatuko lukete (Walker, 1971).

Iraizte-zelulek erpinaldean mikrobiloxka ugari dituzte, eta hauen azpian hainbatpikor eta mitokondrio, erretikulu endoplasmatikoa eta diktiosomak. Hala ere, zelula hauenezaugarririk deigarriena zelularen bolumen gehiena betetzera irits daitekeen bakuolohandia da (Sumner, 1969; Walker 1969; Moya, 1973). Bakuoloaren edukina heterogeneoada, eta batez ere lipofuszinez osatuta dago. Lehen aipatu den bezala, autore batzuenarabera, iraizte-zelulak liseri-zeluletatik eratorriak izan litezke (Walker, 1971), afera horioraindik ere eztabaidan dagoen arren (Dimitriadis & Konstantinidou, 2002).

1.4.- Liseri-guruinaren plastikotasuna

1.4.1.- Epitelioaren aldaketa morfologikoak

Liseri-guruinaren egitura ez da egonkor mantentzen; aitzitik, egoera desberdinenaurrean plastikotasun handia erakusten du. Hainbat ikerlanek deskribatutakoaren arabera,ingurugiroaren estres-iturrien pean, estrusio apokrino/holokrino eta aufogafia prozesuenemendioa behatu da liseri-epitelioan (Soto et al., 1996). Izan ere, kutsatzaile organiko zeinez-organikoen pean egondako moluskuetan eta baita bestelako estres orokorrekoegoeratan (adb., baraualdiaren ondorioz), liseri-epitelioan aldaketa morfologikoesanguratsuak behatu dira, epitelioaren altueraren murrizpena eta zelula-motenproportzioaren aldaketak, bestek beste (Lowe et al., 1981; Couch, 1984; Marigómez et al.,1986; 1993; 1996; 1998b; 2005; Recio et al., 1988; Vega et al., 1989; Cajaraville et al.,1991).

Liseri-epitelioaren batez besteko lodiera adierazteko MET (ingelesezko MeanEpithelial Thickness) parametroa erabili da. Dena den, MET parametroak ezin du bereosotasunean liseri-guruineko epitelioak pairatutako aldaketa estruktural guztiak azaldu.Liseri-dibertikuluaren tamaina adierazten duen MDR (ingelesezko Mean Diverticular


21

Radius) eta lumenaren kalibrearen adierazlea den MLR (ingelesezko Mean LuminalRadius) parametroek ere informazio baliotsua eman dezakete, eta baita MLR/MET etaMET/MDR parametro erlatiboek ere (Vega et al., 1989). Orokorrean, estresatutakomoluskuen MET eta MDR balioak baxuak eta MLR balioak altuak dira. Hala ere, aldaketamorfologikoak ez dira beti espero bezala. Zenbait ikerlanetan, MET jaistearekin batera,MDR mantendu edo igo daiteke (Cajaraville et al., 1991; Cajaraville et al., 1992). MDR,batez ere, estres-iturri iraunkorren aurrean jaisten da esangarriki. Bestalde, mareartekobibalbioen kasuan, liseriketa-jarduera fasikoek ere liseri-epitelioaren altueraren gaineragina dute. I eta II motetako tubuluen morfologia duen liseri-epitelioa IV motetakoenabaino garaiagoa da (7. Ird.). Gainera, estres-egoeretan, MLR goratzearekin batera, IVmotako tubuluen morfologia duen epitelioaren hedapena ere emenda daiteke (Cajaravilleet al., 1991). Azkenik, zenbait egoera patologikotan, kasik epiteliorik gabeko tubuluatrofikoei legokioken V motako epitelio-morfologia aurkitu da (Couch, 1984).

Halaber, muskuiluen liseri-guruinaren kasuan liseri-albeoloen morfologia etatamaina ere ingurumen-baldintzen arabera alda daitezke. Alde batetik, hatz itxurakoproiekzioen tamaina, itsasaldi-erregimenaren arabera desberdina izan daiteke. Bestalde,egoera normaletan hatz itxurako proiekzioak nabarmenagoak diren bitartean, estres pekoegoeretan albeoloen proportziorik handiena ganbarari dagokio, 3D-berreraiketetanoinarrituta frogatu den moduan (3. Ird.; Quincoces, 1995; Lekube 1997).

Oro har, ingurumen-baldintzen arabera suertatutako aldaketa morfologikoek,epitelioaren masa, hots zelulen masa edo kopurua, oso aldakorra dela agerian utzi dute.Gainera, aldaketak, itzulgarriak izanik, ordu gutxitan suertatzen dira gehienetan. Horriesker, epitelio-zelulen berriztapenaren garrantziaz jabetu gara, nahiz eta, gerora azaldukodenez, epitelio honen berriztapenari buruz ezer gutxi dakigun.

1.4.2.- Zelula-moten ordezkapena

Morfologian ez ezik, liseri-guruineko epitelioa osatzen duten zelula-motenpresentzia erlatiboan ere aldakortasun esanguratsua aurkitu da. Oro har, egoera fisiologikoeta patologiko jakin desberdinetan zelula basofilikoen presentzia erlatiboa areagotudaitekeela deskribatu da. Erantzun hori orokorra da molusku espezien artean, xenobiotikoorganiko eta metal pean egondako magurio zein bibalbioetan (Rasmussen et al., 1983;Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1990; 1991; Marigómez et al., 1990; Soto et al., 1997, 2002),eta metal pean egondako bareetan (Marigómez et al., 1986, 1996, 1998b) deskribatu denbezala. Gainera, bestelako estres-egoeretan (adb., baraualdia eta bizkarroein presentzia)

Zati Teorikoa

22

ere erantzun-mota bera aurkitu da (Yoshino, 1976; Marigómez et al., 1992; 1993).Esaterako, Mytilus edulis muskuiluek baraualdi luzea jasan ostean, flagelodun etaflagelobako zelula basofilikoen kopuru erlatiboak gora egin zuela ondorioztatu zen(Thompson et al., 1974). Gainera, dirudienez, zelula-moten proportzioaren aldaketa behinbehinekoa dirudi. Adibidez, Littorina littorea magurioaren kasuan, petrolio-eratorrien peanegotearen ondorioz zelula basofilikoen proportzioak gora egin arren, erantzuna itzulgarriadela ikusi da (Widdows et al., 1984).

Testuinguru honetan, behatutako zelula-moten kopuru erlatiboen aldaketa liseri-zelulen kopuruaren jaitsiera edo zelula basofilikoen proliferazioaren bitartez burutzen oteden argitzeke dago. Litekeena da prozesu biak, liseri-zelulen narriadura eta zelulabasofilikoen proliferazioa, aldi berean gertatzea. Izan ere, zelula basofilikoen kopuru etadesegite-faseko liseri-epitelioaren hedapenaren artean korrelazio positibo esangarriaaurkitu da (Cajaraville et al., 1990). Beste autore batzuen arabera, ordea, zelulabasofilikoen proliferazioa estresak induzitutako liseri-zelulen galeraren aurretik gertatukolitzateke (Thompson et al., 1974). Zentzu horretan, Widdows et al.-ek (1984) diotenez,xenobiotikoek zelula basofilikoen kopuruaren igoera eragingo lukete, estres-egoerei aurreegiteko zelula hauek ekoitzitako entzimen eskari handiagoa bailego.

Estres kronikoa pairatu duten bareetan ere, kaltzio-zelulen kopuru erlatiboren balioaltuak ikusi dira. Esaterako, kupre-meatzaldean bizi diren bareen liseri-guruinekoepitelioan zelula-mota nagusia kaltzio-zelula dugu, liseriketa-jarduerei zein kaltzioarenmetabolismoari dagokienez liseri-guruina berezia izanik (Marigómez et al., 1998b).

1.4.3. Liseri-guruineko epitelioko zelulen plastizitatea

Lehenago aipatu den bezala, liseri-zelulak oso sistema endo-lisosomikoa garatuadauka, lisosomek zelularen bolumen gehientsua betetzen dutelarik (Marigómez & Baybay-Villacorta, 2003). Lisosomen gainean estres-iturri desberdinek eragina izan dezakete,kutsadura kimikoak, gazitasun-estresak, muturreko tenperaturek altua, baraualdiak etaugalketari asoziaturiko estres-egoerak, besteak beste (Lowe et al., 1981; Moore et al.,1987; Lowe, 1988; Cajaraville et al., 1991; 1995a; Marigómez et al., 1991, 1996; Regoli,1992; Krishnakumar et al., 1995; Domouhtsidou & Dimitriadis, 2001). Oro har, liseri-zelulenlisosometan gerta daitezkeen aldaketak hiru taldetan sailka daitezke: tamainazemendatzea, mintza desegonkortzea eta edukinen izaera aldatzea (Marigómez et al.,2005). Lisosomen erantzunak berehalakoak dira, eta zenbait kasutan tamainazemendatzea eta mintza desegonkortzea kitzikadura jaso eta ordu gutxitara dagoeneko


23

behatu dira (Lekube et al., 2000; Izagirre et al., 2005). Hori dela eta, lisosomen erantzunakestres-biomarkatzaile goiztiar gisa kontsideratu dira (Cajaraville et al., 2000; Marigómez &Baybay-Villacorta, 2003; Marigómez et al., 2005).

Dena dela, lisosomen erantzunak bai kutsatzaile-motaren arabera, bai esposizio-denboraren arabera eta baita esposatutako kontzentrazioaren arabera desberdinak izandaitezke. Metalen pean egondako muskuilu eta magurioen liseri-zelulen lisosomendentsitate bolumetrikoaren emendatzen den bitartean (Marigómez et al., 1990), kutsatzaileorganikoen pean egondakoen kasuan, kutsatzailearen izaera, esposizio-denbora etakontzentrazioaren arabera erantzun ezberdinak behatu dira. Esaterako, petrolioarenhidrokarburo eta azetonaren pean egondako muskuiluetan, hasiera batean lisosomaktxikiagoak diren arren (Cajaraville et al., 1995b; Cancio et al., 1998, Marigómez & Baybay-Villacorta, 2003), esposizio luzeagoak tamainaz emendatzea dakarkie (Cajaraville et al.,1995b). Aitzitik, di(2-etilhexil)ftalato gisako zenbait kutsatzaile organiko pean egoteak,hasiera-hasieratik lisosomak tamainaz emendatzea eragin dezake (Marigómez & Baybay-Villacorta, 2003).

Azkenik, zelula basofilikoei dagokienez, aipatutako kopuru erlatiboaren emendioagertatzeaz gain, zelulen morfologia eta ultrastrukturan ere aldaketak aurkitu dira(Marigómez et al., 1998b; Triebskorn & Kohler, 1996). Kadmio kontzentrazio subletalenpean egondako magurioetan, zelula basofilikoen hipertrofia eta basofiliaren galera behatudira, eraldatutako zelula basofiliko hauek liseri-zelula eta zelula basofilikoen artekomorfologia erakutsi dutelarik (Marigómez et al., 1990). Ingurumen kutsatuetanmantendutako Mizuhopecten yessoensis bibalbioaren liseri-epitelioan ere, tarteko itxurakozelula basofilikoak deskribatu dira (Syasina et al., 1997).

Zati Teorikoa

24

2.- EPITELIO-EHUNEN BERRIZTAPENA

Zelula eukariotikoak, jatorriz aske bizi ziren banakako izakiak izan arren eboluzioanzehar izaki zelulanitzen partaide espezializatuak bilakatuz joan dira. Hori dela eta, moduindependentean bizitzeko ezinbestekoak ziren ezaugarriak galduz joan ziren, izakizelulanitzak beren osotasunean bizirik mantentzeko derrigorrezko ezaugarri berriakeskuratuz joan ziren bitartean. Izaki zelulanitza osatzen duten zelulak, nahiz eta genomabera partekatu, elkarren artean arras desberdinak dira. Zelulek, aniztasun zabalekozereginak buru ditzaketen organoetan antolatutako hamaika ehun desberdin itxuratzekoelkarlanari ekiten diote. Ehunak eta organoak behar bezala ulertzeko, zelulen lan egitekomodua eta habitat desberdinetan nola bizi eta hiltzen diren ezagutzea beharrezkoa da(Alberts et al., 2002).

Epitelio-ehuna, animaliak osatzen dituzten lau oinarrizko ehun-motetako bat dugu.Oro har, bi era desberdinetan antolatuta dago, zelulen xafla jarrai moduan edo guruinmoduan. Epitelio-ehunek, oso funtzio desberdinak burutzen dituzte, babespena, zelulenarteko garraioa, xurgapena, jariapena eta iragazkortasuna, besteen artean. Epitelioensorrera eta mantentzearen inguruan oinarrizko hainbat galdera erantzuteke daude oraindikere. Zenbait epiteliok, hestea edo larruazala kasu, zelulen ordezkatze-tasa handia erakutsidute (Potten & Loeffler, 1990), beste zenbaitek, ordea, gibela edo area kasu, egoeranormalean ordezkatze-tasa geldoagoa dute, berriztapen azkarrak behar izatekotanmoldaera bereziak erakutsi dituzten arren (Finegood et al., 1995; Slack, 1995; Alison et al.,1997).

Hurrengo orrialdeetan azalduko diren barne-faktore dibertsoen eraginaz gain,farmakoek, gaixotasunek, ebakuntza kirurgikoek eta ingurumen-faktoreek ere epitelioenberriztapen-tasa eraendu dezakete. Euren artean, argia/iluntasun zikloa faktorenagusitakoa omen da, askotan zelulen proliferazioaren dinamikaren erritmoak eta zikloakpatroi zirkadiarren arabera gauzatzen baitira. Adibidez, hainbat zianobakterio etaprotistotan, DNAren sintesia gauez baino ez da ematen. Hori, babes-mekanismo moduaninterpretatu da, egunez erradiazio ultramoreak DNAren kopia akastunen ekoizpena bultzalezakeelako (Reddy et al., 2005). Animalien artean ere, antzeko portaerak behatu dira, baiarrainen epidermisean (Dekens et al., 2003) eta baita ugaztunen hezur-muinean(Abrahamsen et al., 1997) zein bestelako epitelio-ehunetan ere (Bjarnason & Jordan,2002; Barbeito et al., 2003; Brandi et al., 2004).

Epitelio-ehunen berriztapena

25

Atal honetan, epitelio desberdinetan zelulen berriztapena zein mekanismorenbitartez suertatzen den aurkeztuko dugu. Lehendabizi, sarrera gisa, zelula amenkontzeptuaren inguruan orokortasun batzuk eta zelulen proliferazioa aztertzeko teknikaeskuragarriak azaldu dira laburki. Gerora, epitelioen berriztapenaren estrategiadesberdinak aurkeztu dira, bi estrategia bereiziz: (a) egoera normaletan zelula amenbitartez berriztatzen diren epitelioak; eta (b) nahiz eta bertan ere zelula amak egon,normalean desberdintzatutako zelula helduen bitartez berriztatzen diren epitelioak.

2.1. Epitelioetako zelula amak

Duela 40 urte inguru, ehun bereko bestelako zelula-motak emateko gai zirenzenbait zelula somatiko topatu ziren, zelula amak alegia. Zelula somatiko horiek,lehenengo aldiz saguen ehun hematopoietikoan deskribatu ziren (Till & McCullog, 1961).Azken urteotan, zelula amen presentzia bestelako ehun-mota desberdinetan eredemostratu da, epidermisean, muskuluan, gibelean eta burmuinean, besteak beste (Gage,2000; Slack, 2000). Epitelio gehienek, zelula amak dituzte (Slack, 2000). Zelula amakdefinitu nahian, modu funtzionalean egitera behartuta gaude; kasu gehienetan epiteliokogainontzeko zelulekiko inolako desberdintasun morfologikorik ez baitute. Zelula amakdeskribatzen dituzten ezaugarri funtzionalak honako hauek ditugu (Alberts et al., 2002):

1.- Guztiz desberdintzatu gabeko zelulak dira.2.- Mugarik gabe zati daitezke edo, behintzat, organismoak bizirik dirauen bitartean

zatitzeko gaitasuna manten dezakete.3.- Zatiketa zelularra burutu ostean, zelula kume bakoitzak bi aukera ditu; zelula

ama izaten jarraitu edo eta derberdintzapen-bidea bukaeraraino eraman.Epitelio bateko zelula-mota desberdin guztiak sortzeko gaitasuna

(multipotentzialitatea) zelula amak identifikatzeko sarritan erabili den ezaugarria da.Tamalez, gehienetan, gaitasun hori ehuna kaltetu denean baino ez da azaltzen. Hau da,egoera normalean zelula ama gehienek desberdintzatutako zelula-mota bakarraproduzitzen dute (unipotentzialitatea). Gibelaren kasuan, adibidez, hepatozitoenberriztapenaz hepatozitoak beraiek arduratzen dira (Michalopoulos & DeFrances, 1997),baina, edozein arrazoia dela medio, hepatozitoen zatiketa inhibituta baldin balego,hepatozitoen berriztapena konduktuetako zelulek burutuko lukete (Alison et al., 1997).

Zatiketa zelularraren zinetika ikertu ondoren, zelula amek orokorrean bikoizpen-tasa baxua dutela ondorioztatu da, espero ez bezala. Izatez, epitelio-ehunetan gehienzatitzen diren zelulak zelula anplifikatzaile iragankorrak edo TAC (Transit Amplifying Cell)

Zati Teorikoa

26

deitutakoak dira. TAC zelulak hainbat zatiketa-ziklo pairatu eta gero, desberdintzapen-prozesuan sar daitezke. Euren kopurua altua denean, ehunak desberdintzapenerakogaitasun handia duela ikusi da, zelula ama urriak izan arren (Hall & Watt, 1989).

Oro har, ehunetan zatitzen diren zelulak, zelula amak zein TAC zelulak, tokiberezietan daude kokaturik. Esaterako, hestearen kasuan zelula amak Lieberkühn kriptenzati distaletik gertu kokatuta dauden bitartean, TAC zelulak kriptaren altueraren bi herendistaletan paratuta daude, eta desberdintzatutako zelulak, aldiz, batez ere herenproximalean kokaturik agertu ohi dira (Potten & Loeffler, 1990).

2.2. Zelulen proliferazioa aztertzeko teknikak

Ziklo zelularraren kontzeptua, 1950. hamarkadaren inguruan plazaratu zenarratoien barrabiletan autorradiografiazko teknikak erabiliz 32P-aren inkorporazioa DNAnbehatu ondoren (Howard & Pelc, 1950). Ikerlan horren ondorioz, ziklo zelularra 4 fasetanbanandu zen G1-, S-, G2- eta M-faseak, alegia. Lau fase horietatik deigarriena, etaikuspuntu morfologiko batetik interesgarriena, M-fasea (mitosia) da. Bertan, nukleoa zatituegiten da, eta zelula batetik bi zelula kume sortzen dira. Mitosia gertatu eta gero, zelulakumeak, G1-fasean edo lehenengo hazkuntza-fasean sartzen dira. Bertan, zelula sortuberriak bere ingurua aztertzen du, eta hazteari ekiten dio. Tamaina nahikoa lortu eta gero,eta seinale egokia jasoz gero, S-fasean (sintesia) sartzen da. Bertan nukleoko DNAbikoiztu egiten da, eta, DNA zeharo erreplikatuta egon ondoren, zelula G2-fasean sartzenda. Bertan, zelulak DNA guztiz erreplikatu dela egiaztatzen du, berriro ere hurrengo M-fasean sartu aurretik. G1-fasean dagoen zelulak bere ziklo normala geldiarazi dezake, etaespezializatutako atsedenaldian sar daiteke (G0-fasea). Bertan, asteak, hilabeteak edourteak egon daiteke S-fasean berriro sartu arte, beharrezkoa den seinale espezifikoajasotzearen zain. (Alberts et al.,2002).

Ziklo zelularra eraentzen duen kontrol-sistema molekularra, eboluzioan zehar osokontserbatua da. Esaterako, zelula eukariotiko guztietan zatiketaren kontrolean antzekoproteina eraentzaileek dihardute (Hall & Levinson, 1990). Zelulen proliferazioa ehunetanikertzeko, proteina horien eta beren ekoizpenaren azterketaz baliatzen diren teknikadesberdinak eskuragarri daude. Euren artean erabilienak, fluxu-zitometria, nukleotidoenanalogoak erabileran oinarrituriko teknikak, immunohisto(zito)kimika eta geneenadierazpenaren azterketa molekularra (in situ hibridazioa, PCR...) dira. Moluskuetan zelulaproliferatzaileak detektatzeko teknikak oso gutxitan erabili dira (1. Taula). Izatez, nahiz etaPCNA edo Ki67 moduko proteinak eboluzioan zehar kontserbatuak izan (Prelich et al.,


27

1987; Endl & Gerdes, 2000), moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileen identifikazioanukleotidoen analogoen erabileran oinarritu da batik bat.

2.2.1.- Fluxu-zitometria

Teknika honetan, zelulak seinale batez markatzen dira. Seinaleak, itu-proteina batespezifikoki ezagutzen duen antigorputzen bat zein azido nukleiko berezia ezagutzen duenzunda osagarriren bat izan daitezke. Zelulen esekidura batean zenbait zelula espezifikokihorrela markatu ondoren, laser-izpi batek zeharkatzen duen zulo batetik zelulen esekidurapasarazten da. Orduan, laser-izpiok zeluletan transmititu edo islatu egingo dira, zelulekseinalea daramatenentz arabera. Ondorioz, argia transmititu edo islatu den araberazelulak karga elektrostatiko desberdinez hornituko dira, eta eremu elektromagnetikobatean zehar pasarazi ondoren banandu daitezke (Alberts et al., 2002). Teknika honenbitartez, zelulen kopurua eta zelula bakoitzak duen DNA kopurua ezagutu daitezke. Izanere, aneuploidiarik ez egotekotan, G0- eta G1-fasean dauden zelulak diploideak izangodira, G2-fasean dauden zelulak tetraploideak eta S-fasean daudenek tarteko DNA-kopuruaizango dute. Beraz, zelulen esekidurak erabiliz eta modelo matematiko egokiak aplikatuz,zatiketa-zinetika ere iker daiteke (Baisch et al., 1982). Zenbait kasutan, histologiarakofixatutako eta parafinan inkluditutako zeluletan ere DNA kopurua kalkula daiteke, laginakdesparafinatu eta hidratatu ondoren (Hedley et al., 1983). Fluxu-zitometria, egoerapatologiko desberdinak aztertzeko erabili da, eta bere bidez lortutako proliferazio-indizeektumoreen garapenaren azterketarako ere balio prognostikoa dutela proposatu da (Joensuuet al., 1988). Fluxu-zitometriak, zelula proliferatzaileak detektatzeko bestelako teknikenaurrean daukan abantaila handienetakoa emaitzen objektibotasuna dugu. Gainera, zelula-kopuru handiekin lan egin daiteke, eta interesatzen zaizkigun zelulak isolatzeaahalbidetzen du. Bestalde, beharrezkoa den ekipamendua oso garestia da, eta laginasakabanatu eta desegituratu behar denez, zelula proliferatzaileen kokapena ehunean ezdago aztertzerik. Gainera, zelula proliferatzaileen azpipopulazioak ere galtzen dira.

2.2.2- Nukleotidoen analogoen erabileran oinarrituriko teknikak

3H timidinaren (3H-T) bitartezko markaketa

Zelulen zinetika ehunetan zuzenean aztertzeko, 1950. hamarkadan 3H timidinatritiatuaren (3H-T) bitarteko markaketa, teknika estandarrena bilakatu zen. Zelula

Zati Teorikoa

28

bideragarriek 3H-T DNAn eransten dute S-fasean daudenean (17. Ird.), eta ondorentimidina hori autorradiografia bitartez ikuskor bihur daiteke. Timidina erradioaktiboa,animaliari edo zelulen kultiboari in vivo ematen zaie (3H-T-ren pultsua), eta DNAsintetizatzen ari diren zelulek markatutako timidina beraien DNAn erantsiko dute. Halaber,biopsiaz lortutako materiala eta bestelako lagin-motak aztertzeko, fixapena burutu aurretikdenbora-tarte luzez timidinaz inkubatu behar dira. In vivo pultsuak burutzeko zailtasuna,batetik, zein material erradiaktiboa erabili beharra, bestetik, ezaugarri mugatzaileak izanik,azkeneko urteotan 3H-T gero eta gutxiago erabili da histopatologian. Edozein kasutan,zenbait ikerketa berezi egiteko edo eta ikerkuntz-zentro espezializatuetan teknika hau gauregun oraindik ere erabilia da (Hale et al., 2003).

Bromodeoxiuridinaren (BrdU) bitartezko markaketa

BrdU, timidinaren analogoa den molekula da, eta horregatik DNA sintetizatzen denfasean (S-fasea) nukleoan inkorporatzen da 3H-T moduan (17. Ird.). BrdU inkorporatuduten zelulak immunohisto(zito)kimika bitartez detekta daitezke, BrdUren aurkako


29

17. Irudia: Ziklo zelularraren fasearen arabera adierazten diren markatzaile molekular desberdinak

antigorputzak erabiliz, eta mikroskopioan aztertu (18. Ird.; Gratzner 1982; Alison, 1995).BrdU immunohisto(zito)kimika S-fasean dauden zelulak identifikatzeko oso erabilgarria da.Kasu gehienetan antigorputzarekiko eskuragarritasuna emendatzeko DNA desnaturalizatubeharra dago, azido klorhidrikoaz tratatuz edo liseriketa entzimatikoaren bidez (Gratzner etal., 1982; Roberts et al., 1985; Kikuyama et al., 1988). BrdU, injekzio bitartez emandakopultsu moduan edo etengabe ponpa peristaltikoak erabiliz eman daiteke. Gaur egun,teknika hau metodo estandarra bilakatu da, eta horren ondorioz ikerlan desberdinetan

Zati Teorikoa

30

18. Irudia: Zelula proliferatzaileak detektatzeko erabil daitezkeen teknika desberdinek arratoien hestegorrianeman dituzten irudiak. (A) Ki67 immunohistokimika; (B) BrdU immunohistokimika (C) PCNA immunohistokimika; (D)H2b, H3 eta H4 histonen mRNAren in situ hibridazioa. (Muskhelishvili et al.-etik (2003) birmoldatua).

lortutako emaitzak konparagarriak izatea lortu da. Hala ere, metodo honek beredesabantailak ere badauzka: (1) zenbait kasutan animalia injektatu beharra dago eta berazbaimen bereziak ezinbestekoak dira, (2) BrdU S-fasean eransteaz gain DNAkonpontzerakoan ere DNAri eransten zaio, zelula proliferatzaileen gainestimazioa sorlezakeena; eta (3) BrdU mutagenoa denez, epe luzeko ikerketa toxikologikoetan ez da osokomenigarria.

2.2.3- Antigeno nuklearren immunohistokimikan oinarrituriko teknikak

Ki67 antigenoaren immunohistokimika

Ki67 proteina nuklearra zelula proliferatzaileak detektatzeko oso antigeno erabiliadugu. Ki67 zelula-mota guztietan G1-, S- eta G2-faseetan adierazten den bitartean, G0-fasean ez da adierazten (17. Irudia; Gerdes et al., 1984; Gerlach et al., 1997). Hori delaeta, ehunaren hazkuntza-mailaren neurketetarako erabil daiteke. Hala ere, momentuz berefuntzioa zein den argitzeke dago (Endl & Gerdes, 2000). Minbiziaren ikerkuntzan zeinbestelako gaixotasunen diagnostikoan Ki67 antigenoaren immunohistokimika oso erabiliaizan da (18. Ird.; Scholzen & Gerdes, 2000). Hala ere, proteina honen adierazpenaren etaziklo zelularraren barruan duen kokapenaren inguruan eztabaida ugari dago, eta baitaproteinaren biziraupenaz ere (Littleton et al., 1991; Bruno & Darzynkiewicz, 1992;Goldblum & Appelman, 1995; Oka & Arai, 1996; Scholzen & Gerdes, 2000). Antigenohorren desabantailarik garrantzitsuena, antigenoak fixatzaileekiko daukan sentikortasunhandia da, kasu gehienetan izoztutako materiala erabiltzera bultzatzen duena, informaziomorfologikoaren galera ekarriz (Endl & Gerdes, 2000). Gainera, giza-antigenoaren aurkakoantigorputza erabili da gehienetan, hainbat espezieekiko erreakzionagarritasun gurutzatuabaxu samarra edo nulua izanik. Zorionez, arazo horri irtenbidea emateko asmoz,bakteriotan adierazitako gizakiaren Ki67 antigenoaren aurkako antigorputz berezia garatuda, MIB-5 izenaz ezagutua dena (Schluter et al., 1993; Gerlach et al., 1997). Izan ere, MIB-5 antigorputzak, karraskarien Ki67 antigenoarekiko erreakzionagarritasun gurutzatu osoaltua du, fixatzaileekiko horren sentikorra ez izanik (Gerlach et al., 1997).


31

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) antigenoaren immunohistokimika

PCNA, δ eta ε DNA-polimerasen zein DNAren sintesirako beharrezkoak direnhainbat entzimen proteina laguntzailea dugu (Kurki et al., 1986; Bravo et al., 1987; Wood& Shivji, 1997). PCNA, Miyachi-ren taldeak 1978. urtean lehenengo aldiz deskribatu zuen(Miyachi et al., 1978). PCNAren adierazpena G1-fasearen bukaera aldera emendatzen da,eta S-fasean zehar lortzen du bere adierazpen mailarik altuena. Ondoren, G2- eta M-faseetan adierazpena berriro ere jaisten da (17. Ird.). Berezitasun hauek direla eta, ziklozelularraren fase desberdinak identifikatzea ahalbide dezake (Foley et al., 1993). PCNArenpisu molekularra 36 kDa-koa da, eta immunofluoreszentzia erabiliz bi azpipopulaziobereiztu dira. Lehenengoa, soilik DNAren erreplikapen-guneetan dago, eta DNA ekoiztenden bitartean bere kontzentrazioa igo egiten da. Bigarrena, berriz, nukleoplasmansakabanatuta dago, eta ziklo zelularrean zehar beti, gutxi gorabehera, maila beretsuanadierazten da (Bravo et al., 1987). Bi azpipopulazio horiek, fixatzaileekiko sentikortasundesberdina daukate. Fixatzaile aldehidikoz fixatutako ehunetan bi azpipopulazioakdetektatzen diren bitartean, fixatzaile alkoholikoak erabiltzen direnean soilik DNArenerreplikapen-guneetan dagoen PCNA detektatzen da (PCNA osoaren %20-30-a).PCNAren biziraupena 20 ordukoa da (Bravo & MacDonald., 1987). Nahiz eta PCNAzmarkatutako zelula proliferatzaileen indizeak bestelako teknikekin lortutako indizeekinkonparatzeko arazoak egon diren (Jain et al., 1991; Yu et al., 1991; Visakorpi, 1992; Sarliet al., 1995), PCNA immunohisto(zito)kimika oso erabilia izan da, bai oinarrizko ikerketa

Zati Teorikoa

32

19. Irudia: Mercenaria mercenaria bibalbioaren zelula proliferatzaileen markaketa PCNA immunohistokimikaerabiliz. Geziek marka positiboa adierazten dute eta gezi-buruek nukleo negatiboak. (A) Liseri-guruineko epiteliokozelula proliferatzaileak. B) Zelula proliferatzaileen marka bortitza zakatzen oinaldeko epitelioan. (C) PCNA-markaketapositiboa giltzurruneko granulometan murgildutako hemozitoetan. Eskala marra: 13 μm. (Hanselman et al.-etik (2000)birmoldatua).

egiteko eta baita pronostiko patologikoetan ere (18. Ird.; Faderl et al., 2002; Lillo et al.,2002). Hala ere, zelula proliferatzaileak detektatzeko PCNAk duen baliogarritasunakhainbat zalantza sortu ditu. Izan ere, PCNAren kopurua zelula-moten zein zelulen egoerafisiologiko edo patologikoen arabera esanguratsuki alda daiteke. Beraz, minbizi-zelulak etazelula arruntak bereiztu nahi izan direnean, ez da erreza izan zelulen egoera bakoitzarizegozkion PCNA-markaketaren balioak finkatzea (Morris & Mathews, 1989; Hall et al.,1990; Scholzen & Gerdes, 2000). Gainera, PCNAk DNAren konponketan ere parte hardezake, bere adierazpena bikoizten ari ez diren zeluletan ere beha daitekeelarik (Toschi &Bravo, 1988; Wood & Shivji, 1997).

PCNA, eboluzioan zehar nahiko kontserbatua den proteina dugu (Prelich et al.,1987). Garatutako antigorputz monoklonal komertzialek, batez ere PC10 izenaz ezagutzendenak, erreakzionagarritasun gurutzatu sendoa erakutsi dute (19. Ird.), ugaztun, intsektu,landare, molusku zein legamien PCNA antigenoekin (1 Taula; Waseem & Lane, 1990;González-Melendi et al., 1996; Marigómez et al., 1999; Hanselman et al., 2000).

Ziklinen menpeko kinasen immunohistokimika

Zelulen proliferazioa, ziklo zelularreko fase espezifikoetan proteina-kinasakonplexu desberdinek eraenduta dago. Konplexu horiek, azpiunitate katalitiko eta berarilotutako azpiunitate eraentzaileaz osaturik daude. Proteina-kinasa konplexuen azpiunitatekatalitikoak ziklinen menpeko kinasak (zmk) dira, eta ziklo zelularrean aurrera egiteareneraentzaile nagusiak dira. Kinasa horien jarduera, ziklo zelularrean zehar igo eta jaitsiegiten da, eta gorabehera horiek ziklo zelularraren gertaera nagusietan (DNArenerreplikapena, mitosia, zitokinesia) gertatzen diren proteina ezberdinen fosforilazioaneragina daukate (Morgan, 1997). Adibidez, zmk jakin baten jarduera mitosiaren hasieranigoz gero, kromosomen kondentsazioan edo mintz nuklearraren apurketan parte hartzenduten proteinen fosforilazioen emendioa bultzatuko litzateke. Hainbat zmk desberdindaude, aipagarrienak zmk-1, zmk-2, zmk-4 eta zmk-6 izanik. Ikerlan aplikatu zeinoinarrizko gehienek, lau zmk horiek izan dituzte aztergai (Palacios et al., 2005;Schmetsdorf et al., 2005).

Zmk aurkako antigorputzei dagokienez, zmk-1 delakoaren PSTAIRE deitutakogunea ezagutzen duten antigorputzak garatu dira. Gune hori kontserbatua da, etaugaztunetan gain beste espezie batzuetan antigorputz espezifikoetako elkargarritasungurutzatua frogatu da (Weinstein et al., 1994). Beste zmk aurkako antigorputzeidagokienez, ugaztunetaz kanpo apenas informaziorik dago.


33

Ziklinen immunohistokimika

Proteina hauek, aurrenez aipatutako ziklinen menpeko kinasekin erlazio zuzenadute. Izan ere, ziklinak zmk-konplexuaren azpiunitate eraentzaileak dira. Ziklinak, ziklozelular bakoitzean sintetizatu eta andeatu egiten dira. Kinasa jarduera, ziklinak zmkeiestuki lotzen zaizkienean baino ez da adierazten. Hainbat ziklina-mota desberdin daude,garrantzitsuenak A-, B-, D- eta E-ziklinak izanik (20. Ird.). Ziklo zelularrak aurrera jarraidezan, D-ziklina zmk4 eta zmk6-ri G1-fasean zehar lotu behar zaie (Sherr, 1996). E-ziklinak, zmk2 edo zmk4-ri lotuz, aktibatu egiten ditu, ziklo zelularra G1-fasetik S-faserapasaraziz. A-ziklina, bere aldetik, zmk2-ri S-fasean lotzen zaio, DNAren sintesiaahalbidetuz; eta B ziklina, bestetik, zmk1-ri lotzen zaio, mitosiari bide emanez (Nigg, 1995;Edgar & Lehener, 1996). Ziklinen adierazpena, immunohistokimika bitartez azter daiteke,minbiziarekin erlazionatutako kasuetan (Zhu et al., 2003) zein oinarrizko ikerketetan(Golias et al., 2004) jadanik egin den bezalaxe. Hala eta guztiz ere, ugaztunetatik kanpoziklinei buruzko ikerlan immunohistokimiko urriak burutu dira (1 Taula).

2.2.4.- Geneen adierazpenaren azterketan oinarrituriko teknikak

Aldez aurretik ikusi dugunez, ziklo zelularra eraentzen duten zenbait proteina uneedo fase jakinetan baino ez dira sintetizatzen zikloan zehar, bereziki histonen eta ziklinenkasuan alegia (17. Ird.). Proteina horien adierazpena, antigorputzak erabiliz iker daiteke.

Zati Teorikoa

34

20. Irudia: Ziklina desberdinen adierazpen-mailak ziklo zelularraren fase desberdinetan. Eskuarki ziklina-motabakoitzak bere adierazpen-piko maximoa ziklo zelularraren fase jakin batean lortzen du.

Izan ere, beren funtzioa bete bezain pronto antigenoak andeatu egiten direnez, ziklinenkasu, oso informazio baliagarria ematen dute ziklo zelularraren fasea identifikatu ahalizateko. Esaterako, A-ziklina S-fasearen bukaera-aldera eta G2-fasean zehar soilik topadezakegu, eta B-ziklina, bestalde, G2-fasearen bukaera-aldera eta M-fasean zehar bainoez (20. Ird.). Aldiz, kromatinaren proteina estrukturalak diren histonak oso proteinaegonkorrak dira, sintetizatu eta gero zelularen ziklo osoan zehar aurki ditzakegularik.Adierazpen iragankorra duten ziklinen kasuan zein adierazpen iraunkorra duten histonenkasuan, proteina horiek ekoizten dituzten RNA mezularien presentzia, proteinaksintetizatzen diren une jakinetan emendatzen dira, gerora maila basaletara itzuliz (17. Ird.).Hau da, histonak egonkorrak diren arren, beren geneak S-fasean zehar soiliktranskribatzen dira. Beraz, zelularen batean histonen RNA mezulariak topatzekotan,zalantzarik gabe zelula hori S-fasean dagoena badakigu. Halaber, ziklinen kasuan, ziklinadesberdinen RNA mezularien sintesia ziklina bakoitza topatu dugun baino aurrenekofasean zehar areagotuz doa. Adibidez, B-ziklinaren genearen transkribapena G2-fasean


35

Teknika Espeziea Organoa Erreferentzia 3H timidina Achatina fulica Bihotz-muskulua Martynova & Bystrova, 2002 Crenomytilus grayanus Liseri-traktua Leibson & Frolova, 1994 Aplysia californica Nerbio-sistema Hickmott & Carew, 1991 Margaritifera

margaritifera Zakatza Tomasovic & Mix, 1974

BrdU Planorbarius corneus Mikrogliako zelulen kultiboa

Peruzzi & Sonetti, 2004

Sepia officinalis Enbrioia Grimaldi et al., 2004 Melampus bidentatus Garroen nerbio-

sistema Bale et al., 2001

Pinctada fucata marte nsii Mantu paliala Awaji & Suzuki, 1998 Helix lucorum Protozerebroa Zakharov et al., 1998 Incilaria fruhstorferi Hemozeleko

zelulak Furuta et al., 1994

Mytilus galloprovincialis Zakatzak Martínez-Expósito et al., 1994 Ki67 Helix pomatia Listu-guruina Pirger et al., 2004 PCNA Mercenaria mercenaria Liseri-guruina,

zakatzak, hemozitoak

Hanselman et al., 2000

Mytilus galloprovincialis Liseri-guruina Marigómez et al., 1999 Zmk Aplysia californica Begia Sankrithi & Eskin, 1999 Bulla gouldiana Begia Krucher & Roberts, 1994 Ziklinak Pecten maximus Liseri-guruina Le Pennec & Le Pennec, 2002 Dreissena polymorpha Gonada arra Lamers et al., 1999 Patella vulgata Enbrioia Colas et al., 1993a Patella vulgata Oozitoak Colas et al., 1993b Spisula soldis sima Enbrioia Hunt et al., 1992 Patella vulgata Oozitoak Van Loon et al., 1991

1. Taula: Moluskuen ehunetan zelula proliferatzaileak detektatzeko erabili diren teknika desberdinen adibideak.

zehar areagotuz doa, M-fasearen hasiera-hasieran genearen adierazpenik altuena ematendelarik.

RNA mezulari horiek PCR kuantitatiboaren bidez kuantifika daitezke, DNA-hasleegokiak erabiliz. Era berean, ehunaren gainean molekula horiek lokalizatzeko in situhibridazioa erabili ahal da, RNA- zein DNA-zunda osagarriak erabiliz. DNA-hasle egokiakdiseinatzeko sekuentziaren ezagutza partziala ezinbestekoa da; DNA- eta RNA-zundakdiseinatzeko, bestalde, sekuentzia nukleotidikoaren ahalik eta zatirik handiena ezagutubeharra dago. Proteina homologoek espezien artean nolabaiteko kontserbazio-maila duteneta eboluzioan zehar egonkorrak izan daitezkeena jakina da. Haatik, hau ez da egia RNA-zunden edota DNA-hasleen kasuan, espezie desberdinen proteina beraren sekuentzianukleotidikoak oso desberdinak izan baitaitezke. Sekuentzia nukleotidikoek sekuentziaaminoazidikoak baino aldakortasun handiagoa erakusten dute espezien artean, kodegenetikoaren endekapenaren ondorioz (aminoazido askotarako 4 kodon ezberdinbaitaude), hain zuzen ere. Hau da, antigorputzak erabiliz proteina bera espeziedesberdinetan identifika daitekeen arren, RNA-zundek ez dute ezertarako baliogarriak izanbehar espezie desberdinetan proteina jakin baten RNA mezulariak identifikatzeko. Beraz,edozein kasutan, ikertu nahi den espeziearen sekuentzia nukleotidikoaren ezagutzaminimoa ezinbestekoa da.

Moluskuen kasuan, histonen hainbat mRNA sekuentzia geneen datu-baseetanargitaratu dira, 320 sekuentziatik gora daude eskuragarri (http://www.ncbi.nlm.nih.gov),hain zuzen ere. Taldez-talde, eta tesi honetan aztertuko diren espeziei erreparatuz, M.galloprovincialis-en histona guztien sekuentzia osoak argitaratu dira (Eirin-Lopez et al.,2002), eta beste mitilido askorenak ere (M. edulis, M. trossulus, M. californianus eta M.chilensis). A. ater eta L. littorea gastropodoen histonen sekuentziarik ez dugu ezagutzen,ordea, guztira pulmonatuen 35 sekuentzia desberdin eta orthogastropodoen 78 sekuentziadesberdin argitaratu diren arren. Oraintsu, muskuiluaren histonen sekuentziak 50 genedesberdineko microarray espezifiko batean erabili dira (Dondero & Viarengo, 2005).

Moluskuen ziklinen 18 sekuentzia desberdin ere argitaratuak izan dira. Hala ere, ezda Mytilus, Arion edo Littorina generoen sekuentziarik argitaratu. Argitaratutakosekuentzien artean Dreissenia polymorpha bibalbioaren A-, B-, C- eta D-ziklinen RNAmezularien sekuentzia osoak (Lamers et al., 1999) topa ditzakegu. Halaber, beste bibibalbioen sekuentziak identifikatu dira, hala nola Spissula solidissimaren A- eta B-ziklinaketa Crasssostrea virginicaren zenbait ziklinen antzekotasun handia duten sekuentzianukleotidiko laburrak edo EST-ak (ingeleraz, Expression Sequence Tags; CD646624 etaCD647240 A-ziklina; CD646450 eta 646472 B-ziklina, CD647301 C-ziklina; CD648974 D2-

Zati Teorikoa

36

ziklina eta CD649103 G1-ziklina; ikus NCBI web orrialdea). Crassostrearen sekuentziakgainera merkurio pean mantendutako animalien eta animali kontrolen transkriptomakkonparatuz aurkitu dira; proliferazio zelularra modulatuz ziklina horiek merkurio peanmantendutako ostretan gainadierazi edo azpiadierazi egin baitira (Peatman et al.,argitaratu gabe, ikus NCBI web orrialdea).

PCNA eta Ki67 sekuentziarik ez da klonatu orain arte. Hala ere, M.galloprovincialis-en 435 base paretako EST bat argitaratu da (AJ516167; Venier et al.,2003, ikus NCBI web orrialdea), zeinen sekuentzia aminoazidikoak Danio rerio etaIctalurus punctatus arrainen PCNAren sekuentziekiko homologia (homologia: 1e-29) altuabaitu.

2.3.- Zelula amen bitartez berriztaturiko epitelioak

2.3.1.- Ugaztunen epidermisa

Epidermisa, jatorri ektodermikoa duen larruazalaren oinarrizko epitelio-osagaia da.Zuzenean eta jarraian kanpo-medioarekin kontaktuan egotearen eragina jasotzen duenez,epitelioaren berriztapenak, hots zelulen proliferazioak, ikaragarrizko garrantzia du. Horidela eta, ugaztunen epidermisa organismo helduetan epitelio-ehunak nola berriztatzendiren ikertzeko ohiko eredu esperimentala izanez, bertako proliferazio zelularrarendinamika eta mekanismoak aski ezagunak dira.

Ugaztunen epidermisa, keratinozitoz osatutako epitelio geruzatua da.Keratinozitoek, epidermisari sendotasuna damaion keratina deitutako proteina ekoiztendute. Keratinozitoak epitelioaren oinaldetik erpinalderantz desberdintzatuz doaz, eta goraegiten duten heinean osaketaz eta itxuraz aldatzen dira. Xafla basalaren gainean ezarritadauden zelulak oinaldeko zelulak dira. Zelula hauek zatitzeko ahalmena dute, geruzagerminatiboa konfiguratuz. Euren gainean desmosometan joriak izateari eskerepidermisari trinkotasun mekanikoa eskaintzen dioten zelula handiagoak ditugu (Malpighizelulak). Desmosomen inguruan sortutako arantza itxurako egitura nabarmenakedukitzegatik, zelula hauek osatzen duten epitelioaren zatiari geruza arantzatsu izenaeman zaio, zenbait autorek Malpighi geruza ere deitu duten arren. Hurrengo mailan,geruza arantzatsuaren gainean paratuta, pikor zitoplasmatiko elektrodentsoz hornitutakozelulek, geruza pikortsu izenaz ezagututakoa osatzen dute. Geruza pikortsu horrek,metabolikoki aktiboa den epitelioaren barne-zati eta keratinaz betetako zelula hilezosatutako epitelioaren kanpo-zati arteko muga markatzen du. Geruza keratinotsua


37

izenekoa osatzen duten kanpo-zatiko zelulak etengabe askatzen dira. Gizakiaren kasuan,adibidez, geruza keratinotsua milaka aldiz berriztatu behar da bizitzan zehar. Geruzagerminatiboan zelula amez osatutako keratinozitoen azpipopulazio berezia dago,epidermiseko zelula, ile-folikulu eta izerdi-guruinetako zelulen aitzindari izango dena(Lavker & Sun, 2000). Zelula amok bi tokitan kokaturik daude nagusiki, folikuluen artekoepidermisean eta ile-folikuluaren konkorraren aldean (21. Ird.), azken horiek zatiketangogotsuago dihardutelarik (Ghazizadeh & Taichman, 2001).

Larruazaleko zelula amak normalean nahiko mantso zatitzen diren bitartean, zelulaametatik eratorritako TAC zelulak askoz bizkorrago zatitzen dira (Cotsarelis et al., 1990),zelula ama batetik sortu berria den TAC zelula bakoitzak desberdintzatzeari ekin bainolehen hiruzpabost zatiketa-ziklo pairazten dituelarik (Jones et al., 1995). TAC zeluletatiksortutako zelula kumeek erpinalderantz migratzeari ekiten diote, xafla basaletik urrunduzeta bidean zehar integrinen adierazpen-mailen jaitsiera jasoz. Integrinen beherakada

Zati Teorikoa

38

21. Irudia: Epidermiseko zelula amen kokapena eta beraien banaketa ugaztunetako larruazalean zehar. Babankokatzen diren zelula amek zatitu ondoren papila dermikora, gantz-guruinera zein epidermisaren oinaldera migratzendute, ondoren desberdintzapen-bidean sartuz. (Spradling et al.-etik (2001) birmoldatua).

horrek ziklo zelularra geldiaraztea eragiten du, azkenean desberdintzapena oso-osorikekarriz (Morasso & Tomic-Canic, 2005).

Epidermisaren zati bat kalteturik edo eta zeharo suntsiturik suertatzekotan, kalteainguruko zelula epidermikoek konpontzen dute, proliferazio-tasa areagotuz etasuntsitutako guneraino migratuz. Dena den, kalte-motaren arabera erreakzioa ezberdinaizan daiteke. Adibidez, izpi ultramoreen erradiazioaren aurrean, keratinozitoendesberdintzapena bultzatzen da, geruza keratinotsua trinkoago bihurtuz (Sesto et al.,2002). Haatik, epidermisa mekanikoki larri kaltetzekotan, keratinozitoen proliferazioa etamigrazioa gauzatzen dira (Tomic-Canic et al., 2004). Sortu berria den migrazioarenhelmuga-gunean, zelula ama berrien beharra dago. Horretarako, gune horren albokoertzetako zelula amek zatiketa simetrikoa pairatzen dute, eta zelula ama bakoitzetik bizelula ama kume ateratzen dira, zelula amen kopurua behar bezala emendatuz. Gainera,TAC zelulek eta guztiz desberdintzatu gabeko zelulek ere epitelioaren berreskurapeneanparte har dezakete (Li et al., 2004). Izan ere, epidermiseko xafla basalarekin kontaktuandarraiten zelulek, zelula amak izateko gaitasuna gorde dezakete, kontaktua galdu artedesberdintzapen-bidean sartzen ez baitira.

Desberdintzapenaren eraenketa, ß1-integrinak izeneko proteinen menpean dago.Dirudienez, ß1-integrinen adierazpen-maila baxua duten zelulek, altua dutenek bainozatitzeko ahalmen gehiago dute, zelulak isolatuz gero kolonia berriak sortzeko dutengaitasuna ikertzean ondorioztatu dena (Watt, 2000). Adibidez, TAC zelulek ß1-integrinenmaila baxua dute, zatitzeko gaitasun handia edukiz. Izatez, TAC zelulak zatiketen kopurumugatu batetik aurrera ezin dira berriro ere zatitu; eta, maiztasun handiz zatituz gero, xaflabasaletik askatu eta desberdintzapen prozesuan murgiltzen dira (Jensen et al., 1999). Halaere, zenbait kasutan, xafla basalarekin kontaktuan darraiten zelulak ere desberdintzatzenhas daitezke, kontaktu horien iraunkortasuna keratinozitoen patua muga dezakeen faktorebakarra ez baita. Izan ere, keratinozitoen patua hainbat aldagaien eragin pean legoke,esaterako: zelula amen zatiketa-tasa, zelula amen kumeak zelula ama bilakatzekoprobabilitatea, TAC zeluletan desberdintzatzen hasi aurretik zenbat zatiketa-ziklo emanbehar diren, xafla basaletik askatzeko keratinozitoek behar duten denbora, etadesberdintzapen-prozesua bere osotasunean erdiesteko behar den denbora, besteakbeste. Aldagai guzti horien atzetik, hainbat seinale eta informazio-molekulen saredesberdinetako partaideen mailan gertatutako aldaketak ditugu. Izatez, epitelioenhazkuntza-faktorea (EGF), fibroblastoen hazkuntza-faktorea (FGF), Wnt, Hedgehog,Notch, hezurren proteina morfogenetikoa/ß eraldatze-hazkuntza faktorea (BMP/TGF ß) eta


39

integrinen gisako faktore proteikoek epidermisaren hazkuntza eta desberdintzapeneanparte hartzen dutena badakigu (Oro & Scott, 1998; Dellambra et al., 2000; Watt, 2000).

2.3.2.- Ugaztunen hestea

Ugaztunen heste-epitelioan lau zelula-mota nagusi aurkitu dira, hala nola:enterozitoak, muki-zelulak (ertz itxiko mukozitoak) edo zelula kaliziformeak (ertz irekikomukozitoak), zelula endokrinoak eta Paneth zelulak. Epitelio horrek, endodermotikeratorritako epitelio pseudogeruzatu batean du bere jatorria. Hestearen garapenean zehar,jatorrizko epitelioa inbaginatu egiten da, eta inbaginazio eratu berrien zati distaleko zelulakzatiketan arituz, inbaginazioak hazi egiten dira. Azkenean, inbaginazio horiek, hestemeharrean Lieberkühn kriptak eta heste lodian kolon-guruinak bilakatzen dira (Totafurno etal., 1987).

Saguen kasuan, heste-epitelioaren berriztapena bizkor eta etengabe Lieberkühnkriptetan gertatzen da. Kripta horietako bakoitzean 250 zelula kokatzen dira batezbeste,

Zati Teorikoa

40

22. Irudia: Saguan timidina tritiatua injektatu ondoren, zelula amen kokapena eta geroko migrazio-bidea erakutsidituzten hestearen ebakin histologikoak. A) 40 minutu injektatu ondoren, B) egun bat injektatu ondoren, C) 2 eguninjektatu ondoren, D) 3 egun injektatu ondoren. Irudian segidan markatutako zelulak kriptaren erpinaldera migratuzdoazela ikus daiteke, baita seinalea diluituz doala ere. (Potten-etik (1998) birmoldatua).

horien artean zelula amak, zelula desberdintzatuak eta zelula migratzaile sortu berriakaurki ditzakegularik. Eskuarki, zelula amak kripten heren distalean banatuta daude (Pottenet al., 2003). TAC zelulak, zelula ametatik eratorriak eta 4-6 aldiz zatitzera irisdaitezkeenak, kripten bi heren distaletan lokalizatu dira. Heste-kriptak eta -guruinen arteanhestearen argirantz proiektatutako heste-ebaginazio hazkarak heste-biloxka izenazezagutu dira. Heste meharrean, biloxka bakoitzaren inguruan, beraz, hainbat Lieberkühnkripta daude paratuta, eta kripta horietako zelula amek bai biloxketako eta bai kriptetakoepitelioak osatzen dituzten lau zelula-motak sor ditzakete. Enterozitoak, muki-zelulak etazelula endokrinoak, heste-biloxken mutur distaleranzko migrazio-bidean dauden bitarteandesberdintzatu egiten dira. Migrazio hori, 2-5 egunez gauzatzen dena, oso era antolatuanburutzen da, zutabeka (22. Ird.; Potten, 1998), eta biloxken mutur distalera heltzerakoanzelulak hil egiten dira (Potten, 1998). Bestalde, kolonean zein urdailean, kriptetatik


41

23. Irudia: Heste epitelioko zelulen migrazio eta desberdintzapen-bide orokorrak adierazten dituen irudieskematikoa. (Sancho et al.-etik (2004) birmoldatua).

migratzen duten zelula gazteak hestearen argi-alderantz edo mukosa-alderantz abiatzendira, zelula amak guruinen zati proximalean kokaturik egonik (Yamada et al., 1992).

Heste meharreko Paneth zelulek, kripten mutur distalean paratuta daudenak,mikrobioen aurkako peptidoak eta hazkuntza-faktoreak jariatzen dituzte, eta heste-epitelioko beste zelula-motek ez bezala, kriptetako mutur distalerantz migratzen dute,bidean desberdintzatuz doazelarik (23. Ird.). Helmugara, hau da Lieberkühn kriptetara,iritsi ondoren biziraupen luze samarra dute (20 egun inguru), hil eta fagozitatuak izan bainolehen.

Azkenik, bestelako zelula amekin alderatuz, hesteko zelula amak apoptosiansartzeko gaitasun handiagoa dutela aipatu beharra dago. Halaber, desberdintzapenprozesua nahiko itzulgarria dirudi, zelula kume desberdintzatuak, zelula amenberezitasunak berriro ere berreskuratzeko gai baitira (Marshman et al., 2002).

2.3.3.- Ugatz-guruina

Ugaztun helduen ugatz-guruina, ehun konektibo adipotsuz inguratuta dagoen etaepitelio bakunez osatuta dagoen konduktu-sistema da, indibiduo helduen konduktuetandistalki albeoloak bereiz daitezkeelarik. Konduktuen artean, primarioak eta sekundarioakbereiztu dira, kalibre eta kokapenaren arabera. Konduktu zein aleboloetan, bi zelula-motadesberdin deskribatu dira, jariatzaileak eta mioepitelialak alegia (Kordon & Smith, 1998).Jatorriz epitelio-zelulak diren zelula mioepitelialek, muskulu-zelulen antzera uzkurkorrakizanik, esnea albeoloetatik konduktuetara eroatearen ardura dute, oxitozinarenpresentzian uzkurtuz. Ugatz-guruinak, jatorri ektodermikoa du. Bere garapenarenabiapuntuari dagokionez, ektodermoaren loditze-gune bat aldameneko mesenkimanmurgilduz zelula ametan joria den baba edo konkor moduko egitura sortzen da. Gerora,baba horretatik adarkamenduak desberdintzatuz doaz (Smalley & Ashworth, 2003). Ugatz-guruinaren tamainaren behin-behineko emendioa eta adarkatutako egituren hedapena,hormona-kinada eraginda (Topper & Freeman, 1980), indibiduoaren bizitzan zehar garaijakin batzutan ematen da, pubertarora heldutakoan eta haurdunaldian, alegia, bukaera-babetan zelula amen presentzia nabarmena izanik (Smalley & Ashworth, 2003).Konduktuen adarkatze eta murrizketan, zelula amen ekintza eta apoptosiaren bidezkoheriotza zelularra berebiziko garrantzia duten prozesuak dira (24. Ird.). Hori dela eta,ugatz-gurina, desberdintzapen mekanismoak ikertzeko, zelulen proliferazioa etaheriotzaren arteko lankidetza barne, askotan erabili den eredu esperimentala dugu (Albertset al., 2002).

Zati Teorikoa

42

Epitelio-zelulen proliferazioari dagokionez, guztiz garatutako ugatz-guruinekozelula-mota guztiak zelula ama amankomun batetik (zelula ama multipotentziala) eratorriakdirela behatu da saguen kasuan (Kordon & Smith, 1998). Alde batetik, zelula esne-jariatzaileei dagokionez, haurdunaldian zelula ama zatitzen hastea hormonek eragitendute, beren kopurua hamar-hogei biderrez igo araziz. Horrela, konduktuen bukaera-zatiakhazi egiten dira, adarkamendu berriak eta, azkenean, zelula jariatzaile desberdintzatuezosatutako albeolo dilatatuak eratzen dira (Smalley & Ashworth, 2003). Beste alde batetik,zelula mioepitelialak ere, konduktuetako epitelioan dauden zelula ama multipotentzialetikeratorriak dira (Liu et al., 2005); albeoloak tapizatzen paratu aurretik oso desberdintzapen


43

24. Irudia: (A) Ugatz-guruineko bukaera-konduktuaren alde distalean zelula amak simetrikoki (gezi estuak) zeinasimetrikoki (gezi lodiak) zatitzen dira. Zatiketa asimetriko baten ostean, zelula kumeak zelula mioepitelialak edokonduktu-zelulak emateko desberdintzatzen dira. Argia sortzeko, epitelioko erpinaldean dauden guztiz desberdintzatugabeko zelulak apoptosian sartzen dira. (B) Ugatz-guruineko zelula ama batzuk zatiketa simetrikoa (gezi estuak) etaasimetrikoak (gezi lodiak) pairatzen dituzte epitelioa berriztatzeko. Beste zelula amek, ordea, soilik zatiketaasimetrikoa pairatzen dute, beraien zelula kumeak albeoloen zelula mioepitelialak eta zelula jariatzaileak ematekodesberdintzatuz (Smalley & Ashworth-etik (2003) birmoldatua).

prozesu luzea pairatu behar duten arren. Zelula ama multipotentzialak, garapen etadesberdintzapen fase guztietan xafla basalari lotuta behatu dira (Chepko & Smith, 1997;Chepko & Dickson, 2003). Epitelioaren berriztapenean zelula amen partehartzeakxehetasun handiz deskribatu da (24. Ird.; Smalley & Ashworth, 2003). Zelula amek, oro har,ezaugarri ultrastruktural nabarmenik ez duten arren (arestian aipatu den bezala), ugatz-guruineko zelula ama multipotentzialak berezko ezaugarri ultrastrukturalak baditu (Chepko& Dickson, 2003).

Aitzitik, zenbait ikerlanek hiru zelula amen mota desberdin daudela iradoki dute.Ugatz-guruinaren transplantea jaso duten arratoiak ikertuz, zelula ama multipotentzialazgain beste bi zelula ama desberdin, konduktu sekundariokoak eta albeolokoak alegia,egon daitezkeela ondorioztatu da (Kamiya et al., 1999; Kim et al., 2000). Azken biok zelulaama multipotentziala aitzindari amankomuna dute, eta bai zelula jariatzaileak zein zelulamioepitelialak emango lituzketelarik, norberak bere eskualdean (Kordon & Smith, 1998).Horrela orden hierarkikoa jarraituz, konduktu primarioetako zelula ama beste zelula amabion aitzindaria litzateke.

Esan bezala, zelulen heriotza ere ugatz-guruineko epitelioaren garapenean etaberriztapenean oso fenomeno garrantzitsua da. Izatez, esnea ekoizteko beharraamaitutakoan, zelula jariatzaileak apoptosi bitartez hiltzen dira, albeolo gehienakerregresioz desagertuz. Orduan, makrofagoek, hildako zelulen hondakinak fagozitatzendituzte, ugatz-guruina berriro ere latentzia egoerara itzuliz. Apoptosia hainbat faktore direlamedio aktibatzen da, esne-jariapena blokeatzen den tokietan TGFß3 (ß3 eraldaketahazkuntza-faktorea; ingeleraz, Transforming Growth Factor ß3) metatuz, adibidez.

Zati Teorikoa

44

25. Irudia: Penaeus semisulcatus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren irudi eskematikoa. Bertan zelula-motadesberdinen kokapena ikus daiteke. (E), zelula amak; (R), zelula birxurgatzaileak; (F), zuntz-zelulak; (B), babaitxurako zelulak; (M), zelula txikiak. (Al-Mohanna & Nott-etik (1989) birmoldatua).

Ugatz-guruinaren garapena, obarioko hormona, hormona adenokortikoide etahormona pituitarioen arteko elkarrekintzek eraenduta dago (Topper & Freeman, 1980);hormona horiek hazkuntza-faktoreen gainean duten eragina dela medio (Roberts & Sporn1992). Hazkuntza-faktore horien artean, hazkuntza-faktore epiteliala (EGF), fibroblastoenhazkuntza-faktorea (FGF), α eta ß eraldaketa hazkuntza-faktoreak (TGFα eta TGFß),intsulina antzeko hazkuntza-faktorea (ILGF) eta faktore kolonia-kitzikatzailea (CSF1)ditugu (Fischer & Lakshmanan, 1990; Derynck, 1992; Roberts & Sporn, 1992; Pollard &Hennighausen, 1994).

2.3.4.- Krustazeoen hepatoarea

Hepatoarea, krustazeoen heste ertaineko egitura nagusia da, bolumenari zeinkonplexutasunari dagokionez. Bertan, liseriketa-prozesuaren azkeneko faseak betetzen


45

26. Irudia: Astacus astacus krustazeoaren hepatoarearen tubuluaren enbrioi-gunearen histologia.orokorra (a-c)eta irudi mitotikoen zehaztasunak (d-k).(HS), gune hemolinfatikoa, (A), anafasea, (E), E-zelula, (N), nukleoa, (Me),metafasea, (TL), tubuluen argia, (P), profasea, geziburuek PAS gune positiboak adierazten dute, geziek mikrobiloskakadierazten dute.(Vogt-etik (1994)-tik hartua.

dira, esaterako: 1) aurreko hestetik jasotako elikagaien azken liseriketa; 2) aurrekohestean beharrezkoak diren entzimen ekoizpena, 3) liseriketa produktuen xurgapena etametaketa eta 4) hondakinen askapena. Hepatoarearen egitura-ardatz nagusia, konduktuprimario batek osatzen du; konduktu hori konduktu sekundariotan eta horiek bukaera-mutur itsuko tubuluetan adarkatuz bukatzen delarik (Gibson & Barker, 1979). Krustazeoenespezie desberdinetan, hepatoarearen sorrera eta desberdintzapena une desberdinetangerta daiteke. Zenbaitetan, Penaeus setiferus espeziea kasu, hepatoarea larbaondokofase berantiarrean itxuratzen hasten da; Homarus americanus espeziearen moduko bestekasuetan, berriz, enbrioi-fasean (Biesiot, 1986; Lovett & Felder, 1989).

Dena den, oro har, hepatoarearen epitelioan lau zelula-mota nagusi bereizi dira,hala nola: E-, R-, F- eta B-zelulak (25. Ird.). Zenbait espezietan, bosgarren zelula-mota batgehiago ere identifikatu da, M-zelula izena eman zaiona. E-zelulak (E, embrionary cell),tubuluen mutur distalean kokaturik, zelula ama gisa jokatzen du, eta beste zelula-motaguztien aitzindaria da. R-zelula (R, resorptive cell) birxurgatzailea da, ugariena izanik, etabertan lipido eta glukogenoaren metaketa gauzatzen dira. F-zelulak (F, fiber cells),tubuluen eskualde distalean aurki ditzakegu batik bat. B-zelulak (B, blisterlike cells)hepatoareako epitelioan deskribatu diren zelula handienak dira, tubuluen bi herenproximaletan nagusiak izanik. Azkenik, M-zelulak (M, midget cells), liseri-epitelioarenoinaldean kokaturik lumeneraino iristen ez diren zelula gutxi batzuk baino ez dira (Icely &Nott, 1992).

Aurrenez esan bezala, E-zelulek zelula ama gisa dihardute (26. Ird. Vogt, 1994).Izan ere, E-zelulek desberdintzapen-maila baxua erakusten dute. Haatik, zenbait autorekdiotenaren arabera, zelula-mota guztiak ez datoz zuzenean E-zeluletatik. Zehazki, R- etaF- zelulak, E-zelulen aldamenean kokaturik daudenak, E-zeluletatik eratorritako bi leinuzelular ezberdintzat kontsideratu diren arren, B-zelulak antzerako ezaugarriultrastrukturalak dituzten F-zeluletatik garatuko lirateke. (Loizzi, 1971; Hopkin & Nott,1979). Beste autore batzuk, Penaeus monodon espeziean B-zelula gazteak F- eta R-zelulagazteetatik zalantzarik gabe bereizi daitezkeenaz jabetu ondoren, B-zelulek euren aldetikE-zeluletatik zuzenean sortzen den leinu zelularra osatuko luketeela proposatu dute (Icely& Nott, 1992).

Zati Teorikoa

46

2.4.- Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioak

2.4.1.- Area

Arean, bi epitelio nagusi daude, entzimak liseri-traktura jariatzen dituzten zelulaexokrinoz osatutakoa eta odolera hormonak jariatzen dituzten zelula endokrinozosatutakoa. Area exokrinoa, epitelio bakunez osatutako azinoetan antolatuta dago, nonzelula nagusiak (jariatzaileak), zelula zentroazinarrak eta konduktu-zelulak deskribatubaitira. Langerhans irletan mataza moduan korapilatutako epitelio endokrinoaridagokienez, 4 zelula-mota bereizi dira, α-zelulek glukagona, ß-zelulek intsulina, γ-zelulek


47

ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA Ugaztunen epidermisa

Keratinozitoak

Keratinaren ekoizpena (babesa)

Epidermiseko zelula amak

Ugaztunen hestea Enterozitoak Muki-zelulak Zelula endokrinoak Paneth-zelulak

Hidrolasen jariapena/elikagaien xurgapena Mukiaren ekoizpena Hormonen jariapena Hazkuntza-faktore eta mikrobioen aurkako peptidoen jariapena

Kriptetako zelula amak.

Ugatz-guruina Zelula jariatzaileak Zelula mioepitelialak

Esnearen jariapena Uzkurketa/mugimendua

Ugatz-epitelioko zelula amak

Krustazeoen hepatoarea E zelulak R zelulak F zelulak B zelulak M zelulak

Zelula amak Lipido eta glukogenoaren metaketa Entzimen jariapena Elikagaien xurgapena/liseriketa Hondakinen metaketa

E zelulak

2. Taula: Zelula amen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, euren funtzioa eta jatorria.

area-polipeptidoa eta δ zelulek somatostatina ekoizten dutelarik (Orci & Unger, 1975;Wells, 2003; Jensen, 2004). Garapen embrionarioa ikertu duten autore batzuen aburuz,aurrealdeko gastrodermoan kokatutako zelulek, areako epitelio-zelula guztien zelula amamoduan dihardute (Le Douarin, 1988). Area helduaren epitelioen berriztapen normala 3H-T eta BrdU pultsuen bidez edo PCNA immunohistokimikaz ikertuz, zelula proliferatzaileakazino, konduktu zein Langerhans irletan lokalizatu dira (Githens, 1988; Muller et al., 1990,Elsässer et al., 1994). Hala ere, zelula amen identifikazioa eta berriztapen-mekanismoakez daude guztiz argi, eta horren inguruan ezbaika dabiltza ikertzaileen talde desberdinak.

Alde batetik, epitelioen berriztapen-mekanismoak ezagutzeko, zenbait ikertzaileepitelioak esperimentalki kaltetzean induzituriko zelulen proliferazioaren azterketaz baliatudira. Adibidez, kirurgiaren bitartez area osoaren %90-a erauzi ondoren, Langerhansirletako epitelioaren berriztapena, gelditu diren bertoko zelula endokrino desberdintzatuenzatiketari esker erdietsi daiteke; konduktu-epitelioaren berriztapenaren ardura zelulazentroazinar desberdintzatuek duten bitartean (Brockenbrough et al., 1988; Bonner-Weir etal., 1993). Berriztapen-prozesua berehalakoa da, erauzketa kirurgikoaren une beretsuanhasia hain zuzen ere. Ebakuntza eta gero gelditu diren zelulen kopurua jadanik 7 egunetanbikoiztera iristen da. Zatiketa-tasa bizkor hori, 21. egunerarte manten daiteke. Hala ere,zelula-mota guztien zatiketa-dinamika ez da berdina. α− eta ß-zelulek, BrdU-markaketarikbortitzena kirurgi-erauzketa burutu eta 2 egunetara erakutsi dute, noiz α-zeluletan jorianden Langerhans irlen gune periferikoa bereziki handituta agertu baita. 2. egun horretanintsulina eta glukagona batera ekoizten dituzten zelulak ere behatu dira, α -zelulak ß-zelula bihur daitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Lehenengo 5 egunetan, α-zelulen proliferazio-tasa, ß-zelulena baino altuagoa den bitartean, 7. egunetik aurreratendentzia hori irauli egiten da, behintzat 14 egun igaro artean (Hayashi et al., 2003).Tankera beretsuko zatiketa-dinamika area exokrinoan behatu da.

Zati Teorikoa

48

27. Irudia: Arearen zati baten kirurgi erauzketa eman eta 3 egunetara BrdU markaketa arearen azino, konduktueta Langerhans irletan (Hayashi et al., 2003. tik hartua).

Bestalde, zelula exokrinoak, endokrinoak emateko ere desberdintza daitezkeelaesperimentalki frogatu da, saguak espezifikoki ß-zelulak deuseztatzen dituenestreptozotozina izeneko farmakoaz tratatuz (Gu et al., 1997) zein area-konduktuakirurgikoki buxatuz (Bertelli & Bendayan, 1997). Esperimentu horietan amilasa eta intsulinabatera ekoitz ditzaketen zelulak deskribatu dira, zelula exokrinoak endokrino bihurdaitezkeenaren adierazgarritzat har litekeena. Zentzu berean, arratoi transgenikoengarapena aztertzean, zelula ametatik eratorritako zelula endokrino eta exokrinoenezaugarriak batera dituen zelula-mota bat aurkitu da (Gu et al., 1994). Halaber,konduktuetako zelula amak ß-zelulak emateko desberdintza daitezke, induzituriko kalteeierantzunez zein ezohiko eskari metabolikoen aurrean areagotu daitekeena (Bonner-Weir& Sharma, 2002).

Azkenik, arratoi transgenikoak eredu esperimental gisa erabiliz, areako zelulaendokrinoak zatiketa autologoz baino ez direla zatitzen ere proposatu da, partikularki ß-zelulen kasuan, egoera normalean zein arearen zati handia erauztekoan ß-zeluladesberdintzatuetatik soilik sor daitezkeenak (Dor et al., 2004).

Beraz, α− eta ß-zelulek jatorri berbera omen dutenez, eta zelula endokrino etaexokrinoen jatorria ere amankomuna omen denez, guztiok zelula ama beratik eratorriakizan daitezkeela pentsa genezake (Herrera 2000). Jatorrizko zelula ama horrek areakotranskribapen-faktorea edukiko lukeen arren, ez luke hormonen adierazpen-gaitasunikizango. Gainera, zelula ama amankomunetik zelula ama endokrino eta exokrinoa bereiztudaitezkeenik ezin da baztertu (Seaberg et al., 2004); ezta norberak gerora zelula amaespezifikoagoak eman litzakeenik ere. Izan ere, aitzindari endokrinoak, konduktutik gertuegon arren, ez lirateke konduktu-epitelioaren osagaiak izango (Gu et al., 2002).

2.4.2.- Listu-guruinak

Listu-guruinak, garatze-bidean dagoen mihi-epitelioaren loditze-gune batetiksortzen dira, zeinen ondoan, listu-guruinak izango diren baba itxurako formazio bat eratuz,kondentsazio mesenkimatikoa ematen baita (Melnick & Jaskoll, 2000). Listu-guruinhelduek itxura albeolotubularra dute, eta ehun konektiboak enkapsulatzen dituzten hainbatlobuluz osaturik daude. Eskualde albeolotubularra, azino jariatzaileen multzoek etakonduktuen sistema konplexu batek osatzen dute. Azinoen epitelioan zelula jariatzaileaketa zelula mioepitelialak daude; konduktu-epitelioetan, berriz, ez dago zelula jariatzaileriketa osmoeraenketa moduko funtzioak bertan betetzen dira (Actis et al., 2002).


49

Timidina tritiatuaz markatutako arratoi helduetan, konduktuen zelula pikortsuakkonduktu ertaineko oinaldeko zeluletatik eratorriak direla behatu da. Hasiera batean,konduktuen zelula pikortsu ildaxkatu bihurtzen dira (tarteko egoera), azkenean zelulapikortsu helduak bilakatu arte (Chai et al., 1993; Denny et al., 1993). 3H-T markaketa-indizeek erakutsi dutenaren arabera, ez dirudi konduktu ertainetako zelula amek bizkorzatitzen direnik. Haatik, jarduera proliferatzaile altuena zelula pikortsu ildaxkatuek erakutsidute. Hau da, zelula amak astiro zatitzen diren bitartean, zelula pikortsu ildaxkatuak, agianTAC zelulen analogotzat har genitzakeenak, bizkor zatitzen dira, gerora guztizdesberdintzatuak direnean zatiketa-tasa berriro ere motelduz doalarik (Chai et al., 1993).

Listu-guruinetan esperimentalki kalteren bat induzituz, azinoen kopuruan etatamainan murrizpena sortaraztekotan, (adb., apoptosia bultzatuz), konduktuen antzekoegitura tubularren agerpena suertatu da (Takahashi et al., 2002). Dirudienez, egituratubular horiek konduktu ertainetatik eratorriak izango lirateke, eta azino-zelulen zelulaaitzindarien ordezko sortuberriez osatuta egongo lirateke (Takahashi et al., 1998; 2002).Beste autore batzuen arabera, berriz, tubulu horiek zelula jariatzaileak galdu dituztenazinoak baino ez lirateke izango, zelulen kopuru egokia berreskuratuz gero berriro erefuntzionalak bilakatuko liratekeenak (Scott et al., 1999). Bistan denez, momentuz egituratubular horien jatorria eta esangura biologikoa ez daude batere argi.

Listu-guruinek, kirurgi-buxadura 5 egunez jasan ondoren, konduktuetako zelulapikortsu helduek proliferazio-jarduera handia erakutsi dute, 3H-T zein PCNA markaketakerabiliz frogatu dena (Takahashi et al., 2000). Aitzitik, listu-guruinen kirurgi-erauzketapartziala egin ondoren, azinoen berreskurapena konduktu nagusietako zelulen proliferazioeta desberdintzapenaren bitartez gauzatzen dela behatu da, ebakuntza eta gero geratzendiren azinoek nolabait ere parte hartzen dutelarik (Hanks & Chaudhry, 1971).

Zati Teorikoa

50

28. Irudia: Listu-guruineko konduktu nagusia buxatuta duen arratoian burututako PCNA immunohistokimika.Azino zein konduktuetako zelulek marka positiboa (geziak) erakutsi dute (Takahashi et al.-etik (2001) hartua).

Bestalde, arratoien listu-guruinetako epitelioan dimorfismo sexuala dagoelaaipagarria da. Arratoi ar gazteetan, konduktuetan agertzen diren zelula berri gehienakkonduktu-zelula helduen zatiketatik datoz; hau da, berezko zatiketa edo zatiketa autologoaizenekoa ematen da. Zelula berri desberdintzatuen %20 inguru baino ez dira konduktuertainetako zelula ametatik eratorriak, azinoetan dauden gainerako zelula guztiak zelulahelduen proliferazioz sortuak direlarik. Eme gazteetan, ordea, bai azinoetan zeinkonduktuetan dauden zelulen %60-a zelula ametatik eratorriak dira (Denny et al., 1997).Hala ere, emeak heltzen doazen heinean, azinoetako zelula berriak zeluladesberdintzatuen zatiketa autologoz sortzen dira, zelula amen parte hartzea adinarekinbatera gutxituz doalarik. Aitzitik, eme helduetan, konduktu-zelulak oraindik ere konduktuertainetako zelula ametatik datoz. Desberdintasun honen gakoa, hazkuntza-abiaduranegon daiteke. Izan ere, eme gazteen listu-guruinek oraindik ere hazten jarrai dezakete,batez ere azino-eskualdean; nolabaiteko izaera enbrionarioa mantentzera behartutadaudela erakutsi lezakeena (Denny et al., 1990).

2.4.3.- Ugaztunen gibela

Gibelak jatorri endodermikoa du, endodermoaren alde bentrala loditu egiten dagibelaren dibertikulua eratuz. Hepatoblastoek endodermotik migratzen dute baba modukoeskualde bereizia itxuratuz eta septum transversum izeneko gunean zehar proliferatzendute (Tosh & Strain, 2005). Gibeleko epitelioen berriztapena, ez da egoera normaletanzelula ama gutxi batzuei esker ematen, zelula helduen zatiketa autologoz baizik.Esaterako, gibelaren erauzketa kirurgikoa partzialaren ondoren, berriztapena gainontzekohepatozito zein behazun-epitelioko zelula helduen zatiketaz burutzen da (Fausto, 2001).Beraz, epitelio-zelula horiek oraindik ere guztiz desberdintzatu gabeak direla esangenezake. Are gehiago, hepatozitoak, esaterako, organismoaren biziraupen osoan zeharproliferatzeko gai dira. Kirurgi-erauzketa aplikatu eta hepatozitoetan DNAren sintesia hasibitarteko denbora-tartea hainbat faktoreen pean dago, argiztapen-erregimena eta elikatze-patroia, besteak beste (Yanagi & Potter, 1977). Aitzitik, farmako kartzinogenikoz trataturikoarratoien gibelean, epitelio-zelulen proliferazioa, zelula amatzat har litezkeen eta porta-guneko Hering kanaletan dauden itxura obaleko zelula txikien zatiketaz hasten da. Zelulahoriek bipotentzialak lirateke, hepatozitoak zein behazun-epitelioko zelulak emangobailituzkete (Theise et al., 1999). Antzeko itxura obaleko zelula txikiak barneko porta-gunean ere deskribatu dira, hepatozito zein areako zelulen aitzindaritzat hartu direnak(Tosh & Strain, 2005).


51

Hepatozitoen proliferazioa zerk pizten duen jakiteko hainbat ikerketa burutu dira.Esaterako, gibel-ehunaren zatiak edo eta hepatozito isolatuak gibela ez den ehun bateratransplantatu ostean transplante-hartzailearen gibelaren zati bat ebakuntza bidezerauztean, transplantatutako zelulek, gibela ez den ehun horretan dauden arren, DNAsintetizatzen hasten dira. Horrek, gibela erregeneratzen den bitartean odolean nolabaitekoseinale mitogenikoa agertzen dela iradoki du (Overturf et al., 1999). Izan ere, hepatozitoenhazkuntza-faktoreak (HGF; ingeleraz hepatocyte growth factor), berebiziko garrantziaomen dauka prozesu horretan. Are gehiago, in vitro mantendutako hepatozitoak, HGFrenpresentzian, eta bestelako zitokinen seinalerik bitarteko izan gabe, zatitzen hasten dira.Hala ere, in vivo, HGFz gain, epitelio-hazkuntza faktore (EGF; ingeleraz, epithelial growthfactor) moduko beste faktore batzuen plasma-kontzentrazioak ere igotzen dira kirurgi-erauzketaren ondorioz. Halaber, intsulina, interleukina 6 (IL6) eta norepinefrina molekulenbidezko seinalizazioa ere gibelaren erregenerazioa burutzeko ezinbestekoak dira, nahizeta hepatozitoentzat oinarrizko mitogenoak ez izan. Antza denez, nondik norako orokorrakezagutu diren arren, hepatozitoen proliferazioan diharduten seinale molekularrei buruzoraindik ere argilun dexente dago (Michalopoulos & DeFrances, 1997).

2.4.4.- Moluskuen liseri-guruina

Krustazeo eta intsektu (Vogt 1994; Loeb et al., 2003; Illa, 2005) zein ornodunetan(ikus aurreneko atalak) ez bezala, moluskuen epitelio-ehunen berriztapenaz oso ikerlangutxi burutu dira (Leibson & Frolova 1994). Konkretuki, moluskuen liseri-guruinekoepitelioaren berriztapenaz egindakoak bereziki urriagoak dira (Hanselmann et al., 2000;Marigómez et al., 1999), ehun horren egitura histologikoaz ikerketa ugari egin diren arren(Ikus 1. atala).

Zati Teorikoa

52

29. Irudia: Ostren liseri-epitelioko balizko zelula basofiliko baten anafasea (Yongue-tik (1926) hartua)

Urdaileko zelula amak identifikatu ez diren arren, zatiketa zelularren irudiakargitaratzeaz gain, proliferazio zelularra aztertzeko 3H-T bidezko markaketaz baliatu direnikerlanak burutu egin dira (Leibson & Frolova, 1994). Dirudienez, mitosia gertatutakoan,zatitzear dauden zelulek xafla basaletik urrundu behar dute, eta lumenaren alderamigratzen dute, ondoren zelula kumeek berriro ere epitelioaren oinalderaino itzuliz (Mix,1972). Antzeko prozesua Crenomytilus grayanus muskuiluaren heste-epitelioan deskribatuda, zelulen proliferazio-tasan sasoi-aldaketa nabarmenak aurkitu direlarik (Leibson &Frolova, 1994). Hala ere, zunda espezifikoak erabiliz edo ultrastruktura sakonki aztertuz,zelula amak identifikatzera zuzendutako lanik ez dugu ezagutu.

Bestalde, liseri-guruineko tubuluen epitelioari dagokionez, datu egokien gabeziabera dagoen arren, zelula amen presentzia proposatu da. Ostretan, liseri-epitelioko zelulenaitzindariak izan omen daitezkeenak, liseri-tubuluetako kriptetan aurkitu dira (29 Ird.;Yonge, 1926; Shaw & Battle, 1957; Mix & Sparks, 1971). Izatez, erradiazio ionizatzaileztrataturiko liseri-tubuluen epitelioan, kriptetako zelula horiek epitelio berriaren sorrerarenerantzule nagusiak dirudite (Mix & Sparks, 1971). Mytilus edulis muskuiluan eta Pectenmaximus beiran ere, desberdintzatu gabeko zelula ama bat dagoela proposatu da


53

30. Irudia: PCNA immunohistokimikamuskuiluaren liseri-guruinean etakrustazeoaren hepatoarean. Muskuiluenliseri-guruinean (a-b eta tarteko irudi txikia)positibotasun gehiena liseri-zelulei dagokie(geziak), nahiz eta zelula basofilikobatzuetan markaketa ere ageri den (geziburuak). Urdaileko zelulek markaketapositiboa erakutsi dute (c), eta baitahemozitoek (H) ere (irudi txikia). Kontrol-ebakinetan (d) ez da inolako seinalerikatzeman. Krustazeoen hepatoarearen E-zeluletan (e) markaketa bortitza behatu da.Zelulak desberdintzatuz doazen heineanmarkaketa arinago bihurtuz. E-zeluleneskualdean irudi mitotikoak (m) ikusdaitezke. Hepatoarearen kontrol-ebakinetan (f) ez da inolako markarikatzeman. Eskala-marra: 10 μm (a-c) eta 20μm (d-f) (Marigómez et al.-etik (1999)hartua).

(Thompson et al., 1974; Henry et al., 1991). Beste autore batzuen aburuz, epitelioarenberriztatzearen arduraduna ziliatua, hau da nahiko desberdintzatua, den zelula basofilikoberezia izango litzateke. Horrelakorik Cardium edule bibalbio eta Maricrypta monoxylaprosobrankio itsastarren kasuan iradoki zen (Owen, 1970; Nelson & Morton, 1979). Datupartzial eta eskas horietan oinarrituta, zelula amak zelula basofiloak direna zenbaithamarkadetan ontzat hartu da oro har, datu esperimental berrien sustapenik gabe.

Aitzitik, azken urteotan, Mytilus galloprovincialis muskuiluan, liseri-albeoloetakoepitelioko 2 zelula-motek, liseri-zelula eta zelula basofilikoa hain zuzen, PCNAimmunohistokimikaren bitartez S-fasean sartzeko gai direla frogatu da (30. Ird.; Marigómezet al., 1999). Gainera, bi zelula-motok EGF hartzaileak erakusten dituzte (Canesi et al.,2000). Hori dela eta, behintzat espezie honetan, liseri-epitelioko bi zelula helduak zatitzekogai direla dirudi, ugaztunen hepatozito moduan zatiketa autologoaz baliatuz. Ekarpenhorrek, muskuiluen liseri-guruinean zelula amaren existentzia kolokan utzi du. Hala ere,erradiazio ionizatzailearen eraginaren ondorioz jasandako kalte bortitzen aurrean zelula

Zati Teorikoa

54

ZELULA-MOTA FUNTZIOA JATORRIA Ugaztunen area á-Zelulak ß-Zelulak ã-Zelulak ä-Zelulak

Glukagonaren ekoizpena Intsulinaren ekoizpena Are-polipeptidoaren ekoizpena Somatostatinaren ekoizpena

á-Zelulak/Zelula exokrinoak ß-Zelulak/Zelula exokrinoak ã-Zelulak/Zelula exokrinoak ä-Zelulak/Zelula exokrinoak

Ugaztunen listu -guruina Zelulak jariatzaileak (exokrinoak) Konduktuetako zelulak Zelula jariatzaileak Zelula mioepitelialak Zelula parenkimatikoak

Liseri-entzimen jariapena Oreka osmotikoaren eraenketa Entzimen jariapena Uzkurketa/mugimendua Egituraketa

Zelula exokrinoak Konduktuetako zelula amak Konduktuetako zelula amak/ Zelula jariatzaileak Konduktuetako zelula amak Zelula parenkimatikoak

Ugaztunen gibela Hepatozitoak

Funtzio anitzak

Hepatozitoak/Hering kanaleko zelulak

Moluskuen liseri -guruina Liseri-zelula Zelula basofilikoa

Elikagaien liseriketa Entzimen jariapena

Liseri-zelulak/Kriptetako zelula amak Zelula basofilikoak/Kriptetako zelula amak

3. Taula: Desberdintzatutako zelulen bitartez berriztatzen diren epitelioen zelula-motak, beraien funtzioa etajatorria.

amek liardukete. Azken finean, zelula basofiliko desberdintzatuak (jariatzaileak edoziliatuak) zelula amak direla onartzeko zailtasunak aurkitu ditugun bitartean (Marigómez etal., 1999), Mix eta Sparks (1971) ikertzaileek deskribatutako zelula basofilikoak, txikiak etabiribilak izanik, zelula amak ez direla esateko ez dugu oinarri sendorik.


55

Zati Teorikoa

56

BIBLIOGRAFIA

Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, LaerumOD (1997) Circadian cell cycle variations oferythro- and myelopoiesis in humans. Eur. J.Haematol. 58:333-345.

Actis AB, Lampe PD, Eynard AR (2002) Cellularbasis and clinical implications of biologicalmarkers in salivary tissues: Their topologicaldistribution in murine submandibular gland. OralOncol. 38:441-449.

Alberts B, Jonson A, Lewis J, Raff M, Roberts K,Walter P (2002) Molecular biology of the cell. 4.edizioa. Taylor & Francis New York. 1463 orr.

Alison MR (1995) Assessing cellular proliferation:What's worth measuring? Human Exp. Technol.14:935-944.

Alison M, Golding M, Lalani EN, Nagy P,Thorgeirsson S, Sarraf C (1997) Wholesalehepatocytic differentiation in the rat fromductular oval cells, the progeny of biliary stemcells. J. Hepatol. 26:343-352.

Al-Mohanna SY, Nott JA (1989) Functional cytologyof the hepatopancreas of Penaeus semisulcatus(Crustacea: Decapoda) during the moult cycle.Mar. Biol. 101:535-544.

Argaud A, Bounoure L (1910) Contribution a l´etudeanatomique et histologique du tube digestifd´Arion rufus. S. Anat. Physiol. N. 46:146-174.

Awaji M, Suzuki T (1998) Monolayer formation andDNA synthesis of the outer epithelial cells frompearl oyster mantle in coculture withamebocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.34:486-491.

Babula A, Wielinska L (1988) Ultrastructural studiesof the digestive system of the slug, Derocerasreticulatum (Müller) (Pulmonata). Bull. Soc. AmisSci. Lettres de Poznam. Ser. D. Sci. Biol. 26:73-78.

Baisch H, Beck HP, Christiensen IJ, Hartmann NR,Fried J, Dean PN, Gray JW, Jett JH, JohnstonDA, White RA, Nicolini C, Zeitz S, Watson JV(1982) A comparison of mathematical methodsfor the analysis of DNA histograms obtained byflow cytometry. Cell Tiss. Kin. 15:235-249.

Bale SD, Howard TA, Moffett SB (2001) Neuronaland non-neuronal responses to nerve crush in apulmonate snail, Melampus bidentatus. Invert.Neurosci. 4:105-117.

Barbeito CG, González NV, Badrán AF (2003) Sexand Age-Related temporal variations inintestinal-epithelium proliferation in the sucklingmouse. Chronobiol. Int. 20:97-107.

Basalo C (1998) Organización morfofuncional delos alvéolos de la glándula digestiva del mejillónMytilus galloprovincialis. Lizentziatura-Tesia.UPV/EHU. 134 orr.

Baumforth KR, Grewal N, Large AT, Jones CJ, PerryCJ, Connock MJ (1998) Zonal rotor purificationand characterization of "mannosomes": atubular membrane system in gastropod molluscdigestive gland. Anal. Biochem. 263:189-197.

Beninger PG, Le Pennec M (1991) Functionallanatomy of the scallops. 133-166 orr. Non:Scallops: biology, ecology and aquaculture.Shunway SE (ed). Elsevier, Amsterdam.

Bertelli E, Bendayan M (1997) Intermediateendocrine-acinar pancreatic cells in duct ligationconditions. Am. J. Physiol. C 273:1641-1649.

Biesiot PM (1986) Changes in midgut glandmorphology and digestive enzyme activitiesassociated with development in early stages ofthe American lobster, Homarus americanus.Woods Hole Oceanographic Istitution, Publ.WHOI-86-20, PB89 190276: Doktoradutza-Tesia, 222 orr.

Bjarnason GA, Jordan R (2002) Rhythms in humangastrointestinal mucosa and skin. Chronobiol.Int. 19:129-140.

Boghen A, Farley J (1974) Phasic activity in thedigestive gland cells of the intertidalprosobranch Littorina saxatilis (Olivi) and itsrelation to the tidal cycle. Proc. Malacol. Soc.London 41:41-56.

Bonner-Weir S, Baxter LA, Schuppin GT, Smith FE(1993) A second pathway for regeneration ofadult exocrine and endocrine pancreas. Apossible recapitulation of embryonicdevelopment. Diabetes 42:1715-1720.

Bonner-Weir S, Sharma A (2002) Pancreatic stemcells. J. Pathol. 197:519-526.

Bibliografia

57

Bowen ID (1970) The fine structural localization ofacis phosphatase in the gut epithelial cells of theslug, Arion ater (L.). Protoplasma 70:73-81.

Bowen ID, Davies P (1971) The fine structuraldistribution of acid phosphatase in the digestivegland of Arion hortensis (Fre.). Protoplasma73:73-81.

Brandi GM Calabrese C, Pantaleo MA, MorselliLabate A, Di Febo G, Hakim R, De Vivo A, DiMarco MC & Biasco G (2004) Circadianvariations of rectal cell proliferation in patientsaffected by advanced colorctal cancer. Can.Lett. 208:193-196.

Bravo R, Frank R, Blundell PA, Mcdonald-Bravo H(1987) Cyclin/PCNA is the auxiliar protein ofDNA polimerase-D. Nature 326:515-517.

Bravo R, Macdonald-Bravo H (1987) Existence oftwo cyclin proliferating cell nuclear antigenduring the cell cycle: Association with DNAreplication sites. J. Cell Biol. 105:1549-1554.

Brockenbrough JS, Weir GC, Bonner-Weir S (1988)Discordance of exocrine and endocrine growthafter 90% pancreatectomy in rats. Diabetes37:232-236.

Brouard M, Barrandon Y (2003) Controlling skinmorphogenesis: hope and despair. Curr. Opin.Biotechnol. 14:520-525.

Bruno S, Darzynkiewicz Z (1992) Cell cycledependent expression and stability of thenuclear protein detected by Ki-67 antibody inHL-60 cells. Cell Prol. 25:31-40.

Cajaraville MP (1989) Efectos histopatológicos ycitotóxicos de los hidrocarburos derivados delpetróleo, y su cuantificación en el mejillónMytilus galloprovincialis (Lmk). Doktoradutza-Tesia. 577 orr.

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E(1990) Responses of basophilic cells of thedigestive gland of mussels to petroleumhydrocarbon exposure. Dis. Aquat. Org. 9:221-228.

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E(1991) Consequences of keeping Mytilus in thelaboratory as assessed by different cellularcondition indices. Helgol. Meeresunter. 45:445-464.

Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E(1992) Comparative effects of the wateraccommodated fraction of three oils on mussels2.- Quantitative alterations in the structure of thedigestive tubules. Comp. Biochem. Physiol. C102:113-123.

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, MarigómezI (1995a) Cellular biomarkers as useful tools inthe biological monitoring of environmentalpollution: molluscan digestive lysosomes. 29-55orr. Non:. Cell biology in environmentaltoxicology. Cajaraville MP (ed.). University of theBasque Country Press Service. Bilbo.

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, MarigómezI (1995b) Lysosomes as cellular markers ofenvironmental pollution: time- and dose-dependent responses of the digestive lysosomalsystem of mussels after petroleum hydrocarbonexposure. Environ. Toxicol. Water. Qual. 10:1-8.

Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C,Sarasquete C, Viarengo A (2000) The use ofbiomarkers to assess the impact of pollution incoastal environments of the Iberian Peninsula: apractical approach. Sci. Tot. Environ. 247:295-311.

Cancio I, Orbea A, Völkl A, Fahimi D, Cajaraville MP(1998) Induction of peroxisomal oxidases inmussels: comparison of effects of lubricant oiland benzo(a)pyrene with two typical peroxisomeproliferators on peroxisome structure andfunction in Mytilus galloprovincialis. Toxicol.Appl. Pharmacol. 149:64-72.

Canesi L, Malatesta M, Battistelli S, Ciacci C, GalloG, Gazzanelli G (2000) Immunoelectronmicroscope analysis of epidermal growth factorreceptor (EGFR) in isolated Mytilusgalloprovincialis (Lam.) digestive gland cells:Evidence for ligand-induced changes in EGFRintracellular distribution. J. Exp. Zool. 286:690-698.

Chai Y, Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993)Proliferative and structural differences betweenmale and female mouse submandibular glands.Anat. Rec. 235:303-311.

Zati Teorikoa

58

Chepko G, Dickson RB (2003) Ultrastructure of theputative stem cell niche in rat mammaryepithelium. Tiss. Cell 35:83-93.

Chepko G, Smith GH (1997) Three division-competent, structurally-distinct cell populationscontribute to murine mammary epithelialrenewal. Tiss. Cell. 29:239-253.

Colas P, Launay C, van Loon AE, Guerrier P(1993a) Protein synthesis control cyclin stabilityin metaphase I-arrested oocytes of Patellavulgata. Exp. Cell Res. 208:518-521.

Colas P, Serras F, Van Loon AE (1993b)Microinjection of suc 1 transcripts delays the cellcycle clock in Patella vulgata embryos. Int. J.Dev. Biol. 37:598-594.

Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM (1990) Label-retaining cells reside in the bulge area ofpilosebaceous unit: implications for follicularstem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.Cell 29:1329-1337.

Couch J (1984) Atrophy of diverticular epithelium asan indicator of environmental irritants in theoyster Crassostrea virginica. Mar. Environ. Res.14:525-526.

Czarna Z, Krasowka E, Turska R (1985) The tubularstructures in the cells of the digestive gland ofArion rufus (Mollusca Gastropoda). Zool.Poloniae 32: 23-28.

David H, Götze J (1963) ElektronenmikroskopischeBefunde an der Mitteldarmdrüse vonSchnecken. Z. Mikrosk.-Anat. Forsch. (Leipzig).70:252-272.

Daughaday WH, Rotwein P (1989) Insulin-likegrowth factors I and II. Peptide, messengerribonucleic acid and gene structures, serum, andtissue concentrations. Endocr. Rev. 10:68-91.

Dellambra E, Golisano O, Bondanza S, Siviero E,Lacal P, Molinari M, D'Atri S, De Luca M (2000)Downregulation of 14-3-3sigma prevents clonalevolution and leads to immortalization of primaryhuman keratinocytes. J. Cell Biol. 29: 149:1117-1130.

Dekens MPS, Santoriello C, Vallone D, Grassi G,Withmore D, Foulkes NS (2003). Light regulatesthe cell cycle in zebrafish. Curr. Biol. 13:2051-2057.

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1990)Three-dimensional localization of DNA synthesisin secretory elements of adult female mousesubmandibular gland. Adv. Dent. Res. 4:34-44.

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993)Parenchymal cell proliferation and mechanismsfor maintenance of granular duct and acinar cellpopulations in adult male mouse submandibulargland. Anat. Rec. 235:475-485.

Denny PC, Ball WD, Redman RS (1997) Salivaryglands: a paradigm for diversity of glanddevelopment. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 8:51-75.

Derynck R (1992) The physiology of transforminggrowth factor-α. Adv. Canc. Res. 58:27-52.

Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin ofexcretory cells in the digestive gland of the landsnail Helix lucorum. Malacologia 44:145-151.

Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2001) Lysosomaland lipid alterations in the digestive gland ofmussels, Mytilus galloprovincialis (L.) asbiomarkers of environmental stress. Environ.Pollut. 115:123-137.

Dondero F, Viarengo A (2005) Development of novelsensitive molecular markers for marineenvironment biomonitoring employing mussels.15th SETAC Europe Anual Meeting. Lille.

Dor Y, Brown J, Martinez OI, Melton DA (2004) Adultpancreatic β-cells are formed by self-duplicationrather than stem-cell differentiation. Nature429:41-46.

Edgar BA, Lehner CF (1996) Developmental controlof cell cycle regulators: a fly´s perpective.Science 274:1664-1672.

Eirin-López JM, González-Tizón AM, Martínez A,Méndez J (2002) Molecular and evolutionaryanalysis of mussel histone genes (Mytilus spp.):possible evidence of an "orphon origin" for H1histone genes. J. Mol. Evol. 55:272-83.

Elsasser HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growthof rat pancreatic acinar cells quantitated with amonoclonal antibody against the proliferatingcell nuclear antigen. Cell Tiss. Res. 276:603-609.

Endl E, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein:fascinating forms and an unknown function. Exp.Cell Res. 257:231-237.

Bibliografia

59

Faderl S, Keating MJ, Do KA, Liang S.-Y, KantarjianH.M, O'Brien S, Garcia-Manero G, Manshouri T,Albitar M (2002) Expression profile of 11 proteinsand their prognostic significance in patients withchronic lymphocytic leukemia (CLL). Leukemia16:1045-1052.

Fausto N (2001) Liver regeneration: Fromlaboratory to clinic. Liver Trasn. 7:835-844.

Finegood DT, Scaglia L, Bonner-Weir S (1995)Dynamics of beta-cell mass in the growing ratpancreas. Estimation with a simplemathematical model. Diabetes 44:249-256.

Fisher DA, Lakshmanan J (1990) Metabolism andeffects of epidermal growth factor and relatedgrowth factors in mammals Endocr. Rev. 11:418-442.

Foley J, Ton T, Maronpot R, Butterworth R,Goldworthy TL (1993) Comparison ofproliferating cell nuclear antigen to tritiatedthymidine as a marker of proliferatinghepatocytes in rats. Environ. Health Prespec.101:199-205.

Fretter V, Graham A (1962) British prosobranchmolluscs. Ray Society. 755 orr.

Furuta E, Yamaguchi K, Shimozawa A (1994) Blood-cell producing site in the land slug Incilariafruhstorferi. Kaibogaku. Zasshi. 69:751-764.

Gage FH (2000) Mammalian neural stem cells.Science 287:1433-1438.

Gerdes J, Lemke H, wacker H, Schwab HJ, Stein H(1984) Cell cycle analysis of a cell proliferationasociated human nuclear antigen defined by themonoclonal antibody Ki-67. J. Immunol.133:1710-1715.

Gerlach C, Golding M, Larue L, Alison MR, GerdesJ (1997) Ki-67 immunoexpression is a robustmarker of proliferative cells in the rat. Lab.Invest. 77:697-698.

Ghazizadeh S, Taichman LB (2001) Multiple classesof stem cells in cuteneous epithelium; a lineageanalysis of adult mouse skin. EMBO J. 20:1215-1222.

Gibson R, Barker PL (1979) The decapodhepatopancreas. Oceangr. Mar. Biol. Ann. Rev.17:285-346.

Githens S (1988) The pancreatic duct cell:proliferative capabilities, specific characteristics,metaplasia, isolation, and culture. J. Pediatr.Gastroenterol. Nutr. 7:486-506.

Goldblum JR, Appelman HD (1995) Stromal tumorsof the duodenum: A histologic andimmunohistochemical study of 20 cases. Am. J.Sur. Pathol. 19:71-80.

Golias CH, Charalabopoulos K, Chralabopoulos K(2004) Cell proliferation and cell cycle control: amini review. Int. J. Clin. Pract. 58:1134-1141.

González-Melendi P, Testillano PS, Ahamadian P,Fadón B, Risueño MC (1996) New in situapproaches to study the induction of pollenembryogenesis in Capsicum anuum L. Eur. J.Cell Biol. 69:373-386.

Gratzner HG (1982) Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagentfor detection of DNA replication. Science218:474-475.

Grimaldi A, Tettamanti G, Rinaldi L, Brivio MF,Castellani D, de Eguileor M (2004) Muscledifferentiation in tentacles of Sepia officinalis(Mollusca) is regulated by muscle regulatoryfactors (MRF) related proteins. Dev. GrowthDiffer. 46:83-95.

Gu D, Lee MS, Krahl T, Sarvetnick N (1994)Transitional cells in the regenerating pancreas.Development 120:1873-1881.

Gu D, Arnush M, Sarvetnick N (1997)Endocrine/exocrine intermediate cells instreptozotocin-treated Ins-IFN-γ transgenicmice. Pancreas 15:246-250.

Gu G, Dubauskaite J, Melton DA (2002) Directevidence for the pancreatic lineage: NGN3+cells are islet progenitors and are distinct fromduct progenitors. Development 129:2447-2457.

Hale SA, Capuco AV, Erdman RA (2003) Milk yieldand mammary growth effects due to increasedmilking frequency during early lactation. J. DairySci. 86:2061-2071.

Hall PA, Levinson DA (1990) Review: assessment ofcell proliferation in histological material. J. Clin.Pathol. 43:184-192.

Hall PA, Levison DA, Woods AL, Yu CCW, KellockDB, Watkins JA, Barnes DM, Gillett CE,

Zati Teorikoa

60

Camplejohn R, Dover R, Waseem NH, Lane DP(1990) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)immunolocalization in paraffin sections: An indexof cell proliferation with evidence of deregulatedexpression in some neoplasms. J. Pathol.162:285-294.

Hall PA, Watt F (1989) Stem cells: the generationand maintenance of cellular diversity.Development 106:619-633.

Hanks CT, Chaudhry AP (1971) Regeneration of ratsubmandibular gland following partialextirpation. A light and electron microscopicstudy. Am. J. Anat. 130:195-208.

Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000)Identification of proliferating cells in hard clams.Biol. Bull. 199:199-200.

Hayashi KY, Tamaki H, Handa K, Takahashi T,Kakita A, Yamashina S (2003) Differentiationand proliferation of endocrine cells in theregenerating rat pancreas after 90%pancreatectomy. Arch. Histol. Cytol. 66:163-174.

Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, Rugg CA,Musgrove EA (1983) Method for analysis ofcellular DNA content of paraffin-embeddedpathological material using flow cytometry. J.Histochem. Cytochem. 31:1333-1335.

Henry M (1987) Glande digestive de la palourdeRuditapes decussatus, en métabolisme deroutine. I. La cellule digestive. II La cellulesécrétice. Vie Marine 6:7-24.

Henry M, Bocaud-Camou E, Lefort Y (1991)Functional micro-anatomy of digestive gland ofthe marine bivalves. Mar. Environ. Res. 17:286.

Herrera PL (2000) Adult insulin- and glucagon-producing cells differentiate from twoindependent cell lineages. Development127:2317-2322.

Hickmott PW, Carew TJ (1991) An autoradigraphicanalysis of neurogenesis in juvenile Aplysiacalifornica. J. Neurobiol. 22:313-326.

Hopkin SP, Nott JA (1979) Some observations onconcentrically structured, intracellular garnulesin the hepatopancreas of the shore crabCarcinus maenas (L.). J. Mar. Biol. Assoc. U.K.59:867-877.

Hotchin NA, Gandarillas A, Watt FM (1995)Regulation of cell surface beta 1 integrin levelsduring keratinocyte terminal differentiation J.Cell Biol. Mar. 128:1209-1219.

Howard A, Pelc SR (1950) P32 autoradiographs ofmouse testis; preliminary observations of thetiming of spermatogenic stages. Br. J. Radiol.23:634-641.

Howard B, Mitchell PC, Ritchie A, Simkiss K, TaylorM (1981) The composition of intracellulargranules from the metal-accumulating cells ofthe common garden snail (Helix aspersa).Biochem. J. 194:507-511.

Hunt T, Luca FC, Ruderman JV (1992) Therequirements for protein synthesis anddegradation, and the control of destruction ofcyclins A and B in the meiotic and mitotic cellcycles of the clam embryo. J. Cell Biol. 116:707-724.

Icely JD, Nott JA (1992) Digestion and absortion:digestive system and associated organs. 147-201 orr. Non: Microscopic Anatomy ofInvertebrates. Harrison FW & Kohn AJ (ed). 10;Decapod Crustacea: FW. Wiley-Liss. Inc. NewYork.

Illa I (2005) Un nuevo modelo para el estudio de ladiferenciación de las células madre (stem cells):el nido de regeneracion de Locusta.Doktoradutza-Tesia. Universidad de Navarra.164 orr.

Izagirre U, Ruiz P, Marigómez M (2005) Earlylysosomal membrane destabilisation onexposure to pollutants in mussel digestive cells.13rd Symposium PRIMO.

Jain S, Filipe MI, Hall PA, Waseem N, Lane DP,Levison DA (1991) Prognostic value ofproliferating cell nuclear antigen in gastriccarcinoma. J. Clin. Pathol. 44:655-659.

Janssen HH (1985) Some histological findings ofthe mid-gut gland of the common garden snail,Arion rufus (L.) (Syn. A. ater rufus (L.), A.emporicorum Férrusac), Gastropoda:Stylommatophora. Zool. Anz. 215:33-51.

Jensen UB, Lowell S, Watt FM (1999) The spatialrelationship between stem cells and theirprogeny in the basal layer of human epidermis:

Bibliografia

61

a new view based on whole-mount labelling andlineage analysis. Development 126:2409-2418.

Jensen J (2004) Gene regulatory factors inpancreatic development. Dev. Dyn. 229:176-200.

Joensuu H, Klemi PJ, Korkeila E (1988) Prognosticvalue of DNA ploidy and proliferative activity inHodkin's disease. Am. J. Clin. Pathol. 90:670-673.

Jones PH, Harper S, Watt FM (1995) Stem cellpatterning and fate in human epidermis. Cell80:83-93.

Kamiya K, Higgins PD, Tanner MA, Gould MN,Clifton KH (1999) Kinetics of mammaryclonogenic cells and rat mammary cancerinduction by X-rays or fission neutrons. J.Radiat. Res. 40 Suppl:128-137.

Kikuyama S, Kubora T, Watanabe M, Ishibiki K, AbeO (1988) Cell kinetic study of human carcinomasusing bromodeoxyuridine. Cell Tiss. Kin. 20:1-6.

Kim ND, Oberley TD, Yasukawa-Barnes J, CliftonKH (2000) Stem cell characteristics oftransplanted rat mammary clonogens. Exp. CellRes. 10: 260:146-159.

Klauser DK, Denny PA, Denny PC (1993)Proliferative and structural differences betweenmale and female mouse submandibular glands.Anat. Rec. 235:303-313.

Kordon EC, Smith GH (1998) An entire functionalmammary gland may comprise the progeny froma single cell. Development 125:1921-1930.

Krijgsman, B (1928) Arbeitsrhythmus derVerdauungsdüsen bei Helix pomatia. II.Sekretion, Resorption und Phagocytose. Z.Vergl. Physiol. 8:187-280.

Krishnakumar PK, Casillas E, Vanarasi U (1995)Effect of environmental contaminants on thehealth of Mytilus edulis from Puget Sound,Washington, U.S.A. II. Cytochemical detection ofsubcellular changes in digestive cells. Mar. Biol.124:251-259.

Krucher NA, Roberts MH (1994) Identification ofCDK- and cyclin-like proteins in the eye of Bullagouldiana. J. Neurobiol. 25:1200-1206.

Kurki P, Vanderlaan M, Dolbeare F (1986)Expression of proliferating cell nuclear antigen

(PCNA)/cyclin during the cell cycle. Exp. CellRes. 166:209-218.

Lamers AE, Heiney JP, Ram JL (1999) Cloning andsequence analysis of two cDNAs encodingcyclin A and cyclin B in the zebra musselDreissena polymorpha. Biochim. Biophys. Acta1448:519-24.

Langton RW (1975) Syncrony in the digestivediverticula of Mytilus edulis L. J. Mar. Biol. Ass.U.K. 55:221-229.

Lavker RM, Sun TT (2000) Epidermal stem cells:properties, markers, and location. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 97:13473-13475.

Le Douarin NM (1988) On the origin of pancreaticendocrine cells. Cell 22:169-171.

Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-springessential reorganization of cell proliferation inthe digestive tract epithelia in the musselCrenomytilus grayanus. Mar. Biol. 118: 471-477.

Lekube X (1997) Mytilus galloprovincialismuskuiluaren liseri-guruinaren plastizitatea etadinamika zelularra: 3D-berreraiketa eta PCNAbidezko azterketa. Lizentziatura-tesia.UPV/EHU. 130 orr.

Lekube X, Cajaraville MP, Marigómez I (2000) Useof polyclonal antibodies for the detection ofchanges induced by cadmium in lysosomes ofaquatic organisms. Sci. Tot. Environ. 247:201-212.

Le Pennec G, Le Pennec M (2002) Molecularanalysis of the seasonal expression of genescoding for different functional markers of thedigestive gland of the bivalve mollusk Pectenmaximus (L.). Comp. Biochem. Physiol. B133:417-426.

Li A, Normand P, Redvers R, Kaur P (2004)Extensive tissue-regenerative capacity ofneonatal human keratinocytes stem cells andtheir progeny. J. Clin. Invest. 113:390-400.

Lillo C, Velasco A, Jimeno D, Cid E, Lara JM, AijónJ (2002) The glial design of a teleost optic nervehead supporting continuous growth. J.Histochem. Cytochem. 50:1289-1302.

Littleton RJ, Baker GM; Soombro IN, Adams RL,Whimster WF (1991) Kinetic aspects of Ki-67

Zati Teorikoa

62

antigen expression in a normal cell line. VirchowArch. B Path. Incl. Mol. Path. 60:15-19.

Liu S, Dontu G, Wicha MS (2005) Mammary stemcells, self-renewal pathways, andcarcinogenesis. Breast Canc. Res. 7:86-95.

Loeb MJ, Clark EA, Blacburn M, Hakim RS, ElsenK, Smagghe G (2003) Stem cells from midgutsof Lepidopteran larvae: clues to the regulation ofstem cells fate. Arch. Insect. Biochem. Physiol.53:186-198.

Loizzi RF (1971) Interpretation of crayfishhepatopancreatic function based on finestructural analysis of epithelial cell lines andmussel networks. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat.113:420-440.

van Loon AE, Colas P, Goedemans CE, Neant I,Dalbon P, Guerrier P (1991) The role of cyclinsin the maturation of Patella vulgata oocytes.EMBO J. 10:3343-3349.

Lovett DL, Felder DL (1989) Ontogeny of gutmorphology in the white shrimp Penaeussetiferus (Decapoda, Penaeidae). J. Morphol.201:53-68.

Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects ofoil in the digestive cells of mussels: quantitativealterations in cellular and lysosomal structures.Aquat. Toxicol. 1:213-226.

Lowe DM (1988) Alterations in the cellular structureof Mytilus edulis resulting from exposure toenvironmental contaminants under field andexperimental conditions. Mar. Ecol. Prog. Ser.46:91-100.

Luchtel DL, Martin AW, Deyrup-Olsen I, Boer HH(1997) Gastropoda: Pulmonata. 459-718 orr.Non: Microscopic Anatomy of Invertebrates. FWHarrison FW & Kohn AJ (ed). 6B; Mollusca II.Wiley-Liss. Inc.

Lufty RG, Demian ES (1967) The histology of thealimentary system of Marisa cornuarietis(Mesogastropoda: Ampullariidae). Malacologia5:375-422.

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Coppertreatment of the digestive gland of the slug Arionater L. 2. Morphometrics and histophysilogy.Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36:608-615.

Marigómez I (1989). Aportacion citohistológicas a laevaluación de efectos subletales de cadmio enel medio marino: estudios con el prosobranquioLittorina littorea. Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU.430 orr.

Marigómez I, Vega MM, Cajaraville MP, Angulo E(1989) Quantitative responses of the digestivelysosomal system of winkles to sublethalconcentrations of cadmium. Cell Mol. Biol.35:555-562.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990)Histopathology of the digestive gland-gonadcomplex of marine prosobranch Littorina littorea(L.) exposed to cadmium. Dis. Aquat. Organ.9:229-238.

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1991) Responsesof winkles digestive cell and their lysosomalsystem to environmental salinity changes. CellMol. Biol. 37:29-39.

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1992) Seasonalvariability in the quantitative structure of thedigestive tubules of Littorina littorea. Aquat.Living. Resour. 5:299-305.

Marigómez I, Soto M, Etxenberria M, Angulo E(1993) Effects of size, sex, reproduction andtrematode infestation on the quantitativestructure of digestive tubules in stressedwinkles. Zool. J. B. Anat. 123:319-336.

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, SalisburyJR (1995a) Computer assisted 3-Dreconstruction techniques may provide newinsights into the pattern of histologicalorganisation of the bivalvian digestive gland.12th Inter. Malacol. Congr. Vigo.

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, SalisburyJR (1995b) A novel model for the histologicalstructure of the molluscan digestive gland basedon computer aided 3D-reconstruction andscanning microscopy. VI Cong. SEBC. Congr.Lleida.

Marigómez I, Orbea A, Olabarrieta I, Etxeberria M,Cajaraville MP (1996) Structural changes in thedigestive lysosomal system of sentinel musselsas biomarkers of environmental stress inMussel-Watch programmes. Comp. Biochem.Physiol. C 113:291-297.

Bibliografia

63

Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X(1998a) Cell-type replacement, a succesfulstrategy of molluscs to adapt to chronicexposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol.18:431-435.

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998b)Tissue-level biomarkers in sentinel slugs ascost-effective tools to assess metal pollution insoils. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 34:167-176.

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999)Immunochemical localisation of proliferatingcells in mussel digestive gland tissue.Histochem. J. 31:781-788.

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and general lysosomal responses indigestive cells of mussels exposed to modelorganic chemicals. Aquat. Toxicol. 64:235-257.

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, GarmendiaL, Cajaraville MP (2005) Cell and tissuebiomarkers in mussel, and histopathology inhake and anchovy from Bay of Biscay after thePrestige oil spill (Monitoring campaign 2003).Mar. Poll. Bull. (prentsan).

Marshman E, Booth C, Potten CS (2002) Theintestinal epithelial stem cell. BioEssays 24:91-98.

Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J(1994) Proliferation kinetics of mussel (Mytilusgalloprovincialis) gill cells. Mar. Biol. 120: 41-45.

Martynova MG, Bystrova OA (2002)Undifferentiated cells in the snail myocardiumare capable of DNA synthesis andmyodifferentiation. Biol. Bull. 203:104-111.

Mason AZ (1983) The uptake, accumulation andexcretion of metals by the marine prosobranchgastropod mollusc Littorina littorea (L).Doktoradutza-Tesia. University of Wales,Gwyneed (UK). 575 orr.

Mason AZ, Simkiss K (1982) Sites of mineraldeposition in mineral-accummulating cells. Exp.Cell Res. 139:383-391.

McQuiston RW (1969) Cyclic activity in the digestivediverticula of Lasae rubra (Montagu) (Bivalvia:Eulamellibranchia). Proc. Malacol. Soc. London38:483-492.

Melnick M, Jaskoll T (2000) Mouse submandibulargland morphogenesis: a paradigm for embryonicsignal processing. Crit. Rev. Oral Biol. Med.11:199-215.

Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in thedigestive gland of the marine prosobranchgastropod, Littorina littorea (L.). Proc. Malacol.Soc. London 40:473-482.

Michalopoulos GK, DeFrances MC (1997) Liverregeneration. Science 276:60-66.

Mix MC (1972) Chronic tissue degeneration in thePacific oyster, Crassostrea gigas, followingacute irradiation. Radiat. Res. 49:176-189.

Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestivetubule tissue of the pacific oyster, Crassostreagigas, damaged by ionizing radiation. J.Invertebr. Pathol. 17:172-177.

Miyachi K, Fritzler MJ, Tan EM (1978) Autoantibodyto a nuclear antigen in proliferating cells. J.Immunol. 121:2228-2234.

Moore MN, Pipe RK, Farrar SV (1987) Induction oflysosomal lipid accumulation and fattydegeneration by polycyclic aromatichydrocarbons in molluscan digestive cells. Mar.Environ. Res. 17:230-233.

Morasso M, Tomic-Canic M (2005) Epidermal stemcells: the cradle of epidermal determination,differentiation and wound healing. Biol. Cell97:173-183.

Morgan DO (1997) Cyclin-dependent kinases:Engines, Clocks, and Microprocessors. Ann.Rev. Cell Dev. Biol. 13:261-291.

Morris GF, Mathews MB (1989) Regulation ofproliferating cell nuclear antigen during the cellcycle. J. Biol. Chem. 264:13856-13864.

Morton JE (1956) The tidal rhythm and action of thedigestive system of the lamellibranch Lasaearubra. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 35:563-586.

Morton BS (1969) Studies on the biology ofDreissenas polymorpha Pal. II. Correlation of therhythms of adductor activity, feeding, digestionand excretion. Proc. Malacol. Soc. London38:401-414.

Morton BS (1970) The tidal rhythm and rhythm offeeding and digestion in Cardium edule. J. Mar.Biol. Assoc. U.K. 50:499-512.

Zati Teorikoa

64

Morton BS (1971) The diurnal rhythm and tidalrhythm of feeding and digestion in Ostrea edulis.Biol.J. Linn. Soc. 3:329-342.

Morton B (1979) The diurnal rhythm and the cycle offeeding and digestion in the slug Derocerascaruanae. J. Zool. 187:135-152.

Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia.65-147 orr. Non: The Mollusca. 5. AcademicPress. Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.) NewYork.

Moya J (1973) Estructura fina de algunos elementosglandulares y sus anejos en el aparato digestivodel limaco común Arion empiricorum, Ferussac(Gasterópodo pulmonado). Universidad deBilbao. Doktoradutza-Tesia.

Moya J, Rallo AM (1975) Intracisternalpolycylinders: a cytoplasmic structure in cells ofthe terrestrial slug Arion empiricorum Férussac(Pulmonata, Stylommatophora). Cell Tiss. Res.159:423-433.

Muller R, Laucke R, Trimper B, Cossel L (1990)Pancreatic cell proliferation in normal ratsstudied by in vivo autoradiography with 3H-thymidine. Virchows. Arch. B. Cell Pathol. Incl.Mol. Pathol. 59:133-136.

Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL,Henderson EB (2003) Evaluation of cellproliferation in rat tissues with BrdU, PCNA, Ki-67(MIB-5) Immunohistochemistry and in situhybridization for histone mRNA. J. Histochem.Cytochem. 51:1681-1688.

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity andepithelial renewal in the digestive gland tubulesof the marine prosobranch Maoricryptamonoxyla (Lesson). J. Moll. Stud. 45: 262-283

Nigg EA (1995) Cyclin-dependent protein kinases:key regulators of the eukaryotic cell cycle.BioEssays 17:471-480.

Oka K, Arai T (1996) MIB1 growth fraction is notrelated to prognosis in cervical squamous cellcarcinoma treated with radiotherapy. Int. J. Gyn.Pathol. 15:23-27.

Orci L, Unger RH (1975) Functional subdivision ofislets of Langerhans and possible role of D cells.Lancet 20: 2:1243-1244.

Oro AE, Scott MP (1998) Splitting hairs: dissectingroles of signaling systems in epidermaldevelopment. Cell 25: 95:575-578.

Overturf K, Al-Dhalimy M, Finegold M, Grompe M(1999). The repopulation potential of hepatocytepopulation differing in size and prior mitoticexpansion. J. Am. Pathol. 155:2135-2143.

Owen G (1956) Observations on the stomach anddigestive diverticula of the Lamellibranchia II.The Nuculidae. Q. J. Microsc. Sci. 97:541-567.

Owen G (1966) Digestion. Non: Physiology of themolluscan. 53-96 orr. Wilbur KM & Yonge CM(ed.). 2. Academic Press. New York.

Owen G (1970) The fine structure of the digestivetubules of the marine bivalve Cardium edule.Phil. Trans. R. Soc. London Ser. 60:299-318.

Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes andbivalves. Sci. Prog. 60: 299-318.

Owen G (1973) The fine structure andhistochemistry of the digestive diverticula of theprotobranchiate bivalve Nucula sulcata. Proc. R.Soc. London B. 183:249-264.

Pal SG (1972) The fine structure of the digestiv etubules of Mya Arenaria L. II. Digestive cell.Proc. Malacol. Soc. London. 40:161-170.

Palacios J, Honrado E, Ososio A, Cazorla A, SarrióD, Barroso A, Rodríguez S, Cigudosa JC, DiezO, Alonso C, Lerma E, Dopazo J, Rivas C,Benítez J (2005) Phenotypic characterization ofBRCA1 and BRCA2 tumors based in a tissuemicroarray study with 37 immunohistochemicalmarkers. Breast Cancer Res. Treat. 90:5-14.

Palmer RW (1979) Histological and histochemicalstudy of digestion in the bivalve Arctica islandicaL. Biol. Bull. 156:115-129.

Peatman E, Kucuktas H, Li P, He C, Feng J, Wei X,Liu Z Differentially expressed oyster(Crassostrea virginica) genes after exposure tomercury. 2005. eko uztailan eskuratua.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=31900849”.

Peruzzi E, Sonetti D (2004) Microglia proliferationas a response to activation in the freshwatersnail Planorbarius corneus: A BrdU incorporationstudy. Acta Biol. Hung. 55:287-291.

Bibliografia

65

Platt AM (1971) Doktoradutza-Tesia. The Queen´sUniversity. Belfast.

Pirger Z, Elekes K, Kiss T (2004) Functionalmorphology of the salivary gland of the snail,Helix pomatia: a histochemical andimmunocytochemical study. Acta Biol. Hung.55:221-232.

Pollard JW, Hennighausen L (1994) Colonystimulating factor 1 is required for mammarygland development during pregnancy. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9312-9316.

Potten CS (1998) Stem cells in gastrointestinalepithelium: Numbers, characteristics and death.Philo. Trans. R. Soc. London Ser. B Biol. Sci.353:821-830.

Potten CS & Loeffler M (1990) Stem cells: attributes,cycles, spirals, pitfalls and uncertainties.Lessons for and from the crypt. Development110:1001-1020.

Potten CS, Booth C, Tudor GL, Booth D, Brady G,Hurley P, Ashton G, Clarke R, Sakakibara S,Okano H (2003) Identification of a putativeintestinal stem cell and early lineage marker;musashi-1. Differentiation 71:28-41.

Prelich G, Tan CK, Kostura M, Mathews MB, SØAG, Downey KM, Stillman B (1987) Functionalidentity of proliferating cell nuclear antigen and aDNA polymerase-δ auxiliar protein. Nature326:517-520.

Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glánduladigestiva de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia,Eulamellibranchia): reconstruccióntridimensional asistida por ordenador ymicroscopía electrónica de barrido.Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 112 orr.

Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Lightand electron microscopic studies of the acuteand chronic toxic effects of N-nitrosocompounds on the marine mussel Mytilus edulis(L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine.Aquat. Toxicol. 3:301-311

Reddy AB, Wong GKY, O´Neill J, Maywood ES,Hastings MH (2005) Circadian clocks: Neuraland peripheral pacemakers that impact upon thecell division cycle. Mut. Res. 574:76-91.

Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988)Zinc tratment of the digestive gland of the slugArion ater L. 1. Cellular distribution of zinc andcadmium. Bull. Environ. Contam. Toxicol.41:858-864.

Regoli F (1992) Lysosomal responses as a sensitivestress index in biomonitoring heavy metalpollution. Mar. Ecol. Prog. Ser. 84:63-69.

Roach DK (1968) Rhythmic muscular activity in thealimentary tract of Arion ater (L) (Gastropoda:Pulmonata). Comp. Biochem. Physiol. 24:865-878.

Roberts CG, De Fazio A, Tattersal MH (1985) Asimple rapid meted for the identification of cyclincells in freshly excised tumors. Cytobios 43:313-318.

Roberts AB, Sporn MB (1992) Differentialexpression of the TGF-β isoforms inembryogenesis suggests specific roles indeveloping and adult tissues. Mol. Reprod. Dev.32:91-98.

Robinson WE, Langton RW (1980) Digestion in asubtidal population of Mercenaria mercenaria(Bivalvia). Mar. Biol. 58:73-79.

Robinson WE (1983) Assessment of bivalveintracellular digestion based on directmeasurements. J. Moll. Stud. 49:1-8.

Robledo Y, Cajaraville MP (1996) Ultrastructural andcytochemical study of the Golgi vomplex ofmollusca (Mytilus galloprovincialis) digestivecells. Cell Tiss. Res. 284:449-458.

Rudolph KL, Chang S, Millard M, Schreiber-Agus N,DePinho RA (2000) Inhibition of experimentalliver cirrhosis in mice by telomerase genedelivery. Science 287:1253-1258.

Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs.Hutchinson University Library, London. 184 orr.

Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990)Histomorphology and histochemistry of thedigestive gland of Littorina littorea (L.) in relationto experimental tidal conditions, food availability,and digestion. Zool. Jb. Anat. 120:185-196.

Salvini-Plawen LV (1988) The structure and functionof molluscan digestive systems. 301-379 orr.Non: The Molluscan. Form and function 11.

Zati Teorikoa

66

Trueman ER & Clarke MR (ed). AcademicPress, Orlando, Florida.

Sancho E, Batlle E, Clvers H (2004) Signalingpathways in intestinal development and cancer.Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 20:695-723.

Sanskrithi N, Eskin A (1999) Effects of cyclin-dependent kinase inhibitors on transcription andocular circadian rhythm of Aplysia. J.Neurochem. 72:605-613.

Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995)Assessment of proliferative activity by anti-PCNA monoclonal antibodies in formalin-fixed,paraffin-embedded samples and correlation withmitotic index. Vet. Pathol. 32:93-96.

Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G,Asghar Z, Wheeler MB, Korbutt G, van der KooyD (2004) Clonal identification of multipotentprecursors from adult mouse pancreas thatgenerate neural and pancreatic lineages. Nat.Biotechnol. 22:1115-1124.

Schluter C, Duchowr M, Wohlenberg C, BeckerMHG, Key G, Flad HD, Gerdes J (1993) The cellproliferation-associated antigen of antibody Ki-67: A very large, ubiquitous nuclear protein withnumerous repeated elements, representing anew kind of cell cycle-maintaining proteins. J.Cell Biol. 123:513-522.

Schmetsdorf S, Gärtner U, Arendt T (2005)Expression of cell cycle-related proteins indeveloping and adult mouse hippocampus. Int.J. Dev. Neurosci. 23:101-112.

Scholzen T, Gerdes J (2000) The Ki-67 protein:From the known and the unknown. J. CellPhysiol. 182:311-322.

Scott J, Liu P, Smith PM (1999) Morphological andfunctional characteristics of acinar atrophy andrecovery in the duct-ligated parotid gland of therat. J. Dent. Res. 78:1711-1719.

Sesto A, Navarro M, Burslem F, Jorcano JL (2002)analysis of the ultraviolet B response in primaryhuman keratinocytes using oligonucleotidemicroarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99:2965-2970.

Sherr CJ (1996) Cancer cell cycles. Science274:1672-1677.

Simkiss K (1981) Cellular discrimination processesin metal accumulating cells. J. Exp. Biol. 94:317-327.

Slack JM (1995) Developmental biology of thepancreas. Development 121:1569-1580.

Slack JM (2000) Stem cells in epithelial tissues.Science 287:1431-3.

Smalley M, Ashworth A (2003) Stem cells and breastcancer: a field in transit. Nat. Rev. Canc. 3:832-844.

Sminia T (1981) Gastropods. Non: Invertebrateblood cells. 1. 191-232 orr. Ratcliffe NA &Rowley AF (ed). New York: Academic Press.

Smith GH, Gallahan D, Diella F, Jhappan C, MerlinoG, Callahan R (1995) Constitutive expression ofa truncated INT3 gene in mouse mammaryepithelium impairs differentiation and functionaldevelopment. Cell Growth. Differ. 6:563-577.

Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I(1990) A planimetric study of morphologicalvariability in the digestive diverticula of Littorinalittorea (Linnaeus) and Mytilus edulis (Linnaeus).J. Moll. Stud. 56:339-344.

Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996) Tissueand cell distribution of copper, zinc and cadmiumin the mussel, Mytilus galloprovincialis,determined by autometallography. Tiss. Cell28:557-568.

Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailabilityassessment in "Mussel-Watch" programmes byautomated image analysis of BSD in digestivecell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141-150.

Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M,Morgan AJ, Marigómez I (2002) Subcellulardistribution of cadmium and its cellular ligands inmussel digestive gland cells as revealed bycombined autometallography and X-raymicroprobe analysis. Histochem. J. 34:273-280.

Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T (2001)Stem cells find their niche. Nature 414:98-104.

Sumner AT (1965) The cytology and histochemistryof the digestive gland cells of Helix. Q. J.Microsc. Sci. 106:173-192.

Bibliografia

67

Sumner AT (1966) The fine structure of the digestivegland of Helix, Succinea and Testacella. J. Roy.Microsc. Soc. 85:181-192.

Sumner AT (1969) The distribution of some hydrliticenzymes in cells of the digestive gland of certainlamellibranchs and gastropods. J. Zool. 158:277-291.

Suzuki A, Nakauchi H, Taniguchi H (2004)Prospective isolation of multipotent pancreaticprogenitors using flow-cytometric cell sorting.Diabetes 53:2143-2552.

Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997)Morphological alterations in the digestivediverticula of Mizuhopecten yessoensis(Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas ofPeter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ.Res. 44:85-98

Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Islam N,Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2000).Apoptosis and mitosis of parenchyal cells in theduct-ligated rat submandibular gland. Tiss. Cell32:457-463.

Takahashi S, Nakamura S, Suzuki R, Shinzato K,Domon T, Yamamoto T, Wakita M (2001)Apoptosis and mitosis of myoepithelial cells inatrophic rat submandibular glands. J.Histochem. Cytochem. 49:1557-1563.

Takahashi S, Schoch E, Walker NI (1998) Origin ofacinar cell regeneration after atrophy of the ratparotid induced by duct obstruction. Int. J. Exp.Pathol. 79:293-301.

Takahashi S, Shinzato K, Nakamura S, Domon T,Yamamoto T, Wakita M (2002) The roles ofapoptosis and mitosis in atrophy of theraltsublingual gland. Tiss. Cell 34:297-304.

Theise ND, Saxena R, Portmann, BC, Thung SN,Yee H, Chiriboga L, Kumar A, Crawford JM(1999) The canals of Hering and hepatic stemcells in humans. Hepatology 30:1425-1433.

Thompsom RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974)Effects of starvation on structure and function inthe digestive gland of the mussel (Mytilusedulis). J. Mar. Biol. 54:699-712.

Till JE, McCulloch EA (1961) A direct measurementof the radiation sensitivity of normal mouse bonemarrow cells. Radiat. Res.14:213-222.

Tosh D, Strain A (2005) Liver stem cells-prospectsfor clinical use. J. Hepatol. 42:75-84.

Tomasovic SP, Mix MC (1974) Cell renewal in thegill of the freshwater mussel Margaritiferamargaritifera: an autoradiographic study usinghigh specific activity tritiated thymidine. J. CellSci. 14:561-569.

Tomic-Canic M, Agren MS, Alvarez OM (2004)Epidermal repair and the chronic wound. Non:The epidermis in wound healing. 25-57 orr.Rovee D & Maibach H (ed). CRC Press, U.S.A.

Topper YJ, Freeman CS (1980) Multiple hormoneinteractions in the developmental biology of themammary gland. Physiol. Rev. 60:1049-1106.

Toschi L, Bravo R (1988) Changes incyclin/proliferating cell nuclear antigendistribution during DNA repair synthesis. J. CellBiol. 107:1623-1628.

Totafurno J, Bjerkes M, Cheng H (1987) The cryptcycle. Crypt and villus production in the adultintestinal epithelium. Biophys. J. 52:279-294.

Triebskorn R (1991) The impact of molluscicides onenzyme activities in the hepatropancreas ofDeroceras reticulatum (Müller). Malacologia 33:255-272.

Triebskorn R, Kohler HR (1996) The impact ofheavy metals on the grey garden slug,Deroceras reticulatum (Muller): Metal storage,cellular effects and semi-quantitative evaluationof metal toxicity. Environ. Poll. 93:327-343.

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989)Quantitative alterations in digestive cell structureof the marine gastropod Littorina littorea onexposure to cadmium. Mar. Biol. 103: 547-553.

Venier P, Pallavicini A, De Nardi B, Lanfranchi G(2003) Towards a catalogue of genestranscribed in multiple tissues of Mytilusgalloprovincialis. Gene 314:29-40.

Visakorpi T (1992) Proliferative activity determinedby DNA flow cytometry and proliferating cellnuclear antigen (PCNA) immunohistochemistryas a prognostic factor in prostatic carcinoma. J.Pathol. 168:7-13.

Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology ofthe hepatopancreatic cells of Astacus astacus.Crustacea, Decapoda. Zoomorphol. 114:83-101.

Zati Teorikoa

68

Voltzow J (1994) Gastropoda: Prosobranchia. Non:Microscopic Anatomy of Invertebrates. 5. 111-252 orr. Harrison FW & Kohn AJ (ed). Wiley-Liss. Inc.

Walker G (1969) Studies on digestion of the slugAgriolimax reticulatus (Müller) (Mollusca,Pulmonata, Limacidae). Doktoradutza-Tesia,University of Wales.

Walker G (1971) The cytology, histochemistry, andultrastructure of the cell types found in thedigestive gland of slug, Agriolimax reticulatus.Protoplasma 71: 91-109.

Walker G (1972) The digestive system of the slug,Agriolimax reticulatus (Müller): Experiments onphagocytosis and nutrient absortion. Proc.Malacol. Soc. 40:33-43.

Waseem NH, Lane DP (1990) Monoclonal antibodyanalysis of the proliferating cell nuclear antigen(PCNA). Structural conservation and thedetection of a nuclear form. J. Cell Sci. 96:121-129.

Watt FM (2000) Epidermal stem cells as targets forgene transfer. Hum. Gene Ther. 16:2261-2266.

Weinstein J, Jacobsen FW, Hsu-Chen J, Wu T,Baum LG (1994) A novel mammalian protein,p55CDC, present in dividing cells is associatedwith protein kinase activity and has homology tothe Saccharomyces cerevisiae cell division cycleproteins Cdc20 and Cdc4. Mol. Cell Biol.14:3350-3363.

Wells JM (2003) Genes expressed in the developingendocrine pancreas and their importance forstem cell and diabetes research. DiabetesMetab. Res. Rev. 19:191-201.

Widdows J, Moore MN, Lowe DM. 1984. Sublethalbiological effects and short-term recovery ofmussels (Mytilus edulis) and winkles (Littorinalittorea) following chronic exposure to petroleumhydrocarbon. Non: Long term effects of oil onmarine benthic communities in enclosures.Norwegian Institute for Water Research/NIVATechnical Report No. 0-8200.

Wood RD, Shivji MKK (1997) Which DNApolymerases are used for DNA-repair ineukaryotes? Carcinogenesis 18:605-610.

Yamada K, Yoshitake K, Sato M, Ahnen DJ (1992)Proliferating cell nuclear antigen expression innormal, preneoplastic, and neoplastic colonicepithelium of the rat. Gastroenterology 103:160-167.

Yanagi S, Potter VR (1977) Sequential changes inornithine decarboxylase thymidine kinase, andother enzyme activities in regenerating liver inrats on controlled feeding schedules. Life Sci.1:1509-1519.

Yonge CM (1926) The digestive diverticula inLamellibranchia. Trans. Roy. Soc. Edinbourgh54: 703-718.

Yoshino TP (1976) Histopathological effects of larvaldigenea on the digestive epithelia of the marineprosobranch Cerithidea californica: finestructural changes in the digestive gland. J.Invert. Pathol. 28:209-216.

Yu CCW, Hall PA, Fletcher CDM, Camplejohn RS,Waseem NH, Lane DP, Levison DA (1991)Haemangiopericytomas: The prognostic value ofimmunohistochemical staining with amonoclonal antibody to proliferating cell nuclearantigen (PCNA). Histopathol. 19:29-33.

Zakharov IS, Hayes NL, Ierusalimsky VN,Nowakowsky RS, Balaban PM (1998)Postembryonic neurogenesis in theprotocerebrum of the terrestrial snail, Helixlucorum L. J. Neurobiol. 35:271-276.

Zhu MH, Ni CR, Zhu Z, Li FM, Zhang SM (2003)Immunohistochemical demonstration of cyclinsA, B, D1, D3 and E in hepatocellular carcinomasusing tissue microarrays. Zhonghua. Bing. Li.Xue. Za. Zhi. 32:440-443.

AUZIAREN EGOERA

Moluskuen liseri-guruina eraenketa metabolikoaren organo nagusia da. Horrela,

sistema immunean eta barne medioaren (pH, Ca-kontzentrazioa…) eraenketa

homeostatikoan parte hartzen du, eta elikagaien liseriketa intrazelular eta estrazelularraren

zein hondakinen jariapenaren arduradun nagusia da. Dena den, eta zati teorikoan azaldu

den moduan, moluskuen liseri-guruinaren epitelioa zelula-mota urriz osaturik dago, 2 edo

3 zelula-mota. Liseri-guruina, gainera, estres peko egoera desberdinetan modu

neurgarrian erantzuteko gai da, liseri-epitelioaren lodieraren murrizpenarekin edota liseri-

zelulen lisosomen tamaina eta osagaien aldaketarekin besteak beste. Hala ere, liseri-

guruineko epitelioan gertatutako aldaketen artean garrantzitsuena beharbada zelula-

moten ordezkapena da. Horrela, zelula basofilikoen dentsitate erlatiboa liseri-guruinean

liseri-zelularenaren gainetik emendatu egiten da. Dena den, prozesu hori liseri-zelulen

galera, zelula basofilikoen proliferazioa edo bi prozesuen elkarrekintzak sortua den argitu

beharra dago. Liseri-guruinaren antolakuntza-eredua desberdina da molusku espezie

desberdinen artean eta osaketa zelularra ere desberdina da. Horretaz gain, modelo

desberdinek erakusten duten plastikotasuna ere desberdina da, hori dela eta nagusiki

muskuilu itsastarrean deskribatu diren aldaketak beste molusku-ereduetan orokortu

daitezkeen ere ezagutzea komenigarria litzateke.

Ugaztunen epitelio-ehun desberdinetan kalteren baten eraginez, epitelio-zelulen

galera esanguratsua gertatzekotan, epitelioaren berreskurapena bi modu desberdinetan

ematen da nagusiki; epitelio-ehunen zelula amen zatiketaren bidez, edo oraindik ere

epitelioan darraiten zelula helduen zatiketen bidez. Moluskuen liseri-guruinean, hala ere,

zelula amen presentzia oraindik ere argitzeko dago, eta beraz beharrezkoa zaigu epitelio

honen berriztapena nola ematen den ulertzea, eta baita ere moluskuen bizi-zikloan zehar

berriztapena nola eraentzen den ezagutzea.

Bestalde, moluskuak ingurugiro kutsaduraren organismo zentinela gisa aspaldi

erabiliak izan dira. Izan ere, beraien ehunetan kutsatzaileak metatzen dituzte, eta

kutsatzaileen aurrean modu neurgarrian erantzuteko gai dira. Erantzun neurgarri hauen

artean biomarkatzaileak ditugu. Biomarkatzaileak antolakuntza-maila xinpleetan ematen

diren aldaketen neurketak dira, beranduago eta antolakuntza-maila konplexuagoetan

gertatuko diren aldaketak aurresateko baliogarriak izango zaizkigunak. Hori dela eta,

organismo hauen gainean, eta batez ere beraien liseri-guruinean, hainbat neurketa

biologiko (biomarkatzaileak) zein kimiko (biometaketa) burutzen dira. Liseri-guruinean

gertatzen diren zelula-moten aldaketek, beraz, eragin zuzena eduki dezakete ingurugiro-

71

Hipotesi eta helburuak

kalitatearen jarraipen programetan egindako hainbat neurketetan. Hortaz, zelula-moten

ordezkapenak neurketa hauetan hainbat alditan behatutako emaitza eztabaidatsuetan

eragina izan ote dezaken argitu beharra dago.

HIPOTESIA

Moluskuen liseri-guruineko epitelioaren berriztapena zelula helduen zatiketa

autologoz burutzen da eta aldagai naturalen pean alda daiteke. Esaterako, liseri-epitelioan

ingurumen-estresak bultzatutako zelula-moten ordezkapena, zelula basofilikoen

proliferazio areagotuak eragiten du. Bederen, zelula-moten osaketaren aldaketa horrek,

kutsaduraren jarraipen-programetan erabilitako zenbait biomarkatzaileen gainean eragina

du.

HELBURUAK

Aipatutako hipotesia frogatzeko asmoz, ikerlan honetarako hurrengo helburu

orokor hauek proposatu ditugu:

1.- Moluskuen liseri-guruinaren epitelioaren berriztapena zelula amen edo zelula

helduen zatiketaz ematen den argitzea.

2.- Epitelioaren berriztapenaren dinamika ezagutzea eta beren gain zeintzu

faktorek eragiten duten zehaztea.

3.- Moluskuen liseri-guruinean gertatzen den zelula-moten ordezkapena, zelula

basofilikoen proliferazioak eraginda dagoen antzematea.

4.- Aldaketa horiek kutsaduraren jarraipenerako erabiltzen diren ohiko hainbat

biomarkatzaileen gainean nolako eragina duten zehaztea.

Ikerlanaren helburu orokor horiek segidan azalduko diren eta “Emaitzak eta

Eztabaida” atalean ekin diegun honako helburu espezifiko hauetan xehatu dira.

1.- Kutsatzaile metaliko zein organikoek, muskuiluen liseri-guruineko epitelioan

zelula-moten ordezkapena noiz, nola eta zein puntutaraino eragin dezaketen jakitea.

2.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioko zelula-moten ordezkapenak

autometalografiaz errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen hedapena gisako

biomarkatzaileen gainean nolako eragina duen zehaztea.

72


3.- Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren berriztapenak patroi zirkadianoa edo

zirkamareala jarraitzen ote duen zehaztea.

4.- Tamaina, sasoi eta itsasaldi-erregimena gisako faktore naturalek Mytilus

galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko zelulen jarduera

proliferatzailean nolako eragina duten zehaztea

5.- Kadmioz kutsatutako magurioetan zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen

kopuruaren murrizpen zuzenarekin edota zelula basofilikoen proliferazioarekin

erlazionatuta ote dagoen zehaztea.

6.- Balizko zelula-moten ordezkapen horrek metalen esposizio eta efektu

bilogikozko biomarkatzaileen gainean eraginik ote duen antzematea.

7.- Kutsatzaile organiko eta metalikoen nahasketa pean egondako bareen liseri-

guruinean zelula-moten ordezkapena liseri-zelulen galerarekin edo kaltzio-zelulen

proliferazioarekin erlazionatuta dagoen eta prozesu hori itzulgarria ote den zehaztea.

8.- Prozesu horrek konposatu kimiko horien biometaketan eta efektu eta esposizio-

biomarkatzaileetan nola eragiten duen finkatzea.

9.- Kronikoki kutsadura pean egondako bareen liseri-guruineko osaketa zelularra

zein den zehaztea eta toki garbira lekuzaldatu ondoren liseri-guruinaren osaketa zelularrari

zein biomarkatzaileen erantzunei dagokionez, kutsadura kroniko horrek sorterazitako

aldaketak norainoko eragina izan dezaketen esagutzea.

73


74


Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen peanjarritako muskuiluen liseri-guruinean

Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-epitelioa bi zelula-motez osaturik dago,liseri-zelula eta zelula basofilikoa. Egoera normaletan liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoakdira, baina kutsatzaileen eraginez zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren emendioa deskribatu da.Alterazio horri, zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type replacement) deritzo.Autometalografia (AMG), metalak zeluletan lokalizatzearen bidez metal kutsatzaileen ingurune-mailakebaluatzeko erabiltzen den teknika histokimiko sentikorra da, metalak zilarrezko hauspeakin beltz (BSD;ingeleraz, black silver deposits) gisa liseri-zelulen lisosometan agertzen direlarik. Ikerlan honen helburuakhiru dira. Lehenik, Cd moduko kutsatzaileek CTR eragin dezakeenentz jakitea. Bigarrenik, AMGzerrebelatutako Cd-ren kokapena zelula-espezifikoa den ultrastruktura-mailan egiaztatzea eta, horrelabalitz, AMGren bidez egindako estimazioen gain CTRk zer nolako eragina duen ezagutzea. Azkenik, CTRgerta dadin kutsatzaile desberdinen zein kontzentrazio beharrezkoak diren eta prozesua itzulgarria denfinkatzea. Helburu horiek lortzeko, muskuiluak kutsatzaile organiko eta ez-organikoen kontzentrazio peaneta denbora-tarte desberdinetan mantendu dira laborategiko bost esperimentu osagarritan. CTRkuantifikatzeko, liseri-guruinaren parafinazko ebakietan zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa(VvBAS) estimatu da estereologiaren bidez. Era berean, BSDen dentsitate bolumetrikoa (VvBSD) irudi-

analisia erabiliz kalkulatu da. Horrela, Cd-k CTR eragiten duela demostratu dugu. Bestalde, BSD liseri-zelulen lisosomen barruan eta beren mintzaren inguruan lokalizatu dira espezifikoki, eta inoiz ez zelulabasofilikoetan. BSD, metal espezifikoak ez diren arren, S-ri asoziatutako Cd ioien inguruan eratuak direlaX izpien mikroanalisia eta mapaketen bidez erakutsi dugu. Lokalizazio zelula-espezifiko horren ondorioz,CTRk VvBSD balioen gainean eragina duela frogatu dugu, ingurumen-metalen bioeskuragarritasunaren

estimazioak egiterakoan arazoak ekar litzakeena. Bestetik, kutsatzaile organiko, ez-organiko zein beraiennahasketek CTR eragin dezaketela ikusi dugu, kutsatzaile desberdinen kontzentrazio eraginkorradesberdina den arren.

Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, autometalografia, kadmioa, benzo(a)pirenoa, X izpienmikroanalisia, muskuilua, liseri-guruina.

Zelula-moten ordezkapena kutsatzaileen pean jarritako muskuiluen liseri-guruinean

77

Cell-type replacement in the digestive gland of mussels exposed topollutants

Abstract: The digestive gland epithelium of the mussel Mytilus galloprovincialis (Lmk) is comprised oftwo cell types, namely digestive and basophilic cells. Under normal circumstances digestive cellsoutnumber basophilic cells but under the influence of pollutants a relative increase in the proportion ofbasophilic cells has been described. This alteration has been termed cell-type replacement (CTR).Autometallography (AMG) is a sensitive histochemical technique to localize metals in cells as black silverdeposits (BSD) and has been used in the assessment of environmental metal pollution. BSD are localizedin the digestive cells lysosomes. The objectives of this work are three. First, to know whether pollutants suchas Cd were able to induce CTR. Second, to check wether Cd localization revealed by AMG at theultrastructural level were cell-specific and, if so, to determine wether CTR influenced the estimations madeby AMG. Finally, to determine the effective concentration of various pollutants to provoke CTR and to checkwether CTR is reversible. For these purposes mussels were exposed to different concentrations of organicand inorganic pollutants at various exposure-times in five complementary laboratory experiments. In orderto quantify CTR, volume density of basophilic cells (VvBAS) was estimated on hematoxylin-eosin stained

sections by means of stereology. Similarly, the volume density of BSD (VvBSD) was calculated with the aid

of an image analysis. Results revealed that Cd provoked CTR. On the other hand, while BSD werespecifically localized within digestive cells lysosomes, basophilic cells were devoid of BSD. X-raymicroprobe analisys and X-ray mapping demonstrated that although BSD are not metal specific they weremainly formed around the Cd associated to S atoms. Due to this specific localization, CTR influencesVvBSD values, and therefore when environmental bioavailable metal levels are estimated this must be

taken into account. On the other hand, organic and inorganic pollutants or their mixtures can provoke CTRalthough critical concentrations may change.

Key Words cell-type replacement, autometallography, cadmium, benzo(a)pyrene, X-ray microanalysis,mussel, digestive gland.

Emaitzak eta eztabaida

78

Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de mejillonesexpuestos a contaminantes

Resumen: El epitelio de la glándula digestiva del mejillón Mytilus galloprovincialis (Lmk) estáconstituido por dos tipos celulares, denominados célula digestiva y célula basófila, respectivamente. Encircunstancias normales las células digestivas son más numerosas que las basófilas pero bajo la influenciade contaminantes se ha descrito un aumento en la proporción relativa de células basófílas. Ésta alteraciónha sido denominada sustitución de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement). Laautometalografía (AMG) es una técnica histoquímica sensible que mediante la localización de metales enlas células ha sido utilizada en la evaluación de la contaminación metálica del medio ambiente detectandolos metales como depósitos negros de plata (BSD; del inglés, black silver deposits) en los lisosomas de lascélulas digestivas. El presente estudio tiene tres objetivos. Primero, saber si contaminantes como el Cd soncapaces de provocar CTR. Segundo, determinar si el Cd revelado mediante AMGa nivel ultrastructural selocaliza específicamente en un tipo celular, y si así fuera, conocer si CTR tiene alguna influencia en lasestimaciones hechas sobre los datos obtenidos mediante AMG. Finalmente, establecer lasconcentraciones necesarias por diferentes contaminantes para provocar CTR y determinar si CTR es unproceso reversible. Para cumplir estos objetivos se han diseñado cinco experimentos de laboratoriocomplementarios en los que se han expuesto mejillones a diferentes concentraciones durante diferentesperiodos de tiempo a contaminantes orgánicos e inorgánicos. Para cuantificar CTR se ha estimado ladensidad volumetrica de células basofílicas (VvBAS) en cortes de parafina mediante esterología. Del

mismo modo, se ha calculado la densidad volumétrica de BSD (VvBSD) mediante análisis de imagen. Los

resultados demuestran que el Cd provoca CTR. Por otro lado, mientras los BSD se localizan asociados ala membrana de los lisosomas de las células digestivas, las células basofílicas no muestran BSD. Medianteel empleo de microanálisis y mapeo de rayos X se ha demostrado que aunque los BSD no son específicospara cada tipo de metal, éstos se forman mayormente alrededor de los átomos de Cd asociados a S.Debido a esta localización específica, CTR influye sobre los valores de VvBSD y por lo tanto puede crear

problemas al estimar la biodisponibilidad metálica en el medio ambiente. Por otro lado, los contaminantesorgánicos, inorgánicos y la mezcla de éstos provocan CTR aunque las concentraciones efectivas sondiferentes en cada caso.

Palabras clave: sustitución de tipos celulares, autometalografía, cadmio, benzo(a)pireno, microanálisis derayos X, mejillón, glándula digestiva.


79


80


81

SARRERA

Muskuiluen liseri-guruinaren epitelioa bi zelula-

motez osaturik dago: liseri-zelulak eta zelula

basofilikoak (Morton, 1983). Liseri-zelulek oso

sistema endo-lisosomiko garatua dute, eta batez

ere barne-liseriketaz arduratzen diren arren,

kutsatzaileen metaketan eta detoxifikazioan ere

parte har dezakete (Viarengo, 1989; Cajaraville et

al., 1995). Zelula basofilikoek duten funtzioa

momentuz argitzeke dago, baina liseriketa

estrazelularrean parte har dezakete, horretarako

beharrezkoak diren entzimak sortu eta jariatzen

dituztelarik. Izan ere, beraien erretikulu

endoplasmatiko pikortsua oso garatua dago, eta

horrek beren basofilia bereizgarria emango lieke

(Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1998;

Dimitriadis et al,. 2004). Egoera normaletan liseri-

zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak dira;

baina inguruneko estres-iturri desberdinek,

kutsatzaileek sortutako estresak barne,

epitelioaren osaketan aldaketak sortarazi ditzakete,

zelula basofilikoen proportzio erlatiboa emendatuz

(Thompson et al.,1974; Rasmussen et al., 1983;

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990a;

Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998).

Estresak induzitutako alterazio hori, zelula-moten

ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type

replacement) izenaz ezagutzen dena, liseri-zelulen

galerak, zelula basofilikoen proliferazioak edo bi

prozesu horien konbinaketak sortarazia izan

daitekeela proposatu da (Marigómez et al., 1990a).

Muskuiluen kasuan, N-nitroso konposatuek

(Rasmussen et al., 1983), eta petrolioen eta olio

lubrifikatzailearen uretan egokitutako frakzioak

(WAF; ingeleraz, water accomodated fraction;

Cajaraville et al., 1990a) CTR induzi dezakete.

Halaber, zelai-ikerketen arabera, metal-kutsadura

duten lekuetako moluskuen liseri-guruinean ere

CTR behatu da (Soto & Marigómez,1997a; Syasina

et al., 1997).

Zenbait metalek (Cd, Cu, Zn) eta konposatu

organikok (benzo(a)pirenoa -BaP-), zein beren

nahasketek CTR eragin dezaketen zehaztea dugu

ikerlan honen lehengo helburu. Gainera,

kutsatzaile bakoitzaren kontzentrazio eraginkorra

zein den ere finkatu nahi dugu. Bestalde, CTR

prozesuaren mekanismoak ezagutzeko nahian,

estres-iturria eten ondoren prozesua itzulgarria

denentz jakitea ere planteatu dugu. Azkenik, CTR

pairatu duten muskuiluek (adb., zelaian leku

kutsatuan jasotakoak) laborategian berriro metalen

pean jarriz gero, CTRri dagokion

erantzunkortasuna ere aztertu nahi izan dugu.

Ingurumen-toxikologian, metal kutsatzaileen

maila bioeskuragarrien (esposizioa) zein beren

efektu biologikoak neurtzeko biomarkatzaileak

deritzen neurketak aplikatu ohi dira (Cajaraville et

al., 2000). Esposizio-biomarkatzaileen artean,

zeluletan metatutako metalak kuantifikatzeko oso

sentikorra den autometalografia (AMG) izeneko

teknika histokimikoa dugu. Teknika horren

ezaugarri nagusia, duen izugarrizko sentikortasuna

da, seinale ikuskorra emateko hamar atomo

katalitikoren presentzia nahikoa izan daitekeelarik

(Danscher, 1984). Beraz, moluskuen ehunetan

metalak argi-mikroskopioan lokalizatzeko nahiko

erabilia izan da. AMG aplikatu ondoren, Cu, Zn, Hg

eta Cd moduko metalak zilarrezko hauspeakin beltz

(BSD; ingeleraz, black silver deposits) moduan

agertzen dira markaturik, batez ere liseri-zelulen

lisosometan (Hemelraad & Herwig, 1988; Herwig et

al., 1989; Soto et al., 1996a; 1996b; Soto &

Marigómez, 1997a; 1997b; Domouhtsidou &

Dimitriadis, 2000; Marigómez et al., 2002).

Tamalez, teknika hau oso sentikorra den arren, ez

da batere espezifikoa, metal ezberdinak banan-

banan ezin baitira identifikatu. Beraz, BSDen

presentzia ezin da metal jakin baten kokapenarekin

erlazionatu. Testuinguru honetan, Cd pean

mantendutako animalietan BSDak espezifikoki Cd

ioien inguruan sortzen direla frogatu nahi izan dugu,

elektroi-zunden mikroanalisi (EPMA; ingeleraz,

electron probe microanalysis) moduko teknika

mikroskopiko osagarriak AMGrekin batera erabiliz.

AMG ez bezala, EPMA oso teknika espezifikoa da,

zelulen osaketa elemental zehatza

karakterizatzeko erabilia izan dena (Marigómez et

al., 1990a; Morgan & Morgan, 1998; Dimitriadis &

Papadaki, 2004). Aldi berean, EPMAren emaitzak,

Ag eta Cd moduko metal-ioiak kolokalizatzeko oso

teknika egokia den X izpien mapaketaren bidez

(Morgan & Morgan, 1998) baieztatzea planteatu

dugu.

Bestalde, AMG argi-mikroskopioan aplikatzean

metalak identifikatu ezin baditugu ere,

errebelatutako BSD-hedapena metatutako metalen

mailaren arabera emenda daiteke, bere

kuantifikazioak metal bioeskuragarrien maila

adieraz dezakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b).

Izan ere, liseri-lisosometako BSD-hedapena irudi-

analisi bitartez kuantifikatuz, BSDen dentsitate

bolumetrikoa (VvBSD) deritzon parametroa kalkula

daiteke. VvBSD metal-esposizioaren

biomarkatzaile egokia da, zenbait espezie

desberdinetan ikusi denez (Soto & Marigómez,

1997a, 1997b; Da Ros et al., 2000; Porte et al.,

2001).

Hala ere, biomarkatzaile horren aplikazioari

dagokionez, CTR fenomenoa aintzakotzat hartu

beharrekoa da, metala metatzen duten liseri-zelulak

zelula basofilikoz ordezkatuak baitira, metalak

metatzeko liseri-guruinak duen gaitasuna aldarazita

suertatu daitekeelarik (Soto & Marigómez, 1997b;

Marigómez et al., 2002). Izan ere, metalak metatuz

doazen heinean, VvBSD balioek ez dute zertan

gora egin behar; metala metatzen ez duten zelula

basofilikoak, liseri-zelulak baino ugariak bilaka

baitaitezke. Hots, atalase batetik aurrera metalen

pean jarritako muskuiluetan liseri-epitelioan ematen

den metaleen metaketa zelula-moten

proportzioaren arabera alda liteke (Marigómez et

al., 1990b; 1998). Hori dela eta, VvBSD moduko

biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina

izan dezaken jakitea dugu azken helburu.

Sarrera honetan aipatutako helburuak

erdiesteko, bost esperimentu desberdin diseinatu

ditugu. Guztietan Mytilus galloprovincialis

muskuiluak laborategiko baldintzen pean

kutsatzaile desberdinez tratatu dira, denbora tarte

eta kontzentrazio desberdinetan. Lehenengo

esperimentuan, Plentziatik hartutako muskuiluak

CTR induzi lezaken Cd kontzentrazio pean

mantendu ziren 21 egunez, eta VvBAS eta VvBSDdenbora tarte desberdinetan kalkulatu ziren.

Halaber, Cd-aren lokalizazio ultrastrukturala eta


82


83

BSDen azterketa elementala burutu ziren, Cd-aren

lokalizazioa zelula-espezifikoa dela ikertzeko

asmoz. Bigarrenean, Plentziako muskuiluak, CTR

induzitzen ez duten Cd kontzentrazioak aurkitu

nahian, Cd kontzentrazio baxuago pean mantendu

ziren, eta VvBAS zein VvBSD kalkulatu ziren.

Hirugarren esperimentuan, Cu, Cd eta Zn bidezko

tratamenduen arteko konparaketari ekin zitzaion,

hiru metalen CTR induzitzeko gaitasuna eta

VvBSD balioen gaineko eragina alderatuz. Halaber

esperimentu honetan, muskuiluak hiru metal

horiekin 7 egunez tratatu ondoren, CTR itzulgarria

den jakiteko asmoz, 14 eguneko arazketa-aldia

aplikatu zen. Laugarren esperimentuan, Plentziako

muskuiluak, Benzo(a)pireno (BaP) eta Cd + BaP

pean mantendu ziren 21 egunez, kutsatzaile-mota

desberdinen arteko elkarrekintzak CTRren gainean

daukan eragina aztertzeko asmoz. Azkenik,

bosgarren esperimentuan, aldez aurretik

estresatutako muskuiluak (Zn-ez kutsatuak,

Meñakozetik hartuak), laborategira ekarri eta Cd

kontzentrazio desberdinen pean mantendu ziren 41

egunez, esposizio esperimentalak CTR areago

dezakeenentz ikertzeko.

MATERIAL ETA METODOAK

Erreaktibo kimikoak

Erabilitako erreaktibo kimiko guztiak maila

analitikokoak eta Sigma-Aldrich (St. Louis,

Missouri, Amerikako Estatu Batuak), merkatal-

etxekoak dira besterik agertu ezean.

Prozedura esperimentala

Bestelakorik esan ezean esperimentuetan

erabilitako muskuilu (Mytilus galloprovincialis Lmk)

mareartekoak, Plentzian (Bizkaia) (46º 26´I, 2º

55´M) hartu eta berehala laborategira garraiatu

ziren. Bertan, muskuiluak, argi ultramore bidez

esterilizatutako eta karbono aktiboz zein beirazko

zuntzetan zehar iragazitako itsas-uretan mantendu

ziren 7 egunez, tenperatura egonkorrean (15-

16ºC). Muskuiluak baraurik mantendu ziren,

laborategiko egoerara ohitu egin zitezen, eta

urdailean zeuzkaten hondakinak hustu zitzaten,

kutsatzaile peko tratamenduak hasi aurretik

(moldarazte-tartea). Muskuiluak, esperimentuak

iraun bitartean, fotoperiodo natural pean mantendu

ziren, eta ornogabe itsastarrentzako jaki

komertzialez (Marine Invertebrate Diet, Carolina,

Burlington, North Carolina, Amerikako Estatu

Batuak) elikatu ziren. Etengabeko aireztapena

aplikatu zen, eta ura egunero aldatu zen.

Lehenengo esperimentua

1998.eko apirilean hartutako muskuiluak,

laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 80 µg

Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan

gehitua) zuen itsas-uretan mantendu ziren 21

egunez. Aldi berean, Cd gehitu gabeko kontrol

serie bat ere burutu zen. Azterketa histologiko,

autometalografia eta mikoanalisirako laginak 1., 7.

eta 21. egunetan jaso ziren; absortzio atomikozko

espektrofotometriarako laginak, ordea, bakarrik 18.

egunean.

Bigarren esperimentua

1999.eko martxoan hartutako muskuiluak,


Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan gehitua)

zuen itsas-uretan mantendu ziren 7 egunez. Aldi

berean, Cd gehitu gabeko kontrol serie bat ere

burutu zen. Azterketa histologikoetarako laginak 1.

eta 7. egunetan jaso ziren.

Hirugarren esperimentua

1999.eko martxoan hartutako muskuiluak


Cd/l, 10 µg Cu/l zein 10 µg Zn/l-ko kontzentrazioa

(Cd eta Zn kloruro, Cu sulfato moduan gehituak

izanik) zuen itsas-uretan 7 egunez tratatu ziren

(esposizio-taldeak), azkenik 14 egunez ur garbitan

mantendu zirelarik (arazketa-taldeak). Aldi berean,

metalik gehitu gabeko kontrol serieak ere burutu

ziren. Azterketa histologikoak eta autometalografia

egiteko laginak 1. orduan, eta 1. eta 7. egunetan

hartu ziren, baita 14 eguneko arazketa-aldiaren

ostean ere (21. eguna). Absortzio atomikozko

espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak

neurtzeko laginak 1. orduan, eta 1., 7. eta 21.

egunetan hartu ziren.

Laugarren esperimentua

1998.eko apirilean hartutako muskuiluak,

laborategiko baldintzei moldatu eta gero, 21 egunez

tratamendu desberdinak aplikatu zitzaien: (a) 500

µg Benzo(a)pireno/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-

uretan (BaP talde esperimentala); (b) 80 µg Cd/l

(kloruro moduan) eta 500 µg BaP/l batera zituen

itsas-uretan (Cd + BaP talde esperimentala); eta (c)

uretan disolbagarria izateko, BaP-a dimetil

sulfoxidotan (DMSO) disolbatu zenez, 500 µg

DMSO/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan

mantendu ziren (DMSO kontrola). Aldi berean, Cd-

rik, BaP-rik zein DMSO-rik gehitu gabeko kontrol

serie bat ere burutu zen (Itsas-ur kontrola).

Azterketa histologikoak eta autometalografia

egiteko laginak esperimentuaren 1., 7. eta 21.

egunetan jaso ziren. Absortzio atomikozko

espektrofotometriaren bidez metal-maila tisularrak

neurtzeko laginak 18. egunean hartu ziren.

Bosgarren esperimentua

Meñakozen (43º 24´I, 2º 93´M) 1989.eko

martxoan hartutako muskuiluak laborategiko

baldintzei moldatu eta gero, 10 µg Cd/l eta 80 µg

Cd/l-ko kontzentrazioa (Cd kloruro moduan) zuen

itsas-uretan 41 egunez mantendu ziren. Aldi

berean, Cd-rik gehitu gabeko kontrol serie bat ere

burutu zen. Azterketa histologikoak eta

autometalografia egiteko laginak, 1., 7., 21., 27. eta

41, egunetan hartu ziren.

Analisi kimikoak

Disekzionatu eta gero, lehenengo, hirugarren

eta laugarren esperimentuko liseri-guruinak ur

distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48 orduz

labean berotu ziren, guztiz lehortu arte. Lehortutako

materiala almerizaren laguntzaz txikitu zen, eta

azido nitriko kontzentratuan liseritu zen. Ondoren,

azido nitriko kontzentratua plaka beroan lurrundu

ostean, liseritutako materiala ur distilatuan

diluitutako 0.1 M azido nitrikoan berresekitu zen.

Laginak iragazi ondoren, absortzio atomikozko


84

espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley,

Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu

ziren. Lehenengo eta laugarren esperimentuetan

Cd kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu lehor

modura kalkulatu ziren. Hirugarren esperimentuan,

ordea, metal/maskor-pisua indizeak kalkulatu ziren

(Soto et al., 1995). Erabilitako estandarrak Merck

(Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey,

Amerikako Estatu Batuak) merkatal-etxeak

zertifikatutakoak izan ziren.

Gertakuntza histologikoa

Liseri-guruinaren zati txikiak (10 talde

esperimentaleko) Carnoy fixatzailean fixatu ziren

4ºC-tan ordu batez (Martoja & Martoja-Pierson,

1970). Laginak goranzko graduazioko etanoletan

deshidratatu ziren, metilo bentzoatoan aklaratu

ziren eta bentzenozko bi bainutan murgildu eta

gero, parafinan (60ºC) inkluditu ziren. Ebaki

histologikoak (7 µm) Leitz 1512 eta American

Optical mikrotomoetan lortu ziren. Liseri-guruinaren

beste zati txiki batzuk, %2.5 glutaraldehidoa zuen

kakodilato indargetzailean (0.1 M, pH = 7.2) fixatu

ziren 4ºC-tan 2 orduz. Gerora, indargetzailean

garbitu, goranzko graduazioko etanoletan

deshidratatu eta, azkenik, Epon 812 erretxinan

inkluditu ziren. Ebaki semifinak (1-3 µm) Leica

Ultracut (UCT) ultramikrotomoan lortu ziren.

Autometalografia (argi-mikroskopia)

Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan

desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko

etanoletan hidratatu ziren. Bai parafinazko zein

erretxinazko ebaki semifinak labean (40ºC)

mantendu ziren guztiz lehortu arte.

Ondoren, laginak argazki-emultsio geruza fin

eta uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford

Nuclear Emulsion L4, Ilford, Mobberley,

Ingalaterra). Gerora, laginak ilunpean mantendu

ziren lehortu bitartean (30 minutu), eta

errebelatzaile komertziala erabiliz errebelatu ziren.

Parafinazko laginen kasuan, Ultrafin Tetenal SF

(1:5 diluzioa ur distilatuan; (Tetenal AG & Co,

Norderstedt, Alemania) errebelatzailea 15 minutuz

aplikatu zen. Erretxinazko laginen kasuan, ordea,

Kodak D-19 (Kodak, Paris, Frantzia) (%15 ur

distilatuan) errebelatzailea, 30-45 minutuz aplikatu

zen. Ondoren, errebelatzailearen erreakzioa %1

azido azetikozko disoluzioan minutu batez

murgilduz geldiarazi zen. Azkenik, Agefix (Agfa

Agefix, Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9

uretan) fixatzaileaz 10 minutuz fixatu ziren. Laginak

Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck & Co., Inc,

Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako Estatu

Batuak) montatu ziren. Erretxinan inkluditutako

ebakiak toluidina urdinez kontrastatu ziren. Metal-

ioien presentzia, zilarrezko hauspeakin beltzen

agerpenak adierazten du (Danscher, 1984; Soto et

al., 1998b).

Autometalografia (mikroskopio elektronikoa),

EPMA eta X izpien mapaketa

Beirazko portetan itsatsitako erretxinan

inkluditutako 3 µm-ko ebaki semifinetan

autometalografia aplikatu ondoren, Epon 812

erretxinan inkluditu ziren berriro ere ebaki ultrafinak

egiteko. Mikroskopioan behaketa ultrastruktural


85

morfologikoak egiteko, ebaki ultrafinak kuprezko

euskarrietan bildu ziren, eta uranilo azetatoz eta

berun zitratoz kontrastatu ziren.

Bestalde, mikroanalisia egiteko, ebaki semifinak

aldez aurretik karbono/formvar-ez estalitako

aluminiozko euskarrietan (200 mesh) bildu ziren,

eta berriro ere karbonoz estali ziren. Mikroanalisia,

energia dispertsibozko espektrometroa lotuta

zeukan JEOL 1210 STEM mikroskopioan burutu

zen (kontaketa-denbora = 100 segundu). Espektru-

analisia egiteko Link ISIS 1.04A softwarea erabili

zen (Morgan & Morgan, 1998). X izpien mapaketa

sistema berean burutu zen, Ag (Lα1 -2.984 keV-,

Lß1 -3.151 keV-), Cd (Lß1 -3.316 keV-) eta S (Kα -

2.308 keV-) elementuen seinaleak batera

lokalizatzeko.

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan

irudi-analisiaren bitartez

Liseri-zelulen lisosometan zeuden BSDen

hedapena irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen

(Soto & Marigómez, 1997b), emaitzak BSDen

dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (VvBSD). Argi-

mikroskopiazko irudiak (x100 handipenean) B&W-

CCD TV kamera, HR-TV kolorezko pantaila, Leitz

mikroskopioa, PC ordenagailua, PIP 1024 (Matrox

Electronic Systems Ltd., Dorval, Kanada) sistema

eta Sevisan S.A. (Bilbo, Espainia) entrepresak


86

1. Irudia: Mytilus galloprovincialis muskuiluen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa Cd pean 21 egunezmantendu eta gero. (A) Parafinan inkluditutako materiala. Eskala-marra: 10 µm. (B) Erretxinan inkluditutako liseri-guruinaren ebakisemifina, toluidina urdinez kontrastatua. Gezi-buruek liseri-zelulen lisosometan dauden BSDak erakutsi dituzte, zelula basofilikoek(izarrak), ordea, ez dute BSDrik erakusten. Eskala-marra: 10 µm. (C) Erretxinan inkluditutako eta kontrastatutako ebaki ultrafina.Zelula basofilikoen zitoplasman (BC) ez da BSDrik ikusten, bai ordea, heterolisosometan (gezi-buruak). (N = nukleoa; HL =heterolisosoma; L = lumena). Eskala-marra: 1 µm.

garatutako softwarea erabiliz eskuratu ziren.

Ondoren, eskuz eta softwarearen laguntzarekin

liseri-zelulen lisosometako BSD eta zitoplasma

bereizteko segmentazio-prozedura aplikatu zen.

Neurketak muskuilu bakoitzean 5 eremutan burutu

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10

muskuilu erabili ziren; tratamendu bakoitzeko

guztira 50 neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-

ek (1981) proposatutako formulak erabiliz egin

ziren. Hau da, BSD partikulen tamaina ebakiaren

lodiera baino txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes

efektua zuzentzeko faktorea aplikatu zen.

Zelula basofilikoen analisi estereologikoak

Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm) Masson-

Goldner trikromikoz (Martoja & Martoja-Pierson,

1970) tindatu ziren, zelula basofilikoak argiro

bereiztu ahal izateko. Ondoren, zelula basofilikoen

dentsitate bolumetrikoa (VvBAS) estereologiaren

bidez kalkulatu zen. Horretarako, Nikon Optiphot

mikroskopioari erantsitako marrazketa-tutua erabili

zen (bukaerako handipena = x670). Multipurpose

test system M-168 Weibel gratikula erabiliz, zelula


87

2. Irudia: Muskuilu kontroletan (zutabe zuria) zein 80 µg Cd /lkontzentrazio pean mantendutako (zutabe grisa) muskuiluetankalkulatutako BSDen eta zelula basofilikoen dentsitatebolumetrikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDendentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelulabasofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarra adierazten dute. Goialdeko asteriskoektaldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazten dituzte(p<0.05).

3. Irudia: Zelula basofilikoen identifikazioa (asterisko zuriak) Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-albeoloetan.( A) Kontrola(B) 7 egunez 80 µgCd/l pean mantendutako muskuilua eta (C) 21 egunez 80µg/lCd pean mantendutako muskuilua. Eskala marra:25 µm (A eta B); 10 µm (C).

basofiliko eta liseri-zelulen gainean ezarritako

puntuak zenbatu ziren, VvBAS Delesse

printzipioaren arabera kalkulatuz (Weibel, 1979).

Neurketak elkarrengandik urruti (gutxienez 45 µm)

zeuden 2 ebakietan egin ziren, ebaki bakoitzean

sigi-saga eginez azarez aukeratutako 5 eremutan,

hain zuzen. Guztira, talde bakoitzean 100

zenbaketa egin ziren.

Estatistika

Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+

(SPSS Inc., Microsoft Co.) pakete estatistikoa

erabili zen. Konfidantza-tarteak Student t testa

erabiliz kalkulatu ziren, eta taldeen arteko

desberdintasun estatistiko esangarriak p<0.05

mailan ezarri ziren (Sokal & Rohlf, 1979). Aldagai

esperimentalen esangarritasuna bariantzaren

analisia (ANOVA) erabiliz estimatu zen.

EMAITZAK

Lehenengo esperimentua

Analisi kimikoek muskuiluen liseri-guruinean

Cd-a metatu zela erakutsi zuten. Muskuilu kontrolen

Cd kontzentrazio-maila detekzio-atalasetik behera

mantendu zen bitartean, Cd pean egondako

muskuiluen kontzentrazio tisularra 1131.36 µg Cd/g

ehun-pisu lehor mailara heldu zen.

Mikroskopioan egindako behaketek erakutsi

zutenez, Cd pean egondako muskuiluetan BSDen

zelulabarneko banaketa ez zen uniformea izan.

BSD espezifikoki liseri-zeluletako lisosometan

lokalizatu ziren, zelula basofilikoak BSDrik gabe

agertu ziren bitartean (1. Ird.). Emaitza horiek, 21

egunez Cd pean egondako muskuiluetan,

erretxinan inkluditutako ebaki semifin zein

ultrafinetan konfirmatu ziren. Bertan, BSD

heterolisosometan eta, batez ere, lisosomen

mintzari lotuta, eta inolaz ere zelula basofilikoetan

lokalizatu ziren (1. Ird.). Horretaz gain, liseri-

albeoloen argirantz askatutako hondakinetan ere

BSD behatu ziren maiz, hondakin horiek,

seguruenik, jatorri lisosomikoa zutelarik.

Bestalde, VvBSD balioak Cd pean egondako

muskuiluetan kontroletan baino esangarriki

altuagoak suertatu ziren, batez ere 1. egunean.

Gerora, 7. eta 21. egunen artean VvBSD balioen

beherakada behatu zen, oraindik ere, Cd-z

tratatutako muskuiluen balioak kontrolenak baino

esangarriki altuagoak izanik (2A Ird.).

Halaber, VvBAS balioei dagokienez, muskuilu

kontroletan ez zen aldaketarik erregistratu

esperimentuak iraun bitartean, Cd pean


88

4. Irudia: Cd pean 21 egunez mantendutako muskuilu batenliseri-zelulen lisosometako autometalografiazko zilarrezkohauspeakin beltz baten EDS espektrua, EPMA egin eta gero.

egondakoetan, ordea, balioak nabarmenki igo ziren

(2B eta 3. Ird.). Esperimentuko 1. egunean kontrol

eta Cd-z trataturiko muskuiluen artean

desberdintasun esangarririk behatu ez bazen ere,

7. eta 21. egunetan gorakada esangarria aurkitu

genuen Cd pean egondako muskuiluen kasuan.

Autometalografiatutako ebaki ultrafinen gainean

egindako X izpien mikroanalisiak, BSDetan Cd-a

eta S-a, Ag-arekin batera zeudela erakutsi zuen (4.

Ird.). Halaber, emaitz horiek X izpien mapaketaren

bidez konfirmatu ziren (5. Ird.). Aitzitik, X izpien

mapaketaren emaitzek ziotenez, Cd-a eta S-a liseri-

zelulen nukleo zein zitosolean ere lokalizatu ziren,

seinalea heterolisosometan baino ahulagoa izan

arren, eta bertan Ag-aren seinalerik ez zegoen

arren (5. Ird.)

Bigarren esperimentua

VvBSD delakoaren emaitzek, 10 µg Cd/l pean

mantendutako muskuiluen liseri-lisosometan

metalen presentzia esperimentuko lehenengo

egunetik kontrolenetakoetan baino nabarmen

altuagoa zela erakutsi zuten, joera hori

esperimentuan zehar mantendu zelarik (6A Ird.).

VvBAS balioei dagokienez, esperimentu osoan

zehar ez zen desberdintasun esangarririk behatu

Cd pean egondako muskuilu eta muskuilu kontrolen

artean (6B Ird.).

Hirugarren esperimentua

Cd/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar

ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cu zein

Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu

batez Cd-z trataturiko muskuiluen indize hori


89

5. Irudia: Cd pean mantendutako muskuiluetan AMG aplikatuondoren, kadmio (Cd), zilar (Ag) eta sufrerako (S) X izpiendistribuzio-mapak. Lau mikrografiak eremu mikroskopikoberean hartuak daude. Gezi-buruek zitosolaren hauspeakinakmarkatzen dituzte liseri-zelula baten heterolisosomen (HL)barnean.

kontrolen berdina izan arren, 1 eta 7 egun ondoren

kontrolarena baino esangarriki altuagoa suertatu

zen. Arazketa-aldiak, bere aldetik, ez zuen

Cd/maskor-pisua indizearen inolako beherakadarik

ekarri; haatik, balioak 7 eguneko tratamendu ostean

lortutakoak baino are altuagoak suertatu ziren (1.

Taula).

Cu/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar

ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd zein

Zn pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu

batez Cu-z trataturiko muskuiluen indize hori



zen. Cu pean egondako muskuiluen hilkortasuna

handia gertatu zenez, 21. egunean ez genuen izan

analisi kimikoak egiteko behar bezain beste laginik,

eta, beraz, ezin dugu arazketa-aldiaren Cu/maskor-

pisua indizearekiko eraginari buruzko daturik eman

(1. Taula).

Zn/maskor-pisua indizea esperimentuan zehar

ez zen aldatu muskuilu kontroletan, ezta Cd zein

Cu pean mantendutakoetan ere. Bestalde, ordu

batez Zn-az trataturiko muskuiluen indize hori



zen, aurreneko bi kasuen legez. Arazketa-aldiak,

bere aldetik, ez zuen Zn/maskor-pisua indizearen

inolako beherakadarik ekarri; haatik, balioak 7

eguneko tratamendu ostean lortutakoak baino are

altuagoak suertatu ziren (1. Taula).

Autometalografiaz errebelatutako BSD,

aurreneko esperimentuen emaitzekin bat, hiru

metal pean mantendutako muskuiluetan liseri-

zelulen lisosometan lokalizatu ziren, batez ere.

BSDen kuantifikazioa burutu ondoren, Cd, Cu

eta Zn pean egondako muskuiluetan lortutako

VvBSD balioak kontroletan baino altuagoak izan

ziren jadanik lehenengo ordutik, eta tendentzia hori

7 egunez mantendu zen (7A Ird.). Cd eta Cu pean

egondako muskuiluen VvBSD balio altuenak 7.

egunean erregistratu ziren; Zn-aren kasuan, ordea,

baliorik altuena 1. egunean gertatu zen. Izan ere,

balio altu hori esperimentu osoan zehar

erregistratutako baliorik altuena izan zen (7A Ird.).

Arazketa-aldiaren ostean VvBSD balioak


90

6. Irudia: Muskuilu kontrol (zutabe zuria) zein 10 µgCd/l peanmantendutako (zutabe grisa) muskuiluak. (A) Irudi-analisibitartez neurtutako BSDen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa.Segmentu bertikalek desbidazio estandarra adierazi dute.Goialdeko asteriskoek taldeen arteko desberdintasunesangarriak adierazi dute (p<0.05).

esangarriki jaitsi ziren hiru metalen kasuan, berriro

ere kontrolen mailara helduz (7A Ird.).

Liseri-epitelioan zelula basofilikoen proportzio

erlatiboa kuantifikatzeko erabilitako VvBAS balioak

ez ziren esperimentuan zehar aldatu muskuilu

kontroletan, ezta Cd eta Cu pean mantendutako

muskuiluetan ere (7B Ird.). Bestalde, 7 egunez Zn-

az trataturiko muskuiluen liseri-epitelioan VvBASbalioetan gorakada esangarria behatu zen, gerora,

arazketa-aldiaren ostean kontrolen mailara jaitsi

zena (7B Ird.).

Laugarren esperimentua

Analisi kimikoek, kadmioa BaP-z nahastuta

egon arren (Cd + BaP taldea), liseri-guruinean Cd-

a metatu zela erakutsi zuten. Muskuilu kontroletan

(DMSO-z tratatutakoak) Cd-aren kontzentrazio

balioak detekzio-atalasetik behera agertu ziren

bitartean, Cd + BaP pean mantendutakoen liseri-

guruinean 1079.25 µg Cd/g ehun-pisu lehor aurkitu

ziren.

Aurreneko esperimentuetan bezala, BSD

espezifikoki liseri-zeluletako lisosometan lokalizatu

ziren bitartean, zelula basofilikoetan ez zen seinale

esangarririk detektatu. Esperimentuko 1. egunetik

21. egunera, BaP eta Cd + BaP tratamenduetako

muskuiluetan neurtutako VvBSD balioak DMSO

kontroletan neurtutakoak baino esangarriki

altuagoak izan ziren, bereziki 1. egunean, gorakada

hori batik bat Cd + BaP tratamenduan nabarmena

gertatu zelarik (8A Ird.).

VvBAS balioei dagokienez, DMSO-z trataturiko

muskuilu kontroletan saiakuntza-denboran zehar

nolabaiteko igoera behatu zen. Hala ere, VvBAS


91

Lagina Cd indizea Cu indizea Zn indizea Kontrola Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia

0.00126344 0.00214682 0.00100389 0.00608193

0.07669171 0.01559907 0.00763639 0.02290661

0.12930922 0.15481972 0.11437475 0.12991251

Cd-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia

0.00313986 0.0098965* 0.0256267* 0.0370562*

0.01043518 0.01598671 0.00776714 0.02040212

0.1238165 0.18353205 0.12913258 0.12461644

Cu-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia

0.00398981 0.0035511 0.00560253

###

0.0146126 0.0342118* 0.0681148*

###

0.1450487 0.19813616 0.15587894

###

Zn-esposizioa Ordu 1 Egun 1 7 Egun Arazte-aldia

0.00132747 0.00281531 0.00075713 0.0075807

0.0085813 0.01860038 0.00892704 0.02057063

0.13776012 0.26060344* 0.19286193* 0.32503914*

1. Taula: AAS bidez neurtutako liseri-guruineko Cd, Cu eta Zn/maskor-pisua indizea, metal pean ordu batez eta 1, 7 eta 21 egunezmantendutako muskuiluetan eta muskuilu kontroletan. Asteriskoek kontrolekiko desberdintasun esangarriak adierazten dituztep<0.05 mailan. ### muskuiluak hil zirenez ez zen gelditu animalia nahikorik arazketa esperimenturako.

balioen emendioa askoz nabarmenagoa izan zen

BaP eta Cd + BaP tratamenduetako muskuiluetan

(8B Ird.).

Bosgarren esperimentua

Esperimentuko 1. egunetik, VvBSD balioak 80

µg Cd/l kontzentrazio pean egondako muskuiluetan

kontroletan baino nabarmenki altuagoa izan ziren.

10 µg Cd/l kontzentrazio pean egondako

muskuiluetan, berriz, astebete behar izan zen

VvBSD balioak kontrolenetatik esangarriki

desberdinak izatera iristeko. Hala ere, Cd

kontzentrazio handiaz lau astez trataturiko

muskuiluetan, VvBSD balioen behin behineko

jaitsiera puntuala suertatu zen, 6 aste ostean berriro

ere VvBSD balio altuak neurtu zirelarik (9A Ird.).

VvBAS balioei dagokienez, muskuilu kontrolek

balio baxuak erakutsi zituzten esperimentuak iraun

bitartean. Bestalde, Cd kontzentrazioaren

menpekoa ez zen igoera esangarria behatu zen Cd

pean mantendutako muskuiluen VvBAS balioetan,

1. astetik aurrera behintzat (9B Ird.).

EZTABAIDA

Kadmioak CTR eragin dezake

Kutsatzaileek zein bestelako estres-iturriek

muskuiluen liseri-guruinean aldaketak sortarazten

dituztela ezaguna da; euren artean CTR izenekoa

(Thompson et al., 1974; Rasmussen et al., 1983;

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b;

Syasina et al., 1997; Marigómez et al., 1998).

Ikerlan honetan, Cd-ak muskuiluen liseri-guruinean

CTR prozesua bultza dezakeela baieztatu dugu.


92

7. Irudia: Muskuilu kontroletan zein 10 µg/lCd, Cu eta Zn pean jarritakoetankalkulatutako parametro estereologikoak. (A)Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDendentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruinekozelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa.Segmentu bertikalek desbidazio estandarraadierazi dute. Goialdeko matrizetakoasteriskoek taldeen arteko desberdintasunesangarriak adierazi dituzte (p<0.05).

Laborategiko kontrol esperimentaletan VvBASbalioak 0.05-0.1 µm3/µm3 tartekoak diren

bitartean, Cd pean egondakoetan 0.15-0.22

µm3/µm3-koak izatera irits daitezke.

Hala ere, eraginkortasun horren atalase kritikoa,

desberdina da, muskuiluen jatorri eta baldintza

esperimentalen arabera. Esaterako, Plentziako

muskuiluetan, 80 µg Cd/l kontzentrazio pean 7

egunez egotea VvBAS-aren emendio esangarria

sortzeko beharrezkoa den bitartean, aldez aurretik

zelaian Zn-az kutsatutako Meñakozeko

muskuiluetan laborategian 10 µg Cd/l kontzentrazio

pean 7 egunez egotea nahikoa da VvBASemendatzeko. Aitzitik, 10 µg Cd/l kontzentrazio

pean 7 egunez egoteak VvBAS balioaren igoerarik

ez zien ekarri Plentziako muskuiluei.

Zelula-moten ordezkapen honen arrazoia

momentuz ezagutzen ez bada ere, autore batzuen

arabera, kutsaduraren aurkako babes-mekanismoa

izango litzateke. Alde batetik, zelula basofilikoen

emendioa, detoxifikazio-prozesuak eragindako

liseri-zelulen andeakuntzari aurre egiteko

erantzuna izango litzatekeela proposatu da, zelula

basofilikoak liseri-epitelioaren berriztapenaz

arduradunak direla suposatuz (Mix & Sparks, 1971;

Thompson et al., 1974). Bestalde, kutsatzaile

organikoen kasuan batik bat, zelula basofilikoek

aktiboki detoxifikazioan parte hartzen dutenez,

euren presentzia areagotzea, detoxifikazio-

prozesuaren ondorioa izan liteke (Widdows, 1984;

Cajaraville et al., 1990a; Triebskorn & Künast,

1990). Halaber, Widdows et al.-ek (1984),

kutsatzaileen aurrean zelula basofilikoen

kopuruaren gorakada, arazketa-aldiko eskakizun

energetiko gehigarriari erantzuteko beharrezkoak

diren entzimen jariapen areagotuarekin erlaziona

litekeela iradoki zuten. Azkenik, zelula basofilikoen

emendioa itxurazkoa baino ez dela, eta kutsatzaile

pean egoteak liseri-zelulen galera ekarri izanaren

ondorioz zelula basofilikoak nagusitzen direla ere

proposatu egin da (Marigómez et al., 1990b).

Izatez, hiru alternatiba horien artean VvBAS-en

emendioa zeinek azal dezaken argitzea tesi honen

helburuetako bat da, geroko kapituluetan jorratuko

den bezala.

Metalen metaketa zelula-espezifikoa

CTR eragiteak, liseri-epitelioko metaketa-

gaitasunean aldaketa garrantzitsuak sor ditzake.

Izan ere, zelula-mota desberdinek, kutsatzaileak

metatzeko gaitasun ezberdina eduki dezakete

(Marigómez et al., 2002). Moluskuetan, BSD liseri-

zelulen lisosometan agertu dira batez ere, eta

beraz, zelula basofilikoen proportzio erlatiboaren

igoerak, metalak metatzeko konpartimentua

murrizten duenez, metatzeko gaitasuna txikitzea

ekar lezake (Marigómez et al., 1998).

Ikerlan honetan, ere Cd pean egondako

muskuiluetan, BSD espezifikoki liseri-zeluletako

lisosometan agertu dira, argi-mikroskopian

oinarritutako beste moluskuen espezietan zenbait

ikerketek diotenarekin bat datorrena (Hemelraad &

Herwig, 1988; Holwerda, 1991; Giamberini et al.,

1996; Marigómez et al., 1996; 2002; Soto et al.,

1996a, 1996b, Soto & Marigómez, 1997b).

Lisosomen barruan metalak bahitzeak, metal horien

toxizitatea jaisten lagunduko luke, behin-behinekoz

behintzat. Gerora, metaletan joriak diren lisosomak


93

liseri-dibertikuluen argira askatu eta ondoren

gorotzekin batera kanporatuko lirateke (Ireland &

Marigómez, 1992; Viarengo & Nott, 1993;

Cajaraville et al., 1995; Langston et al., 1998;

Marigómez et al., 2002).

Hala ere, argi-mikroskopioaren bidez lortutako

emaitz horiek ez dira maiz mikroskopia

elektronikoaren bidez baieztatu, dakigunez. Izatez,

AMGren aplikazioak maila ultrastrukturalean urriak

dira (Domouhtsidou & Dimitriadis, 2000; Dimitriadis

& Papadaki, 2004).

Ikerlan honetan, mikroskopio elektronikoan

burututako AMGk, BSD espezifikoki liseri-zelulen

lisosometan lokalizatzen direla egiaztatu du.

Zehazki, BSD heterolisosometan, batez ere

mintzari lotuta, eta inolaz ere zelula basofilikoetan

lokalizatu dira. Emaitza horiekin ados, X izpien

mikroanalisia aplikatuz, Littorina littorea

magurioaren liseri-zeluletako lisosomek Cd-a

metatzeko konpartimentu nagusia osatzen dutela

frogatu zuten Marigómez et al.-ek (1991). Merkurio

dosi oso altuz tratatutako muskuiluetan, ordea,

liseri-zeluletako lisosometan egoteaz gain zelula

basofilikoetan ere aurkitu dira BSD (Domouhtsidou

& Dimitriadis, 2000). Beraz, banaketa intrazelularra

dosiaren menpekoa (metalaren izaeraren

menpekoa den bezala) izatea ezin da baztertu.

Izatez, Recio et al.-ek (1988), Zn pean egondako

bareetan, metala liseri- zein kaltzio- eta iraizte-

zeluletan esposizio-denbora eta dosiaren arabera

ager daitekeela erakutsi zuten, metodo histokimiko

konbentzionalak erabiliz, ditizona tindaketa, alegia.

Bestalde, AMGk ez du zuzenean Cd-aren

presentzia adierazi behar, teknika hau metal-

espezifikoa ez delako; eta gainera, BSDen eraketa

metal-ioien Ag-arekiko duten irisgarritasunaren

menpean dagoelako (Danscher, 1981). Alde

batetik, Cd-rik gabeko tokitan BSDak eratzea

posiblea da. Esaterako, Cd eta beste metal astunen

pean egoteak, ehunetako metal esentzialen (Fe-a,

Cu-a adibidez) berbanaketa sortarazi lezake

(Mason & Simkiss, 1983; Mason et al., 1984;

Mason & Jenkins, 1995), eta kasu horretan BSDek

lekuzaldatutako metal horien agerpena eta ez Cd-

aren presentzia erakutsiko lukete.


94

8. Irudia: DMSO-kontrol taldeko (zutabe zuria) zein BaP(zutabe gris argia) eta Cd+BaP (zutabe gris iluna) peanmantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametroestereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDendentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelulabasofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarra adierazi dute. Goialdeko asteriskoektaldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte(p<0.05).

Arazo horri erantzuna emateko asmoz,

AMGrekin batera metal-espezifikoak diren X izpien

mikroanalisia eta X izpien mapaketa izeneko

teknikak (Morgan et al., 1997) aplikatu egin dira

ikerlan honetan.

X izpien mikroanalisiek erakutsi dutenez, Cd eta

S-a kolokalizatuta agertu dira BSDetako Ag-arekin

batera, X izpien mapaketaren bidez konfirmatu

dena. Horrela, Ag-a Cd-aren inguruan, BSDak

eratuz, nukleatu dela ikusi dugu. Bertan S ere

egoteak seguruenik Cd-metalotioneina (Cd-MT)

konplexuen presentziaren frogatzat har liteke, aldez

aurretik proposatu den bezala (Soto et al. 1996a).

MT-k metalen presentzian induzigarri eta S-tan

aberatsak diren proteinak dira, aminoazido guztien

%33-a zisteinak direlarik (Pavicic et al., 1991; Isani

et al., 2000; Roesijadi, 1994; 2000). MT nukleoan,

zein zitosolean eta lisosometan ager daitezke

(Langston et al., 1998).

Cd-z trataruriko magurioetan, AMGk liseri-

epitelioan metatutako Cd-aren frakzio bat soilik

erakutsi dezakeela proposatu da (Soto et al.,

1996b). Gure ikerlanak hipotesi hori sustatu du.

Izan ere, X izpien mapaketen emaitzen arabera,

Cd-a eta S-a liseri-zelulen lisosometatik kanpo,

zitosolean zein nukleoan, kolokalizaturik leudeke,

bertan BSDrik ez badago ere. Emaitz horiek Cd-MT

konplexuen presentziarekin erlaziona daitezke.

AMGk, lisosometako entzimek Cd-MT konplexua

liseritu ondoren soilik Cd-a detektatuko lukeen

bitartean, ezingo luke zitosoleko Cd-MT

konplexuetan estuki loturik dagoen Cd-a errebelatu,

Cd ioiak Ag-arekiko behar bezain eskuragarriak ez

direlako.

Ondorioz, Cd pean egondako muskuiluen liseri-

zeluletan AMG bitartez Cd-a lokalizatu dugula esan

genezake, Cd-aren frakzio osoaren zati bat baino

ez bada ere, lisosometan Cd-MT konplexu

liserituetakoa hain zuzen. Beraz, AMG bitartez

errebelatutako Cd-aren frakzioa liseri-zeluletako

lisosometan lokalizatu da espezifikoki. Horrek ez du

esan nahi Cd-aren beste frakziorik ez dagoenik

liseri-zelulen beste konpartimentuetan edo, zelula

basofilikoetan ere; baina, behintzat, frakzio horiek

ezin dira AMG bitartez lokalizatu.


95

9. Irudia: Muskuilu kontroletan (puntu zuriak) eta Cd dosi bienpean (lerro grisa = 10 µg/l eta lerro beltza = 80 µg/l)mantendutako muskuiluetan kalkulatutako parametroestereologikoak. (A) Irudi-analisi bitartez neurtutako BSDendentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-guruineko zelulabasofilikoen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarra adierazi dute.

CTRk BSDen kuantifikazioaren gain duen

eragina

AMG bitartez errebelatutako lisosomen barneko

BSDak, irudi-analisiaren bitartez kuantifika

daitezke, horrela estimatutako VvBSD parametroak

ingurumeneko metal bioeskuragarrien mailak

adierazi litzakeelarik (Soto & Marigómez, 1997b).

BSD espezifikoki liseri-zeluletan eratzen direla

aintzat hartuz gero, metal kutsatzaileek beraiek

eragindako CTR moduko efektuek AMG bitartez

estimatutako metalen ingurumen-mailen gainean

eragina izan dezakete. Izan ere, Soto & Marigómez-

ek (1997b), arazo horretaz jabetuta, VvBAS eta

VvBSD batera aintzat hartzen zituen protokolo bat

proposatu zuten metalen esposizio-mailak

muskuiluen liseri-guruinean AMG aplikatuz

estimatzeko.

Ikerlan honetan, balizko eragin hori laborategiko

esperimentuetan oinarrituta aztertu dugu. Horrela,

Cd pean mantendutako muskuiluen kasuan, VvBASnabarmenki igotzerakoan, VvBSD balioek

beherantz egin edo, behintzat, ez zuten

tratamenduaren ondorioz gorantzago egin.

Esaterako, muskuiluak 80 µg/l-ko Cd

kontzentrazioaz tratatzean VvBSD balio altuenak 1.

egunean lortu ziren (1. esperimentua), eta denbora

aurrera joan ahala VvBSD balioak mantendu edo

jaitsi egin ziren, VvBAS balioen gorakadarekin

batera. Halaber, BaP eta Cd + BaP tratamenduen

ondorioz erantzun berbera ikusi dugu (4.

esperimentua), eta baita 10 µg/l-ko Zn

kontzentrazio pean 1 eta 7 egunez mantendutako

muskuiluen kasuan ere. Zn-aren kasuan, ordea,

CTR esperimentuko 7. egunean ageri zen. Bertan,

1. egunean Zn kontzentrazio tisularra eta VvBSDaltuak izan ziren bitartean, 7. egunean jaitsi egin

ziren, VvBAS gorakadarekin batera.

Gainera, muskuiluak CTR induzitzen ez duten

Cd eta Cu kontzentrazio baxuez tratatzerakoan

VvBSD balioen dinamikan ez da erregistratu

aldaketarik esperimentuan zehar (2. eta 3.

esperimentuak). Izan ere, 10 µg Cd/l

kontzentrazioz trataturiko bigarren esperimentuko

muskuiluetan, VvBSD esangarriki igo zen bitartean,

VvBAS ez zen aldatu.

Bestalde, Cd pean egon ostean 14 eguneko

arazketa-aldiak, Cd kontzentrazio tisularraren

igoera sortarazi zuen liseri-guruinean, aldi berean

VvBSD jaitsi zen arren. Itxuraz zentzu gutxiko

aldaketa horiek, liseri-epitelioaren zein ondoko

ehunen osaketa zelularraren aldaketekin erlaziona

litezke. Alde batetik, liseri-epitelioaz gain inguruko

ehun konektiboan eta hemozitoetan ere meta

daiteke kadmioa (Soto et al., 1996a), eta VvBSDbalioek liseri-lisosometan dauden BSDei soilik

dagozkie. Izan ere, VvBSD balioak kalkulatzeko,

beste zeluletan dauden BSD zein AMGk errebelatu

ez dituen metalak ez dira kontuan hartu, AAS

aplikatzean, berriz, metal frakzio guztiak batera

barneratzen dira. Gainera, liseri-lisosometan

metatutako Cd-a liseri-dibertikuluen argira

kanporatzen da, ondoren gorotzekin batera

eliminatua izateko (Marigómez et al., 2002).

Hondakin horiek BSDetan joriak dira, eta irudi-

analisi bitartez ez dira kuantifikatu; analisi

kimikoetan, ordea, hondakin horiek daramaten

metala ere neurtu den bitartean.


96

Ondorioz, metal-esposizioaren adierazleak

diren analisi kimiko zein AMG bidez lortutako

parametroen gain eragin esanguratsua du CTRk,

laborategiko esperimentuko metal pean egondako

muskuiluen kasuan behintzat, aldez aurretik zelai-

ikerketan oinarrituz proposatu zenarekin bat

datorrena (Soto & Marigómez, 1997b).

CTR eragin lezaketen kutsatzaileen maila

kritikoak

VvBSD zein beste biomarkatzaileen gainean

izan dezaken eragina kontuan hartuz, molusku

espezie desberdinetan CTR fenomenoa gerta dadin

beharrezkoak diren kutsatzaile desberdinen

kontzentrazio kritikoak ezagutzea komeni da.

Ikerlan honetan, 80 µg Cd/l, 10 µg Zn/l, 500 µg

DMSO/l eta 500 µg BaP/l-ko dosiek CTR eragin

dezaketela ondorioztatu dugu, beti ere denbora-

tarte desberdinetan kutsatzailearen arabera.

Halaber, 0.25 mg N-metil-N-nitro-N-nitroso-

guanidinaz 15 egunez zein fuel olioaren %6 WAFez

35 egunez tratatutako muskuiluetan eta 1.25 mg

Cd/l-z 17 egunez tratatutako magurioetan CTR

fenomenoa ere gertatu da (Rasmussen et al., 1983;

Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b).

Behe-atalasearen bila, 3. esperimentuan

muskuiluak Cd, Cu eta Zn dosi baxuz tratatu ziren.

Bigarren esperimentua egin ondoren, 10 µg Cd/l-ko

kontzentrazioak 7 egunetan CTRrik eragin ez

zuena bagenekienez, kontzentrazio esperimental

hori aukeratu zen 3. esperimenturako. Bertan, 2.

esperimentuaren emaitzak konfirmatu ziren, eta

baita ere 10 µg Cu/l-ko kontzentrazioak ez zuela

CTRrik induzitzen. Zn-aren kasuan, ordea, 10 µg/l-

ko dosiak CTR jadanik 7. egunean eragin dezake.

Dosiaren menpeko erantzunak ere Cd pean

egondako magurioetan behatu dira. Bertan, 20

egunez 1.25 mg Cd/l kontzentrazioak liseri-epitelioa

nagusiki zelula basofilikoz osatuta egotea sortarazi

zuen bitartean, 500 µg Cd/l-ko kontzentrazioa ez

zen horren eraginkorra suertatu (Marigómez et al.,

1990b). Hain Cd kontzentrazio handiak magurioen

liseri-guruinean CTRrik ez eragiteak, espezien

arteko sentikortasuna oso desberdina izan

daitekeela utzi du agerian.

CTRren itzulgarritasuna

CTR fenomenoaren izaera eta beren

biomarkatzaileen gaineko eragina behar bezala

ulertzeko, prozesua itzulgarria denentz finkatzea

ezinbestekoa iruditu zitzaigun.

Arazketa-prozesuari dagokionez, Zn pean

mantendutako muskuiluetan, CTR prozesua

itzulgarria zela egiaztatu zen, behin estres-iturria

desagertutakoan, liseri-epitelioaren zelulen

proportzioa berriro ere bere hasierako balioetara

itzuli baitzen. CTR fenomenoaren itzulgarritasuna

ez da soilik muskuiluen kasuan ikusi; magurio eta

bareen kasuetan ere estres-egoera jasan eta gero,

zenbait egunez arazten utzitakoan, liseri-epitelioko

zelulen proportzioa berriro ere hasierako egoerara

itzul daitekeela frogatu da (4. eta 5. Kapituluak).

CTRaren gainean eragina izan dezaketen

faktoreak

CTR fenomenoa noiz eta nola ematen den

hobeto ulertzeko, bere gainean ingurumen-faktore


97

desberdinek nolako eragina duten ezagutzea

beharrezkoa zaigu. Faktore hauen artean,

muskuiluen adina, itsasaldi-erregimena, urteko

sasoia, kutsatzaileen arteko elkarrekintza eta aldez

aurretik kutsatzaile pean egon izana ditugu,

besteak beste.

Urteko sasoiari dagokionez, udan VvBASneguan baino altuagoa da. Sasoiari lotutako

aldaketa hori ziklo gonadalarekin erlazionatu da

(Méndez, 1993).

Kutsatzaileen arteko elkarrekintza ikertzeko

asmoz, laugarren esperimentuan Cd-arekin batera

muskuiluak BaP kutsatzaile organikoaren pean jarri

ziren. Analisi kimikoek diotenez, kutsatzaileen

nahasketa horrek ez zuen eraginik izan liseri-

guruinak Cd-a metatzeko duen gaitasunean.

Emaitza hori, beste ikerlan batzuekin bat dator. Izan

ere, Cd eta alkilbentzeno sulfonatua kutsatzaile

organikoaren artean ez da ere ez lehiaketa-

mekanismorik aurkitu (Da Ros et al., 1995). Hala

ere, BSDen emaitzek, BaP-k metalen mobilizazioa

eragin dezakela erakutsi digute. Hau da, BaP

taldeko muskuiluetan VvBSD balioak esangarriki

igo dira esperimentuko lehenengo egunetik.

Beharbada, BaP-aren eraginez, metal esentzialak

liseri-zelulen lisosometara mobilizatuak gerta

litezke.

Laugarren esperimentu honetan, Cd + BaP

nahasketak CTR eragiten du, baita BaPk eta

DMSOk (nahiz eta maila baxuagoan) ere. Cd + BaP

nahasketak emandako VvBAS balioak, Cd pean

mantendutako muskuiluen antzekoak izan dira,

beraz nahiz eta Cd-a eta BaP-a norberak bere

aldetik CTR eragin, bien nahasketak ez du erantzun

gehigarririk ekarri.

CTR fenomenoaren gainean eragina izan

dezakeen beste faktoreetako bat, aldez aurretik

estres-egoera batean egotea izan daiteke.

Bosgarren esperimentuan, Zn-ez kutsatuta zegoen

Meñakoz izeneko lekutik (Soto et al., 1995) hartu

ziren muskuiluak. 7 egunez laborategian ur garbitan

egon ondoren Plentziako muskuilu kontrolen

VvBSD eta VvBAS balio antzekoak erakutsi

zituzten. Izan ere, 3. esperimentuan CTR gutxienez

14 egunetan itzulgarria dela ikusi denez, 7

egunetan VvBAS balioak berreskuratzea ez zaigu

harrigarria gertatu. Gainera, kontrol gisa erabilitako

muskuiluetan, balioak beste esperimentuen

kontrolen maila baxuan mantendu ziren 5.

esperimentuak iraun bitartean. Cd pean jarritako

muskuiluetan, ordea, aurreneko esperimentuetan

ez bezala, 10 µg Cd/l-ko kontzentrazioak CTR

induzitu zuen. Muskuilu hauetan, aldez aurretik

estres-egoera batean egon izanak, beraien liseri-

guruineko VvBAS Plentziako muskuiluetan baino

errezago goratzea eragin zezakeen. Bestalde, bi

Cd kontzentrazioen desberdinen pean

mantendutako muskuiluetan VvBSD balioen

jeitsiera behatu zen, VvBAS balioen aldaketekin

sinkronian agertu ez ba ziren ere. Gainera, VvBSDbalioak Plentziako muskuiluetan (2. esperimentuko

datuak) baino denbora gehiago behar izan zuten

modu esangarrian igotzeko. Beraz, aldez-aurretik

estres-egoera batean egon izanak, dirudienez, CTR

erantzunaren nondik norakoak, zein metalen

detoxifikazio-mekanismoak eta -dinamika afekta

ditzake.


98

Ondorioak

Ikerlan honetan lortutako emaitzek dioskutenez,

muskuiluen liseri-guruinean CTR eragiteko gai da

kadmioa. Bestalde, Cd-a ehunetan detektatzeko

erabili den AMG bitartez errebelatutako BSDak,

liseri-zelulen lisosometan espezifikoki lokalizatu

dira. Hori dela eta, CTRk VvBSD balioen gainean

eragina dauka, metala metatzeko

konpartimentuaren txikitzearen ondorioz. Bestalde,

CTR gertatzeko beharrezkoa den kutsatzaile

desberdinen kontzentrazio-atalaseak zehaztu dira,

kutsatzaile eta espeziearen arabera desberdinak

izanik. Halaber, estres-iturria etetean CTR

itzulgarria izan daitekeela atzeman dugula

azpimarratzekoa da. Azkenik, CTR prozesuaren

gainean zenbait faktorek eragina eduki dezaketela

ikusi dugu; kutsatzaileak nahasketetan agertzea eta

muskuiluak aldez aurretik estres-egoeran egon

izana, besteak beste.

BIBLIOGRAFIA

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez I, Angulo E (1990a)

Responses of basophilic cells of the digestive gland of

mussels to petroleum hydrocarbon exposure. Dis. Aquat.

Org. 9:221-228

Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1990b) Short-term toxic

effects of 1-naphthol on the digestive gland-gonad complex

of the marine prosobranch Littorina littorea (L.): a light

microscopic study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 19:17-

24

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995)

Cellular biomarkers as useful tools in the biological monito-

ring of pollution: molluscan digestive lysosomes. :29-55 orr.

Non: Cell Biology in Environmental Toxicology. Cajaraville

MP (ed.). University of the Basque Country Press Service.

Bilbo.

Cajaraville MP, Bebianno MJ, Blasco J, Porte C, Sarasquete C,

Viarengo A (2000) The use of biomarkers to assess the

impact of pollution in coastal environments of the Iberian

Peninsula: a practical approach. Sci. Total Environ.

247:295-311.

Danscher G (1981) Histochemical demonstration of heavy

metals. A revised version of the sulphide silver method sui-

table for both light and electronmicroscopy. Histochemistry

71:1-16.

Danscher G (1984) Autometallography. A new technique for

light and electron microscopic visualization of metals in bio-

logical tissues (gold, silver, metal sulphides and metal sele-

nides). Histochemistry 81:331-335.

Da Ros L., Nasci C, Campesan G, Sartorello P, Stocco G,

Menetto A (1995) Effects of linear alkylbenzene sulphona-

te (LAS) and cadmium in the digestive gland of mussel,

Mytilus sp. Mar. Environ. Res. 39:321-324.

Da Ros L, Nasci C, Marigómez I, Soto M (2000) Biomarkers

and trace metals in digestive gland of indigenous and

transplanted mussels, Mytilus galloprovincialis, in Venice

lagoon, Italy. Mar. Environ. Res. 50:417-423.

Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004)

Cytochemical and histochemical aspects of the digestive

gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in

relation to function. J. Mol. Histol. 35:501-509.

Dimitriadis VK, Papadaki M (2004) Field application of autome-

tallography and X-ray microanalysis using the digestive

gland of the common mussel. Ecotoxicol. Environ. Saf. 59:

31-37.

Domouhtsidou GP, Dimitriadis VK (2000) Ultrastructural locali-

zation of heavy metals (Hg, Ag, Pb, and Cu) in gills and

digestive gland of mussels, Mytilus galloprovincialis (L.).

Arch. Environ. Contam. Toxicol. 38:472-478.

Giamberini L, Auffret M, Pihan JC (1996) Hemocytes of the

freshwater mussel, Dreissena polymorpha Pallas: cytology,

cytochemistry and X-ray microanalysis. J. Moll. Stud. 62:

367-379.

Hemelraad J, Herwig HJ (1988) Cadmium kinetics in freshwa-

ter clams. IV. Histochemical localization of cadmium in

Anodonta cygnea and Anodonta anatina exposed to cad-

mium chloride. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 17:337-

343.

Herwig HJ, Brands F, Kruitwagen E, Zandee DI (1989)

Bioaccumulation and histochemical localization of cad-

mium in Dreissena polymorpha exposed to cadmium chlo-

ride. Aquat. Toxicol. 15:269-286.

Holwerda DA (1991) Cadmium kinetics in freshwater clams. V.

Cadmium-copper interaction in metal accumulation by


99

Anodonta cygnea and characterization of the metal-binding

protein. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 21:432-437.

Ireland MP, Marigómez I (1992). The influence of dietary cal-

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mg & P and his-

tological changes in the digestive gland cells of the snail

Achatina Fulica Bodwich. J. Moll. Stud. 58:157-168.

Isani G, Andreani G, Kindt M, Carpene E (2000)

Metallothioneins (MTs) in marine molluscs. Cell Mol. Biol.,

46: 311-330.

Langston WJ, Bebianno MJ, Burt GB (1998) Metal handling

strategies in molluscs. orr: 219-283 Non: Metal Metabolism

in aquatic envionments. Langston WJ & Bebianno MJ

(ed.).Chapman & Hall. London.

Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil on diges-

tive cells in mussels: quantitative alterations in cellular and

lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 8:265-272.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990a) Cellular distribu-

tion of cadmium in the common winkle Littorina littorea (L.)

determined by X-ray microprobe analysis and histoche-

mistry. Histochemistry 94: 191-199.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990b) Histopathology

of the digestive gland-gonad complex of the marine proso-

branch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis. Aquat.

Org. 9:229-238.

Marigomez JA, Soto M, Angulo E (1991) Responses of winkles

digestive cells and their lysosomal system to environmen-

tal salinity changes. Cell. Mol. Biol. 37:29-39.

Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level bio-

markers of biological effect of mercury on sentinel slugs,

Arion ater. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31:54-62.

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1997) Tissue-level

biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to

assess metal pollution in soils. Arch. Environ. Contam.

Toxicol. 34:167-176.

Marigómez I, Cajaraville, MP, Soto M, Lekube X (1998) Cell-

type replacement, a successful strategy of molluscs to

adapt to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol.

20:411-414.

Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Giamberini L

(2002) Cellular and subcellular distribution of metals in

molluscs. Microsc. Res. Tech. 56:358-392.

Martoja R, Martoja-Pierson M (1970) Técnicas de Histología

Animal. Toray Masson. Barcelona. 350 orr.

Mason AZ, Jenkins KD (1995) Metal detoxification in aquatic

organisms. 479-608 orr. Non: Metal speciation and bioavai-

lability in aquatic systems Tessier A & Turner DR (ed.).

John Wiley and Sons. New York.

Mason AZ, Simkiss K (1983) Interactions between metals and

their distribution in tissues of Littorina littorea (L) collected

from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K. 63:

661-672.

Mason AZ, Simkiss K, Ryan KP (1984) The ultrastructural loca-

lization of metals in specimens of Littorina littorea collected

from clean and polluted sites. J. Mar. Biol. Ass. U.K.

64:699-720.

Méndez PA (1993) Composición celular y estructura tisular de

la glándula digestiva de mejillones en un programa de

seguimiento de la contaminación en el estuario de el Abra.

Lizentziatura-Tesia. UPV/EHU. 88 orr.

Mix MC, Sparks AK (1971) Repair of digestive tubule tissue of

the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing

radiation. J. Invert. Pathol. 17: 172-177.

Morgan AJ, Winters C, Stürzebaum S (1997) X-ray microanaly-

sis techniques. 245-276 orr. Non: Methods in molecular

Medicine Biology. 117: Electron Microscopy Methods and

Protocols Hajibagheri N (ed.). Humana Press Inc. Totowa

New Jersey.

Morgan JE, Morgan AJ (1998) The distribution and intracellular

compartmentation of metals in the endogeic earthworm

Aporrectodea caliginosa sampled from an unpolluted and a

metal-contaminated site. Environ. Pollut. 99:167-175.

Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia. 65-147orr.

Non: The Mollusca 5 Saleuddin ASM & Wilburg M (ed.).

Academic Press. New York.

Pavicic S, Balestreri E, Lenzi P, Raspor B, Branica MF(1991)

Isolation and partial characterization of cadmium induced

metallothionein-like proteins in Mytilus galloprovincialis.

Mar. Chem. 36:249-265.

Pearse AGE (1980) Histochemistry. Theoretical and applied.

Vol 1. preparative and optical technology. 4. edizioa.

Edinburgh: Churchill Livingstone. 1055 orr.

Porte C, Sole M, Borgi V, Martínez M, Chamorro J, Torreblanca

A, Ortiz-Zarragoitia M, Orbea A, Soto M, Cajaraville MP

(2001) Chemical, biochemical and cellular responses in

digestive gland of mussels Mytilus galloprovincialis from

the Spanish Mediterranean coast. Biomarkers 6:335-350.

Rainbow PS, Dallinger R (1993) Metal uptake, regulation and

excretion in freshwater invertebrates. 119-131 orr. Non:

Ecotoxicology of metals in invertebrates Dallinger R &

Rainbow PS (ed.). Lewis Publ. Boca Raton, Florida.


100


101

Rasmussen LPD, Hage E, Karlog O (1983) Light and electron

microscopic studies of the acute and chronic toxic effects

of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus edu-

lis (L.). II. N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine. Aquat.

Toxicol. 3:301-311.

Recio A, Marigomez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc treat-

ment of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1.

Cellular distribution of zinc and calcium. Bull. Environ.

Contam. Toxicol. 41:858-864.

Roesijadi G (1994) Metallothionein induction as a measure of

response to metal exposure in aquatic animals. Environ.

Health Persp. 102:91-95.

Roesijadi G (2000) Metal transfer as a mechanism for metallo-

thionein-mediated metal detoxification. Cell Mol. Biol. 46:

393-405.

Sokal RR, Rohlf FJ (1979). Biometría. Madrid: Blume. 832 orr.

Soto M, Kortabitarte M, Marigómez I (1995) Bioavailable heavy

metals in estuarine waters as assessed by metal/shell-

weight indices in sentinel mussels Mytilus galloprovincialis.

Mar. Ecol. Prog. Ser. 125:127-136.

Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Marigómez I (1996a)

Autometallographic localization of protein-bound copper

and zinc in the common winkle, Littorina littorea: a light

microscopical study. Histochem. J. 28:1-13.

Soto M, Cajaraville MP, Marigómez I (1996b) Tissue and cell

distribution of copper, zinc and cadmium in the mussel

Mytilus galloprovincialis determined by autometallography.

Tiss. Cell 28:557-568.

Soto M, Marigómez I (1997a) BSD extent, an index for metal

pollution screening based on the metal content within

digestive cell lysosomes of mussels as determined by

autometallography. Ecotox. Environ. Saf. 37:141-151.

Soto M, Marigómez I (1997b) Metal bioavailability assessment

in "Mussel-Watch" programmes by automated image

analysis of BSD in digestive cell lysosomes. Mar. Ecol.

Prog. Ser. 156:141-150.

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I. (1998a)

Autometallographed metal content in digestive cells of win-

kles: a cost-effective screening tool to monitor Cu and Zn

pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140.

Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b)

Autometallographical procedure for the localization of

metal traces in molluscan tissues by light-microscopy. J.

Histotechnol. 21:123-127.

Syasina IG, Vaschenko MA, Zhandan PM (1997) Morphological

alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten

yessoensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of

Peter the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res.

44:85-98.

Taylor, MG (1995). Mechanisms of metal immobilization and

transport in cells. 155-170 orr. Non: Cell Biology in

Environmental Toxicology. Cajaraville MP (ed.).University

of the Basque Country Press Service. Bilbo.

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of

starvation on structure and function in the digestive gland

of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K. 54:

699-712.

Triebskorn R, Künast C (1990) Ultrastructural changes in the

digestive system of Deroceras reticulatum (Mollusca:

Gastropoda) induced by lethal and sublethal

concentrations of the carbamate molluscicide cloethocarb.

Malacologia 32:89-106.

Viarengo A (1989) Heavy metals in marine invertebrates:

mechanisms of regulation and toxicity at the cellular level.

Rev. Aquat. Sci. 1:295-317.

Viarengo A, Nott JA (1993) Mechanisms of heavy metal cation

homeostasis in marine invertebrates. Comp. Biochem.

Physiol. C 103:355-372.

Viarengo A, Canesi L, Mazzucotelli A, Ponzano E (1993) Cu, Zn

and Cd content in different tissues of the Antarctic scallop

Adamussium colbecki, role of metallothionein in heavy

metal homeostasis and detoxification. Mar. Ecol. Prog. Ser.

95:163-168.

Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press.

London 415 orr.

Widdows J, Moore MN, Lowe DM. 1984. Sublethal biological

effects and short-term recovery of mussels (Mytilus edulis)

and winkles (Littorina littorea) following chronic exposure to

petroleum hydrocarbon. Non: Long term effects of oil on

marine benthic communities in enclosures. Norwegian

Institute for Water Research/NIVA Technical Report No. 0-

82007.


102

Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamoldezirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean etaurdailean

Laburpena: Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen liseri-guruineko eta urdaileko epitelio-zelulenberriztapena bromodeoxiuridinaren (BrdU) immunohistokimika bitartez ikertu da. Muskuiluak 4 mg BrdU/litsas-ur disoluzio pean etengabe mantendu ziren. Tratamenduari ekin eta 6 ordu ondoren, laginak 2 ordurohartu ziren 2 egunez. BrdU-markaketa argi-mikroskopioan zuzenean kontaketak eginez estimatu zen,balioak zelula BrdU-positiboen ‰ -tan emanez. BrdU erreakzio positiboa liseri-zelulen, zelula basofilikoen,eta konduktu zein urdaileko zelulen nukleoetan behatu zen, eta baita hemozitoetan ere. Liseri-dibertikuluetan, zelulen berriztapena eredu zirkamareala jarraituz sinkronizaturik agertu zen: BrdUmarkaketa, itsasbeheran igo eta itsasgoran jeisten zen. Liseri-zeluletan, irudi mitotikoa argiak behatu ziren.Lortutako emaitzek, zelula-mota desberdintzatuek proliferatzeari ekin diezaioketela egiaztatu ziguten, aldezaurretik egindako Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikaren emaitzekin batzetorrena. Urdailean ere epitelio-zelulen berriztapena sinkronizatuta zegoela atzeman genuen.

Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, berriztapen zelularra, mitosia, itsasaldia, fotoperiodoa, liseri-guruina,bibalbioak.

Zelulen proliferazioaren aldamolde zirkamareala muskuiluaren liseri-guruinean

103

Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestivegland and stomach

Abstract: Epithelial cell renewal in mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk) digestive gland and stomachwas investigated by bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. Mussels were exposed to 4 mgBrdU/l seawater continuously. Then, starting after 6 h treatment samples were collected every 2 h for 2 daysand BrdU labelling was estimated by direct counting at the light microscope as ‰ BrdU positive cells. BrdUpositive reaction was observed in the nuclei of digestive, basophilic, duct and stomach cells, as well as inhemocytes. Cell renewal in digestive diverticula is synchronised following a circatidal pattern: BrdU labellingincreased during low tide and decreased during high tide. Clearcut mitotic figures were identified indigestive cells, which confirmed that mature cell types proliferate, in agreement with the results fromimmunohistochemistry for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunohistochemistry. Epithelial cellrenewal in the stomach also appeared to be synchronised.

Key Words: bromodeoxyuridine, cell renewal, mitosis, tide, photoperiod, digestive gland, bivalves.

Variación circamareal en la proliferación de células epiteliales en glánduladigestiva y estómago de mejillón

Resumen Se investigó la renovación de células epiteliales en glándula digestiva y estómago delmejillón (Mytilus galloprovincialis, Lmk) mediante inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Seexpusieron contínuamente mejillones a 4 mg BrdU/l agua de mar. Así,transcurridas 6 h de haberse iniciadoel tratamiento se recogieron muestras cada dos h durante 2 días y se estimó el marcaje de BrdU medianterecuento directo al microscopio fotónico en términos de ‰ de células BrdU positivas. Se observó reacciónBrdU positiva en los núcleos de las células digestivas, basófilas, de los conductos y del estómago, asícomo en hemocitos. La renovación celular en los divertículos digestivos estaba sincronizada de acuerdocon un patrón circamareal: el marcaje con BrdU aumentaba durante la marea baja y disminuía durante lamarea alta. Se identificaron cortes limpios de figuras mitóticas en células digestivas, lo que confirmó quelas células maduras son capaces de proliferar, de acuerdo con resultados anteriores deinmunohistoquímica de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). También la renovación de células delepitelio del estómago parecía estar sincronizada.

Palabras clave: bromodeoxiuridina, renovación celular, mitosis, marea, fotoperiodo, glándula digestiva,bivalvos.


104


105

SARRERA

Moluskuen liseri-guruin ehunaren oinarrizko

zelulen berriztapenari dagokionez kasik ikerlanik ez

dago, egitez. Muskuiluetan, liseri-guruina

azkenean urdailean zabaltzen diren konduktu

primarioei konduktu sekundarioen bitartez loturiko

unitate albeolotubularren multzotan antolatuta

dago. Unitate albeolotubular horien epitelioa bi

zelula-mota helduz osaturik dago, liseri-zelulak eta

zelula basofilikoak deitutakoak, hain zuzen

(Morton, 1983). Liseri-zelulek elikagaien liseriketa

intrazelularraren ardura dute, sistema endo-

lisosomiko erabat garatua daukatelarik. Zelula

basofilikoak, urriagoak, zelula jariatzaileak dira,

basofiliaren ezaugarria ematen dien erretikulu

endoplasmatiko pikortsu garatuaz hornituta

daudelarik (Dimitriadis et al., 2004). Epitelioa arras

dinamikoa da, eta elikagaien eskuragarritasunari

zein bestelako ingurumen-faktoreei erantzunez, bi

zelula-moten itxura, kopurua eta edukiak ordu gutxi

batzuetan bortizki alda daitezke (Morton 1983).

Izan ere, elikatze-ziklo bakoitzean, hots, ordu gutxi

batzuen buruan, liseri-epitelioa guztiz berriztatzen

dela proposatu da (Nelson & Morton 1979). Zelulen

berriztapen bizkor hori gertatu ala ez, zelula

basofilikoen proportzioa emendatzea dakarren

epitelioaren berrantolaketa, ingurumen-estresaren

iturri desberdinek bultzatzen dutena behin eta

berriz egiaztatu da (Thompson et al. 1974;

Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990;

Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997;

Marigómez et al. 1998a; 1. Kapitulua). Zelula-

moten ordezkapena (ingeleraz, Cell Type

Replacement; CTR) izenaz ezagutzen den

fenomeno hori, alde batetik, ingurumen-erasoa

jaso eta ordu gutxietara jada nahiko aurreratua

egon daiteke, eta, bestalde, zeharo itzulgarria da,

estresa eten eta egun gutxietara jada zelula-moten

proportzioa bere onera datorrelarik (Marigómez et

al., 1998b). Hastapenetako ikerlanetan, CTR zelula

basofilikoen proliferazioa areagotuak sor zezakeela

kontsideratu zen (Thompson et al. 1974;

Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al. 1990;

Marigómez et al. 1990; 1998a). Haatik, zelula

basofilikoen proliferazioaren ideia guztiz baztertu

ezin bada ere, oraintsu eginiko esperimentuek

CTRren gorakadak zelula basofilikoen

proliferazioan baino gehiago liseri-zelulen galeran

datzala iradoki dute (Marigómez et al., 1998b;

Zaldibar et al., 2001). Bestalde, ingurumen-estresa

sortarazten duten iturriak desagertzekotan liseri-

zelulak proliferatzeko gai dira, laborategiko

baldintza kontrolatu pean buruturiko sendabidetze-

esperimentuetan erakutsi den moduan (Zaldibar et

al., 2001; 4. & 5. Kapituluak). Zoritxarrez, liseri-

guruinean zalantzabako irudi mitotikoak bilatzeak

ez du fruitu onik ekarri orain arte (Thompson et al.

1974; Rasmussen et al 1983; Cajaraville et al.

1990; Marigómez et al. 1990; Syasina et al. 1997;

Marigómez et al. 1998a; 1998b; Marigómez et al.

1999; Zaldibar et al. 2001).

Izan ere, mitosiak nekez aurkitu dira bibalbioen

liseri-guruinean. Ikerlan aurrendari batean, Yonge-

k (1926) anafasean omen zegoen zelula baten

marrazkia aurkeztu zuen. Autore horrek, zenbait

zelula basofilikok zelula ama (sic., young cell)

moduan joka dezaketela, eta, krustazeoen

hepatoarean bezalaxe (Icely & Nott 1992; Vogt

1994), zelula gaztez osatutako kriptetatik

(habietatik) zelulen berriztapena abia daitekeela

iradoki zuen. Are gehiago, erradiazio ionizatzaile

pean egondako ostretan liseri-guruineko epitelioa

ea zeharo desagerrarazi ondoren, epitelio-zelulen

birpopulatzea kripta-zelulen mitosien bidez

eratutako zelula-habien eraiketaz hasten da (Mix &

Sparks 1971). Hala ere, nahiz eta itxuraz

basofilikoak izan, kripta-zelulak txikiak dira, eta ezin

dira inolaz ere zelula basofiliko heldu (jariatzaile)

gisa kontsideratu, nahiz eta geroagoko artikuluetan,

bestelako argibide sustatzailerik gabe, zelula

basofilikoak bibalbioen liseri-guruineko epitelioaren

birsortzearen erantzuleak diren zelula gazteak

direla proposatu den (Fankboner 1971; Palmer,

1979; Morton 1983). Aitzitik, Proliferating Cell

Nuclear Antigen (PCNA) immunohistokimikak

oraintsu erakutsi duenez (Marigómez et al., 1999),

muskuiluetan bai liseri-zelulak eta baita zelula

basofilikoak ere desberdintzatzeko, S-fasean

sartzeko eta proliferatzeko gai dira, sagu helduaren

listu-guruinetan zatiketa autologoa pairatzen duten

zenbait zelula-mota helduek egiten duten bezalaxe

(Denny et al., 1993). Halaber, Mya arenaria-ren

liseri-tubuluetan ere, epitelio-zelula helduak PCNA -

positiboak dira (Hanselmann et al., 2000).

Ondorioz, zelula amek epitelioen berriztapenean

parte hartuko lukete baina soilik epitelioan kalte

masiboak ematekotan; bestela, baldintz

normaletan, epitelio-zelulen berriztapena liseri-

zelula eta zelula basofiliko helduen zatiketa

autologoa dela medio burutuko litzateke.

Ornodunen ehunetan, epitelio-zelulen berriztapen-

dinamika eta prozesu horretan inplikatutako zelula-

motek jasandako aldaketak, egoera fisiologiko eta

patologikoen menpean daudela modu sinesgarrian

erakutsi da (Karam & Leblond 1993; Santa Barbara

et al., 2003).

Muskuiluen liseri-guruineko epitelioaren

berriztapena sinkronizatuta egonez mitosiak gauez

burutuko balira, aurreneko ikerlanetan mitosirik

aurkitu ez izana azalduko litzateke (Marigómez et

al., 1998b; Zaldibar et al., 2001). Zelulen zatiketa-

tasan aldamolde zirkadiarrak algetatik hasita

ugaztunetaraino deskribatu izan dira (Makarov et al.

1995; Abrahamsen et al. 1998; Bjarnasson et al.

1999; García et al. 2001). Are gehiago, zenbait

eredu esperimentaletan behintzat, zelulen

proliferazioa eta ordezkatze-prozesuak batez ere

gauez gertatzen direna jakin badakigu (Scheving et

al., 1978; Abrahamsen et al., 1998; Bjarnasson et

al., 1999; García et al., 2001).

Muskuiluen liseri-guruineko zelulen

proliferazioak patroi zirkadiarra jarraitzen duen

antzemateko, zelula proliferatzaileen banaketa

bromodeoxiuridina (BrdU) immunohistokimika

aplikatuz ikertu da Mytilus galloprovincialis (Lmk.)

muskuiluan. BrdU timidinaren analogoa da, eta

ziklo zelularraren S-fasean zehar zelula

proliferatzaileen DNAri eransten zaio. Muskuiluak, 4

mg BrdU/l-ko kontzentrazioa zuen itsas-uretan

mantendu ziren 2 egunez. BrdUren agerpena

immunohistokimika bitartez detektatu zen, eta

zelula proliferatzaileen proportzio erlatiboa (BrdU-

markaketa) denbora-tarte desberdinetan

erregistratu zen, BrdU-markaketan aldaketa

zirkadiarrak identifikatu ahal izateko.


106


107


Erreaktibo kimikoak





Laginak eta prozedura esperimentala

Gutxi gorabehera 35-45 mm-ko luzerako

maskorra zuten mareazpiko M. galloprovincialis

(Lmk) muskuiluak Plentzian (Bizkaiko Golkoa

43°24'I, 2°56'M) hartu ziren, uztailan eta goizerdiko

itsasbeheran (10:12 a.m.). Laginketa mareazpiko

muskuiluetara mugatu zen, itsasaldien zikloa eta

fotoperiodoaren arteko elkarrekintza ekiditeko

asmoz. Muskuiluak (n=80) laborategira garraiatu

ziren eta 15 l-ko polietilenozko akuario batean

mantendu ziren 15°C-tan eta etengabeko

aireztapenaz. Itsas-ura argi ultramorea erabiliz

esterilizatu zen, eta karbono aktiboz zein beirazko

zuntzetan zehar iragazi egin zen; esperimentuak

iraun bitartean itsas-ura ordezkatu ez zelarik.

Muskuiluei, ornogabe itsastarrentzako jaki

komertziala (Marine Invertebrate Diet, Carolina,


Batuak) egunero eman zitzaien, goizeko 12:00-tan.

Baldintza horietan, muskuiluak BrdU-tratamendu

pean 2 egunez mantendu ziren. Hasieran, itsas-

uretan 4 mg BrdU/l-ko pultsua aplikatu zitzaien, eta

gerora 2 mg/l-ko pultsuak 4 orduro aplikatu ziren,

maila zitotoxikoetara heltzeke BrdUren

eskuragarrita-suna etengabe ziurtatu ahal izateko.

Horrela, saiakuntza-denboran zehar BrdUren

galerarik gertatuko ez balitz ere, uretan metatutako

gehiegizko BrdUren kontzentrazioa 20 mg/l baino

baxuagoa izango litzateke. Ornogabe itsastarrekin

egindako pultsu-esperimentuetan BrdUren

kontzentrazioak 500 mg/l-ko bezain altuak erabili

dituzte beste ikertzaileek (Candia Carnevali et al.,

1997; Goergen et al., 2002). Hala ere, guk BrdU

kontzentrazio askoz baxuagoa aplikatzea erabaki

genuen honako arrazoi hauengatik: (1) muskuiluak

laborategian egoera egokian mantentzeko ur

bolumen handia ezinbestekoa zen, (2) 20-40 mg

BrdU/l baino kontzentrazio altuagoek, muskuiluen

ehunen zelulen berriztapena inhibi dezakete

(Martínez-Expósito et al., 1994); eta (3) aurreneko

ikerketek, 4 mg BrdU/l-ko kontzentrazioa liseri-

guruineko epitelioan BrdU-markaketa konspikuoa

erdiesteko nahikoa dela adierazi baitziguten.

Muskuiluak denbora-tarte desberdinetan sakrifikatu

ziren, BrdU-markaketaren fluktuazio-erritmoak

identifikatu ahal izateko.

Zelula BrdU-positiboen immunohistokimika

Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean

(%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10

azido azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4°C-tan.

Fixatu ondoren, laginak goranzko graduazioko

etanolezko bainu-serie batean deshidratatu ziren

eta parafinan inkluditu ziren 60°C-tan. Ebakiak (3-

4 µm-ko lodiera) American Optical mikrotomoan

ebaki ziren eta aldez aurretik (3-amino propil

trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jaso

ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren,

beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie

batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz

(PBS; ingeleraz, Phosphate-Buffered Saline)

garbitu ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa

ekiditeko, ebakiak %3 zuen H2O2-an inkubatu ziren

5 minutuz, eta berriro PBSz garbitu ziren. DNA, 0.1

N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37°C-tan.

Ebakiak, Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector

Laboratories, Burlingame, California, Amerikako

Estatu Batuak) hornitutako suero blokeatzailean

ordu batez inkubatu ziren giro-tenperaturan eta

berriro ere PBSz garbitu ziren. Gero, ebakiak

BrdUren aurkako antigorputz espezifikoan (Roche,

Basilea, Suitza; %0.1 bovine serum albumine zuen

PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak PBSz

garbitu ziren, eta ondoren, Vectastain Elite ABC Kit-

aren bitartez, abidina-biotina entzima-konplexua

erabiliz antigorputza ikustarazi zen. Laburki,

ebakiak, PBSn diluitutako saguaren aurkako

zaldiaren IgG antigorputz sekundario biotinilatuan

inkubatu ziren, 30 minutuz, eta ondoren PBSn

garbitu ziren. Peroxidasa jarduera ikustarazteko

kromogenoaren disoluzioa (3-amino-9-

etilokarbazola, %0.015 H2O2 zuen sodio azetato

indargetzailean -pH 5.2- disolbatua) erabili zen.

Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu ziren

(10 s), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina

glizerolatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse

Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak)

muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50

(Olympus Tokio Japonia) mikroskopioari atxiki

zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi

ziren.

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argi-

mikroskopioan kontateka zuzenaren bidez burutu

zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen

proportzioa antzemateko asmoz, 1000 zelula

zenbatu ziren lagin bakoitzean, beste ikerketetan

erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et

al., 1999). Aldez aurretik egindako behaketa

histologikoek, liseri-epitelioaren tubulu moduko

ebakidura bakoitzean gutxienez 20-30 zelula

daudela erakutsi zuten. Hori dela eta, eguneroko

lana errazteko asmoz, zelula BrdU-positiboen

zenbaketa aleatorioki hautatutako 40 tubulu

moduko ebakiduretan burutu zen (800-1200 zelula)

liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki konduktu

sekundarioen ebakidura bakoitzean 70-90 zelulak

agertzen direnez gero, zelula BrdU-positiboen

zenbaketa 10 konduktu sekundarioen ebakiduretan

burutu zen (700-900 zelula). Horrek, laginaren

tamaina egoki lortzearen eta konduktu

sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen

zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia

suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan

‰--ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu

bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula

zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru

baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea

oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen.

Datuak kasu honetan ere ‰-ko balioetan eman

dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko.

Analisi estatistikoak, SPSS/PC+ programa

erabiliz burutu ziren (SPSS, Microsoft). Denboraren

eragina ikusi ahal izateko, faktore bateko ANOVA

burutu zen, eta konparaketa anitzak eginez

parekatutako batezbestekoen artean

desberdintasun esangarriak (p<0.05) finkatzeko


108

Duncan testa aplikatu zen. Azkenik, erregresio ez

linealaren analisiak Sigma Plot programaren

bitartez (SPSS, Microsoft) burutu ziren.

Mitosien bilaketa

Beste parafinazko ebaki batzuk (3 µm-koak)

aldez aurretik deskribatu bezala prozesatu ziren,

hematoxilina-eosinaz tindatu eta argi-

mikroskopioan behatu ziren, liseri-guruinaren

ehunean irudi mitotikoak identifikatzeko asmoz.

Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopioari atxiki

zegoen Olympus PM20 kameran lortu ziren.

EMAITZAK

Muskuiluen liseri-guruinan, zelula BrdU-

immunorreaktiboak urdail, konduktu sekundario eta

liseri-albeoloen epitelioetan lokalizatu egin ziren (1

Ird.). Liseri-epitelioan, liseri-zelulek zein zelula

basofilikoek positiboki markatutako nukleoa

erakutsi zuten, nahiz eta zelula erreakzionagarri

gehienak liseri-zelulak izan (1A Ird.). Konduktu

sekundarioetan, zelula BrdU-positiboak zati

ziliatuetan kokaturik agertu ziren gehien bat (1B

Ird.). Urdailean beste epitelioetan baino askoz

zelula immunopositibo gehiago behatu ziren (1C

Ird.). Azkenik, hemozitoen nukleoetan ere

markaketa bortitza aurkitu genuen. Hemozitoak,

sarritan epitelio-zelula BrdU-positiboen azpian

kokaturik agertu ziren, xafla basalaren (zentzu

histologikoan) azpian, hain zuzen ere (1B Ird.).

Gainera, zelulen soberakinak, nukleo BrdU-

positiboak barne, liseri-traktuaren argian askotan

behatu ziren, hondakin zelularrekin batera (1D Ird.).

BrdUren aurkako antigorputzarik gabe inkubatu

ziren kontrol-ebakiek ez zuten inolako markaketarik

erakutsi (1E Ird.).

Faktore bateko ANOVA analisien (1. Taula) zein

batezbestekoen arteko konparaketa anitza egiteko

Duncan testaren arabera, BrdU-markaketa

baloreak laginketa-denboren artean esangarriki

desberdinak izan ziren. Duncan testaren arabera

esangarriki desberdinak ziren zenbait azpitalde

homogeneo bereiztu ziren, 2. Ird.-an erakutsi den

bezalaxe. Liseri-epitelioan, zelulen ‰20-‰25

bitartean BrdUz markatuta agertu zen; konduktu

sekudarioetan, berriz, markaketa 8 aldiz baxuagoa

izan zen gutxi gorabehera (‰3), eta urdailean 6

biderrez altuagoa (‰150) (2 Ird.). Liseri-guruineko

zelulen BrdU-markaketak liseri-zelulen proliferazio-

tasaren aldaketak islatu zuen batik bat, zelula

basofiliko BrdU-positiboak oso noizean behin baino

behatu ez zirelako. Liseri-epitelioan, BrdU-

markaketaren jaitsiera nabarmenak 20:00-24:00

eta 08:00-10:00 tarteetan erregistratu ziren,

bitartean igoerak behatu zirelarik (2A Ird.).

Esperimentazio-egun bietan aldamolde erritmiko

berdintsua aurkitu genuen. Erregresio ez-linealaren

analisiaren ondoren, gutxi gorabehera 12 h-ko

maiztasuna zuen funtzio sigmoideo bati doitu

zitzaion, esangarriki. (3 Ird.). BrdU-markaketak

konduktu sekundarioetan eta urdaileko epitelioan

antzeko irudi erritmikoen patroia erakutsi zuen (2B,

C Ird.), baina erregresio ez-lineala eta korrelazio-

koefizientea ez ziren estatistikoki esangarriak izan.

Muskuiluen liseri-guruina ohi bezala behatu

ostean, irudi mitotikoak han-hemenka identifikatu

ziren liseri-zeluletan (1F Ird.), eta hemozito zein

urdaileko zeluletan ere.


109

EZTABAIDA

PCNA erabiliz aldez aurretik egindako lanek,

liseri-epitelioa osatzen duten zelula-mota guztiek

proliferatzeko gaitasuna dutela erakutsi dute

(Marigómez et al., 1999). Liseri-zelulak zein zelula

basofilikoak desberdintzatzeko eta mitosian

sartzeko gai direla proposatu da. Dena den, bere

biziraupen luzeari esker, PCNA-immunoerreakzio-

nagarritasuna, zelula amen mitosien bidez

sortarazitako zelula desberdintzatuen nukleoetan

ere detekta daiteke (Casasco et al., 1995). Gure

ikerlan honetan, liseri-zeluletan irudi mitotikoak

agertu izanak eta BrdU-immunohistokimikaren

emaitzek, zelulen berriztapena liseri-zelula eta

zelula basofiliko helduen zatiketa autologoaren

bitartez erdiesten dela egiaztatu dute. Hala ere, oro

har, BrdU-markaketa PCNA-markaketa baino

ahulagoa da. Markatutako zelulen proportzioan

aurkitutako desberdintasunak, 3H-Timidina, PCNA

eta BrdU erabili direneko tasen araberakoak izan

daitezke (Elsässer et al., 1994; Bromley et al.,

1996; Moriki et al., 1996). Horrela, arratoiaren

areako zelula azinarretan, zelula PCNA-positiboak

3H-Timidina-positiboak baino 10 aldiz ugariagoak

dira, bi teknika histokimikoen bidez lortutako

emaitzen artean korrelazio esangarria dagoen

arren (Elsässer et al., 1994). Azalpenik egokiena,

seguru asko, PCNAren bizi-iraupena 20 ordukoa

izatean datza; S-fasearen iraupena baino luzeagoa

dena, hain zuzen. Hori dela eta, zelula PCNA-

positiboak ez dira soilik S-fasean daudenak baizik

eta S-fasean daudenak edo eta oraintsu S-fasea

gainditu berri dutenak ere. Ondorioz, PCNA

immunohistokimikak zelula proliferatzaileak

lokalizatzeko seinale bortitzagoa eskaini dezaken

arren; proteinaren biziraupen luzeagoak epitelioen

berriztapenaren dinamikak aztertzeko desabantaila

suposa diezaguke. BrdU-immunohistokimika, bere

aldetik, helburu hori betetzeko egokiagoa dela

dirudi, BrdUren biziraupena laburragoa denez,

pultsu-esperimentuetan aplikatzeko aukera eskaini

baitiezaguke. Izatez, proliferazioaren markatzaile

immunohistokimiko sendoena eta fidagarriena dugu

BrdU, S-faseak baino ez dituelako identifikatzen

(Bromley et al., 1996). BrdU-pultsu esperimentuak

hainbat animali eredutan aplikatu diren arren,

ornogabe itsastarren kasuan murritzak dira

(Harzsch et al., 1999; Awaji & Suzuki, 1995; Candia

Carnevali et al., 1997; Goergen et al., 2002).

Muskuilu itsastarretan, BrdU-pulsua nola aplikatu

arazo nagusietakoa izan genuen. Ikerlan honetan,

BrdU uretan disolbatu zen, eta beraz, elikatze-

iragazketa aurrera joan ahala BrdU zelulei iristen

zitzaien. Prozedura horrek, liseri-guruineko

ehunetan BrdU eranstea ahalbidetzen zuela

baieztatu zen, aldez aurretik zakatz-ehunetan

behatu izan zen bezalaxe (Martínez-Expósito et al.,

1994).

Immunohistokimika aplikatzekotan, pultsu batez

emandako BrdU, mitosiondoko zeluletan beren

bizitza osoan zehar detekta daiteke, nukleoan

seinalea esponentzialki diluituko luketen

proliferazio-prozesu suzesiboak ez gertatzekotan

behinik behin (Ward et al., 1991). Ikerlan honetako

baldintza esperimentalen arabera, BrdU-markaketa

esperimentuak aurrera egin ahala igoz joango zela


110

espero genuen. Aitzitik, BrdU-markaketa oso bizkor

jaitsi zen, 4 orduren buruan: ‰25-tik ‰2-ra unitate

albeolotubularretan eta ‰150-‰40-ra urdailean (2

Ird.). Nukleoetatik BrdU-markaketa desagertzea,

zelulen zatiketa suzesiboen ondorioa ote dugu, edo

markatutako zelulak jaio orduko hiltzearen ondorioa

ote da?.

Arratoiaren gibeleko epitelio-zeluletan egindako


111

1. Irudia: BrdU-positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan (A), konduktuetan (B),urdailean (C) eta urdailaren argian askatutako materialean (D). Kontrol-ebakiean ez da inolako zelula BrdU-positiborik behatu (E).Hematoxilina-eosinaz tintatutako kromosomak (gezia) mitosian dagoen liserri-zelula batean (F). A) unitate albeolotubularra; D)konduktuko epitelio-zelula; H) hemozitoa; S) urdaileko epitelio-zelula.DC) liseri-zelula; BC) zelula basofilikoa. Eskala-marrak: 25µm (A-E); 50 µm (F).

in vitro BrdU-pultsu esperimentuetan, BrdU-

immunomarkaketa hiru zatiketa zelular eta gero

desagertu dela demostratu da (Evarts et al., 1996).

Mihiko keratinozito murinoetan, BrdU-markaketaren

balio maximo eta minimoen artean gutxi

gorabehera 12 orduko aldea dago (Garcia et al.,

2001), baina indize mitotikoaren piko maximoa

BrdU-markaketaren piko maximoa baino 8 ordu

beranduago gertatzen da, BrdUren piko

minimoaren momentuan, hain zuzen. Horrela,

BrdU-markaketa zelulen zatiketaren ostean

diluituko balitz, horrek muskuiluen liseri-epitelioan

DNA bikoizketa eta zelulen zatiketa prozesu nahiko

azkarrak izatea suposatuko luke. Muskuiluetan

ziklo zelularraren iraupenari buruz ditugun datu

urriek, ordea, kontrakoa erakutsi dute. Esaterako,

zakatzetako epitelio-zeluletan ziklo zelularrak 30

ordu inguru irauten dituela frogatu da (Martínez

Expósito et al., 1994). Hala ere, epitelio-zelulek

behin eta berriro, zelula amen moduan,

proliferatuko balute, BrdU-markaketa ez zen

diluituta suertatuko; zatiketa berri bakoitzean gure

baldintza esperimentaletan etengabe eskuragarria

den BrdU gehiago behin eta berriro erantsiko

bailukete.

Bestalde, erabilitako BrdU kontzentrazioak

zitotoxikoak ez direla pentsatu arren (Martínez

Expósito et al., 1994), etengabeko BrdU-

esposizioak, zelula-mota bakoitzari dagokion modu

espezifikoan ziklo zelularraren progresioa alda

lezake (Diermeier et al., 2004). Batetik, BrdUk

apoptosia eragin dezake. Bestetik, BrdU eransteak

faboratutako DNA parekatze-akatsen ondorioz ziklo

zelularra eten daiteke (Yao et al., 1998). Are

gehiago, BrdUk, arearen kasuan esaterako,

garapen-programa espezifikoki eragin dezake,

proteinen sintesi- eta jariapen-patroietan aldaketa

deigarriak sortaraziz (Van Nest et al., 1983). Beraz,

gure baldintza esperimentaletan BrdU erantsi duten

liseri-guruineko epitelioko-zelulak alteratuta egonez

gero epiteliotik aska zitezkeen. Horrek, bertan

aurkitutako BrdU-markaketaren berehalako

beherakadak azalduko lituzke. Izan ere, gure

ikerlanean liseri-traktuaren argian zelula BrdU-

positiboak maiz behatu ditugu soberakinen artean

(1D Ird.).

Liseri-unitate albeolotubularreko epitelioan

BrdU-markaketaren kuantifikazioari buruzko

emaitzak liseri-zelulen proliferazio-tasaren

aldaketei dagozkie batez ere, BrdU-markatutako

zelula basofilikoak oso gutxitan behatu baitira. Gure

emaitzen arabera, epitelio-zelulen berriztapena

nabarmenagoa da urdailean unitate albeolotubula-

rretan eta konduktuetan baino. Urdail-epitelioan,

‰150 zelula ere egon daitezke aldi berean S-

fasean eta, dirudienez, epitelioa bere osotasunean

3 egunetan berrizta daiteke. Bestalde, liseri-zelulen

‰25-a eta bakarrik konduktuetako zelulen ‰3-a

sartzen dira S-fasean une batean. Beraz, unitate


112

1. Taula: Ikertutako hiru epitelioetan laginketa-denborak BrdU-markaketan duen eragina finkatzeko egindako faktore batekoANOVA-ren laburpena. P(F), Fisher ratioaren probabilitatea;a.g., askatasun-graduak. Estatistikoki esangarriak gertatu zirendesberdintasunak (p<0.05), asterisko batez adierazita daude.

F ratio a.g.(1) a.g. (2) p(F)

Unit. albeolotubularrak 5.060 13 61 <0.001*

Liseri-konduktuak 3.668 13 61 <0.001*

Urdaila 3.830 13 38 0.002*

(1) taldeen artean; (2) talde barruan

albeolotubularreko epitelioa hilabete batean eta

konduktuetako epitelioa 6 hilabetetan berriztatuko

lirateke beren osotasunean. Oro har, urdaileko eta

unitate albeolotubularretako epitelioetako zelulen

berriztapen-tasa ertaina eta altua bitartean dagoela

esan genezake.

Guruin-epitelioei dagokienez, BrdU-markaketa

indizea gibel murinoaren ‰4-a (Cantz et al., 2003)

eta hamsterraren guruin harderiarraren ‰15-18

bitarteko balio-errangoan alda daiteke (Fernández-

Suárez et al., 1996), balio hauek bibalbioen liseri-

zeluletan erregistratutakoak baino txikiagoak izanik.

Gure ikerlanean, ‰20 zelula BrdU-positiboko 2

batezbesteko piko maximoak topatu dira liseri-

unitate albeolotubularretan egunero eta, beraz,

egun bakoitzean zelulen ‰40-a S-fasean sartzen

direla estima genezake. Beraz, liseri-epitelio osoa

hilabetero (25 egun) guztiz berriztatuta suertatuko

litzateke. Unitate albeolotubularretako epitelioaren

berriztatze osoa erdiesteko beharrezkoa den

denbora-tarte hori ez dator bat inolaz ere liseri-ziklo

bakoitzean, hau da, birritan egunero marearteko

muskuiluetan, liseri-epitelioa osorik berriztatzen

zela argudiatzen zuen autoreen iritziarekin (Nelson

& Morton, 1979).

Gizakiaren kolon-ondesteko mukosan


113

3. Irudia: Unitate albeolotubularretako liseri-epitelioanbehatutako BrdU-markaketa (‰ zelulak) eta denboraren (orduesperimentalak) arteko erregresio ez-lineala. Doipenarikegokiena honako funtzio sigmoideo honi egokitu zitzaion:

Y=13.838+6.978[sin(2ΠX/10.988)+4.324]; r2=0.338; nonerregresio- eta korrelazio-koefiziente guztiak estatistikokiesangarriak izan baitziren (p<0.05). Gailurren arteko zeinbailaren arteko distanzia 12 ordu ingurukoa izan zen (goikogeziak, itsasgora; beheko geziak, itsasbehera).

2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun)naturalean mantendutako muskuiluen liseri-guruineko BrdU-markaketa (‰ ± desbidazio estandarra) denboraren arabera(eguzki-denbora). (A) unitate albeolotubularrak; (B) liseri-konduktuak; eta (C) urdaileko epitelioa. Tratamenduaeguerdiko 12:00-tan hasi zen, 4 mg BrdU/l itsas-ur pultsuaaplikatuz, eta ondoren 2 mg BrdU/l itas-ur gehitu ziren 4 orduro(geziak). Muskuiluei janaria bi aldiz (asteriskoak) eman zitzaienegunero. Segmentu horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria,argitasun-tarteak; marraduna, ilunabar-tarteak; beltza,iluntasun-tarteak) adierazi dituzte. Erabilitako ikurren forma etatrama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeakadierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05).

batezbesteko BrdU-markaketa indizea ‰77-110

bitartekoa da (Potten et al., 1992), arratoiaren

epitelio gastrikoan ‰150 ingurukoa den bitartean

(Gama et al., 2000). BrdU-markaketa balio horiek

guruinak ez diren epitelio normaletan balio-atalase

maximoak direla dirudi (Bertalanffy 1962; Humme &

Potten 1980; Potten et al. 1992; Pawlinoski et al.,

1999; Gama et al. 2000), eta ikerlan honetan

urdailean aurkitutakoen antzekoak dira. Liseri-

unitate albeolotubularren kasuan aplikatutakoen

antzeko kalkuluetan oinarrituz, konduktuetako eta

urdaileko berriztapen osoa 6 hilabetetan (175 egun)

eta 3 egunetan, hurrenez hurren, burutuko

litzatekeela ondorioztatu da. Liseri-konduktuetako

epitelioaren BrdU-markaketa indizea baxua

kontsidera daiteke, ‰2 eta ‰3 bitarteko indizea

duen obarisektomizatutako arratoien endometrio-

aren moduko beste ehunen antzera (Pawlinoski et

al., 1999).

Gure emaitzen arabera, muskuiluen liseri-

unitate albeolotubularretako epitelio-zelulen

berriztapenak patroi fluktuagarria jarraitzen du.

Patroi horrek, gailur eta bailarak 6 ordutako

txandatan agertzen direneko erritmo zirkamareal

perfektoa irudikatzen du. Antzeko erritmo

zirkamarealak hainbat ornogabe itsastarren mota

askotako prozesu fisiologikoetan behatu dira

(Naylor 1996, Abello et al., 1997). Bi proliferazio-

ziklo gauzatzen dira egun batean zehar.

Proliferazio-eredua errepikatu egiten da, zelulak

itsasgorako orduetan S-fasean sartzen dira, geroko

orduetan, zatiketa zelular bizkorrak pairatzeko. Izan

ere, zelula BrdU-positiboak ia desagerturik daude 4

orduren buruan. Liseri-konduktuetako BrdU-

markaketa patroia ez da unitate albeolotubularretan

deskribatutakoaren oso desberdina, baina seinalea

hain baxua denez laginketa-denboren arteko

desberdintasunak BrdU-markaketan esangu-

ratasun biologiko eta esangarritasun estatistikorik

gabekoak dira. Urdailean ere epitelioaren

berriztapena sinkronizatuta dagoela dirudi.

Bibalboen liseri-traktuan epitelio-zelulek zatitu

baino lehen migratu egiten dutela deskribatu da

mitosiak epitelioaren erpinaldean gertatuz (Mix

1970; Leibson & Frolova 1994). Aitzitik, nukleo

BrdU-positiboak epìtelio-zelulen oinaldeko

herenean kokaturik daudela aurkitu dugu.

Gizakiaren aho-epitelioan (Bjarnasson et al.,

1999) eta bizkar-muinean (Abrahamsen et al.,

1998), zein arratoiaren liseri-traktuan ere (Scheving

et al., 1978), bereziki zelula ugari aurkitu dira S-

fasean ilunabarrean, gauan zehar beraien kopurua

nabarmenki jaitsiz. Xaguaren keratinozitoetan S-

fase gehienak gauez ematen dira (Garcia et al.,

2001). Otarrainaren zerebroan neurogenesiaren

mailarik altuena ilunabar aldean gertatzen da, gaua

jarduera fisiologiko maximoaren garaia izanik

(Goergen et al., 2002). Epitelio-zelulen proliferazio-

jardueraren aldaketa erritmikoen denbora-patroia

ehun- eta espezie-espezifikoa izan liteke

zalantzarik gabe, muskuiluen liseri-guruinean

elikatze eta liseriketa moduko jarduera zikliko zein

erritmo marealen menpekoa izanik (Nelson &

Morton 1979; Morton 1983). Ikerlan honetan,

marea-ziklo eta fotoperiodoaren arteko

interferentziak ekiditeko asmoz, bakarrik

mareazpiko muskuiluak aztertu dira. Hala ere,

Mytilusen habitata itsasbeherako mailatik metro


114

gutxi batzutara baino ez da iristen. Eskualde

horretan animaliek kinada fotikoak eta gorantz zein

beherantzko mareen pauta erritmikoak ere jasotzen

dituzte. Ondorioz, marea-erritmoa liseri-sistemaren

zelulen proliferazioaren prozesu erritmikoak

gobernatzeko Zeitgeber perfektua izan daiteke,

kasu honetan bezala muskuiluak mareazpikoak

badira ere.

Laburbilduz, liseri-zeluletan irudi mitotikoak

behatu izanak eta BrdUren emaitzek, zelulen

berriztapena liseri-guruineko zelula helduen

zatiketa autologoaren bitartez gauzatzen dela

egiaztatu dute. Urdaileko eta liseri-unitate

albeolotubularreko epitelioek, zelulen berriztapen-

tasa ertaina eta altua bitarteko dute. Epitelio-zelulen

berriztapena sinkronizatuta dago, 24 ordutan 2 ziklo

osoak betetzen dituen patroi zirkamareala jarraituz.

BIBLIOGRAFIA

Abello P, Warman CG, Naylor E (1997) Circatidal moulting

rhythm in the shore crab Carcinus maenas. J. Mar. Biol.

Assoc. U.K. 77:277-280.

Abrahamsen JF, Smaaland R, Sothern RB, Laerum OD (1998)

Circadian cell cycle variations of erythro- and myelopoiesis

in humans. Eur. J. Haematol. 58:333-345.

Awaji M, Suzuki T (1995) The pattern of cell proliferation during

pearl sac formation in the Pearl oyster. Fisheries Sci.

61:747-751.

Bertalanffy FD (1962) Cell renewal in the gastrointestinal tract

of man. Gastroenterology 11:472-475.

Bjarnasson GA, Jordan RCK, Sothern RB (1999) Circadian

variation in the expression of cell-cycle proteins in human

oral epithelium. Am. J. Pathol. 154:613-622.

Bromley M, Rew D, Becciolini A, Balzi M, Chadwick C, Hewitt

D, Li YQ, Potten CS (1996) A comparison of proliferation

markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell

position in the crypts of normal human colonic mucosa.

Eur. J. Histochem. 40:89-100.

Cajaraville MP, Díez G, Marigómez JA, Angulo E (1990)



Org. 9:221-228.

Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of

bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages

of arm regeneration in the feather star Antedon

mediterranea. Cell Tiss. Res. 289:363-374.

Cantz T, Zuckerman DM, Burda DR, Dandri M, Goricke B,

Thalhammer S (2003) Quantitative gene expression

analysis reveals transition of fetal liver to mature

hepatocytes after transplantation in uPA/RAG-2 mice. Am.

J. Pathol. 162:37-45.

Casasco A, Casasco M, Icaro Cornaglia A, Mazzini G, De

Renzis R, Tateo S (1995) Detection of Bromo-

deoxyuridine- and Proliferating Cell Nuclear Antigen-

immunoreactivities in tooth germ. Connective Tiss. Res.

32:63-70.

Denny PC, Chai Y, Klauser DK, Denny PA (1993) Parenchymal

cell proliferation and mechanisms for maintenance of

granular duct and acinar cell populations in adult male

mouse submandibular gland. Anat. Rec. 235:475-485.

Diermeier S, Schmidt-Bruecken E, Kubbies M, Kuntz-Schughar

LA, Brockhoff G (2004) Exposure to continuous

bromodeoxyuridine (BrdU) differentially affects cell cycle

progression of human breast and bladder cancer cell lines.

Cell Prolif. 37:195-206.

Dimitriadis VK, Domouhtsidou GP, Cajaraville MP (2004)

Cytochemical and histochemical aspects of the digestive

gland cells of the mussel Mytilus galloprovincialis (L.) in

relation to function. J. Mol. Histol. 35:501-509.

Elsässer HP, Biederbick A, Kern HF (1994) Growth of rat

pancreatic acinar cells quantitated with a monoclonal

antibody against the proliferating cell nuclear antigen. Cell

Tiss. Res. 276:603-609.

Evarts RP, Hu Z, Omori N, Omori M, Marsden ER, Thorgeirsson

SS (1996) Precursor-product relationship between oval

cells and hepatocytes: comparison between tritiated

thymidine and bromodeoxyuridine as tracers.

Carcinogenesis 17:2143-2151.

Fankboner PV (1971) Intracellular digestion of symbiotic

zooxanthellae by host amoebocytes in giant clams

(Bivalvia: Tridacnidae), with a note on the nutritional role of

the hypertrophied siphonal epidermis. Biol. Bull. 141:222-

234


115


116

Fernández-Suárez A, López JM, Carbajo S, Alvarez-Uria M,

Carbajo-Pérez E (1996) New insights into cytodynamics of

the hamster Harderian gland as provided by the

bromodeoxyuridine-labelling method. Histol. Histopathol.

11:351-355.

Gama P, Goldfeder EM, Bertacini de Moraes JC, Alvares EP

(2000) Cell proliferation and death in the gastric epithelium

of developing rats after glucocorticoid treatments. Anat.

Rec. 260:213-221.

García MN, Barbeito CG, Andrini LA, Badrán AF (2001)

Circadian rhythm of DNA synthesis and mitotic activity in

tongue keratinocytes. Cell Biol. Inter. 25:179-183.

Goergen EM, Bagay LA, Rehm K, Benton JL, Beltz BS (2002)

Circadian control of neurogenesis. J. Neurobiol. 53:90-95.

Hanselmann R, Smolowitz R, Gibson D (2000) Identification of

proliferating cells in hard clams. Biol. Bull. 199:199-200.

Harzsch S, Miller J, Benton J, and Beltz B, (1999) From embryo

to adult: Persistent neurogenesis and apoptotic cell death

shape the lobster deutocerebrum. J. Neurosci. 19:3472-

3485.

Humme WJ, Potten CS (1980) Changes in proliferative activity

as cells move along undulating basement membranes in

stratified squamous epithelium. British J. Dermatol.

103:499-504.

Icely JD, Nott JA (1992) Digestion absorption: digestive system

and associated organs. 147-201 orr. Non: Harrison FW, &

Humes AG (ed) Microscopic anatomy of invertebrates. 10:

Decapod Crustacea. Wiley-Liss, New York.

Karam SK, Leblond CP (1993) Dynamics of epithelial cells in

the corpus of the mouse stomach. I. Identification of

proliferative cell types and pinpointing of the stem cell.

Anat. Rec. 236:259-279.

Leibson NL, Frolova LT (1994) Winter-spring essential

reorganization of cell proliferation in the digestive tract

epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol.

118:471-477.

Makarov VN, Schoschina EV, Luning K (1995) Diurnal and

circadian periodicity of mitosis and growth in marine

microalgae. 1. Juvenile sporophytes of laminariales

(phaeophyta). Eur. J. Phycol. 30:261-266.

Marigómez I, Cajaraville M P, Angulo E (1990) Histopathology

of the digestive gland-gonad complex of the marine

prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis.

Aquat. Org. 9:229-238.

Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart GBJ (1998a) Tissue-level

biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to


Toxicol. 34:167-176.

Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998b) Cell-

type replacement, a successful strategy of molluscs to


18:431-435.

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical

localisation of proliferating cells in mussel digestive gland

tissue. Histochem. J. 31:781-788.

Martínez-Expósito MJ, Pasantes JJ, Méndez J (1994)

Proliferation kinetics of mussel (Mytilus galloprovincialis)

gill cells. Mar. Biol. 120:41-45.

Mix MC (1970) Cell renewal systems in the gut of the oyster,

Crassostrea gigas. Veliger 14:202-205.


the Pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing

radiation. J. Invert. Pathol. 17:172-177.

Moriki T, Takahashi T, Kataoka H, Hiroi M, Yamane T, Hara H

(1996) Proliferation marker MIB-1 correlates well with

proliferative activity evaluated by BrdU in breast cancer: an

immunohistochemical study including correlation with

PCNA, p53, c-erbB-2 and estrogen receptor status. Pathol.

Internat. 46:953-961.

Morton B (1983) Feeding and digestion in Bivalvia. 65-147 orr.

Non: Saleuddin A S M. & Wilburg M (ed) The Mollusca. 5.

Academic Press, New York.

Naylor E (1996) Crab clockwork: the case for interactive

circatidal and circadian oscillators controlling rhythmic

locomotor activity of Carcinus maenas. Chronobiol.

Internat. 13:153-161.

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial

renewal in the digestive gland tubules of the marine

prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud.

45:262-283.

Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999)

Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related

protein expression in small cell carcinoma of the

esophagus; a comparative study with small cell carcinoma

of the lung and squamous cell carcinoma of the

esophagus. Histol. Histopathol. 14:479-485.

Palmer RE (1979) A histological and histochemical study of

digestion in the bivalve Arctica islandica L. Biol. Bull.

156:115-129.

Pawlinoski M, Melén-Mucha G, Mucha S (1999) The

involvement of the renin-angiotensin system in the

regulation of cell proliferation in the rat endometrium.

Cell.Mol. Life Sci. 55:506-510.

Potten CS, Kellett M, Roberts SA, Rew DA, Wilson GD (1992)

Measurement of in vivo proliferation in human colorectal

mucosa using bromodeoxyuridine. Gut 33:71-78.


microscopic studies on the acute and chronic toxic effects

of N-nitroso compounds on the marine mussel Mytilus

edulis (L.). II N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine. Aquat.

Toxicol. 3:301-311.

Santa Barbara P, van den Brink GR, Roberts DJ (2003)

Development and differentiation of the intestinal

epithelium. Cell Mol. Life Sci. 60:1322-1332.

Scheving LE, Burns RE, Pauly JE, Tsai TH, (1978) Circadian

variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone

marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191:479-486.


alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten



44:85-98.



of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Ass. U. K.

54:699-712.

Van Nest G, Raman RK, Rutter WJ (1983) Effects of

dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein

synthesis and secretion during in vitro pancreatic

development. Dev. Biol. 98:295-303.

Vogt G (1994) Life-cycle and functional cytology of the

hepatopancreatic cells of Astacus astacus. Crustacea,

Decapoda. Zoomorphology 144:83-101.

Ward JM, Henneman JR, Osipova GY, Anisimov VN (1991)

Persistence of 5-bromo-2'-deoxyuridine in tissues of rats

after exposure in early life. Toxicology 70:345-352.

Yao XH, Sugihara H, Hattori T, Katsura K, Takamatsu T (1998)

Regulation of apoptotic cell death in the pyloric glands of

the canine stomach. Virchows Arch. 433:275-280.

Yonge CM (1926) The digestive diverticula in Lamellibranchia.

Trans. Roy. Soc. Edin. 54:703-718.

Zaldibar B, Iturralde J, Cancio I, Marigómez I (2001) Reversible

cell-type replacement in marine mollusc Littorina littorea

exposed to cadmium. SETAC Europe Ann. Conf., Vienna.


117


118

Zelula epitelialen berriztapena muskuiluen liseri-guruin eta urdailean: sasoi, adin eta erregimenmarealari lotutako aldamoldeak

Laburpena: Tamaina, adin eta itsasaldi-erregimen desberdineko Mytilus galloprovincialis (Lmk)muskuiluen liseri-albeolo eta urdaileko epitelioko zelulen jarduera proliferatzailearen aldamolde naturalaikertu da sasoi desberdinetan. Muskuiluak, timidinaren analogoa den bromodeoxiuridinarekin (BrdU) 6orduz tratatu ondoren, 2 orduro hurrengo 36 ordutan BrdUren immunohistokimika burutu zen. Ondoren,zelula BrdU-positiboen proportzio erlatiboa BrdU-markaketa gisa (‰) kuantifikatu zen. Sasoiaridagokionez, desberdintasun esangarriak behatu ziren BrdU-markaketan. Udan, udazkenean eta neguanbaino askoz jarduera proliferatzaile altuagoa neurtu zen. Adin (tamaina) desberdineko animalien artean ezzen zelulen jarduera proliferatzaile desberdinarik behatu. Bestalde, marearteko eta mareazpiko muskuiluenliseri-guruineko epitelioen artean desberdintasunak aurkitu ziren, bai BrdU-markaketa mailetan, eta baitaaldamolde-patroian ere, non marearteko muskuiluetan BrdU-markaketa fotoperiodoak zein itsasaldi-erregimenak modulatua baitzegoen eta mareazpiko muskuiluetan, patroi zirkamareala jarraitu baitzuen.

Gako-hitzak: bromodeoxiuridina, immunohistokimika, liseri-zelula, zelula basofilikoa, berriztapenzelularra, erritmo zirkamareala, tamaina, adina, sasoia, marea, bibalbioak.

Sasoi,tamaina eta erregimen marealarekin erlazionatutako berriztapen zelularra

119

Epithelial cell renewal in the digestive gland and stomach of mussels: season,age and tidal regime related variations

Abstract: The natural variability in cell proliferation activity in the epithelium of the digestive gland andstomach was investigated in mussels, Mytilus galloprovincialis (Lmk), of different age and tidal level atdifferent seasons. After treating mussels with the thymidine analogue bromodeoxyuridine (BrdU) for 6hours, BrdU immunohistochemistry was performed every 2 hours for the next 36. Then, the relativeproportion of BrdU positive cells was quantified as BrdU labelling (‰). Marked seasonal differences wererecorded in BrdU labelling, with much higher proliferating activity in summer than in autumn and winter. Cellproliferation seemed not to be significantly dissimilar between mussels of different age (size). In contrast,the digestive gland epithelium of mussels from intertidal and subtidal populations differed not only in thelevels but also in the pattern of variation of BrdU labelling, which in intertidal mussels appeared to bemodulated by photoperiod and tide, unlike in subtidal mussels, in which variations followed a circatidalpattern.

Key words: bromodeoxyuridine immunohistochemistry, digestive cell, basophilic cell, cell epithelialrenewal, circatidal rhythm, size, age, season, tide, bivalve.

Renovación de células digestivas en glándula digestiva y estómago demejillon: variación según la época, edad y régimen mareal

Resumen: Se ha investigado la variabilidad natural en la actividad proliferativa de las células de la glánduladigestiva y del estómago de mejillón, Mytilus galloprovincialis (Lmk), de diferente edad y régimen de mareaen diferentes épocas del año. Los mejillones fueron tratados con bromodeoxiuridina (BrdU), un análogo dela timidina, durante 6 horas y en las siguientes 36 horas se realizó la immunohistoquímica de BrdU cada 2horas. A continuación, se cuantificó la proporción relativa de células BrdU positivas (‰). Se observarondiferencias significativas en el marcaje de BrdU relacionadas con la época del año, siendo la proliferacióncelular mucho más marcada en verano que en otoño e invierno. La proliferación celular no resultó diferenteentre animales de diferentes edades (tamaño). Por el contrario, en el epitelio de la glándula digestiva demejillones intermareales y submareales no sólo resultó diferente el nivel, sino también el patrón devariación del marcaje de BrdU. En mejillones intermareales ese patrón parece modulado por el fotoperiodoy la marea, a diferencia de los submareales en los que las variaciones siguen un patrón circamareal.

Palabras clave: inmunohistoquímica de bromodeoxiuridina, célula digestiva, célula basofílica, renovacióncelular, ritmo circamareal, tamaño, edad, época, marea, bibalvio.


120


121

SARRERA

Muskuiluen liseri-guruineko epitelioa

desberdintzatutako 2 zelula-motez osaturik dago,

liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia. Liseri-

zelulek, oso sistema endo-lisosomiko garatua dute

eta elikagaien liseriketa intrazelularraz arduratzen

dira. Zelula basofilikoek, izaera basofiloa damaien

erretikulu endoplasmatiko pikortsu garatua dute,

eta liseri-zelulak baino urriagoak dira. Marigómez

et al.-ek, (1999), PCNA immunohistokimika erabiliz,

bi zelula-mota horiek proliferatzeko gai direla

frogatu zuten. Liseri-zeluletan irudi mitotikoak

aurkitu izanak eta BrdU immunohistokimikak,

zelulen berriztapena liseri-zelula eta zelula

basofiliko helduen zatiketa autologoaz burutzen

dela baieztatu dute (Zaldibar et al., 2004). Liseri-

dibertikuluen epitelio-zelulen berriztapena

sinkronizatuta dago patroi zirkamareala jarraituz,

BrdU-markaketaren aldaketek adierazi zutenez

(Zaldibar et al., 2004). Esperimentu horiek,

mareazpiko muskuiluekin soilik burutu ziren arren,

edonola ere itsasaldi-erregimena eraginkorra zela

proposatu zen. Dirudienez, liseri-guruineko

epitelioaren zelulen berriztapena, Izagirre-ren

(2000) arabera liseri-zelulen jarduera fisiologikoa

(adb, liseriketa intrazelularra) murrizten deneko

une jakinetara mugatuta dago. Beraz, jarduera

fisiologiko eta ziklo zelularraren arteko

elkarrekintza ezagutzea, liseri-epitelioaren zelulen

berriztapen ulertzeko oinarrizkoa izango litzateke.

Testuinguru horretan, liseri-guruinaren gainean

eragina duten aldagai naturalek (adina, sasoia,

itsasaldi-erregimena), liseri-guruineko zeluletan

aurkitutako jarduera proliferatzailearen eredu

zirkamareala, aldarazi edo modula dezaketen

finkatzea erronka erabakigarria da. Liseri

guruinaren forma eta funtzioa, liseritze-iraupena

eta intentsitatea eta beste prozesu fisiologikoak

barne, aldagai horien arabera aldatu egiten da

(Etxeberria et al., 1994; Cancio et al., 1999;

Fernández-Reiriz et al., 2001; Wong & Cheung,

2001; Le Pennec & Le Pennec, 2002; Pazos et al.,

2003). Are gehiago, tamaina (adin) desberdineko

muskuiluek, liseri-guruineko zelulen proliferazio-

eredu ezberdina dute. Izatez, SDS-PAGE

elektroforesiaren ondoko PCNAren

immunotransferentziak, muskuilu txikien (gazte

heldugabeak) liseri-guruineko zelulak muskuilu

handienetakoak (helduak) baino proliferazio

gaitasun handiagoa zutela erakutsi zuten

(Marigómez et al., 1999).

Hiru sasoi desberdinetan (negua, udara eta

udazkena) itsasarteko bi eskualde desberdinetan

(mareartekoa eta mareazpikoa) hartutako tamaina

desberdineko (txikiak-gazteak eta handiak-

helduak) Mytilus galloprovincialis (Lmk) muskuiluen

liseri-guruineko eta urdaileko zelula

proliferatzaileen banaketa, BrdU-

immunohistokimika bitartez ikertu zen.


Erreaktibo kimikoak





Atariko esperimentua

Mareazpiko eta marearteko Mytilus

galloprovincialis muskuiluen liseri-guruineko eta

urdaileko zelulen proliferazioa konparatu ahal

izateko, BrdU-pultsua marearteko muskuiluak

pairatzen duten urperatze-aldira mugatu behar izan

zen (6 ordu). Aldez aurretik burututako

esperimentuak uretango BrdU-esposizio jarraia

aplikatu ondoren, BrdU-markaketa patroi

zirkamareala erakutsi zutenez, oraingo honetan

BrdU-pultsua egunaren unerik egokiena finkatzeko

zenbait aurretiko esperimentu diseinatu ziren.

Helburu hori betetzeko, 160 mareazpiko muskuilu

gazte (maskorraren luzera <15 mm) eta 160 heldu

(maskorraren luzera 35-45 mm) uztailean

itsasbeheran jaso ziren Plentzian (Bizkaiko Golkoa,

43º24´ I 2º56´ M). Muskuiluak laborategira garraiatu

ziren, eta polietilenozko 4 akuariotan (80 muskuilu

15 l itsas uretan) etengabeko aireztapenaz eta

15ºC-tara mantendu ziren. Itsas-ura argi ultramorea

erabiliz esterilizatu zen, eta karbono aktiboz zein

beirazko zuntzetan zehar iragazi egin zen. 12

orduro itsas-ura aldatu zen eta muskuiluei, uraren

aldaketarekin batera, janaria eman zitzaien (Marine

Invertebrate Diet, Carolina, Carolina Supply Co,


Batuak). Bi esperimentu osagarri burutu ziren.

Lehenengo esperimentuan (Eguneko pultsuaren-

esperimentua), muskuilu gazte eta helduak,

bakoitza bere aldetik 4 BrdU mg/l zuen itsas-uretan

6 orduz jarri ziren, 14:00-tan hasita. Ondoren,

muskuiluak BrdUrik gabeko itsas-uretan murgildu

ziren, eta hurrengo 36 ordutan 2 orduro 5

espezimen sakrifikatu ziren. Bigarren

esperimentuan, (Gaueko pultsuaren esperimentua)

BrdU-pultsu berdina gauean zehar (24:00-tatik

06:00-ak arte) aplikatu zen eta muskuiluak

hurrengo 28 ordutan 2 orduro sakrifikatu ziren.

Esperimentu nagusia

Urteko hiru sasoi desberdinetan, negua

(martxoa), uda (uztaila) eta udazkena (urria),

muskuiluak (n = 320), Plentzian itsasbeheran hartu

ziren, laborategira garraiatu eta lehen aipatutako

baldintza berberetan mantendu ziren. Marearteko

eta mareazpiko populazioetan, adin desberdineko

(gazteak: <15 mm eta helduak: 35-45 mm

maskorraren luzera) muskuiluak hautatu ziren, eta

beraz, sasoi bakoitzean lau joku esperimental (80

muskuilu bakoitzean) ezarri ziren: marerazpiko

muskuilu helduak (LS), marearteko helduak (LI),

mareazpiko gazteak (SS), eta mareazpiko gazteak

(SI).

Talde esperimental guztiak, 4 BrdU mg/l zuen

itsas-uretan 6 orduz jarri ziren, 14:00-tan hasita,

marearteko muskuiluen urperatze-denboran zehar,

hain zuzen. Ondoren, muskuiluak BrdU gabeko

uretan murgildu ziren, eta denbora-tarte

desberdinetan talde bakoitzetik 5 espezimen

sakrifikatu ziren, BrdU-markaketa kuantifikatzeko.

LS eta SS taldeetan itsas-ura 12 orduro aldatzen

zen. LI eta SI taldeko muskuiluak marearteko

baldintzetan mantendu ziren, 6 orduz airean eta 6

orduz uretan murgildurik, euren jatorrizko lekuan

zegoen itsasaldi-erregimena jarraituz. Janaria

(Marine Invertebrate Diet) talde esperimental

guztietako muskuiluei batera 12 orduro ematen

zitzaien , marearteko muskuiluak uretan murgilduta


122


123

zeuden momentuan.

BrdU immunohistokimika

Liseri-guruinaren zati txikiak Carnoy fixatzailean

(%60 etanol absolutua, %30 kloroformoa eta %10

azido azetikoa) ordu batez fixatu ziren 4°C-tan,

goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie

batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu

ziren, 60°C-tan. Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera)

American Optical mikrotomo batean erdietsi ziren,

eta aldez aurretik (3-amino propil trietoxisilano)

silanizatutako portaobjektuetan jaso ziren.

Ondoren, ebakiak xilenoz desparafinatu,

etanolezko bainu-serie batean hidratatu, eta

PBSaz (fosfato indargetzaile salinoa; ingelesez,

Phosphate-Buffered saline) garbitu ziren.

Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko, ebakiak

%3 zuen H2O2-an 5 minutuz inkubatu ziren eta

berriro PBSaz garbitu ziren. DNA, ordu batez

37°C-tan 0.1N HCl-z desnaturalizatu zen. Ebakiak,

borato indargetzailean (pH=8.5) neutralizatu eta

PBSaz garbitu ziren. Ondoren, ebakiak Vectastain

Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories, Burlingame,

Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak) hornitutako

serum blokeatzaile normalean (NBS, ingelesez;

Normal Blocking Serum) ordu batez inkubatu ziren,

giro-tenperaturan, eta berriro PBSaz garbitu ziren.

Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz

espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza; 1:10 %0.1

behi-albumina seruma zuen PBSan) inkubatu

ziren. Laginak PBSaz garbitu, eta ondoren,

Vectastain Elite ABC Kit-a erabiliz abidina-biotina-

entzima (ABC) metodoaren bidez

immunokonplexuak ikustarazi ziren. Laburki,

ebakiak, PBSan diluitutako sagu aurkako zaldiaren

IgG antigorputz sekundario 30 minutuz biotinilatuan

inkubatu ziren, eta ondoren PBSan biziki garbitu

ziren. Peroxidasa jardueraren ikustaraztea, sodio

azetato indargetzailean (pH = 5.2) 3-amino-9-

ethylkarbazola eta %0.015 H2O2 zituen

kromogeno-disoluzioa erabiliz erdietsi zen.

Azkenik, ebakiak hematoxilinaz kontrastatu (10

segundu), dabiluretan garbitu eta Kaiser gelatina

glizerinatuan (Merck & Co., Inc, Whitehouse

Station, New Jersey, Amerikako Estatu Batuak)

muntatu ziren. Mikrografiak, Olympus BX50

(Olympus, Tokio, Japonia) mikroskopioari atxiki

zegoen Olympus PM20 argazki-kameraz erdietsi

ziren.

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa

Zelula BrdU-positiboen kuantifikazioa, argi-

mikroskopioan konkateka zuzenaren bidez burutu

zen. Liseri-epitelioan zelula BrdU-positiboen

proportzioa antzemateko asmoz, lagin bakoitzean

1000 zelula zenbatu ziren, beste ikerketetan

erabilitako lagin-tamainaren arabera (Okudela et

al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Aldez aurretik

egindako behaketa histologikoek, liseri-epitelioaren

tubulu moduko ebakidura bakoitzean gutxienez 20-

30 zelula daudela erakutsi zuten. Hori dela eta,

eguneroko lana errazteko asmoz, zelula BrdU-

positiboen zenbaketa aleatorioki hautatutako 40

tubulu moduko ebakiduretan burutu zen (800-1200

zelula) liseri-guruin bakoitzean. Halaber, eskuarki

konduktu sekundarioen ebakidura bakoitzean 70-

90 zelulak agertzen direnez gero, zelula BrdU-

positiboen zenbaketa 10 konduktu sekundarioen

ebakiduretan burutu zen (700-900 zelula). Horrek,

laginaren tamaina egoki lortzearen eta konduktu

sekundarioen zeharkako ebakidurak lortzearen

zailtasunaren arteko konpromisozko erabakia

suposatu zuen. Datuak adierazteko momentuan

‰-ra pasatu ziren. Urdailean, kontaketa trantsektu

bat eginez burutu zen, eta guztira 200 zelula

zenbatu ziren epitelioan barrena. Zelula-kopuru

baxuago hori, urdailean jarduera proliferatzailea

oso handia dela egiaztatu ondoren hautatu zen.

Datuak kasu honetan ere ‰-ko balioetan eman

dira, aurrekoekin konparagarriak izan ahal izateko.

EMAITZAK

Liseri epitelioko liseri-zelula zein zelula

basofilikoek, BrdU-positibo ziren nukleoak erakutsi

zituzten, nahiz eta zelula BrdU-positibo gehienak

liseri-zelulak izan (1. Ird.). Urdaila, nukleo BrdU-

positibo gehien erakutsi zituen organoa izan zen (1.

Ird.). Tindaketaren kontrol-ebakietan ez zen inolako

positibotasunik behatu (1. Ird.).

Atariko esperimentuak

BrdU-markaketari dagokionez, liseri-guruin eta

urdaileko epitelioan patroi zirkamareal

konparagarria ezagutu zen, seinale/zarata erlazioa

urdailean txikiagoa izan arren. Beraz, liseri-

guruineko epitelioko BrdU-markaketa emaitzak

soilik aurkeztuko dira hemendik aurrera.

Eguneko pultsu-esperimentuan, muskuilu

helduetan liseri-guruineko ‰33 zelulek BrdU

markaketa aurkeztu zuten. Animali gazteetan,

ordea, markaketa baxuagoa izan zen (‰21) (2A eta

2C Ird.). Liseri-epitelioaren BrdU-markaketaren

kuantifikazioari dagozkion emaitzak, liseri-zelulen

proliferazio-tasan gertatutako aldaketei egokitu

zitzaizkien, zelula basofiliko BrdU-positiboak

noizean behin soilik behatu baitziren. Termino

kualitatiboetan, muskuilu gazte zein helduetan

aldamolde bera aurkitu zen. Aldamoldea itsasaldi-

erregimenak (IE) edo argia/iluntasuna zikloak (AIZ)

gobernatua dagoen zehazteko asmoz, uretan

murgiltzearen (itsasbeheratik itsasgoranzko bidea)

eta aire-esposizioaren (itsasgoratik itsasbeherantz)

uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu

zen (1. Taula, 3. Ird). Helburu horretarako, eta

esperimentua aurrera joan ahala behatutako BrdU-

markaketan beherakada kontuan hartuz, kalkuluak

egiteko BrdU-pultsu osteko lehenengo 12 ordutako

datuak baino ez ziren aintzat hartu. Batezbesteko

BrdU-markaketaren balio altuena, gaueko

murgiltze-aldian (marea altua) aurkitu zen muskuilu

gazte zein helduetan; muskuilu gazteetan, gainera,

eguneko murgilketa-aldian tarteko balioak

erregistratu zirelarik (3. Ird.). Bi bidetako ANOVA

analisiak muskuilu helduetan IE eta IE x AIZ

faktoreek batezbesteko BrdU-markaketan eragin

esangarria zutela adierazi zuten, muskuilu

gazteetan, ordea, IE x AIZ elkarrekintza faktorerik

esangarriena (p<0.05) suertatu zen (2. Taula).

Gaueko pultsu-esperimentuan, muskuilu

helduetan liseri-epitelioko zelulen ‰7-rarte BrdU-ko

markaketa izatera iritsi zen, muskuilu gazteetan

markaketa-pikoa altuagoa (‰12) izanik (2B eta 2D

Ird.). Termino kualitatiboetan muskuilu gazte zein

helduetan aldamolde bera aurkitu zen. Aldamoldea,

itsasaldi-erregimenak (IE) edo argia/iluntasuna

zikloak (AIZ) gobernatua den zehazteko asmoz,


124

urera murgiltzearen eta aire-esposizioaren

uneetako batezbesteko BrdU-markaketa kalkulatu

zen, egunez zein gauez (1. Taula, 3. Ird.). Helburu

horretarako, eta BrdU-pultsuaren ostean zein

hurrengo egun argiko unean BrdU-markaketan piko

nabarmenik behatu ez zelako kontuan hartuz,

kalkuluak egiteko BrdU-pultsua eman eta 24 orduko

osteko datuak baino ez ziren aintzat hartu.

Batezbesteko BrdU-markaketa maximoa gauez

behatu zen arren, bereziki muskulilu gazteetan, ez

zen talde esperimentalen artean desberdintasun

esangarririk topatu (3. Ird.). Honekin bat, bi bidetako

ANOVA analisiak, muskuilu gazteetan BrdU-

markaketaren gainean efektu esangarria soilik AIZ-

k zuela adierazi zuen. Muskuilu helduetan, bere

aldetik, IE, AIZ eta beraien elkarrekintzek ez zuten

efektu esangarririk eduki BrdU-markaketaren

gainean (2. Taula).

Esperimentu nagusiak

Urte-sasoi, adin eta itsasaldi-erregimenaren

efektua zelulen proliferazioaren gainean

Urteko hiru sasoi, eta bi itsasaldi-erregimen

desberdinetan hartutako bi adineko muskuiluen

zelulen proliferazioa modu integratu batean

konparatzeko hainbat parametro desberdin

kalkulatu ziren (3. Taula). Orotariko BrdU-

markaketa/egun indizea pultsu osteko lehenengo

12 orduetan behatutako piko maximoan

erregistratutako zelula BrdU-positiboen kopurua (A,

3. Taula), balio hau bikoiztuz 24 ordutako datuak

islatzeko asmoz (B, 3. Taula) eta zuzenketa-faktore

batez biderkatuz (C, 3. Taula) 3. Taulako balioak

lortzeko estimatu ziren. Zuzenketa-faktorea, (ZF)

aurreko esperimentuetan ez bezala (Zaldibar et al.,

2004), BrdU-gehipena jarraia izan beharrean 6


125

1. Irudia: BrdU positiboak diren nukleoen identifikazioa (geziak) unitate albeolotubularretako liseri-zeluletan, konduktuetan etaurdailean (A-D); D) konduktuko epitelio-zelula), A) unitate albeolotubularra, H) hemozitoa, BC) zelula basofilikoa, DC) liseri-zelula,S) urdaileko epitelio-zelula. Ebaki kontrolean ez da inolako zelula BrdU positiborik behatzen (E). Eskala-marra: 50 µm

orduko pultsua erabili zela kontuan hartuz aplikatu

zen, konparazioak egiteko asmoz.

ZF= 1.21 = GJ/PO.

BrdU-markaketa/egun indizea = PO x 2 x ZF;

non, ZF: Zuzenketa-faktorea; GJ: BrdU-gehipen

jarraian lehenego 12 orduetan neurtutako zelula

BrdU positiboak; eta PO: 6 orduko BrdU pultsu

ostean llehenego 12 orduetan neurtutako zelula

BrdU positiboak, baitiran.

Azkenik, epitelioa bere osotasunean

berriztatzeko beharrezkoa den denbora, egunetan

(epitelio-berriztapen denbora; EBD) kalkulatu zen,

aldez aurretik deskribatutako kalkuluetan oinarrituz

(D, 3. Taulan).

Liseri-guruineko jarduera proliferatzailea,

nabarmenki aldatu zen sasoien artean, udan

altuena izanik, eta itsasaldi-mailen artean (3.

Taula). BrdU-markaketa/egun indizearen baliorik

altuenak (C, 3. Taulan) udan erregistratu ziren; noiz

liseri-guruineko epitelioaren EBD (D, 3. Taulan) adin

eta itsasaldi-erregimenaren arabera 2 eta 6 aste

bitartekoa izan baitzen. BrdU-markaketa/egun

indizearen baliorik baxuenak, eta beraz EBD

baliorik altuenak (6 hilabete inguru), udazkeneko

mareazpiko muskuiluetan aurkitu ziren. Neguan,

BrdU-markaketa/egun indizean ez zen

desberdintasun esangarririk behatu itsasaldi-

erregimenen artean, baina balioak apur bat


126

2. Irudia: 2 egunez fotoperiodo (argitasun/iluntasun) naturalean mantendutako mareazpiko muskuiluen liseri-guruineko BrdUmarkaketa (‰ ± desbidazio estandarra) denboraren arabera (eguzki-denbora). (A) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak. (B)Gaueko pultsuko muskuilu gazteak. (C) Eguneko pultsuko muskuilu helduak (D) Gaueko pultsuko muskuilu helduak. Geziek BrdUpultsua eman zitzaien ordua adierazten dute. Marra horizontalek, argiztapen-baldintzak (zuria, argitasun-tarteak; marraduna,ilunabar-tarteak; beltza, iluntasun-tarteak),eta esperimentua egin zeneko egunetako itsasaldi baldintzak (zuri, airean; marraondulatuak, uretan adierazten dituzte).Erabilitako ikurren forma eta trama desberdinek esangarriki desberdinak diren azpitaldeakadierazi dituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05).

handiagoak izan ziren muskuilu gazteetan

helduetan baino (3. Taula). Udazkeneko

marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean

desberdintasun harrigarriak behatu ziren,

marearteko muskuiluetan zelulen proliferazioa

garrantzitsua zen bitartean, mareazpiko

muskuiluetan kasik ez baitzegoen. Udan bereziki,

BrdU-markaketa/egun indizea, muskuilu helduetan

gazteetan baino altuagoa izan zen (3. taula).

Epitelio-zelulen proliferazioaren aldamoldeak

Neguko eta udazkeneko mareazpiko

muskuiluetan, liseri-epitelioko zelulen proliferazio-

jarduera antzemanezina izan zen (3. Taula), beraz

epitelio-zelulen berriztapenean ez zen inolako

aldamolderik ageri. Aitzitik, desberdina izan arren,

udako muskuiluetan zein udazkeneko mareazpiko

muskuiluetan, zelulen proliferazioan aldamolde

garbiak antzeman ziren (2A, 2C eta 4. Ird.).

Marearteko eta mareazpiko muskuiluen artean

proliferazioaren aldamolde desberdinak identifikatu

zirela aipatzekoa da.

Mareazpiko muskuiluek, bai heldu zein gazteek,

BrdU-markaketaren aldamolde bera erakutsi zuten,

atariko esperimentuetan (Eguneko pultsu-

esperimentua 2A eta 2C Ird.) deskribatu zen

moduan. Hala ere, marearteko muskuiluen BrdU-

markaketaren aldamoldea arras desberdina izan

zen, eguneko piko bakarra ageri baitzen eta BrdU-

markaketa balioak ez baitziren aldatu itsasgoran

zehar, egunez ezta gauez ere (4. Ird.). Udan, liseri-

guruineko ‰17.25-a BrdU-positiboak izan ziren.

BrdU-markaketa, eguneko aire-esposizioan

emendatzen zen (10:00 eta 12:00-ak bitartean), eta

ia inolako aldaketarik gabe mantentzen zen aire-

esposizioko ilunabarreko ordua heldu arte (4A Ird.).


127

EGUNEKO PULTSUA HELDUAK GAZTEAK

Airean Uretan Guztira AIREAN Uretan Guztira

Eguna 1±1.414 1±0.89 2 2.4±2.074 6.5±5.45 8.9

Gaua 0.44±0.73 16.15±16.49 16.59 2.44±2.92 11.25±+9.02 13.69

Guztira 1.44 17.15 18.59 4.84 17.75 22.59

GAUEKO PULTSUA HELDUAK GAZTEAK

Airean Uretan Guztira Airean Uretan Guztira

Eguna 3.75±2.5 2.8±0.83 6.55 1.33±1.53 1±1.41 2.33

Gaua 2.42±2.71 4.75±3.24 7.17 5.91±5.90 7.9±5.51 13.81

Guztira 6.17 7.55 13.72 7.24 8.9 16.14

1. Taula: Atariko esperimentuan ikertutako talde experimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zein airean edo uretanmurgilduta egotean, muskuiluetan kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa + desbidazio estandarra.

Udazkenean, BrdU-markaketa maximoa (‰18.5),

goizeko aire-esposizioari (gaua bukaera eta

eguerdi bitartean zabaltzen zena) egokitu zitzaiona

(08:00), eta berehala, berriz ere hurrengo

murgiketa-aldia heldu aurretik, maila basaletara

bueltatzen zen (4B Ird.).

EZTABAIDA

Mareazpiko eta marearteko muskuiluak

alderatzeko BrdU-pultsuaren aukeraketa

Eguneko pultsu-esperimentuan, BrdU-

markaketa gaueko murgilketa-aldian behatu zen

muskuilu gazte zein helduetan, eguneko

murgilketa-aldian tarteko balioak behatuz. Muskuilu

gazteetan itsasaldi erregimena efektu esangarria


128

3. Irudia: Atariko esperimentuan ikertutako taldeexperimentaletako liseri-albeolotan egunez eta gabez zeinairean edo uretan murgilduta egotean, muskuiluetankuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketa. (A) Egunekopultsuko muskuilu helduak; (B) Gaueko pultsuko muskuiluhelduak; (C) Eguneko pultsuko muskuilu gazteak; (D) Gauekopultsuko muskuilu gazteak; (E) BrdU-gehipen jarraikoesperimentuan (Zaldibar et al., 2004) lortutako batezbestekoBrdU-markaketa. Segmentu bertikalek errore estandarraadierazten dute. Goiko asteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan.


129

EGUNEKO PULTSUA

Askatasun-graduak F p(F)

Itsasaldi-erregimena (IE)

1 4.091 0.05*

Argia/iluntasuna zikloa (AIZ)

1 3.348 0.08

IE x AIZ 1 4.266 0.048*

Helduak

Barne-errorea 482.5 Itsasaldi-erregimena (IE)

1 8.943 0.06


1 1.234 0.28

IE x AIZ 1 1.189 0.29

Gazteak

Barne-errorea 862.92

GAUEKO PULTSUA



1 0.412 0.53


1 0.087 0.77

IE x AIZ 1 2.347 0.14

Helduak


1 0.507 0.48


1 7.268 0.01*

IE x AIZ 1 0.323 0.58

Gazteak


PULTSU JARRAIA



1 12.614 0.001*


1 3.433 0.07

IE x AIZ 1 2.399 0.13

Helduak

Barne-errorea 2159 MAREARTEKO MUSKUILUAK



1 2.115 0.15


1 1.75 0.19

IE x AIZ 1 0.002 0.96

Uda


1 3.362 0.07


1 0.684 0.41

IE x AIZ 1 2.283 0.13

Udazkena


2. Taula: Atariko esperimentuan, esperimentu nagusian eta argitaratutako BrdU-pultsu jarraia (Zaldibar et al., 2004) izan dutenmuskuiluetan itsasaldi-erregimenak, argia/iluntasuna zikloak zein beraien arteko elkarrekintzak duten eragina finkatzeko egindakobi bideetako ANOVA-ren laburpena. p(F), Fisher ratioaren probabilitatea. Estatistikoki esangarriak gertatu ziren desberdintasunak(p<0.05) asterisko batez adierazita daude.

eragin zuen BrdU-markaketan; muskuilu helduetan,

ordea, itsasaldi-erregimena eta argi/iluntasun

zikloaren interakzioa esangarria izan zen.

Aldamolde hori, BrdU-pultsu jarraia jaso zuten

mareazpiko muskuilu handietan behatutakoaren

antzekoa izan zen (Zaldibar et al., 2004). Seguru

asko, 6 ordutako pultsuaren ostean suertatutako

BrdUren eskuragarritasunaren beherakadak,

etengabeko BrdUren gehipenaren kasuan (Zaldibar

et al., 2004) ez bezala, BrdUren pultsua eman eta

12 ordutara proliferazio zelularrean aldamolde

zirkamareala zergaitik desagertuz joan zen

azalduko luke. Bereziki muskuilu helduen kasuan,

zeintzuetan, BrdU-markaketa bortitzagoa izanik

(piko maximo altuagoak), BrdU-ren hornidura

mugatua gazteetan baino kritikoagoa suertatuko

litzatekeen. Baldintza horietan, esperimentu

honetan zeharreko BrdU-maila eskuragarriak

muskuiluentzat baxuak izatea litekeena da (Potten

et al., 1992, Candia Carnevali et al., 1997); hala

ere, BrdU kontzentrazio ez kaltegarriak erabili

beharrak alde batetik (ikusi Zaldibar et al., 2004),

eta esperimentu nagusi hauetan ikertu nahi

genituen marearteko muskuiluak uretan BrdU pean

mantentzeko denbora mugatuak bestetik, diseinu

esperimentalaren nondik norakoak agindu

zizkiguten.


130

4. Irudia: 2 egunez fotoperiodo(argitasun/iluntasun) eta erregimen mareal(airean/uretan) naturalean mantendutakomuskuiluen liseri-guruineko BrdUmarkaketa (‰ ± desbidazio estandarra)denboraren arabera (eguzki-denbora). (A)udako marearteko muskuilu handiak, (B)udazkeneko marearteko muskuilu handiak.Geziek BrdU pultsua eman zitzaien orduaadierazten du. Marra horizontalek,argiztapen-baldintzak (zuria, argitasun-tarteak; marraduna, ilunabar-tarteak;beltza, iluntasun-tarteak), eta erregimenmareala (uhinak, uretan murgilduta)adierazten dituzte. Erabilitako ikurrenforma eta trama desberdinek esangarrikidesberdinak diren azpitaldeak adierazidituzte, Duncan testaren arabera (p<0.05).


131

Gaueko pultsu-esperimentuan behatutako

zelulen proliferazioaren aldamoldea desberdina

izan zen. BrdU-markaketa, soilik gauez emendatu

zen modu esangarrian, elkarren segidako bi piko

maximo emanez. Egunez (argialdia) aldiz, soilik

maila basalak neurtu ziren, baita BrdU-pultsua

eman eta ondorengo laginketetan ere. Izan ere,

BrdU-markaketa baliorik baxuenak pultsua eman

osteko orduetan izatea deigarria da; zeren eta

eguneko pultsu-esperimentuan BrdU-markaketa

maximoak BrdU-pultsuaren osteko lehen

momentuetan, erregistratu ziren. Ugaztunetan,

liseri-traktuko epitelioaren proliferazio zelularra

gauez gertatzearen berri eman dute zenbait

ikerlanek (Scheving et al., 1978; Smaaland, 1996).

Molusku itsastarretan, prozesu zelular batzuk

nagusiki gabez eta beste batzuk nagusiki egunez

gertatzen direla deskribatu den arren (Levy et al.,

1994), muskuiluetan liseri-zelulen proliferazioak

aldamolde zirkamareala jarraitzen duela

demostratu da (Zaldibar et al., 2004). Ildo horretatik,

emaitzok itsasaldia zelulen proliferazio-zikloa

gobernatzen duen faktore nagusia dela adierazi

duten arren, fotoperiodoak, neurri batean

behintzat, zelulen proliferazio-prozesuak modula

ditzakeela dirudi. Dena den, fotoperiodoaren

eragina BrdU-hornidura mugatuak sortutako

artefaktuaren ondorio soila ere izan liteke. Eguneko

pultsu-esperimentuan, IE x AIZ elkarrekintza

esangarria suertatu zeneko animalia helduetan,

piko maximoak handiagoak izan ziren eta

lehendabiziko argialdian zehar erregistratu ziren,

BrdU-ren pultsuaren osteko lehen laginketetan.

Ikerlan honetako eta baldintza esperimental

berdinetan burututako BrdU-pultsu jarraian

lortutako emaitzak alderatzeko, egunez zein gauez

GAZTEAK HELDUAK A B C D A B C D

MAREARTEKOA 5.8 11.6 14.04 70 4 8 9.68 100 NEGUA

MAREAZPIKOA 6.25 12.5 15.12 66 4.25 8.5 10.28 95

MAREARTEKOA 10 20 24.2 40 17.25 34.5 41.74 24 UDA MAREAZPIKOA 21 42 50.82 20 33 66 79.86 12

MAREARTEKOA 10.66 21.32 25.79 38 18.5 37 44.77 22 UDAZKENA

MAREAZPIKOA 2.33 4.66 5.64 175 2.4 4.8 5.808 170

3. Taula: Esperimentu nagusiaren talde esperimentaletako muskuiluen liseri-albeolotan kuantifikatutako batezbesteko BrdU-markaketaren laburpena. (A) Lehendabiziko 12 ordutan eskuratutako BrdU-markaketaren piko maximoa. (B) 24 ordutan S-faseansartuko liratekeen zelulak egunero 2 piko ematen direla kontutan hartuta. (C) BrdU-pultsu jarraiako esperimentuaren datuak(Zaldibar et al., 2004) kontutan hartuta eta zuzenketa-faktorea sartu eta gero, egunero S-fasean sartuko liratekeen zelula kopuruteorikoa. (D) Liseri-epitelioa osoa berriztatzeko beharrezkoa liratekeen egun kopurua..

lortutako murgilketa- eta aire esposizio-aldietako,

eta batezbesteko BrdU-markaketa balioak kalkulatu

ziren Zaldibar et al., (2004) BrdU pultsu jarraiko

esperimentuan lortutako datuetatik abiatuz eta

ikerlan honetan aplikatutako kalkuluetan oinarrituz

(1. eta 2. Taulak, 3E Ird.). Eguneko pultsu-

esperimentuko gazteetan gertatzen den moduan,

batezbesteko BrdU-markaketan soilik itsasaldi-

erregimenak eragiten du modu esangarrian.

Ondorioz, atariko bi esperimentuen emaitzak

kontuan hartuz, esperimentu nagusia burutzeko

eguneko pultsu-esperimentuaren prozedura

jarraitzea erabaki zen bi arrazoi nagusi hauek direla

eta: (a) eguneko pultsu-esperimentuan BrdU-

markaketa handiagoa erregistratu zen, eta (b)

eguneko pultsu-esperimentuan aurkitutako

aldamoldeak, aldez aurretik BrdU-gehipen jarraia

aplikatu zeneko esperimentuan aurkituriko

aldamoldearen (Zaldibar et al., 2004) antz gehiago

du.

Sasoiaren eragina epitelioko zelulen

berriztapenean

Zelulen proliferazio-tasen baliorik altuenak udan

gertatu ziren. Muskuiluen liseri-guruinean urteko

sasoiaren arabera aldaketak behatu dira, entzimen

jardueran (Cancio & Cajaraville, 1999; Le Pennec &

Le Pennec, 2002), lipido-edukietan (Pazos et al.,

2003), parametro peroxisomikoetan (Cancio et al.,

1999) zein liseri-zelulen lisosomen egituran

(Etxeberria et al., 1994). Tenperatura epelagoak eta

eurei lotutako egokitze termikoak zein elikagaien

presentzia areagotua, liseri-epitelioko dinamikan

oso garrantzitsuak izan daitezke, liseri-epitelioaren

aktibazioa emanez. Beraz, udako liseri-epitelioko

zelulen proliferazio-tasa areagotua, alga- eta

fitoplankton-bloom-ek sortarazitako elikagaien

eskuragarritasun handiagoarekin erlazionatuta

egon daiteke, muskuiluen hazkuntza somatikoaren

emendioa ekar dezakeena. Are gehiago, udako

jarduera metabolikoaren igoerak zelulak kaltetzea

eta zelulen berriztapena handitzea sortu izana ere

posible da, izan ere, neguko muskuiluekin alderatuz

udakoen ehunetan DNA-harizpi matxuratu- eta

proteinen desnaturalizazio-tasa altuagoak ikusi

baitira (Hofmann & Somero, 1996; Shaw et al.,

2000). Beraz, liseri-guruinean zelulen proliferazio

areagotua, epitelioaren berriztapen eta egituren

mantenuarekin zein hazkuntza somatikoarekin

erlazionatuta egongo litzateke. Era berean,

udazkenean eta neguko azken hilabeteetan,

tenperaturaren eta elikagaien eskuragarritasunaren

jaitsierek, eta honekin batera jarduera metaboliko,

kalte zelular eta zelulen berriztapenaren jaitsierek

ikerlan honetan behatutako proliferazio-tasa

txikituak azalduko lituzkete. Halaber, Japoniako

itsasoko Cremomytilus grayanus espeziearen liseri-

traktuan ere, Leibson & Frolova-k (1994) zelulen

proliferazio-tasaren urteko sasoiarekin

erlazionatutako aldaketa esangarriak topatu

zituzten, zelulen proliferazioaren piko maximoak

maiatza-ekaina aldean eta piko minimoak otsaila-

martxoan topatu zituztelarik. Autore hauek, zelulen

proliferazioaren jaitsiera, neguko hilabeteetako

tenperatura baxuek eragindako jarduera metaboliko

eta elikadura-jarduera gutxituei egotzi zieten.


132

Adinarekin erlazionatutako aldaketak epitelio-

zelulen berriztapenean

Aldez aurretik PCNA immunohistokimika erabiliz

muskuilu gazteen liseri-guruinak helduena baino

proliferazio-jarduera altuagoa zuela erakutsi arren

(Marigómez et al., 1999), ikerlan honetan ez da

halakorik behatu. Izatez, muskuilu gazte eta

helduek antzeko proliferazio-tasak erakutsi

zituzten. Are gehiago, udan, BrdU-markaketa/egun

indizea muskuilu helduetan gazteetan baino

altuagoa izan zen. PCNA eta BrdUren

sentikortasunak desberdinak izatea (Sarli et al.,

1995; Muskhelishvili et al., 2003), emaitza

eztabaidatsu hauek azaldu lituzke. Are gehiago,

PCNAren kasuan ez bezala, BrdU-markaketa,

pultsu osteko BrdUren eskuragarritasunaren

araberakoa izango litzateke, eta hori gazte eta

helduen artean desberdina izan liteke,

muskuiluetan adinarekin alda daitezkeen elikadura-

jarduera, asimilazio-eraginkortasun eta beste

prozesu fisiologikoen menpean egonik (Thompson

et al., 1974; Bayne et al., 1976). Beraz, uretango

pultsu berak ez du ziurtatu behar muskuilu gazte

eta helduek BrdUren kopuru bera eta momentu

berean jaso behar dutenik. Haatik, termino

kualitatiboetan behintzat, muskuilu gazte eta

helduek aldamolde patroi bera erakutsi zuten, liseri-

epiteliora heldutako BrdUren kopurua faktore

mugatzaile nagusietakoa ez zela izan iradoki

zuena. Are gehiago, PCNAren bidez lortutako

emaitzak immunoblotetan oinarritu ziren, ikerlan

honetan lortutako BrdUren emaitzek

immunohistokimika oinarri duten bitartean. Ezin

daiteke baztertu, PCNA immunohistokimika aplikatu

ondoren, Marigomez et al.-ek, (1999) aurkitu

zituzten desberdintasunak, liseri-guruineko epitelio-

zelulen proliferazio-tasaren arteko

desberdintasunei baino gehiago, homogeneizatuan

zeuden beste zelula-mota batzuei egokitzea. BrdU

bidez lortutako emaitza, berriz, liseri-zelulen

jarduera proliferatzailearekin zuzenean

erlazionatuta egongo litzateke.

Itsasaldi-erregimenaren eragina epitelioko

zelulen berriztapenean

Marearteko muskuiluetan, aire-esposizio aldian

S-fase gehiago erregistratu ziren, baina uretan

murgildutakoan ez zen BrdU-markaketan

jeitsierarik behatu. Horrek, murgilketa zein aire-

esposizio aldietan, DNA erreplikapenak, aurrera

darraiela esan lezake, baina zatiketa zelularra

nagusia da animaliak airera esposatuak dauden

bitartean. Badirudi zelulen zatiketa ezingo zela inoiz

marea altuan gertatu jatearekin batera, DNAren

sintesia jatearekin batera eman litekeen bitartean.

Jatearen eta bestelako zenbait jarduera fisiologiko

garrantzitsuen arteko denboraren bereizketa

molusku itsastarren kasuan aski deskribaturik dago

(Susswein et al., 1983).

Bestalde, marearteko organismoek euren bide

metabolikoak egunero birritan aldatu beharrean

topa daitezke, hipoxiaren aldi luze zein laburrak

jasateren ondorioz. Hori, beherakada metabolikoen

bitartez lortzen da, bai energia lortzeko bide

anaerobikoak aktibatuz zein transkripzioaren

eraenketa edota proteinen fosforilazio itzulgarrien

bidezko entzima-jardueraren aldaketaz erdietsi

daitekeena (Greenway & Storey, 2000; Ton et al.,


133

2003; David et al., 2005; Papandreou et al., 2005).

Oxigenoaren eskaera modu egokian ez

hornitzekotan, zelulen kopurua ere txikitu beharra

dago, beraz, hipoxiarekiko erantzuna, ziklo

zelularraren gelditze edo eta apoptosiaren indukzio

gisa deskriba daiteke (Ton et al., 2003; Papandreou

et al., 2005), ornodunetan hipoxiak induzitutako

faktorea (HIF-1) izeneko transkripzioaren

suspertzaile baten kontrolpean suertatzen dena

(Gracey et al., 2001, Ton et al., 2003; Papandreou

et al., 2005). Airean egoteak eta ondorengo

hipoxiak, edo uretan murgiltzearen ondorengo

beroxigenatzeak, DNAren erreplikapen eta prozesu

mitotikoen geldiaraztea sor izana aintzat har

genezake, baina, dirudienez hori ez da ikerlan

honetan behatu dena. Bi prozesuok, zelulei BrdU

berriaren eskuratzearen gutxitzea lekarkieke eta

baita uretan murgilduta egon bitartean S-faseari

ekin zioten zeluletako BrdU-markaketa metatzea

ekarri, eta hori ikerlan honetan ez da behatu. Ildo

beretik, eta HIF-1 tankerako proteina bat

Crassostrea virginica marearteko moluskuan

identifikatu den arren (NCBI, CD648099), hipoxia

larriaren ondorioz azpi eta gainadierazitako zenbait

gene Crassostrea gigas-en aztertu dituen ikerlan

berriago batek (David et al., 2005), ez du zelulen

proliferazio-prozesuan inolako eraenketaren berririk

eman, ezta areagotutako apoptosi-erantzunarena

ere. Edozein kasutan, ornodunetan gertatzen den

modu berean, moluskuen neuronetan ere, hipoxia-

baldintzek apoptosia piz dezaketela proposatu da

(Jonas et al., 2005; Papandreou et al., 2005).

Itsasbehera izan bitartean (6 ordu bakarrik) airean

egotea areagotutako apoptosi-erantzuna eragitea

ez da litekeena; baina, hori gertatzekotan, zelulen

berriztatze altuago hori, ikerlan honetan behatutako

marearteko indibiduoen liseri-guruineko zelulen

proliferazio gaitasun areagotuarekin orokorrean

erlaziona liteke. Edonola ere, marearteko

muskuiluak mareazpikoekin konparatu direnean

ehunetan areagotutako kalte-zelularra eta

proteinen desnaturaltzea behatu dira (Hofmann &

Somero, 1995).

Aerobiosi/anaerobiosi baldintzez gain, elikatze-

jarduera ere, muskuilu itsastarren fisiologia eragiten

duen faktore nagusienetarikoa da. Itsasaldi-

erregimenak, muskuiluen liseri-epitelioaren forma

eta funtzioan berebiziko eragina du, jarraiki

(mareazpiko muskuiluak) edo txandaka

(mareartekoak) jaten duten arabera liseri-epitelioak

modu desberdinean funtzionatzen baitu (Owen,

1972, Robinson et al. 1981; Izagirre, 2002). Hala

ere, itsasaldia eta fotoperiodoa estuki erlazionaturik

daude, bibalbioen elikatze-jarduerari dagokionez

behintzat. Animaliak, batez ere egunez elikatzen

dira, fotosintesia dela eta, algak ur-zutabean

nagusiki egunez agertzen baitira. Beraz, gaua

endekatutako epitelioa berrizta daitekeen unea

dugu. Mareateko muskuiluen kasuan, DNAren

bikoizpena edozein momentutan gerta daiteke,

baina mitosiak muskuiluak airera esposaturik

daudenean soilik suertatzen dira, jaten ez dauden

bitartean, hain zuzen. Are gehiago, liseri-guruineko

epitelioa dinamikoa da oso, eta berau osatzen

duten bi zelulen profila, kopurua zein edukia,

elikagai eta ingurumen baldintzen arabera ordu

gutxiren buruan bortizki alda daitezke (Thompson et

al., 1974; Soto & Marigómez, 1997; Syasina et al.,


134

1997). Ildo beretik, itsasbeheran elikatze-tasa eta

xurgapen-efizientzia emendatzen dira (Wong &

Cheung, 2001), eta liseri-entzima ugarien jarduerak

ur-azpian suspertzen dira (Fernandez-Reiriz et al.,

2001). Honela, elikatze-tasak eta entzima-jarduerak

doituz, xurgapena egonkor manten daiteke (Wong

& Cheung, 2001). Liseri-epitelioaren berriztapena

elikatze-ziklo bakoitzarekin batera burutzen dela

iradoki da, hau da, marearteko muskuiluetan

birritan egunero (Nelson & Morton, 1979). Horrela,

mareazpiko muskuiluetan liseri-zelulen

proliferazioak aldamolde zirkamareala darraien

bitartean (Zaldibar et al. 2004; ikerlan honetako

emaitzak), marearteko muskuiluetan, pairatu

beharreko baldintza mugatuagoak direla eta,

itsasaldiak eta fotoperiodoak liseri-zelulen

proliferazioa agindu lezakete, eta, ondorioz, BrdU-

markaketen emendioa egunean behin eta bortizki

gertatuko da.

Ondorioak

Talde esperimentalen arteko desberdintasun

nabarmenenak itsasaldi-erregimen eta urteko

sasoiaren aldaketekin antzeman dira. Azken finean,

ez dirudi adinak proliferazio-aldamoldean eragin

handiegirik duenik. Areagotutako jarduera

metabolikoa dela eta, uda hazkuntza somatiko

gehien edo zelulen berriztapen-tasa altuagoa duen

sasoia dela ondorioztatu dugu, muskuilu gazte zein

helduek antzeko proliferazio-aldamoldea erakutsiz.

Bestalde, itsasaldi-erregimen desberdina duten

muskuiluen artean desberdintasun handiak daude,

baina, oro har, liseri-epitelioan zelulen proliferazioa

liseriketa bukatutakoan gertatu behar da.

BIBLIOGRAFIA

Bayne BL, Widdows J, Thompson RJ (1976) Physiology I. 121-

206 orr. Non: Marine mussels, their ecology and

physiology. Bayne BL (ed). Cambridge University Press.

Cambridge.

Cancio I, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of xanthine

oxidoreductase activity in the digestive gland cells of the

mussel Mytilus galloprovincialis: A biochemical,

histochemical and immunochemical study. Biol. Cell 91:

605-615.

Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of

peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in

mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with

lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123:135-144.

Candia Carnevali MD, Bonasoro F, Biale A (1997) Pattern of

bromodeoxyuridine incorporation in the advanced stages

of arm regeneration in the feather star Antedon

mediterranea. Cell Tiss. Res. 289:363-374.

David E, Tanguy A, Pichavant K, Moraga D (2005) Response of

the Pacific oyster Crassostrea gigas to hypoxia exposure

under experimental conditions. FEBS J. 272:5635-5662.

Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994)

Digestive lysosome enlargement induced by experimental

exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected

from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27:338-

345.

Fernandez-Reiriz MJ, Labarta U, Navarro JM, Velasco A (2001)

Enzymatic digestive activity in Mytilus chilensis (Hupe

1854) in response to food regimes and past feeding history.

J. Comp. Physiol. 171:449-456.

Gracey AY, Troll JV, Somero GN (2001) Hypoxia-induced gene

expression profiling in the euryoxic fish Gillichthys

mirabilis. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 98:1993-1998.

Greenway SC, Storey KB (2000) Seasonal change and

prolonged anoxia affect the kinetic properties of

phosphofructokinase and pyruvate kinase in oysters.

Comp. Biochem. Physiol. B 170:285-293.

Hofmann GE, Somero GN (1996) Interspecific variation in

thermal denaturation of proteins in the congeneric mussels

Mytilus trossulus and M. galloprovincialis: Evidence from

the heat-shock response and protein ubiquitination. Mar.

Biol. 126:65-75


135

Izagirre U (2002) Itsasaldien, sasoien, elikadura-erregimenen

eragina liseri-zelulen lisosometan eta euren

kutsatzaileekiko erantzunetan. Lizentziatura-Tesia. 78 orr.

Jonas EA, Hickman JA, Hardwick JM, Kaczmarek LK (2005)

Exposure to hypoxia rapidly induces mitochondrial channel

activity within a living synapse. J. Biol. Chem. 280:4491-

4497.

Leibson, N.L & Frolova, L.T. 1994. Winter-spring essential

reorganization of cell proliferation in the digestive tract

epithelia in the mussel Crenomytilus grayanus. Mar. Biol.

118:471-477.

Le Pennec, G & Le Pennec, M. 2002. Molecular analysis of the

seasonal expression of genes coding for different

functional markers of digestive gland of the bibalve mollusk

Pecten maximus (L). Comp. Biochem. Physiol B 133:417-

426.

Levy M, Weller A, Susswein AJ (1994)Learned changes in the

rate of respiratory pumping in Aplysia fasciata in response

to increases and decreases in seawater concentration.

Behav. Neurosci. 108:161-170.

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical

localisation of proliferating cells in mussel digestive gland

tissue. Histochem. J. 31:781-788.

Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, Henderson EB

(2003) Evaluation of cell proliferation in rat tissues with

BrdU, PCNA, Ki-67(MIB-5) immunohistochemistry and in

situ hybridization for histone mRNA. J. Histochem.

Cytochem. 51:1681-1688.

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial

renewal in the digestive gland tubules of the marine

prosobranch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud.

45:262-283.

Okudela K, Ito T, Kameda Y, Nakamura N Kitamura H (1999)

Immunohistochemical analysis for cell proliferation-related

protein expression in small cell carcinoma of the

esophagus; a comparative study with small cell carcinoma

of the lung and squamous cell carcinoma of the

esophagus. Histol. Histopathol. 14:479-485.

Owen G (1972) Lysosomes, peroxisomes and bivalves. Sci.

Prog. Ser. Oxf. 60:229-318.

Papandreou I, Powel A, Lim AL, Denko N (2005) Cellular

reaction to hypoxia: sensing and responding to an adverse

environment. Mut. Res. 569: 87-100.

Pazos AJ, Sánchez JL, Román G, Pérez-Parallé ML, Abad M

(2003) Seasonal change in lipid classes and fatty acid

composition in the digestive gland of Pecten maximus.

Comp. Biochem. Physiol. B 134: 367-380.

Potten CS, Kellet M, Rew DA Roberts SA. (1992) Proliferation

in human gastrointestinal epithelium using

bromodeoxyuridine in vivo: data for different sites,

proximity to a tumour, and polyposis coli. Gut 33:524-529.

Robinson WE, Pennington MR, Langton RW (1981) Variability

of tubule type within the digestive glands of Mercenaria

mercenaria L., Ostrea edulis L., Mytilus edulis L. J. Exp.

Mar. Biol. Ecol. 54:265-276.

Sarli G, Benazzi C, Preziosi R, Marcato PS (1995) Assessment

of proliferative activity by anti-PCNA monoclonal antibodies

in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and correla-

tion with mitotic index. Vet. Pathol. 32:93-96.

Scheving LE, Burns ER, Pauly JE, Tsai T (1978) Circadian

variation in cell division of the mouse alimentary tract, bone

marrow and corneal epithelium. Anat. Rec. 191:479-486.

Smaaland R. 1996. Circadian rhythm of cell division. Prog. Cell

Cycle Res. 2:241-266.

Shaw JP, Large AT, Livingstone DR, Doyotte A, Renger J,

Chipman JK, Peters LD (2000) Elevation of cytochrome

P450-immunopositive protein and DNA damage in mussels

(Mytilus edulis) transplanted to a contaminated site. Mar.

Environ. Res. 54:505-509.

Soto M, Marigómez I (1997) Metal bioavailability assessment in

“mussel-watch” programmes by automated image analysis

of autometallographical black silver deposits (BSD) in

digestive cell lysosomes. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141-

150.

Susswein AJ, Gev S, Feldman E, Markovich S (1983) Activity

patterns and time budgeting of Aplysia fasciata under field

and laboratory conditions. Behav. Neural Biol. 39:203-220.


alterations in the digestive diverticula of Mizuhipecten



44:85-98.



of the mussel (Mytilus edulis, L.). J. Mar. Biol. Assess. U.

K. 54:699-712.

Ton C, Stamatiou D, Liew CC (2003) Gene expression profile of

zebrafish exposed to hypoxia during development. Physiol.

Genom. 13:97-106.


136


137

Wong WH, Cheung SG (2001) Feeding rhythms of the green-

lipped mussel, Perna viridis (Linnaeus, 1758) (Bivalvia:

Mytilidae) during spring and neap tidal cycles. J. Exp. Mar.

Biol. Ecol. 257:13-36.

Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2004) Circatidal variation in

epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland

and stomach. Cell Tiss. Res. 318:395-402.


138

Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmiopean jarritako Littorina littorea moluskuitsastarraren liseri-guruinean

Laburpena: Littorina littorea magurio itsastarren zelula basofilikoen proliferazioa eragiteko 1.25 mg Cd/lpean jarri ziren 21 egunez. Ondoren, magurioak itsas-ur garbitan 10 egunez arazten utzi ziren, zelula-moten ordezkapena itzulgarria zen antzemateko. Liseri-guruinak, Carnoy fixatzailean fixatu eta analisihistologikoak egiteko parafinan inkluditu ziren. Zelula basofilikoen (VvBAS) eta liseri-zelulen (VvDIG)

dentsitate bolumetrikoa kuantifikatzeko hematoxilina eosinaz tindatutako ebakien gainean analisiestereologikoak burutu ziren. Zelulen tamaina eta kopuru absolutua estimatu ondoren, behatutakoaldaketek liseri-zelulen galerari eta aldi bereko zelula basofilikoen hipertrofiari egotzi zitzaien, eta ez zelulabasofilikoen kopuruaren emendioari. Hamar egunetako arazketa-aldiaren ondoren zelula-moten osaketaeta tamaina kasik balio normaletara itzuli ziren. PCNA immunohistokimikak, Cd pean egondako etaarazketa taldeko magurioen liseri-epitelioan kontrolean baino liseri-zelula proliferatzaile gehiago zeudelaerakutsi zuen. Hau da, liseri-zelulen galera netoak liseri-zelulen proliferazioaren areagotzearekin batzetorrela iradoki du, zelula basofilikoen ekarpenak zerikusirik ez zuen bitartean. Beraz, Cd pean egoteak,Cd-aren detoxifikazioa burutzeko liseri-zelulen berriztapena areagotuko zuela dirudi. Autometalografia(AMG) bitartez errebelatzen diren zilarrezko hauspeakin beltzak (BSD; ingeleraz, black silver deposits),nagusiki Cd ioien inguruan eratuak, liseri-zelulen lisosometan agertu ziren, zelula basofilikoetan BSDenpresentziarik behatu ez zen bitartean. Arazketa-aldia burutu eta gero BSD ez ziren horren nabarmenakizan. Liseri-zelulen lisosometan gertatutako aldaketak kuantifikatzeko, kriostatoko ebakien gainean ß-glukuronidasa jardueraren erakusketa histokimikoa gauzatu zen. Gerora, eta irudi-analisi automatizatuarenlaguntzaz liseri-lisosometan gertatutako aldaketak neurtu ziren. Cd pean mantendutako magurioetanhandiagotutako lisosomak behatu ziren, arazketa-aldiaren hamar egunak eta gero berriro ere kontrolenbalioetara itzuliz. Liseri-zelulen proliferazioan ikusitako aldaketek, liseri-zelulen galerak eta zelulabasofilikoen hipertrofiak, ez zuten ikerlan honetan erabilitako esposiziozko (BSD) eta efektuzko (erantzunlisosomikoak) biomarkatzaileen gainean eragin nabarmenik eduki.

Gako-hitzak: zelula-moten ordezkapena, magurioa, kadmioa, PCNA, liseri-guruina, efektu- etaesposizio-biomarkatzaileak.

Zelula-moten ordezkapen itzulgarria kadmio pean jarritako Littorina littorea molusku itsastarraren liseri-guruinean.

139

Reversible cell-type replacement in the digestive gland epithelium of themarine mollusc Littorina littorea exposed to cadmium

Abstract: Marine winkles Littorina littorea were exposed to 1.25 mg/l Cd for 21 days to provoke theproliferation of basophilic cells. Then, animals were depurated in clean seawater for 10 days to determinewhether CTR was reversible. Digestive glands were fixed in Carnoy and paraffin embedded for histologicalanalysis. The volume densities of basophilic cells (VvBAS) and digestive cells (VvDIG) were calculated by

stereology on haematoxylin-eosin stained sections. VvBAS raised and VvDIG decreased in Cd exposed

animals. After estimation of cell size and absolute cell numbers, these changes were attributed to digestivecell loss and concomitant basophilic cell hypertrophy but not to increased numbers of basophilic cells. Thecell type composition and cell size almost fully returned to normal values after 10 days depuration.Accordingly, PCNA immunohistochemistry demonstrated that proliferating digestive cells were moreabundant in winkles exposed to Cd and after 10 day depuration than in control specimens, suggesting thatnet digestive cell loss was accompanied by increased digestive cell proliferation and that CTR was notrelated to any contribution by basophilic cells. Thus, Cd-exposure seems to provoke an enhanced digestivecell turnover in order to cope with Cd detoxification. Autometallography revealed the presence of black silverdeposits (BSD), most likely formed around Cd ions, in digestive cell lysosomes whereas basophilic cellsappeared devoid of them. After depuration, BSD were less conspicuous. Changes occurring in digestive celllysosomes were quantified by automatized image analysis on cryostat sections stained to demonstrate ß-glucuronidase activity. Enlarged lysosomes were observed in Cd-exposed winkles while return to controllevels ocurred after 10 days depuration. Changes in digestive cell proliferation, digestive cell loss andbasophilic cell hypertrophy did not apparantly affect the exposure (BSD) and effect (lysosomal responses)biomarkers investigated herein.

Key Words cell-type replacement, winkle, cadmium, PCNA, digestive gland, effect and exposurebiomarkers.


140

Sustitución reversible de tipos celulares en el epitelio de la glánduladigestiva del molusco marino Littorina littorea expuesto a cadmio

Resumen Bígaros marinos Littorina littorea fueron expuestos a 1.25 mg/l de Cd durante 21 días conel fín provocar la proliferación de células basofílicas. Posteriormente, los animales se depuraron por unperíodo de 10 días en agua de mar limpia con el fin de observar si el recambio de tipos celulares erareversible. Las glándulas digestivas se fijaron en Carnoy fueron incluídas en parafina. La densidadvolumétrica de células basofílicas (VvBAS) y células digestivas (VvDIG) se calculó mediante estereología

en muestras teñidas con hematoxilina-eosina. En los bígaros expuestos a Cd se observó un aumento enlos valores VvBAS y un descenso en los valores VvDIG. Después de estimar el tamaño y el número

absoluto de células, éstos cambios se atribuyeron a la pérdida de células digestivas y a la hipertrofiaconcomitante de las células basofílicas, y no al aumento de éstas. Después del período de 10 días dedepuración, la composición de tipos celulares y el tamaño de las células volvieron a valores cercanos a losnormales. La inmunohistoquímica de PCNA demostró que la proliferación de células digestivas era mayoren los bígaros expuestos a Cd y después de 10 días de depuración que en los bígaros control, sugiriendoque la pérdida neta de células digestivas viene acompañada por el aumento en la proliferación de célulasdigestivas y no tiene relación alguna con la contribución de las células basofílicas. Por lo tanto, laexposición a Cd parece provocar una renovación aumentada de células digestivas. Los depósitos negrosde plata (BSD; del inglés, black silver deposits) mayormente formados alrededor de los iones de Cd yrevelados mediante autometalografía se localizaron en los lisosomas de las células digestivas, mientrasque no se detectaron en las células basofílicas. En el grupo de los bígaros depurados los depósitos fueronmenos llamativos. Se midieron los cambios ocurridos en los lisosomas de las células digestivas medianteanálisis de imagen sobre muestras de criostato, previamente teñidas para la demostración de la enzima ß-glucuronidasa. Se observó un mayor tamaño de lisosomas en los bígaros expuesto a Cd, que volvieron alos valores controles después de los 10 días de depuración. Los cambios en la proliferación de célulasdigestivas, la pérdida de células digestivas y la hipertrofia de células basofílicas no tuvieron efecto sobrelos biomarcadores de exposición (BSD) y efecto (respuestas lisosómicas) empleados en este trabajo.

Palabras clave: sustitución de tipos celulares, bígaro, cadmio, PCNA, glándula digestiva, biomarcadoresde efecto y exposición.


141


142


143

SARRERA

Moluskuen liseri-guruina ingurumen-toxikologia

ikerketetarako itu-organoa da; izan ere

,kutsatzaileen metaketa eta detoxifikazioan parte

hartzen du (Marigómez et al., 2002). Orokorrean,

molusku gehienen liseri-guruina antzeko

antolaketa-eredua aurkezten du; hots, liseri-

dibertikulua epitelio bakun batez osaturik dago eta

bertan bi zelula-mota agertzen dira, liseri-zelula eta

zelula basofilikoa, alegia (Morton, 1983). Liseri-

zelulek, elikagaien liseriketa intrazelularrean parte

hartzen dute, eta oso sistema endo-lisosomiko

garatua dute; zelula basofilikoak, bestalde, zelula

jariatzaileak dira, eta gastropodotan pikor

mineralizatu zitoplasmatikoak izan ditzakete

(Mason, 1983). Baldintza fisiologiko normaletan,

liseri-zelulak zelula basofilikoak baino ugariagoak

dira, baina estres-egoera desbedinetan, zelula

basofilikoen proportzio erlatiboa emendatzen da,

fenomeno hau zelula-moten ordezkapena (CTR;

ingeleraz, cell type replacement) izenarekin

ezaguna delarik (Cajaraville et al., 1990a;

Marigómez et al., 1990). Zelula-moten

ordezkapena, kutsatzaileen eragin pean egondako

taxon desberdineko eta habitat desberdineko

moluskuetan ematen den fenomeno orokorra da

(Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989;

Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez et al.,

1990; 1996). Kutsatzaile organiko (Cajaraville et

al., 1990a) zein metaliko (Soto & Marigómez,

1997a; 1997b) desberdinen kontzentrazio

subletalen pean jarritako bibalbioek, nagusiki zelula

basofilikoz osatutako liseri-guruina aurkezten dute.

Modu berean, laborategian Cd pean jarritako

gastropodo itsastarrek, zelula basofiliko

hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluak aurkezten

dituzte (Marigómez et al., 1990). Zelula

basofilikoen kopuru erlatiboaren igoera esangarria

hidrokarburo aromatikoen pean jarritako

gastropodo itsastarretan ere behatu da (Cajaraville

et al., 1990b).

Zelula-moten ordezkapena, liseri-zelulen

kopuruaren murrizpenarekin zuzenean edo, zelula

basofilikoen proliferazioarekin erlazionatuta

dagoen erantzun beharra dago. Oraintsu, gure

taldeak muskuiluen liseri-guruineko liseri-zelulak

zein zelula jariatzaileak PCNA eta BrdUren

immunohistokimikarekiko erreaktiboak direla

erakutsi du (Marigómez et al., 1999, Zaldibar et al.,

2004). Beraz, zelula-mota bakoitzak ziklo zelularra

bere aldetik burutzen du . Bestalde, 1.25 mg Cd/l

itsas-ur kotzentrazioak, magurioen liseri-guruineko

zelula basofilikoen proportzio erlatiboen igoera

esangarria sorterazten duela deskribatu da

(Marigómez et al., 1990). Ekarpen horiek kontuan

hartuta, ikerlan honen helburua, zelula-moten

ordezkapena prozesu itzulgarria ote den, eta

zelula basofilikoen proliferazioa edo liseri-zelulen

galera dela medio ematen ote den argitzea da.

Gainera, prozesua itzulgarria izatekotan zelula-

moten ratio normalera itzultzea liseri-zelulen

proliferazioaren areagotze batek eragin ote duen

finkatu behar da. Helburu horiek betetzeko,

magurioak 1.25 mg Cd/l itsas-ur kontzentrazio

pean jarri ziren 3 astez, baldintza esperimental

horietan zelula-moten ordezkapena sortaraz

zitekeela bagenekielako (Marigómez et al., 1990),

eta, ondoren, 10 egunez itsas-ur garbitan eduki

ziren; izan ere, aldez aurretik arazketak zelula

basofilikoen kopuruan jaitsiera eragin dezakeela

ikusi da.

Zelula-moten ordezkapen-prozesuak hainbat

emaitza biokimiko eta bioenergetiko eztabaidatsu

azal ditzake, uretan eta muskuilu itsastarren ehun

bigunetan neurtutako metal-kontzentrazioak

erlazionatzerakoan behatutako emaitza

eztabaidakorrak, besteak beste. Marigómez et al.

(1996, 1998), Soto et al. (1998a) eta Soto &

Marigómez-ek (1997b) esposizio luze edo

kronikoen ondorioz liseri-epitelioetan metalen

metaketarik ematen ez zela aurkitu zuten; izan ere,

epitelio horietan ez da apenas liseri-zelularik

ikusten, eta euren lisosomak metaleen metaketa-

toki nagusia dira. Zelula-espezifiko diren hainbat

biomarkatzaile (parametro lisosomikoak,

peroxisomen proliferazioa...) erabiltzen direnean

lortutako emaitzak interpretatzerakoan, antzeko

ondorioak lortu daitezke. Kutsatzaileen eragin pean

jartzeak liseri-zeluletako lisosomen tamainaren

handipena eragiten du normalean (Cajaraville et al.,

1995a; Etxeberria et al., 1995; Marigómez et al.,

2005a), baina zelai ikerketetan denbora tarte

laburrez kutsatzaile organikoen pean jarritako

animalietan lisosomen tamainaren txikipena

deskribatu da baita (Marigómez & Baybay-

Villacorta, 2003). Metaketa-gaitasuna eta

biomarkatzaileen erantzun batzuk zelula-mota

espezifikoak direnez, zelula-moten osaketan

ematen diren aldaketak, biometatze eta

biomarkatzaileen ikerketetan, ustekabeko emaitza

gisa ager daitezkeela susma daiteke. Testuinguru

honetan, ikerketa honen bigarren helburua, zelula-

moten ordezkapenak, metal-esposizio eta efektu

biologikozko biomarkatzaile ezagunak diren AMGz

lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD;

ingeleraz, black silver deposits) hedapenean eta

lisosomen tamaina aldaketan eraginik ote duen

ikustea da (Cajaraville et al., 1995a; Marigómez et

al., 2002).


Erreaktibo kimikoak





Prozedura esperimentala

2.5-3.5 zm altuera kolumelarreko Littorina

littorea magurioak merkatu batean eskuratu ziren

2001. eko urtarrilean eta litro bateko akuarioetan

mantendu ziren moldatzen 17ºC-tan 7 egunez.

Girora moldatzeko denbora igaro ondoren,

magurioak 1.25 mg Cd/l-pean jarri ziren 21 egunez.

Kontzentrazio subletal horrek liseri-guruineko

epitelioko zelula basofilikoen proportzio

erlatiboaren igoera esangarria sortarazten duela

aldez aurretik egindako esperimentuetan

deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Esposizio-

denbora bitartean, magurioak aldez aurretik

izoztutako Fucus vesiculosus algaz “ad libitum”

elikatu ziren. Janaria eta ura 2 egunero aldatu ziren.

Kadmio peko 21 egunak igaro ondoren, talde

esperimental bakoitzeko 10 magurio hartu ziren, eta


144


145

liseri-guruina/gonada konplexua disekzionatu zen

gero deskribatuko den bezala. Gainontzeko

magurioak, itsas-ur garbitan mantendu ziren 10

egunez, arazteko asmoz, eta ondoren aurreko

magurioen modu berean prozesatu ziren.

Laginen prozesaketa

Liseri-guruina/gonada konplexuaren zati txikiak

Carnoy fixatzailean (%60 etanol absolutua, %30

kloroformoa eta %10 azido azetikoa) fixatu ziren

ordu batez 4°C-tan. Fixatu ondoren, laginak

goranzko graduazioko etanolezko bainu-serie

batean deshidratatu ziren eta parafinan inkluditu

ziren 60°C-tan. Ebakiak (7 µm-ko lodiera)

mikrotomoan ebaki ziren. Ehunaren beste zati txiki

bat, %10 sakarosa zuen 0.1 M fosfato

indargetzailean (pH 7.4) murgildu zen 10 minutuz

4ºC-tan. Ondoren, gehiegizko indargetzailea

iragazi-papera erabiliz lehortu, eta Cryo-M-Bed

(TAAB Laboratories Equipments Ltd., Aldermaston,

Ingalaterra) konposatuan inkluditu zen, amaieran

laginak nitrogeno likidotan izoztu ziren. Ehunaren

hirugarren zati bat, zati txikitan xehetu zen (<1

mm3) eta %2.5 glutaraldehido zuen kakodilato

indargetzailean (CB; 0.1 M; pH 7.2) fixatu zen 2

orduz 4ºC-tan. Ondoren, laginak %2 osmio

tetroxidoa eta %3 potasio ferrozianuroa zuen

CBan, 1:1 diluzioan, postfixatu ziren ordu batez

4ºC-tan. Laginak ur distilatuan garbitu ziren (3x10

minutu), goranzko graduazioko etanolezko bainu-

serie batean deshidratatu ziren, eta EPON 812

erretxinan inkluditu ziren. Ebaki semifinak Leica

Utracut ultramikrotomo baten bitartez eskuratu

ziren, eta toluidina urdinez tindatu ziren, argi

mikroskopioan behaketak egiteko.

Zelula basofilikoen tamainaren estimazio

morfometrikoa

Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm)

hematoxilina-eosinaz tindatu ziren liseri-zelulak

(eosinofiloak) eta zelula basofilikoak (ilunak)

bereizteko. Zelula basofilikoen tamainaren

estimazio zakar bat lortzeko Olympus BX50

mikroskopio (Olympus, Tokio, Japonia) (amaierako

handipena x540) bati atxiki zegoen irudi-analisi

baten bitartez (Visilog 5.4 softwarea, Noesis,

Crolles, Frantzia) tratamendu bakoitzeko

aleatorioki aukeratutako 20 zelula basofilikoen

soslaia eskuratu zen. Neurketak egiteko soilik

epitelioaren xafla basaletik (zentzu histologikoan)

lumenera argiro zabaltzen ziren soslai

triangeluarreko zelula basofilikoak aukeratu ziren.

Soslai bakoitzerako ebakiduraren azalera (As) eta

luzeera maximoa (Lm) neurtu zen eta ondoren

zelula basofilikoak konikoak zirela onartuz (Mason,

1983) beraien tamaina (SBAS) hurrengo oinarrizko

formula geometrikoen arabera kalkulatu zen. SBAS= (π x As2)/(3 x Lm), µm3-tan. Horrela As = (B x

Lm)/2; r = B/2; Vkonoa =(π/ 3) x r2 x Lm = (π/3) x

(As/Lm)2 x Lm, non B soslai triangeluarraren

basearen luzera den, eta r luzera maximoaren

ardatzarekiko elkartzuta den konoaren erradio

maximoa den.

Epitelioaren konposizio zelularraren analisi

estereologikoak

Hematoxilina-eosinaz tindatutako lagin

berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (VvDIG) eta

zelula basofilikoen (VvBAS) dentsitate

bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura

estereologikoa aplikatu zen. Horretarako

kontaketak lagin bakoitzean azarez aukeratutako

zelai batetan egin ziren kontaketak guztira talde

esperimental bakoitzeko 10 kontaketak burutuz.

Analisi estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot

mikroskopio bati atxiki zegoen irudi-hodi bat erabili

zen (amaierako handipena x670). VvDIG eta

VvBAS kalkulatzeko Weibel gratikula

(multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979)

erabili zen eta liseri-zelula zein zelula basofilikotan

eroritako puntuak kuantifikatu ziren eta kalkuluak

Delesse-ren printzipioen arabera gauzatu ziren

(Weibel, 1979).

Liseri-zelula eta zelula basofilikoen

bolumenaren estimazio absolutuak dentsitate

bolumetrikoen datuetan oinarrituz burutu ziren.

Liseri-zelulek eta zelula basofilikoek betetzen zuten

bolumena (VDIG = VvDIG x 17.8 x 106 µm3; VBAS= VvBAS x 17.8 x 106 µm3) arbitrarioki

aukeratutako liseri-guruinaren bolumen batekiko

kalkulatu zen (17.8 x 106 µm3 gutxi gorabehera).

Bolumen hori kalkulu estereologikoak egiteko

erabilitako Weibel gratikularen (356000 µm2)

arbitrarioki aukeratutako 50 µm-ko lodierako

ebakidura bati dagokio. Lodiera hori zelula

basofilikorik handiena guztiz barneratua egotea

ahalbidetzen du.

Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan

liseri-zelula eta zelula basofilikoen kopurua

kalkulatzeko, liseri-zelulek tamaina konstantea

zutela onartu zen (talde esperimental

desberdinetan egindako behaketa mikroskopikoek

liseri-zelulen altueran aldaketa txikiak erakusten

dituzte, 30-33 µm, kalibrea konstante mantendu

zelarik, 6-8 µm), eta zelula basofilikoen tamainen

estimazio errealak aldez aurretik azaldu bezala egin

ziren.

PCNA immunohistokimika

Ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) mikrotomo batean

lortu eta aldez aurretik (3-amino propil

trietoxisilanoz) silanizatutako portaobjektuetan jazo

ziren. Ondoren, laginak xilenoz desparafinatu ziren,

beheranzko graduazioko etanolezko bainu-serie

batean hidratatu eta fosfato indargetzaile salinoz

(PBS; ingeleraz, phosphate-buffered saline) garbitu

ziren. Peroxidasa jarduera endogenoa ekiditeko,

ebakiak %3 zuen H2O2an inkubatu ziren 5 minutuz,

eta berriro PBS-az garbitu ziren. Ebakiak,

Vectastain Elite ABC Kit-ak (Vector Laboratories,

Burlingame, Kalifornia, Amerikako Estatu Batuak)

hornitutako suero blokeatzailean 30 minutuz

inkubatu ziren giro-tenperaturan, eta berriro ere

PBS-an garbitu ziren. Gero, ebakiak PCNAren

aurkako antigorputz espezifikoan (PC10, 1:1500

PBSan) inkubatu ziren. Laginak PBS-az garbitu

ondoren, Vectastain Elite ABC Kit-aren bitartez eta

abidina-biotina entzima-konplexua erabiliz

antigorputza ikustarazi zen. Laburki, ebakiak, PBS-

an diluitutako saguaren aurkako zaldiaren IgG

antigorputz sekundario biotinilatuan inkubatu ziren,

30 minutuz, eta PBS-an garbitu. Peroxidasa

jarduera 3,3´-diaminobenzidina tetrahidrokloridoa

(DAB) eta %0.03 H2O2 zuen PBS indargetzailea

erabiliz ikustarazi zen. Azkenik, ebakiak


146

hematoxilinaz kontrastatu ziren (10 s), dabilen

uretan garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan


Amerikako Estatu Batuak) montatu ziren.

Mikrografiak, Olympus BX50 mikroskopio batetara

atxiki zegoen Olympus PM20 argazki-kamera batez

erdietsi ziren.

Autometalografia

Metalak, Danscher-ek (1984) deskribatutako eta

Soto et al.-ek (1998b) modifikatutako prozedura

jarraituz determinatu ziren parafinan inkluditutako

laginetan. Ebakiak (7 µm), laburki xilenoz

desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko

etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean

(37ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak

ondoren, argazki-emultsio geruza fin eta uniforme

batez estali ziren gela ilunean (Ilford Nuclear

Emulsion L4, Ilford, Mobberley, Ingalaterra).

Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean

(30 minutu) eta laginak Ultrafin Tetenal SF (1:5

diluzioa ur destilatuan) (Tetenal AG & Co,

Norderstedt, Alemania) errebelatzaile komertziala

erabiliz errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren,

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa

zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez, eta

azkenik erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa-

Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu

zen 10 minutuz. Hauspeakin beltz (BSD) moduan

agertutako metalak irudi-analisi baten bitartez

(Biological Measurement System software BMS-

Sevisan, Bilbo, Espainia.) kuantifikatu ziren.

Horrela, BSDen dentsitate bolumetrikoa (VvBSD)

kalkulatu zen: VvBSD = VBSD/VEH non VBSD

BSDen bolumena den eta VEH ehunaren

bolumena.

Lisosomen estereologia

ß-glukuronidasa entzimaren erreakzio

histokimikoa fixatu gabeko kriotomo ebakietan

burutu zen Moore-k (1976) deskribatu eta

Cajaraville et al.-ek, (1989) modifikatu legez.

Ebakiak (8 µm) -21ºC-ko kabinako tenperatura

zuen CM3000 kriotomoan (Leica Instruments

GmbH, Nussloch, Alemania) lortu ziren, ebakiak

giro-tenperaturan zeuden portaobjektuetan jazo

ziren eta -40ºC-tan mantendu ziren tindatu aurretik.

Ebakiak, 28 mg naphtol AS-BI glucuronide 1.2 ml

sodio bikarbonatoan (50 mM) disolbatutako eta 100

ml-arte %2.5 NaCl zuen 0.1 M sodio azetato

indargetzailean (pH 4.5) murgildu ziren. Disoluzio

honetan, %20 (W/V) polibinilo alkoholezko 10-21 g

disolbatu ziren egonkortzaile koloidal gisa. Ebakiak

40 minutuz 37ºC-tan inkubatu ziren etengabeko

irabiatzea zuen bainu batean. Ondoren, laginak

%2.5 NaCl-tan garbitu ziren 2 minutuz eta 37ºC-

tan,eta %2.5 NaCl eta 1 mg/ml Fast Garnet GBC

0.1 M fosfato indargetzailean (pH 7.4) tindatu ziren

10 minutuz giro tenperaturan. Ebakiak, Baker

formol kaltzikoan (%4 formaldehido, %1 CaCl2 eta

%2.5 NaCl) fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan.

Laburki, uretan garbitu eta gero %0.1 zuen Fast

Green FCF disoluzioan kontrastatu zen 2 minutuz.

Azkenik, ebakiak Kaiser gelatina glizerinatuan

muntatu ziren.

Prozedura estereologikoa aplikatuz eta irudi-

analisia erabiliz liseri-zelulen lisosomen egitura

kuantifikatu zen (Cajaraville et al., 1995b;


147

Etxebarria et al., 1994). Sistema, aldez aurretik

Cajaraville et al.-ek, (1991) deskribatu dutenez

B&W-CDD bideo-kamera batez, Leitz Laborlux

mikroskopio batez eta Pentium ordenagailu batez

osaturik dago, softwarea BMS sistema izanik

(Sevisan, Bilbo, Espainia). x100 handipeneko

objektiboa erabili zen eta lisosomak eta liseri-

zelulen zitoplasma bereiziz irudi binarizatuak erabili

ziren. Lehenengo neurketak eskuz doitu ziren, lagin

desberdinen arteko tindaketa-intentsitate

desberdintasun txikiak ekiditeko asmoz. Irudi-

analisi sistemak hurrengo parametroak sortzen ditu:

lisosomen dentsitate bolumetrikoa (VvLYS =

VL/VC), dentsitate superfiziala (SvLYS = SL/VC),

azalera/bolumena ratioa (S/VLYS = SL/VL) eta

dentsitate numerikoa (NvLYS = NL/VC) non V =

bolumena, S = azalera, L = lisosomak eta C = liseri-

zelulen zitoplasma baitira. Formula

estereologikoak, batezbesteko diametroa

ebakiduraren lodiera baino txikiagoak duten

partikulentzako zuzenketa-faktorea dauka sartuta

(Lowe et al., 1981). Cajaraville et al.-en, (1995a)

arabera, 5 neurketa burutu ziren liseri-guruin

bakoitzeko.


148

1. Irudia: Magurio kontrol (A eta B) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioen (C eta D) irudi histologikoak, bai hematoxilina-eosinaz (A eta C) zein toluidina urdinez (B eta D) tindatutako ebakietan. Geziek zelula basofilikoak adierazten dituzte. L) liseri-tubuluen argia. Eskala-marrak: 50 µm (A, B eta D) eta 25 µm (C).

Estatistika

Emaitzak estatistikoki analizatzeko SPSS/PC+


erabili zen. Lisosomen Vv eta Nv logaritmikoki

transformatu ziren analisi estatistikoa aplikatu

aurretik, indibiduoen arteko bariantza

batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai

esperimentalen esangarritasuna, bide bateko

bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu

zen, eta parekatutako batezbestekoak, Duncan

testa erabiliz konparatu ziren.

EMAITZAK

Liseri-epitelioaren analisi morfometriko eta

estereologikoa

Esperimentuak iraun zuen denbora guztian

magurio kontrolen liseri-guruinean behatutako

zelula-mota nagusia pikor zitoplasmatiko

heterogeneoak zituen liseri-zelula izan zen. Zelula

basofilikoak, beraien soslai piramidal

karakteristikoarekin taldekatuak agertu ziren (1A

eta 1B Ird.). Bestalde, zelula basofilikoen maiztasun

erlatiboa askoz nabarmenagoa izan zen 21 egunez

Cd pean jarritako magurioetan (1C eta 1D Ird.).

Liseri-dibertikuluen lumena dilatatu samarra

zegoela zirudien (1C Ird.), baina analisi

estererologikoak egin ondoren animalia kontrol eta

kutsatuen artean VvLUMEN balioan

desberdintasun esangarririk ez zegoela

ondorioztatu zen (2. Ird.). Are gehiago, Cd pean

jarritako magurioen liseri-zelulek iraizpenean gogoz

jarduten ari ziren (1C eta 1D Ird.), baina epitelioaren

lodierak ez zuen funtsezko murrizketarik pairatu

(epitelioaren ebakiduraren azalera: kontrolak,

36633±2894 µm2; Cd pean jarritakoak,

35640±2761 µm2; araztutakoak, 39514±4028

µm2). Azkenik, Cd pean jarritako magurioetan,

zelula basofilikoek, handiagoak izanik, basofilia

gutxiago zutela (1C eta 1D Ird.) eta pikor

zitoplasmatikoen populazio heterogeneoagoa

zutela ematen zuen (1D Ird.). Behaketa hauek

sendotzeko asmoz irudi-analisiaren laguntzarekin

zelula basofilikoen tamaina estimatu zen

ebakiduraren azaleren neurketa zuzenak burutuz.

3. irudian ikusten denez, Cd pean jarritako

magurioetan zelula basofilikoen tamaina (bolumena

µm3-tan adierazita) kontrolena baino bi aldiz

handiagoa izan zen, azken hauek esperimentuak

iraun bitartean aldakatarik jaso ez zutelarik. Ur

garbitan 10 egunez arazten egon ondoren, liseri-

guruinaren epitelioa ezin zen animali kontrolen

epiteliotik bereizi. Zelula basofilikoen tamaina

normala berreskuratu zen, euren bolumenaren

neurketek adierazi zutenez (3. Ird.).


149

2. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l peanmantendutako (zutabe grisa) magurioen liseri-tubuluenlumenaren dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarrak adierazi dituzte.

Liseri-guruinaren epitelioko zelula-moten

osaketan gertatu ziren aldaketak kuantifikatzeko,

VvBAS eta VvDIG kalkulatu ziren (4. Ird.). Bi

parametroak, osagarriak izanik, Cd pean jarritako

magurioetan eta magurio kontrol eta 10 egunez

arazten mantendutako magurioen artean

esangarriki desberdinak izan ziren (4A eta 4B Ird.).

VvBAS-en igoera, edota aldibereko VvDIG-en

jaitsiera, liseri-zelulen galerak edota zelula

basofilikoen ugaritzeak sortua den zehazteko

asmoz, liseri-zelula eta zelula basofilikoen bolumen

eta kopuru absolutuen estimazioa burutu zen,

planimetria eta estereologia batera aplikatuz.

Termino absolututan, Cd pean jarritako

magurioetan liseri-zelulen bolumena, berriro ere 10

egunetako arazketa-aldiaren ondoren jaitsi zen

kontrolen balioetara bueltatuz (4D Ird.). Bitartean,

zelula basofilikoen bolumena 10 egunez Cd pean

jarritako magurioetan igo zen, eta arazketaren egin

ondoren, berriro ere kontrolen balioetara bueltatu

zen (4D Ird.). Horrela, 17.8 x 106 µm3-ko liseri-

guruinaren zati bati dagokionez, kontroletan liseri-

zelulen bolumena 11.8 x 106 µm3 koa izan zen,

gutxi gorabehera. Cd pean jarri ondoren, liseri-

zelulen 1.6 x 106 µm3-ko bolumena galdu zen, eta

10 eguneko arazketa-aldia igaro ondoren, liseri-

zelulen bolumena berriro ere 12.7 x 106 µm3-ko

baliora bueltatu zen. Liseri-zelulen kopuruari

dagokionez, Cd pean jarritako magurioetan liseri-

guruinaren zati horretan 1850 liseri-zelula galdu

zitrela erakutsi zuten, magurio kontroletan liseri-

zelulen kopurua 13900 zeluletakoa izanik, gutxi

gorabehera. 10 egunez arazten utzi ondoren, liseri-

zelulen kopurua kontroletan baino apur bat

altuagoa izan zen, 14700 inguru. Zelula

basofilikoen bolumen absolutuari dagokionez, 17.8

x 106 µm3-ko zati arbitrarioan, magurio kontrolen

1.1 x 106 µm3-ko bolumena Cd pean jarritako

magurioetan 2.3 x 106 µm3-ra emendatu zen, eta

arazketaren ondoren berriro 1.2 x 106 µm3-ra itzuli

zen. Zelula basofilikoen kopurua, bere aldetik, 210-

315 tartean mantendu zen, eta talde esperimental

desberdinen artean esangarriki aldatu ez zelarik

(4E eta 4F Ird.).

PCNA immunohistokimika

Aurretik aipatutako zelula-kopuruen aldaketak

azaltzeko asmoz, zelulen proliferazio tasetan

balizko aldaketak aurkitzeko PCNA

immunohistokimika aplikatu zen. Behar bezalako

irudiak lortzeko, zailtasun handiak topatu ziren; izan

ere, lipofuszinak eta pikor zitoplasmatikoetan

seinale ez-espezifiko bortitza topatu zen; batez ere,

Cd pean jarritako magurioetan. Tindaketa-

prozedura desberdinekin, DAB, fosfatasa alkalinoa

eta tindagai fluoreszenteak barne, hainbat


150

3. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mgCd/l peanmantendutako (zutabe grisa) magurioen zelula basofilikoenbatezbesteko bolumena. Segmentu bertikalek desbidazioestandarra adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan.

saiakuntza egin ondoren, nukleo PCNA-positiboak

bestelako egituretatik errez bereiztea lortu zen ,

baina aldez aurretik pentsatutako PCNAren analisi

kuantitatiboak egitea ezinezkoa suertatu zen. Dena

den, behaketa kualitatiboak, nahiz eta mugatuak

izan, interesgarriak suertatu ziren oso. Erabilitako


151

4. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen neurketa estereologikodesberdinak. (A) Zelula basofilikoen dentsitate bolumetrikoa; (B) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa; (C) Zelula basofilikoek

betetzen duten bolumena 17.8 x 106 µm3 bolumenarekiko; (D) Liseri-zelulek betetzen duten bolumena 17.8 x 106 µm3

bolumenarekiko; (E) Zelula basofilikoen kopurua 17.8 x 106 µm3 -tako bolumen batean: (F) Liseri-zelulen kopurua 17.8 x 106 µm3

-tako bolumen batean. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrka adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan.

arratoien PCNA aurkako PC10 antigorputz

komertziala, magurioen zelula proliferatzaileak

detektatzeko gai izan zen; izan ere, gonadan oso

erreakzio bortitza behatu zen (5A Ird.). Gonada

arran, espermatozito primarioetan, sekundarioetan

baino erreakzio bortitzagoa behatu zen, eta

espermatida helduek ez zuten PCNA-markaketarik

erakutsi (5A Ird.). PCNArik gabe inkubatutako

tindaketa kontroletan ez zen inolako seinalerik ikusi

(5B Ird.). Gonada emean, erreakzio positiboa

obozitoen nukleoan soilik behatu zen, nukleoloan

inolako seinalerik behatu ez zelarik (5C eta 5D Ird.).

Bestalde, magurio kontroletan liseri-zelulen nukleo

PCNA-positibo gutxi behatu ziren, eta lipofuszinen

erreaktibotasunagak sortutako zarata gutxi aurkitu

genuen (6A-C Ird.). Hala ere, Cd pean jarritako

magurioetan, lifofuszina eta lisosomen materialak

PCNA-markaketa bortitza eman zuten (6D-F Ird.),

magurio kontroletan eta araztuetan behatu ez zena

(6F-H Ird.).

Autometalografia

Autometalografiak, liseri-zelulen lisosometan

zilarrezko hauspeakin beltzen (BSD) presentzia

erakutsi zuen, zelula basofilikoetan BSDrik behatu

ez zen bitartean (7. Ird.). Magurio kontroletan

BSDen maila basalak behatu ziren, eta Cd pean

mantendutako magurioetan askoz erreakzio

bortitzagoak aurkitu ziren (7A-C Ird.). 10 eguneko

arazketa-aldia bukatu ondoren, tindaketa-patroia,

magurio kontroletan ikusitakoaren antzekoa izan

zen (7D Ird.). Behaketa horiek, VvBSD gisa

neurtutako BSDen hedapena neurtzerakoan

lortutako emaitza kuantitatiboekin bat egin zuten.

VvBSD balioak, Cd pean jarritako magurioetan

magurio kontroletan baino hiru aldiz handiagoak

izan ziren, eta are gehiago, araztutako magurioen

artean eta magurio kontrolen artean ez zen

desberdintasun esangarririk aurkitu (8. Ird).

Lisosomen egitura-aldaketak

Lisosomak, ß-glukuronidasa entzimaren

histokimika erabiliz ikustarazi ziren. Honela, arre-


152

5. Irudia: PCNA immunohistokimika burutu ondoren magurioen gonada ar eta emean behatutako immunomarkaketa. (A) PCNA-markaketa positiboa ikusten da espermatogonietan g), espermatozito primario p) eta sekundarioetan s) eta baita espermatidetanere t). Eskala-marra: 25 µm. (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako lagin kontroletan (folikulu espermatikoa) ez da inolakomarkaketa positiborik behatzen. Eskala-marra: 25 µm. (C) eta (D) PCNAren lokalizazioa gonada emeetan, bai obozito helduetano), zein obozito goiztiarretan e). Nukleoek markaketa positibo bortitza erakusten duten bitartean (geziak), nukleoloetan ez damarkaketarik behatzen (gezi-buruak). Eskala marra: 50 µm.

purpura koloreko egitura esferiko gisa agertu ziren

liseri-zelulen zitoplasman. Lisosomak, Cd pean

jarritako magurioetan kontrol eta araztutako

taldeenetan baino apur bat handiagoak eta

ugariagoak ziren (9. Ird.). Lisosomen egituraren

analisi estereologikoak erakutsi zutenaren arabera,

nahiz eta S/VLYS eta NvLYS parametroetan

desberdintasun esangarririk ez aurkitu Cd-ak,


153

6. Irudia: PCNA immunohistokimika magurio kontrol eta 1.25 mg Cd/l pean mantendutako magurioetan. (A eta C) Maguriokontrolak, T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa, H) hemozitoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte,eta gezi-buruek zelula basofiliko positiboak adierazten dituzte. Ikusi lipofuszinen erreaktibogarritasun urria magurio kontroletan (A).Eskala-marra: 50 µm (A) eta10 µm (C). (B) Antigorputz primariorik gabe inkubatutako laginetan ez da inolako markaketa positiborikbehatzen. Eskala-marra: 50 µm. (D-F) Cd pean 21 egunez mantendutako magurioetan lipofuszinak erreakzio bortitza erakustendute. T) liseri-tubuloa, D) liseri-zelula, B) zelula basofilikoa. Geziek liseri-zelula positiboak adierazten dituzte, eta gezi- buruek zelulabasofiliko positiboak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm (D) eta 10 µm (E eta F). (G-H) 10 egunez arazten utzitakomagurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasuna ahulagoa da eta zelula PCNA positibo ugari (geziak) ikus daitezke. T) liseri-tubuloa. Eskala-marra: 50 µm (G) eta 10 µm (H).

VvLYS balioaren igoera (lisosomen handipena)

esangarria eragin zuen, arazketa burutu ondoren

balioak berriro ere kontrolen mailara itzuliz (10.

Ird.).

EZTABAIDA

Moluskuen liseri-guruinean kutsatzaileen eragin

pean behatutako bestelako erantzunen artean,

epitelioko zelula-moten ordezkapena (CTR)

bibalbio eta gastropodoetan fenomeno orokor gisa

deskribatu da (Widdows et al., 1984; Lowe &

Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b;

Marigómez et al., 1990; 1996; 2005a; 2005b).

Zenbait kasutan, bai zelula basofiliko normalek zein

hipertrofiatutako liseri-guruineko epitelioko parterik

nagusiena osatuz aurkitu dira, eta horregatik, CTR

prozesua zelula basofilikoen proliferazioa dela

medio burutzen dela proposatu da (Rasmussen et

al., 1983; Lowe & Clarke, 1989: Cajaraville et al.,

1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990; Syasina et

al., 1997). Are gehiago, Yonge (1926) eta Mix &

Sparks-en (1971) lanetan oinarriturik, orokorrean,

liseri-guruinaren epitelioaren berriztapen-gaitasuna

zelula basofilikoei esleitu zaie (Thompson et al.,

1974; Nelson & Morton, 1979). Izatez, zelula

basofilikoen proliferazioa, babes-mekanismoa izan

daitekeela iradoki da, non zelula basofilikoak behar

bezalako baldintzak ematekotan liseri-zelula

helduetan desberdintzatu baitaitezken (Thompson

et al., 1974). Zelula basofilikoei eta liseri-zelulei

funtzio arras desberdinak egokitu zaizkiela kontuan


154

7. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa, bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunezmantendu eta gero, (A eta B); maguio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutako magurioetan (D). Geziek liseri-zelulenlisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak adierazten dituzte, gezi-buruek liseri-epitelioko xafla basalean dagoen metalaadierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.

hartuz gero (Mersoy & Farley, 1973; Mason, 1983),

Marigómez et al.-ek (1990), aipatutako hipotesia

betetzeko aukera gutxi daudela iradoki zuten.

Ikerlan horren arabera, zelula basofilikoz osatutako

tubuluen agerpenaren erantzulea, liseri-zelulen

kopuruaren jaitsiera soilik izango litzateke. Are

gehiago, ikerlan horretan epitelioan neurtutako

aldaketa morfologikoek eta honako ikerlan honetan

zelula proliferatzaileak identifikatu izanak, bigarren

hipotesia baieztatzen dute, geroago ikusiko denez.

Kutsatzaileen pean jarritako moluskuetan,

liseri-guruineko epitelioaren masaren galera netoa

gertatu izana hainbat ikerlanetan frogatu da (Lowe

et al., 1981; Couch, 1984; Tripp et al., 1984;

Marigómez et al., 1986; 1993; Minnitti, 1987; Axiak

et al., 1988; Recio et al., 1988; Lowe & Clarke,

1989; Vega et al., 1989; Cajaraville et al., 1992;

Ireland & Marigómez, 1992; Syasina et al., 1997;

Snyman, et al., 2005). Halaber, zenbait zeharkako

ebidentziek liseri-dibertikuluen luzeraren

murrizpena gertatzen dela adierazi dute, esaterako

kutsatzaileen pean egondako muskuiluen liseri-

guruinaren 3-D-ko berreraikuntzak egin ondoren

ikusi zenez, (Quincoces, 1995). Muskuiluetan,

liseri-guruinaren unitate morfofuntzionala ganbara

baten bitartez liseri-konduktuetara lotzen diren hatz

itxurako egiturez osaturik dago (Marigómez et al.,

1995). Metal eta kutsatzaile organikoen pean

mantendutako muskuiluetan, hatzen luzera

esangarriki txikitzen da (Quincoces, 1995). Masa

epitelialaren murrizpen hori, liseri-zelulen

galerarekin lotuta egon daiteke, eta ondorioz, zelula

basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko igoera

gauzatuko litzateke. Magurioen liseri-dibertikuluak

ez dira muskuiluenak bezain plastikoak.

Muskuiluetan, liseri-guruinaren morfologia prozesu

fisiologiko normaletan ere aldaketa bortitzak

jasotzen dituen bitartean, (liseriketa-ziklo

bakoitzean adibidez; Robinson, 1983),

magurioenaren itxura eta morfologia orokorra askoz

egonkorragoa da, adibidez liseriketan zehar (Sáez

et al., 1990). Hala ere, 1.25 mg Cd/l-ko

kontzentrazio pean egondako magurioetan, liseri-

epitelioaren lodieraren jaitsiera esangarria gertatu

zen (Vega et al., 1989), eta beraz, Cd kontzentrazio

horrek, magurioetan ere masa epitelialaren galera

garbia eragiten duela ondoriozta daiteke. Ikerlan

honetan, aipatutako efektuaren ebidentziarik ez da

behatu; izan ere, Cd pean egondako magurioetan

VvLUMEN balioa ez da modu esangarrian aldatu.

Hala ere, Vega et al.-ek (1989) aplikatutako

metodologia, lan honetan aplikatutako hurbilketa

estereologikoa baino sentikorragoa izan zen. Izan

ere, lan honetan lumenaren tamaina, tubuluen

tamaina eta epitelioaren lodiera aldi berean

kalkulatu dira. Gainera, bi esperimentuak urteko


155

8. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta 1.25 mg Cd/l peanmantendutako (zutabe grisa) magurioen zilarrezko hauspeakinbeltzen dentsitate bolumetrikoa. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoektaldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituztep<0.05 mailan.

sasoi desberdinetan burutu ziren (errute-garaian,

abendua-urtarrila versus errute-ostean, otsaila-

martxoa). Erantzuna termino kualitatibotan

antzekoa izatea espero bada ere, erantzunaren

hedadura desberdina izan daiteke, abendua-

urtarrila garaian (Vega et al., 1989) otsaila-martxoa

garaian (ikerlan hau) baino erantzun sentikorragoak

behatuz. Modu berean, CTR erantzuna, nahiz eta

Cd kontzentrazio berdinak erabili, leunagoa

suertatu da ikerlan honetan, abendua-urtarrila

garaian burutu ziren esperimentuekin (Marigómez

et al., 1990) alderatuz. Are gehiago, Marigómez et

al.-en (1990) arabera, espero baino zelula

basofilikoen hipertrofia gutxiago behatu da oraingo

honetan .

Zelulen galeraren ebidentziarekin batera, orain

epitelioko zelulen berriztapen-mekanismoen

inguruan datu berriak daude eskuragarri.

Muskuiluen liseri-guruinean, bai liseri-zelulak zein

zelula basofilikoak PCNA zein BrdU

immunohistokimikak eginez erreakzionagarriak

direla frogatu da, eta beraz, bi zelula-motek bere

ziklo zelularra norberak bere aldetik betetzen dute

(Marigómez et al., 1999; Zaldibar et al., 2004). Hori

dela eta, kutsatzaileen eraginez desagertu diren

liseri-zelulak ordezkatzeko ez dirudi zelula

basofilikoak proliferatzen eta desberdintzatzen

direnik, liseri-zelulek bere aldetik bikoizteko

gaitasuna baitute. PCNA immunohistokimikaren

bitartez behatu denez, nahiz eta Cd pean

mantendutako magurioetan eta araztutako

magurioetan lipofuszinen erreakzionagarritasun

handiak emaitza kuantitatiboak lortzerik baimendu

ez, badirudi Cd-ak liseri-zelulen proliferazioaren


156

9. Irudia: Littorina littorea magurioaren liseri-epitelioan ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren lokalizazioa histokimika bitartez,bai 1.25 mg Cd/l pean 21 egunez mantendu eta gero, (A eta B ); magurio kontroletan (C); zein 10 egunez arazten mantendutakomagurioetan (D). Geziek lisosomen barneko ß-glukuronidasa jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.

areagotzea eragiten duela. Areagotutako

proliferazio hori, 10 egunez arazten utzitako

magurioetan oraindik ere mantentzen da.

Proliferazio-tasak kalkulatzeko gai izan ez garenez,

arazketa ondoren liseri-guruinean gertatzen den

zelula-moten berreskurapena, liseri-zelulak gehiago

proliferatzen dutelako edo liseri-zelula gutxiago

galtzen direlako ondorioztatzea ezinezkoa zaigu.

Kadmio pean egondako magurioetan, liseri-

zelulen bolumen absolutua jaitsi zen 10 egunetako

arazketa-aldia eta gero, kontrolen balioetara itzuli

bazen ere. Zelula basofilikoen bolumen absolutua,

Cd peko tratamenduaren ondoren igo zen eta

arazketa-aldia eta gero berriro ere kontrolen

balioetara jaitsi zen. Liseri-zelulen bolumen

absolutuaren jaitsiera, liseri-zelulen galera netoa

dela medio eman zen bitartean (1850 liseri-zelula

galdu ziren liseri-guruinaren 17.8 x 106 µm3-ko zati

batean), zelula basofilikoen bolumenaren igoera

zelulen hipertrofiak sortua da, eta ez zelula

kopuruaren igoerak, sortua izan zen.

Ikerlan honetan lortutako emaitza guztiak batera

kontuan hartuta, CTR, zelula basofilikoen

proliferazioak sortua baino, gehiago, liseri-zelulen


157

10. Irudia: Magurio kontrol (zutabe zuria) eta Cd pean mantendutako (zutabe grisa) magurioen ß-glukuronidasa jarduerarenparametro estereologikoak (A) Dentsitate bolumetrikoa; (B) Dentsitate superfiziala; (C) Azalera/Bolumena ratioa; (D) Dentsitatenumerikoa. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasunesangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan.

galera netoak sortua zela dirudi. Hala ere, liseri-

zelulen galera neto hori, liseri-zelulen proliferazio

areagotuarekin batera gertatu zen. Ornodunen

zeluletan, programatutako heriotza zelularra zein

zelulen proliferazioa Cd-ak eragiten duena jakina

da (Beyersmann & Hechtenberg, 1997; Habeebu et

al., 1998; Piechotta et al., 1999). Cd pean

egondako Helix pomatia barraskiloetan kontroletan

baino lau aldiz programatutako heriotza zelular

gehiago erregistratu da liseri-zeluletan

(Chavikovsky et al., 2004). Programatutako

heriotza zelular hori, elkar baztertzaileak ez diren

autofagia eta apoptosioren konbinaketak eraginda

dagoela dirudi (Bursch et al., 2000; Chavikovsky et

al., 2004). Izan ere, oraingo honetan Cd-ak liseri-

zelulen proliferazioa eragin dezakeela behatu da;

beraz, liseri-zelulen galera netoa zelulen heriotza

eta proliferazioaren arteko balantze gisa azal

daiteke. Beraz, magurioetan, Cd pean egoteak,

arazketari aurre egiteko liseri-zelulen berriztapena

areagotzen du.

Kadmio pean egondako magurioen zelula

basofilikoen hiperplasia, esposizio-denbora eta

kontzentrazioaren araberakoa da (Marigómez et al.,

1990). Zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen)

hiperplasia zenbait metalen pean egondako

lehorreko gastropodoetan ere deskribatu da

(Marigómez et al. 1996; 1998; Chabicovsky et al.

2004). Hiperplasia hori fenomeno desberdinekin

erlazionatu da: (1) liseri-zelulen funtzioak (liseriketa

intrazelularra barne) kaltetuta egonez gero,

liseriketa estrazelularrerako entzimen areagotutako

ekoizpenarekin (Cajaraville et al., 1990b;

Marigómez et al., 1990); (2) zelula basofilikoetan

areagotutako detoxifikazio-jarduerekin (Cajaraville

et al., 1990a; Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn

& Köhler, 1996); eta (3) apoptosi bidez hildako

liseri-zelulen fagozitosiarekin (Chabicovsky et al.,

2004), hain zuzen ere. Bestalde, aipatutako

hiperplasia, liseri-zelulen galerak epitelioan toki

libre gehiago uzten duenez, zelula basofilikoen

tamaina eta soslai aldaketekin erlazionatuta egon

daiteke, ugaztunen urdaileko epitelioan deskribatu

den bezala (Clarke, 1970). Liseri-guruinaren

histofisiologiari dagokionez, duela gutxi egindako

behaketen arabera (argitaratu gabe), ez dirudi

areagotutako entzimen jariapena azalpen

sinesgarria denik. Halaber, kutsatzaile organikoen

pean, baina ez metalen pean, zelula basofilikoen

erretikulu endoplasmatiko pikortsuan areagotutako

jarduera detoxifikatzaileen berri eman da

(Livingstone & Pipe, 1992; Triebskorn & Köhler,

1996). Edonola ere, metalen detoxifikazioaren

kasuan partaide nagusiak liseri-zelulak direnez

(Vega et al., 1989), ikerlan honetako behaketak

azaltzeko pisu gutxiko aukera dirudi. Azkenik, zelula

basofilikoek hiltzen ari diren liseri-zelulen hondarren

fagozitosian parte hartzen dutela hiperplasia

azaltzeko aukera egokiena izan daiteke. Intsektuen

epidermisean (Locke, 1985), ugaztunen hepatozito

(Dini et al., 2002), Sertoli zelula (Nakanishi &

Shiratsuchi, 2004) eta bestelako epitelio-zeluletan

(Monks et al., 2005), eta gastropodoen liseri-

guruineko epitelio-zeluletan (Chavikovsky et al.,

2004), hiltzen diren epitelio-zelulak, alboko epitelio-

zelulek fagozitatzen dituztela deskribatu da.

Oraintsu, Cd-z elikatutako bareetan gorputz

apoptotikoak izan daitezkenak deskribatu dira (5.


158

Kapitulua). Edonola ere, azken hipotesi hori

baieztatzeko, teknika immunohistokimikoak erabiliz

zelula apoptotikoen identifikazio espezifikoak eta

mikroskopio elektroniko mailan egindako ikerketak

burutzea beharrezkoa da.

Ikerlan honen ekarpen garrantzitsuena, CTR

itzulgarria dela frogatzea izan da: 10 eguneko

arazketa-aldia eta gero, liseri-zelulak berriz ere

zelula basofilikoak baino ugariagoak suertatu dira.

Liseri-zelulen PCNA-markaketa Cd pean

mantendutako zein araztutako magurioetan

antzekoa izanik, CTRren itzulgarritasunak liseri-

zelulen galera moteltzearekin zerikusia behar du

izan, Cd-aren gabezian liseri-zelulen jarduera

metabolikoa berriz ere bere egoera normalera

itzultzea espero baita (Marigómez et al., 1986).

Beraz, liseri-zelulen berriztapena kutsatzaileen

gisako ingurumen-faktoreek modulatua dagoela

dirudienez, zelula-moten osaketa bereizgarria

ingurumen-baldintza berezi bati egotzi ahal zaio.

Ingurumen-erasoaren maila eta luzeraren

araberakoa izan daitekeen moldaera hori, liseri-

guruinaren fisiologiaren ulermenean eta

biomarkatzaileen aplikazioan eragina izan dezake,

itu-zeluletan ezartzen ez diren eta matrize

analitikoan (liseri-guruina) suertatzen diren

aldaketak aintzakotzat hartzen ez dituzten

prozedurak erabiltzen badira.

Metal-esposizioak sortarazitako CTRk, BSD-

hedapena bezalako esposizio-biomarkatzaile eta

lisosomen erantzunak bezalako efektu-

biomarkatzaileen gainean eragina izan dezakeela

frogatu da muskuiluetan (Soto et al., 2002; 1.

Kapitulua). Modu berean, metal-esposizioak

muskuilu eta magurioen liseri-guruinean

eragindako masa netoaren aldaketek, AAS bidez

estimatutako ehunetako metal-zaman eragina izan

dezakete (Soto et al., 1997a; 1997b). Dirudienez,

liseri-zelulen galerak eta berreskurapenak, ikerlan

honetan aplikatutako biomarkatzaileen (BSD-

hedapena, lisosomen parametro estereologikoak)

gainean eraginik ez dute. Magurioen liseri-

guruineko VvBAS balioak 0,2 µm3/µm3 baino

handiagoak izan arren, zelula basofilikoak

saihestuz; lisosomen barneko metal-kopuru eta

lisosomen handipenaren neurketak zuzenean liseri-

zelulen gainean egin daitezke.

Laburbilduz, ikerlan honen ondorioak honako

hauek dira: (1) "itxurazko" zelula-moten

ordezkapena liseri-zelulen galerak eta aldibereko

zelula basofilikoen hipertrofiak sortua dela; (2)

prozesua itzulgarria dela; (3) liseri-zelulen

proliferazioa Cd pean mantendutako magurioetan

areagotzen dela, eta tendentzia hori arazketa-

aldiaren ondoren mantentzen dela; eta (4) liseri-

zelulen galera eta berreskurapena ikerlan honetan

erabilitako maila zelular eta tisularreko

biomarkatzaileen gainean eraginik ez dirudi duenik.

BIBLIOGRAFIA

Axiak V, George JJ, Moore MN (1988) Petroleum hydrocarbons

in the marine bivalve Venus verrucosa: accumulation and

cellular responses. Mar. Biol. 97:225-230.

Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regula-

tion, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol.

Appl. Pharmacol. 144:247-261.

Bursch W, Ellinger A, Gerner CH, Fröhwein U, Schulte-

Hermann R (2000) Programmed cell death (PCD) apopto-

sis, autophagic PCD, or others?. Ann. N.Y. Acad. Sci.

926:1-12.


159

Cajaraville MP, Marigómez JA, Angulo E (1989) A stereological

survey of lysosomal structure alterations in Littorina littorea

exposed to 1-naphtol. Comp. Biochem. Physiol. C 93:231-

237.




Org. 9:221-228.





24.

Cajaraville MP, Marifómez JA, Angulo E (1991) Automated

measurement of lysosomal structure alterations in oocytes

of mussels exposed to petroleum hydrocarbons. Arch.

Environ. Contam. Toxicol. 21:395-400.

Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992)

Comparative effects of the water accommodated fractions

(WAF) of three oils on mussels. 2.- Quantitative alterations

in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem.

Physiol. C 102:113-123.

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995a)

Lysosomes as cellular markers of environmental pollution:

time- and dose-dependent responses of the digestive lyso-

somal system of mussels after petroleum hydrocarbon

exposure. Environ. Toxicol. Water Qual. 10:1-8.

Cajaraville MP, Robledo Y, Etxeberria M, Marigómez I (1995b)

Cellular biomarkers as useful tools in the biological monito-

ring of environmental pollution: molluscan digestive lysoso-

mes. 29-45 orr. Non: Cell Biology in Environmental

Toxicology. Cajaraville MP (ed) University of the Basque

Country Press Service. Bilbo.

Chabicovsky M, Klepal W, Dallinger R (2004) Mechanisms of

cadmium toxicity in terrestrial pulmonates: Programmed

cell death and metallothionein overload. Environ. Toxicol.

Chem. 23:648-655.

Clarke RM (1970) A new method of measuring the rate of shed-

ding of epithelial cells from the intestinal villus of the rat.

Gut 11:1015-1019.

Couch JA (1984) Atrophy of diverticular epithelium as an indi-

cator of environmental irritants in the oyster, Crassostrea

virginica. Mar. Environ. Res. 14:525-526.





Dini L, Pagliara P, Carlà EC (2002) Phagocytosis of apoptotic

cells by liver: A morphological study. Microsc. Res. Tech.

57:530-540.

Etxeberria M, Sastre I, Cajaraville MP, Marigómez I (1994)

Digestive lysosome enlargement induced by experimental

exposure to metals (Cu, Cd and Zn) in mussels collected

from a zinc polluted site. Arch. Environ. Toxicol. 27:338-

345.

Etxeberria M, Cajaraville MP, Marigómez I (1995) Changes in

digestive cell lysosomal structure as biomarkers of environ-

mental stress in the Urdaibai estuary (Biscay Coast,

Iberian Peninsula). Mar. Poll. Bull. 30:599-603.

Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced

apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153:48-

58.

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary cal-

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and his-

tological changes in the digestive cells in the snail Achatina

fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168.

Livingstone DR, Pipe RK (1992) Mussels and environmental

contaminants: molecular and cellular aspects. 425-464 orr.

Non: The Mussel Mytilus: ecology, Physiology, Genetics

and Culture. EM Gosling (ed). Elsevier Science Publs B.V.

Amsterdam.

Locke M (1985) A structural analysis of post embryonic deve-

lopment. 103-165 orr. Non: Parasites-Their world and ours.

Mattrick CF & Desser SS (ed). Elsevier Biomedical Press.

New York.

Lowe DM, Clarke KR (1989) Contaminant-induced changes in

the structure of the digestive epithelium of Mytilus edulis.

Aquat. Toxicol. 15:345-358.

Lowe DM, Moore MN, Clarke KR (1981) Effects of oil in the

digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellu-

lar and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1:213-226.

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986) Copper treatment of the

digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Morphometrics

and histophysiology. Bull. Environ. Contam. Toxicol.

36:608-615.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of

the digestive gland-gonad complex of the marine proso-


Org. 9:229-238.


160

Marigómez I, Soto M, Etxeberria M, Angulo E (1993) Effects of

size, sex, reproduction, and trematode infestation on the

quantitative structure of digestive tubules in stressed win-

kles. Zool. Jb. Anat. 123:319-336.

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995)

Computer assisted 3-d reconstruction techniques may pro-

vide new insides into the pattern of histological organisa-

tion of the bivalvian digestive gland. 12th Int. Malacol.

Congr. Vigo.




Marigómez I, Cajaraville MP, Soto M, Lekube X (1998) Cell-

type replacement, a successful strategy of mollusks to


20:411-414.

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical loca-

lisation of proliferating cells in mussel digestive gland tis-

sue. Histochem. J. 31:781-788.



molluscs. Microsc. Res. Tech. 56:358-392.

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and

general lysosomal responses in digestive cells of mussels

exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol.

64:235-257.

Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005a) Lysosomal enlarge-

ment in the digestive cells of mussels exposed to cadmium,

bezo[a]pyrene and their combination. Comp. Biochem.

Physiol. C 141:188-193.

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L,

Cajaraville MP (2005b) Cell and tissue biomarkers in mus-

sel, anh histopathology in hake and anchovy from Bay of

Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign

2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan).

Mason AZ (1983) The uptake, accumulation and excretion of

metals by the marine prosobranch gastropod mollusc

Littorina littorea (L). Doktoradutza-Tesia. University of

Wales, Gwyneed (UK). 575 orr.

Merdsoy B, Farley I (1973) Phasic activity in the digestive gland

of the marine prosobranch gastropod, Littorina littorea (L.).

Proc. Malacol. Soc. London 40:473-482.

Minnitti F (1987) Effects of copper pollution on the hepatopan-

creas of Cyclope neritea L. (Mollusca:Gastropoda). Zool.

Anz. 219:141-146.


the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing


Monks, J., Rosner, D., Geske, F.J., Lehman, L., Hanson, L.,

Neville, M.C., Fadok, V.A. (2005) Epithelial cells as pha-

gocytes: Apoptotic epithelial cells are engulfed by mam-

mary alveolar epithelial cells and repress inflammatory

mediator release. Cell Death Diff. 12:107-114.

Moore MN (1976) Cytochemical demonstration of latency of

lysosomal hydrolases in digestive cells of the common

mussel Mytilus edulis, and changes induced by thermal

stress. Cell Tiss. Res. 175:279-287.

Morton B (1983) Feeding and digestion in bivalvia. 65-147 orr.

Non: The Mollusca. ASM & Wilburg M. (ed). Academic

Press. Saleuddin. New York.

Nakanishi Y, Shiratsuchi A (2004) Phagocytic removal of apop-

totic spermatogenic cells by sertoli cells: Mechanisms and

consequences. Biol. Pharma. Bull. 27:13-16.

Nelson L, Morton JE (1979) Cyclic activity and epithelial rene-

wal in the digestive gland tubules of the marine proso-

branch Maoricrypta monoxyla (Lesson). J. Moll. Stud.

45:262-283.

Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke

HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda liman-

da) as possible new biomarker for anthropogenic stress.

Ecotox. Environ. Saf. 42:50-56.

Quincoces I (1995) Un nuevo modelo de la glándula digestiva

de Mytilus galliprovincialis (Bivalvia, Eulamellibranchia):

reconstrucción tridimensional asistida por ordenador y

microscopía electrónica de barrido. Lizentziatura-Tesia.

UPV/EHU. 112 orr.



of N-nitroso compounds on the marine mussel, Mytilus

edulis (L) II. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine Aquat.

Toxicol. 3:301-311.

Recio A, Marigómez JA, Angulo E, Moya J (1988) Zinc tratment

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Cellular

distribution of zind and cadmium. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 41:858-864.

Robinson WE (1983) Assessment of bivalve intracellular diges-

tion based on direct measuremets. J. Moll. Stud. 49:1-8.


161

Sáez V, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1990)

Histomorphology and histochemistry of the digestive gland

of Littorina littorea (L.) in relation to experimental tidal con-

ditions, food availability, and digestion. Zool. Jb. Anat.

120:185-196.

Snyman RG, Reinecke AJ, Reinecke SA (2005) Quantitative

changes in the digestive gland cells of the snail Helix

aspersa after exposure to fungicide copper oxychloride.


Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A pla-

nimetric study of morphological variability in the digestive

diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and Mytilus edulis

Linnaeus. J. Moll. Stud. 56:339-344.

Soto M, Marigomez I (1997a) BSD extent, an index for metal





in “mussel-watch” programmes by automated image analy-

sis of autometallographical black silver deposits (BSD) in


150.

Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997a) The contribution of

metal/shell weight index in target-tissues to metal body

burdens in sentinel marine mollusks. 1 Littorina littorea.

Sci. Tot. Environ. 198:135-147.

Soto M, Ireland MP, Marigómez I (1997b) The contribution of

metal/shell weight index in target-tissues to metal body

burdens in sentinel marine mollusks. 2 Mytilus galloprovin-

cialis. Sci. Tot. Environ. 198:149-160.

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigomez I (1998a)

Autometallographed metal content in digestive cells of win-

kles: a cost-effective screening tool for monitoring Cu and

Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140.

Soto M, Quincoces I, Marigómez I (1998b)

Autometallographical procedure for the localization of

metal traces in molluscan tissues by light microscopy. J.

Histotechnol. 21:123-127.

Soto M, Zaldibar B, Cancio I, Taylor MG, Turner M, Morgan AJ,

Marigómez I (2002) Subcellular distribution of cadmium

and its cellular ligands in mussel digestive gland cells as

revealed by combined autometallography and X-ray micro-

probe analysis. Histochem. J. 34:273-280.


alterations in the digestive diverticula of Mizuhopecten yes-

soensis (Bivalvia: Pectenidae) from polluted areas of Peter

the Great Bay, Sea of Japan. Mar. Environ. Res. 44:85-98.

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starva-

tion on structure and function of the digestive gland of the

mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54:699-

712.

Triebskorn R, Köhler HR (1996) The impact of heavy metals on

the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal

storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of

metal toxicity. Environ. Poll. 93:323-343.

Tripp MR, Fries CR, Craven MA, Grier CE (1984)

Histopathology of Mercenaria mercenaria as an indicator of

pollutant stress. Mar. Environ. Res. 14:521-524.

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative altera-

tions in the structure of the digestive cell of Littorina littorea

on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103:547-553.

Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press.

London 415 orr.

Widdows J, Bakke T, Bayne BL, Donkin P, Livingstone DR,

Lowe DM, Moore MN, Evans SV, Moore SL (1984)

Responses of Mytilus edulis on exposure to the WAF of

North Sea oil. Mar. Biol. 67:15-31.


Trans. Roy. Soc. Edin. 54:703-718.




162


Liseri-zelulen berriztapena kadmio etakerosenozko nahasketa baten peanesperimentalki jarritako bareen liseri-guruinekoepitelioan

Laburpena: Arion ater (L) bareak lurzoruen osasun-maila ebaluatzeko organismo-behale gisaproposatu dira. Kutsatzaile pean egondako bareen liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketakbehatu dira, aldaketa horien artean esanguratsuena liseri-zelulen galera eta horrekin batera iraizte- etakaltzio-zelulen emendioa izanik. Lan honen helburua, liseri-zelulen galerak efektu- eta esposizio-biomarkatzaileen gainean eragina duen, eta zelulen galera hori laborategiko baldintzetan metal etakonposatu organikozko nahasketa baten pean jarritako bareetan itzulgarria ote den antzematea da.Horretarako, bareak kutsatu gabeko toki batetik (Delika, Euskal Herria) hartu ziren eta 10 µg Cd + %30kerosenotik lortutako urari egokitutako frakzioa zuen janariaz 27 egunez elikatu ziren. Gorputzeko metal-zama eta kerosenoaren mailak kalkulatu ziren erabilitako esposizioa eraginkorra zela baieztatzeko asmoz.Esposizio-biomarkatzaile gisa, autometalografia bitartez lortutako zilarrezko hauspeakin beltzen (ingeleraz,Black Silver Deposits; BSD) dentsitate bolumetrikoa eta azil-KoA oxidasa (AOX) entzimaren jarduera erabiliziren. Efektu-biomarkatzaile gisa, liseri-epitelioa osatzen duten 3 zelula-moten (liseri-, iraizte- eta kaltzio-zelulak) dentsitate bolumetrikoan neurtutako aldaketak erabili ziren. Zelula proliferatzaileakbromodeoxiuridinaren (BrdU) immunodetektapenaren bitartez identifikatu ziren. Ikerlan honen emaitzek,kutsatzaile pean jarritako bareetan AOX jarduera eta BSD-en denstitate bolumetrikoaren igoera eta liseri-zelulen kopuruaren jaitsiera gertatzen dela islatu zuten, dena den aldaketa horiek liseri-guruinekokutsatzaileen metaketa-gaitasunean eta erabilitako efektu- eta esposizio-biomarkatzaileen gaineaneraginik ez zuten izan. Gainera, liseri-epitelioko zelula-moten osaketan behatutako aldaketa eraldatu horiarazte-aldiko 7 egunen buruan itzulgarria zela behatu zen. BrdU-markaketak kutsatzaile pean egoteakliseri-zelulen proliferazio areagotua eragiten duela erakutsi zuen, proliferazio-jarduera areagotu hori arazte-aldian zehar ere mantentzen zelarik.

Gako-hitzak: liseri-guruina, bareak, zelula-moten ordezkapena, kadmioa, kerosenoa, efektu- etaesposizio-biomarkatzaileak..

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lanborategi-ikerketa

163

Digestive cell turnover in the digestive gland epithelium of slugsexperimentally exposed to a mixture of cadmium and kerosene

Abstract: Slugs, Arion ater (L), have been proposed as sentinel organisms to assess soil environmentalhealth. In slugs under the influence of pollutants changes in the cell-type composition of the digestive-glandhave been observed, among these changes, the most remarkable one is the loss of digestive cells and therelated increase of excretory and calcium cells.The aim of the present work was to determine whetherdigestive cell loss affects biomarkers of exposure and effect and whether is reversible in the digestive glandof slugs exposed to a mixture or metal and organic pollutants under laboratory conditions. For thesepurposes, slugs collected from a non-polluted site (Delika, Basque Country) were dosed with 10 µg Cd/gr+ 30% of the water accommodated fraction of kerosene in the food for 27 days. Metal body burdens andkerosene tissue levels were measured. The volume density of black silver deposits (VvBSD) revealed by

autometallography, and the activity of the enzyme acyl-CoA oxidase (AOX) were used as exposurebiomarkers. As effect biomarkes, changes in the volume density of the three cell types that constitute thedigestive gland epithelium in slugs (digestive, excretory and calcium cells) were calculated. Proliferatingcells were identified by means of bromodeoxyuridine (BrdU) immunohistochemistry. The results of thepresent work revealed that the mixture of pollutants provoked an increase in VvBSD and AOX activity as

well as a decrease in the number of digestive cells. Anyway, these changes had no effect in the capacity ofthe digestive gland to accumulate or in the effect and exposure biomarkers employed. Moreover, thechange in cell-type composition measured in the digestive epithelium was reversible after 7 days ofdetoxification. BrdU-labelling showed that exposure to pollutants provoked an enhanced digestive cellproliferation, that perdured during detoxification

Key words: digestive gland, slugs, cell-type replacement, cadmium, kerosene, effect and exposurebiomarkers.


164

Renovación de células digestivas en el epitelio de la glándula digestiva delimacos experimentalmente expuestos a una mezcla de cadmio y keroseno

Resumen: Los limacos, Arion ater (L) han sido propuestos como organismos centinela en la evaluaciónde la salud del suelo. Se han observado cambios en la composición de tipos celulares de la glánduladigestiva de limacos bajo la influencia de contaminantes. De entre todos estos cambios el más reseñablees la pérdida de células digestivas y el aumento de células excretores y de calcio que le acompaña. Elobjetivo del presente trabajo es determinar si la pérdida de células digestivas afecta a los biomarcadoresde exposición y efecto, y si dicha pérdida es reversible en limacos expuestos a una mezcla decontaminantes metálicos y orgánicos en condiciones de laboratorio. Con ese fín, se recogieron limacos deun lugar no contaminado (Delika, País Vasco) y se trataron con 10 µg Cd/gr + 30% de la fracciónacomodada al agua de keroseno en la dieta durante 27 días. Se midió la concentración de Cd y dekeroseno en la glándula digestiva. La densidad volumétrica de BSD (VvBSD), (BSD, del inglés; Black Silver

Deposit) revelados mediante autometalografía y la actividad del enzima acil-CoA oxidasa fueron losbiomarcadores de exposición estudiados. Como biomarcadores de efecto se calcularon los cambios en ladensidad volumétrica de los tres tipos celulares que contituyen el epitelio de la glándula digestiva delimacos (células digestivas, excretoras y de calcio). Las células proliferativas se identificaron medianteimmunohistoquímica de bromodeoxiuridina (BrdU). Los resultados obtenidos demostraron que la mezclade contaminantes provocan un aumento en VvBSD y en la actividad AOX así como la pérdida de células

digestivas en limacos, aunque los cambios observados en el epitelio digestivo no afectaron a la capacidadde acumulación de contaminantes ni a los biomarcadores de efecto y exposición empleados en el presentetrabajo. Además, el cambio en la composición de tipos celulares del epitelio digestivo fué reversibledespués de 7 días de depuración. Por otro lado, el marcaje de BrdU demostró que la exposición acontaminantes induce la proliferación de las células digestivas y que dicho aumento en la tasa deproliferación se mantiene durante el período de detoxificación.

Palabras clave: glándula digestiva, limacos, recambio de tipo celular, cadmio, keroseno,biomarcadores de efecto y exposición.

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: laborategi-ikerketa

165


166


167

SARRERA

Moluskuetan, liseri-guruinaren epitelioko zelula-

moten osaketa larriki aldatuta suerta daiteke

kutsatzaile-esposizio subletalen ondorioz

(Rasmussen et al., 1983, Widdows et al., 1984;

Lowe & Clarke, 1989; Cajaraville et al., 1990a;

1990b; Marigómez et al., 1990; 1996; 1998a;

1998b; Soto et al., 2002). Efektu hori, zelula-moten

ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell-type

replacement) izenaz ezagutu da, eta orokorki

zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo

kopuru erlatibo gisa neurtu da (Rasmussen et al.,

1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989;


1990; 1996; 1998a; 1998b; 1. Kapitulua). CTR,

kutsadura oean gerta daitekeen zelula basofilikoen

(kaltzio-zelulen) proliferazioaren ondorioa dela

iradoki da (Thompson et al., 1974; Rasmussen et

al., 1983, Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke,

1989; Cajaraville et al., 1990a; 1990b; Marigómez

et al., 1990; 1996). Haatik, Cd pean mantendutako

magurioetan behatutako zelula basofilikoen

itxurazko areagotzea nagusiki liseri-zelulen galera

(DCL; ingeleraz, Digestive Cell Loss) eta aldi

bereko zelula basofilikoen hipertrofiaren (BDH;

ingeleraz, Basophilic Cell Hypertrophy) ondorioa

dela frogatu da berriki (4. Kapitulua). DCL, liseri-

zelulen proliferazio eta heriotzaren arteko

desorekaren ondorioa dela dirudi, nahiz eta liseri-

zelulen kopuruaren galera netoa suertatu, Cd peko

esposizioak liseri-zelulen proliferazioaren

emendioa eragiten baitu (4. Kapitulua).

Muskuilu zein magurioetan, liseri-guruinaren

epitelioa bi zelula-mota nagusiz osaturik dago,

liseri-zelula eta zelula basofilikoa, alegia; hortaz,

"itxurazko" CTR, epitelioko zelula-kopuruaren

galera netoa ematen denez, DCLren ondorio

zuzena dela onar genezake (1. eta 4. Kapituluak).

Lehorreko gastropodoen liseri-guruineko epitelioa,

ordea, morfologikoki desberdintzatutako hiru

zelula-motez osaturik dago: liseri-zelulak

(ugarienak), iraizte-zelulak eta kaltzio-zelulak

(basofilikoak) (Sumner, 1965). Hala ere, iraizte-

zelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden

liseri-zelulak, eta ez hirugarren zelula-mota

desberdintzatua, izango liratekeela proposatu da,

(Porcel et al., 1996; Dimitriadis & Konstantinidou,

2002). Molusku itsastarretan bezala, kaltzio-zelulen

(zelula basofilikoen) hipertrofia eta kopuru erlatibo

emendatuaren berri eman da metalen pean

mantendutako lehorreko bareetan (Marigómez et

al. 1996; 1998a). Hala ere, iraizte-zelulen

proportzio erlatiboa ere emenda daiteke

(Marigómez et al., 1998a) eta, beraz, bareen liseri-

guruinean hiru zelula-motetan gertatzen diren

aldaketak "itxurazko" CTR gainean nola eragiten

duten argitu beharra dago. Are gehiago, Cd eta Zn

pean mantendutako magurio eta muskuiluetan

behintzat, "itxurazko" CTR egun gutxiren buruan

itzulgarria denez (1. eta 4. kapituluak), moluskuen

liseri-guruineko epitelio-zelulen berriztatzearen

ikuspegi orokorra eskuratzeko asmoz, erantzun

hori zelula-moten osaketa konplexuagoa duten


168

bareen liseri-guruinean ere itzulgarria ote den

argitzea komenigarria iruditu zitzaigun.

Beste alde batetik, muskuiluen kasuan metal-

esposizioak eragindako CTRk autometalografia

(AMG) bidez errebelatutako zilarreezko haupeakin

beltzen (BSD; ingeleraz, Black Silver Deposits)

BSD-hedapenaren moduko esposizio-

biomarkatzaileen gainean eragina duena badakigu

(Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Hala ere, Cd pean

jarritako magurioetan ez dirudi DCLk BSD-

hedapenaren gainean eragina duenik, lisosomen

barneko BSDen neurketa mikroskopikoak liseri-

zeluletan modu errazean egin baitaitezke, zelula

basofilikoak taldekaturik agertu ohi direlako.

Bareetan, metal desberdinen arabera emaitza

desberdinak erdietsi dira. Dietan 1000 µg Hg/g dosi

pean 3 aste baino gehiagoz tratatutako bareetan,

liseri-guruineko epitelioan suertatutako zelula-

moten osaketaren aldaketak VvBSD (BSDen

dentsitate bolumetrikoa) esangarriki eragin zuen,

liseri-epitelioa nagusiki BSDrik gabeko iraizte-

zelulez osaturik baitzegoen (Marigómez et al.,

1996). Merkurio pean mantendutako bareetan, BSD

liseri-zeluletan bereziki ugariak, iraizte-zeluletan

esangarriki urriagoak eta kaltzio-zeluletan bakanak

zirela aipatu beharra dago. Aitzitik, Zn pean

mantendutako bareetan, zelula-moten osaketak ez

zuen BSD-hedapenean eraginik izan, AMG bidez

errebelatutako BSDak hiru zelula-motetan

lokalizatu baitziren (Marigómez et al., 1998a). Cd

pean jarritako bareetan, aurretiko behaketek

BSDak iraizte-zeluletan ere bazeudela erakutsi

zuten, eta, beraz, lotugai-multzo eskuragarrien

arabera metal desberdinak zelula-mota

desberdinetan bahitu daitezkeela kontuan hartuz

(Marigómez et al., 2002), Cd-aren presentzian

zelula-moten ordezkapenean behatutako aldaketek

BSD-hedapenaren moduko metal-esposizioaren

biomarkatzaileen gainean eragina duten ikertzea

planifikatu genuen.

Azkenik, metal indibidualen, metalen

nahasketen, zein kutsatzaile organikoen pean

jarritako bareen liseri-gurineko epitelioan ere

"itxurazko" CTR deskribatu da (Müller, 1994;

Marigómez et al., 1996; 1998a; 6. Kapitulua), baina

metal eta konposatu organikoen nahasketek

eragindako efektuei buruz ez dago datu

eskuragarririk, guk dakigunez. Moluskuen liseri-

guruinean, zelula-moten osaketari dagokionez

metal eta hidrokarburoen nahasketen eta

kutsatzaile indibidualen eragina desberdina denez

(1. Kapitulua), ikerlan honetan Cd eta kerosenozko

(beren urari egokitutako frakzioa, hain zuzen; WAF:

ingeleraz, Water Accommodated Fraction)

nahasketa kutsatzaile eredu gisa aukeratu zen.

Horrela, ikerlan honetako helburuak hurrengoak

dira: (1) metal (Cd) eta kutsatzaile organikozko

(keroseno-WAF) nahasketa pean mantendutako

bareen liseri-guruinean DCL dagoen den finkatzea;

(2) magurioetan bezala, kutsatzaileen pean

jarritako bareen liseri-guruinean, DCL prozesu

itzulgarria den frogatzea; eta (3) zelula-moten

osaketan gertatutako aldaketek BSD-hedapena

moduko esposizio-biomarkatzaileen gainean

eragina duten argitzea. Helburu horiekin, Delika

(Euskal Herria) inguruko toki garbi batetik Arion ater

bareak hartu ziren. Kadmio eta keroseno-WAF

nahasketaren dosi subletal pean 27 egunez jarri


169

ziren, eta ondoren laborategiko egoera garbitan

mantendu ziren 7 egunez. Neurketa osagarri gisa,

elikatze-jarduera eta hazkuntza, egunero neurtu

ziren. Bareen liseri-guruineko Cd eta kerosenoaren

kontzentrazioak, absortzio atomikozko

espektrofotometria (AAS) eta gas-

kromatografia/masa-espektrometria (GC/MS)

bidez neurtu ziren, hurrenez hurren. Halaber, AMG

bidez errebelatutako BSDen dentsitate

bolumetrikoa (VvBSD) eta azil-KoA oxidasa (AOX)

entzimaren jarduera bareen liseri-guruinean,

metalen eta konposatu organikoen esposizio-

biomarkatzaile gisa aplikatu ziren, hurrenez hurren.

Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten

hiru zelula-moten dentsitate bolumetrikoa (VvDIG,

VvEXC, VvCAL) hematoxilina-eosinaz tindatutako

parafinazko ebakien gainean estereologia erabiliz

kalkulatu zen. Gainera, liseri-guruinen bolumen-

unitate arbitrario bateko zelula-kopuru absolutua

ere estimatu zen. Azkenik, bromodeoxiuridina

(BrdU) immunohistoki-mika erabiliz zelula

proliferatzaileak identifikatu ziren.


Erreaktibo kimikoak





Diseinu esperimentala eta laginen prozesaketa

Arion ater (Linnaeus) lehorreko bareak Iberiar

penintsularen iparraldeko Delikako (42º 58’I, 3º

1’M) gune landatar garbian ekainaren bukaeran

(ar-fasea) hartu ziren. Animaliak laborategira

garraiatu ziren, eta 15 aleko taldeetan mantendu

ziren, aireztapen egokia baimentzeko saretxo

batez estalitako 3 l-ko kutxetan. Kutxak, egunero

dabilur ugariz garbitu ziren, esperimentuak iraun

bitartean.

Elikagairik gabeko moldatze-denbora (7 egun)

igaro ondoren, bareak egunero azenario, sagar,

uraza eta kalabaza zati proportzionalak zituen eta

%1.5 agar uretan zuen "dieta naturalez" elikatu

ziren. Hogei bare, Cd (10 Cd µg/g) eta %30

keroseno-WAF nahasketaz tratatu ziren. WAFa,

900 ml ur distilatu eta 100 ml keroseno gau osoan

20ºC-tan etengabe irabiatzen nahastuz ekoiztu

zen. Kadmioa, agar-disoluzioa prestatzeko erabili

zen uretan kloruro gatz moduan disolbatu zen,

agar-disoluzioa %30 WAF eta %70 ur distilatuan

prestatu zelarik. Horrela janariaren Cd eta

kerosenoaren kontzentrazioak 395.93 µg/g ehun-

pisu lehor eta 415.36 µg/g ehun-pisu lehor izan

ziren, hurrenez hurren. Aldi berean, esposatu

gabeko kontrol seriea ere mantendu zen. 27 egun

ondoren, Cd + keroseno nahasketaz tratatutako

bareak 7 egunez "dieta naturalez" elikatu ziren,

arazte-prozesua ikertzeko asmoz. Tratamenduaren

erreplika-serie bat gehitu genuen, bestearen

baldintza berberetan mantendu zena.

Janaria egunero aldatu zen. Elikatze-jarduera

determinatzeko, emandako janaria eta utzitako

janaria egunero pisatu ziren. Bareak ere egunero

eta taldeka pisatu ziren.

Esperimentuan zehar analisi kimiko eta

biologikoak egiteko hainbat animalia beharrezkoak

zirenez, erabilitakoak erreplika-serieko barez

ordezkatzen ziren animalien dentsitatea konstantea

mantentzeko asmoz. Izan ere, lehorreko

gastropodoen fisiologia populazio-dentsitatearen

arabera esangarriki aldatzen dela deskribatu da

(Runham & Hunter, 1970).

Analisi kimikoak

Disekzionatutako liseri-guruinak (tratamenduko

18. egunean, eta 7 egunetako arazte-aldia eta

gero), ur distilatuan garbitu ziren, eta 120ºC-tara 48

orduz labean berotu ziren, guztiz lehortu arte.

Lehortutako materiala almerizaren laguntzaz txikitu

zen, eta azido nitriko kontzentratuan liseritu zen.

Ondoren, plaka beroan azido nitriko kontzentratua

lurrundu ostean, liseritutako materiala ur distilatuan

diluitutako (0.1 M) azido nitrikoan berresekitu zen.

Laginak absortzio atomikozko espektrofotometroan

(PerkinElmer 2280, Wellesley, Massachusetts,

Amerikako Estatu Batuak) neurtu ziren.

Kadmioaren kontzentrazioak, µg Cd/g ehun pisu

lehor modura kalkulatu ziren. Erabilitako

estandarrak Merck merkatal-etxeak (Merck & Co.,

Inc, Whitehouse Station, New Jersey, Amerikako

Estatu Batuak) zertifikatutakoak izan ziren.

Kerosenoa neurtzeko, disekzionatutako liseri-

guruinak (tratamenduko 18. egunean, eta 7

eguneko arazte-aldia eta gero), ur distilatuan

garbitu ostean izoztu egin ziren. Izoztutako

materiala, liofilizatu, txikitu eta pisatu zen. Ondoren,

azetonan murgilduta ultrasoinuen bidezko

erauzketari ekin zitzaion. Iragazi ondoren laginak

FID detektagailua zuen HP 6890 gas-

kromatografo/masa-espektrometroan (Hewlett-

Packard, Palo Alto, California, Amerikako Estatu

Batuak) neurtu ziren.

Analisi biologikoetarako esperimentuko 0., 3.,

18., eta 27. egunetan eta arazte-aldiko 7. egunean

5 bare disekzionatu ziren taldeko. Liseri-guruinaren

zati txikiak Carnoy fixatzailean (%60 etanol

absolutua, %30 kloroformoa eta %10 azido

azetikoa) fixatu ziren ordu batez 4°C-tan. Fixatu

ondoren, laginak goranzko graduazioko etanolezko

bainu-serie batean deshidratatu ziren, eta parafinan

inkluditu ziren 60°C-tan. 7 µm-ko lodiera zuten

ebakiak mikrotomoan lortu ziren, eta hematoxilina-

eosinaz tindatu ziren behaketa morfologikoak eta

zelula-moten osaketaren neurketak burutu ahal

izateko.

Autometalografia

Parafinazko ebakiak xilolezko bainuetan

desparafinatu ostean, beheranzko graduazioko

etanoletan hidratatu ziren. Parafinazko ebakiak

labean (40ºC) mantendu ziren guztiz lehortu arte.

Laginak argazki-emultsio geruza mehe eta

uniformez estali ziren, gela ilunean (Ilford Nuclear


Gerora, laginak ilunpean mantendu ziren lehortu

bitartean (30 minutu), eta errebelatzaile komertziala

erabiliz Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur

distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt,

Alemania) errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren,

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikozko

disoluzioan minutu batez murgilduz geldiarazi zen.

Azkenik, fixatzaileaz (Agfa Agefix, Agfa-Gevaert

N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) 10 minutuz fixatu

ziren. Laginak, Kaiser gelatina glizerinatuan


170

muntatu ziren. Metal-ioien presentzia, zilarrezko

hauspeakin beltzen agerpenak adierazten du

(Danscher, 1984; Soto et al., 1998).

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan irudi-

analisiaren bitartez


azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto

& Marigómez, 1997), emaitzak BSDen dentsitate

bolumetriko gisa adieraziz (VvBSD). Argi-





eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak





Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 5 bare

erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 25

neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981)

proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da,

BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino

txikiagoa zela kontuan hartuz, Holmes efektua

zuzentzeko faktorea aplikatu zen.

Epitelioaren konposizio zelularraren analisi

estereologikoak

Hematoxilina-eosinaz tindatutako lagin

berberak erabiliz (7 µm), liseri-zelulen (VvDIG),

kaltzio-zelulen (VvCAL) eta iraizte-zelulen (VvEXC)

dentsitate bolumetrikoak kuantifikatzeko prozedura

estereologikoa aplikatu zen. Horretarako lagin

bakoitzean azarez aukeratutako zelai batean egin

ziren kontaketak, guztira talde esperimental

bakoitzeko 5 kontaketa burutuz. Analisi

estereologikoak burutzeko Nikon Optiphot

mikroskopioari atxiki zegoen irudi-hodia erabili zen

(orotariko handipena: x670). VvDIG, VvCAL eta

VvEXC kalkulatzeko Weibel gratikula

(multipurpouse test system M-168; Weibel, 1979)

erabili zen, eta liseri-zelula, iraizte-zelula zein zelula

basofilikotan eroritako puntuak zenbatu ziren,

dentsitate bolumetrikoak Delesse printzipioaren

arabera kalkulatzeko (Weibel, 1979).

Liseri-zelula, kaltzio-zelula eta iraizte-zelulen

estimazio absolutuak dentsitate bolumetrikoen

datuetan oinarrituz burutu ziren. Liseri-, kaltzio- eta

iraizte-zelulek betetzen zuten bolumenak

(VDIG=VvDIG x 17.8 x 106 µm3; VCAL=VvCAL x

17.8 x 106 µm3; VEXC=VvEXC x 17.8 x 106 µm3)

arbitrarioki aukeratutako liseri-guruinaren bolumen

batekiko kalkulatu ziren (17.8 x 106 µm3 gutxi

gorabehera): bolumen hori kalkulu estereologikoak

egiteko erabilitako Weibel gratikularen (356000

µm2) arbitrarioki aukeratutako 50 µm-tako

lodierako ebakidurari dagokio. Lodiera horrek,

kaltzio-zelula handiena guztiz barneratua egotea

ahalbidetzen du.

Ondoren, liseri-guruineko zati arbitrario horretan

liseri-, kaltzio- eta iraizte-zelulen kopurua

kalkulatzeko, zelula-mota guztiek tamaina

konstantea zutela onartu zen. Horrek iraizte- eta

kaltzio-zelulen tamainaren azpiestimazioa ekarriko

zuen, kutsatzaile pean egondako bareetan

behintzat.


171

AOX peroxisomikoaren jarduera

AOX jarduera espektrofotometrikoki

determinatu zen, 502 nm-ko uhin-luzeera erabiliz,

Small et al.-ek (1985) ezarritako metodologia

jarraituz. Bareen liseri-guruinak 4 ml/g ehun pH 7.6

zuen TVBE indargetzailean (1 mM sodio

bikarbonatoa, 1 mM EDTA, %0.1 etanola eta %0.01

Triton X-100) teflonezko homegenizatzailea erabiliz

izotzezko bainuan homogenizatu ziren. Lagin

homogenizatuak 500 g-tara zentrifugatu ziren 15

minutuz 4ºC-tan eta, ondoren, AOX jarduera

neurtzeko, gainjalkina TVBE indargetzailean 10

aldiz diluitu zen. Saiakerak, 30 µM palmitoil-CoA

oxidasa substratu gisa erabiliz, peroxidasa

endogenoak katalizatutako diklorofluoreszeina

diazetatoaren (Molecular probes, Eugene, Oregon,

Amerikako Estatu Batuak) H2O2 menpeko

oxidazioa du oinarri. Orotariko proteina-

kontzentrazioa Lowry et al.-ek (1951) garatutako

metodoan oinarritutako DC protein assay (BioRad,

Hercules, California, Amerikako Estatu Batuak)

erabiliz kalkulatu zen, estandar gisa γ-globulina

erabiliz.


Liseri-guruineko zelula proliferatzaileak BrdU

immunohistokimika bidez lokalizatzeko, 27.

esposizio-eguneko eta arazte-aldi osteko bareei

3.5 mg BrdU injektatu zitzaien oinean zehar.

Carnoy-z fixatutako eta parafinan inkluditutako

ebakiak (3-4 µm-ko lodiera) American Optical

mikrotomoan lortu ziren, eta aldez aurretik (3-amino

propil trietoxisilanoz) silanizatutako

portaobjektuetan jaso ziren. Ondoren, laginak

xilenoz desparafinatu ziren, beheranzko

graduazioko etanolezko bainu-seriean hidratatu eta

fosfato indargetzaile salinoz (PBS; ingeleraz,

Phosphate-Buffered Saline) garbitu ziren. DNA, 0.1

N HCl-ez desnaturalizatu zen ordu batez, 37°C-tan.

Ebakiak, %5 bovine serum albumine (BSA) zuen

suero blokeatzailean ordu batez inkubatu ziren giro-

tenperaturan eta berriro ere PBS-z garbitu ziren.

Gero, ebakiak BrdUren aurkako antigorputz

espezifikoan (Roche, Basilea, Suitza); %0.1 BSA

zuen PBSan 1:10 diluitua) inkubatu ziren. Laginak

PBS-z garbitu ziren, eta ondoren, abidina-biotina

entzima-konplexua erabiliz antigorputza ikustarazi

zen. Laburki, ebakiak, PBS-an diluitutako saguaren

aurkako ahuntzaren IgG antigorputz sekundario

biotinilatuan inkubatu ziren, 30 minutuz, eta

ondoren PBSn garbitu ziren. Fosfatasa alkalinoa

jarduera ikustarazteko kromogenoaren disoluzioa

(naftol fast-red zuen PBS indargetzailean

disolbatua) erabili zen. Azkenik, ebakiak Mayer

hematoxilinaz kontrastatu (1 minutu), dabiluretan

garbitu eta Kaiser gelatina glizerinatuan (Merck &

Co., Inc, Whitehouse Station, New Jersey,

Amerikako Estatu Batuak) muntatu ziren.

Mikrografiak, Olympus BX50 (Olympus, Tokio,

Japonia) mikroskopioari atxiki zegoen Olympus

PM20 argazki-kameraz erdietsi ziren.

EMAITZAK

Bare kontrolek elikatze-jarduera konstantea

erakutsi zuten esperimentuak iraun bitartean (1B

Ird.). Maneiu esperimentalak eta laborategiko

baldintzek jaitsiera txikia eragin zuten bareen


172

pisuan (1A Ird.). Esperimentuko lehengo sei

egunetan bare kontrolek zein kutsatzaileen pean

jarritako bareek antzeko elikatze-jarduera eta

hazkuntza erakutsi zuten (1. Ird.). 10. egunetik

aurrera, berriz, kutsatzaile pean jarritako bareetan

elikatze-jardueran jaitsiera nabarmena behatu zen,

eta momentu horretatik aurrera beraien pisua

kontrolena baino txikiago gertatu zen. Arazte-aldia

igaro eta gero, elikatze-jardueran nolabaiteko

susperraldia antzeman zen arren, ez zen bareen

pisuaren igoeran islatu. Hala ere, momentu

horretaraino neurtutako etengabeko pisu-galerak

ez zuen luzaroago jarraitu (1. Ird.).

Bare kontroletan neurtutako Cd kontzentrazioak

baxuak izan ziren, zelaitik hartutako bareetan

neurtutakoen antzekoak, eta aldaketarik gabe

mantendu ziren esperimentuak iraun bitartean.

Bestalde, kutsatzaileen pean jarritako bareetan Cd

kontzentrazioa kontroletan neurtutakoak baino 10

aldiz handiagoak izan ziren esperimentuaren 18.

egunean, eta arazte-aldia bukatu ondoren balioak

kontroletan neurtutako mailetara itzuli ziren (1.

Taula).

Keroseno kontzentrazio tisularrei dagokienez,

kutsatzaileen pean 18 egunez jarritako bareetan

neurtutako kontzentrazioa kontroletan baino 3 aldiz

handiagoa izan zen esperimentuaren. Arazte-aldia

bukatu ondoren, bere aldetik, liseri-guruinaren

keroseno kontzentrazioak kontroletan neurtutako

mailetara itzuli ziren (1. Taula).

Kutsatzaile pean jarritako bareetan, BSDak

liseri-zelulen lisosometan eta iraizte-zelulen

bakuoloetan lokalizatu ziren (2B Ird.). Gainera,

liseri-azinoen lumenera iraizitako eta jatorri

lisosomiko zuten liseri-zelulen hondakinek BSD

nabarmenak erakutsi zituzten (2C Ird.). Horretaz

gain, zenbait laginetan liseri-epitelioaren xafla

basalean BSDen presentzia detektatu zen. Kontrol

eta araztutako bareen liseri-guruinetan ez zen

apenas BSDen presentziarik aurkitu (2A eta 2D

Ird.). Horrekin lotuta, bare kontrolek VvBSD maila

basalak erakutsi zituzten. Tratamendu pean

jarritako bareetan, VvBSD maila denbora aurrera


173

1. Irudia: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean mantendutako bareen pisuaren aldaketa (A) eta elikatze-jarduera metatua (B).Puntu zuriak bare kontrolei dagozkie eta puntu beltzak kutsatzaileen nahasketaz tratatutako bareei. Beheko geziak esposizio- etaarazte-aldiaren nondik norakoak adierazi ditu.

joan heinean handitu zen (3. Ird.), 18 eta 27.

egunetan bereziki agerian gelditu zena. Araztearen

7 egunak igaro eta gero, VvBSD balioak kontrolen

mailetara itzuli ziren (3. Ird.).


174

Cd Kontzentrazioa 18. Eguna Arazte-aldia

Kontrola 102.84±78.16 94.36±36.6

Cd + keroseno 904.672±548.847 168.256±25.6

Keroseno Kontzentrazioa 18. Eguna Arazte-aldia

Kontrola 136.64±36.89 114.24±41.25

Cd + keroseno 415.32±170.14 163.25±52.13

1. Taula: Bare kontrol eta Cd + keroseno pean jarritako bareen liseri-guruinetan neurtutako Cd eta kerosenoaren adierazgarriakdiren hidrokarburoen gehiketaren kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor) esperimentuko 18. egunean eta arazte-aldia bukatuondoren.

2. Irudia: Metalen lokalizazio autometalografikoa Arion ater barearen liseri-epitelioan: bare kontroletan (A), Cd + keroseno pean 18egun egondako bareetan (B), Cd + keroseno pean 27 egun egondako bareetan (C eta irudi txikia), eta 7 eguneko arazte-aldia jasozuten bareetan (D). L, liseri-epitelioaren lumena; gezi-buruak, liseri-zelulen lisosometan dauden zilarrezko hauspeakin beltzak,geziak, liseri-epitelioko lumenean dagoen metala. Eskala-marra: 25 µm.

Peroxisomen proliferazioaren adierazle gisa

neurtutako azil-KoA oxidasa (AOX) jarduera Cd +

keroseno nahasketa pean induzitu zen 3. egunean

(4. Ird.). Gerora, AOX jarduera esangarriki jaitsi zen,

kontrol zein esposatutako bareetan, eta ez zen

aurkitu taldeen arteko desberdintasun esangarririk

(4. Ird.).

Bare kontrolen liseri-guruina nagusiki liseri-

zelulez osaturik agertu zen, eta iraizte- zein kaltzio-

zelula urriak taldekaturik agertu ziren (5A Ird.). 18

(5B Ird.) eta 27 (5C Ird.) egunez Cd + keroseno

nahasketaz tratatu ondoren, iraizte-zelulen kopurua

esposizio-denborarekin emendatu zela bistakoa

zen. Modu berean, kaltzio-zelulak ere

nabarmenagoak suertatu ziren, eta gainera itxuraz

hipetrofiaturik ageri ziren,(5B Ird. eta 5C irudi txikia).

Kutsatzaileen peko esposizioaren ondorio gisa,

odol-hodiak erlatiboki ugaritu ziren, eta euren

paretetako Leydig zelulak puztuta agertu ziren.

Zazpi eguneko arazte-aldiaren ondorioz, liseri-

guruinaren epitelioak kontrolen itxura berreskuratu

zuen (5D Ird.), liseri-zelula ugari eta iraizte-zelula

urriez eratuta egonik; kaltzio-zelulek oraindik ere

nolabaiteko hipertrofia erakusten jarraitu zuten

arren.

Aurrekoarekin bat, VvCAL, VvEXC eta VvDIGparametroek, Cd + keroseno nahasketa pean

jartzeak eta ondorengo arazte-aldiak bareen liseri-

guruinaren zelula-moten osaketan aldaketa

esangarriak eragin zituztela adierazi zuten (6. Ird.).

Bare kontroletan VvDC balioek ez zuten aldaketarik

erakutsi, eta modu iraunkorrean 0.8 baliotik gora

mantendu ziren. Kutsatzaileen pean jarritako

bareetan, berriz, parametro horretan jaitsiera

esangarria aurkitu zen esperimentuko 3. egunetik

aurrera, hortik aurrera antzeko balioak (inoiz ez 0.7

baliotik behera) lortu zirelarik. Araztearen ondorioz,

VvDC balioen igoera esangarria behatu zen, bare

kontrolen antzeko balioak eskuratuz (6A Ird.).

Liseri-zelulen batezbesteko tamaina (8 µm-ko

diametro eta 50 µm altuera) kontuan hartuz, gutxi

gorabehera liseri-guruineko 17.8 x 106 µm3 zati

batean (kalkulu estereologikoak burutzeko erabili

den Weibel gratikularen kaltzio-zelula handiena

barneratzea ahalbidetzen duen 50 µm-ko lodiera

arbitrarioaren ebakidurari dagokiona), liseri-zelulen

kopurua 4275±487 (3. eguna) eta 4797±111 (27.

eguna) bitartekoa izan zen bare kontroletan; eta

kutsatzaile pean jarritako bareetan, ordea,

3736±647 baliora jaitsi zen (21. eguna). Zazpi

eguneko arazte-aldiaren ondoren, liseri-zelulen

kopurua 5344 baliora igo zen (6B Ird.). VvEXC eta

iraizte-zelulen kopuruan aldaketa deigarriagoak

antzeman ziren (6C eta 6D Ird.). VvEXC 3. egunetik

aurrera hiru aldiz handiagoa izan zen kutsatzaile

pean jarritako bareetan kontroletan baino, arazte-


175

3. Irudia: .Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd + keroseno peanmantendutako (zutabe grisa) bareen lisosometan neurtutakozilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate bolumetrikoa(VvBSD). Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi

dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasunesangarriak adierazi dituzte (p<0.05). Kutsatzaile peanmantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarrazegoenez, ez dago desbidazio estandarrik.

aldiaren ondoren balioak berriro ere bare kontrolen

mailetara itzuli zirelarik (6C Ird.). Horrela, iraizte-

zelulen kopurua 243-tik 748-ra emendatu zen,

arazte-aldiaren ondoren 224-ra bueltatu zen

bitartean. Bestalde, VvCAL balioei dagokienez, ez

zen desberdintasun esangarririk behatu (6E eta 6F

Ird.). Orotara, epitelio-zelulen kopurua ez zen

desberdina izan ez esposizio ezta arazte-aldiaren

ondorioz ere (6G Ird.).


BrdU-positiboak ziren bareen liseri-guruineko

zelulen nukleoek kolore gorria erakutsi zuten (7.

Ird.). Liseri-epitelioan batez ere liseri-zelulak

positiboki markaturik aurkitu ziren, eta nahiz eta

iraizte-zelulen lipofuszinen materialak

erreakzionagarritasuna erakutsi, errez bereiz

zitekeen nukleo positibo eta sasipositibotasunaren

artean (7G Ird.). Urdailaren epitelioan ere nukleo

BrdU-positiboak behatu ziren (7E Ird.). Cd +

keroseno nahasketa pean jarritako bareetan, eta

baita arazte-prozesua pairatu zutenetan ere, talde

kontroletan baino nukleo BrdU-positibo gehiago

aurkitu ziren. (7B-D eta F Ird.). BrdU aurkako

antigorputzik gabe inkubatutako tindaketaren ebaki

kontroletan ez zen inolako positibotasunik topatu.

EZTABAIDA

Ikerlan honetako emaitzek, Cd + keroseno

nahasketaz tratatzeak bareen liseri-guruinean

zelula-moten osaketan aldaketak sortarazten

dituela erakutsi dute, aldaketa horiek liseri-zelulen

proportzioa gutxiagotzea eta iraizte-zelulena

handiagotzearekin zerikusia izanik. Gainera,

erantzuna 7 egunetan guztiz itzulgarria dela frogatu

egin da, ikerlan honetako baldintza

esperimentaletan behintzat.

Cd + keroseno pean jarritako bareek, metala eta

kerosenoa metatu zituzten euren ehunetan, liseri-

guruinaren AAS eta GC/MS bitaeteko analisiek

erakutsi zutenez. Lehorreko gastropodoen liseri-

guruineko kutsatzaileen kontzentrazioa

ingurumeneko esposizio-mailekin esangarriki

erlazionatuta dagoena jakina da (Popham &

D'Auria, 1980; Ireland, 1981; Marigómez et al.,

1998a; Beeby & Richmond, 2002; Hamers et al.,

2004). Beraz, esperimentalki trataturiko bareen

liseri-guruinean aurkitutako Cd eta keroseno

kontzentrazioen gorakada esangarriek, aplikatutako

kutsatzailearen esposizio-modua eraginkorra izan

zela egiaztatu zuten. Antzeko esposizio-modua

beste metal toxikoen kasuan aplikatu da aldez

aurretik (Marigómez et al., 1986a; Recio et al.,

1988a; 1988b; Marigómez et al., 1996), baina

kerosenoaren kasuan (WAFa lortzea eta dieta


176

4. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta Cd +keroseno peanmantendutako (zutabe grisa) bareen liseri-guruineanneurtutako AOX jarduera. Segmentu bertikalek desbidazioestandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoak taldeen artekodesberdintasun esangarria adierazi ditu (p<0.05). Kutsatzailepean mantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarrazegoenez, ez dago desbidazio estandarrik.

naturalean gehitzea) zeharo hurbilketa berria izan

zen.

Esposizio-biomarkatzaileek ere, kimika

analitikoaren datuak baieztatu zituzten. Cd +

keroseno nahasketaz tratatutako bareen liseri-

zeluletako lisosometan VvBSD esangarriki igo

izana, metal-esposizioaren adierazle moduan har

dezakegu. Era berean, Hg pean egoteak, liseri-

zeluletako lisosometan BSDen presentzia

areagotua dakar (Marigómez et al., 1996). Metalen

metaketa, moluskuen liseri-guruinean oso erantzun

azkarra dena jakina da; izan ere, Cd pean

mantendutako muskuiluetan egun bakar batean

VvBSD balioak esangarriki goratu ziren (Soto et al.,

2002; 1. Kapitulua). Ikerlan honetan, VvBSD

parametroan behatutako aldaketak, denbora eta

dosiaren menpekoak dira. Hortaz, kerosenoaren

presentziak bareen liseri-guruinean Cd-aren

metaketa oztopatu ez zuela ondoriozta daiteke.

Halaber, Cd + bezo(a)pireno (BaP) pean jarritako

muskuiluetan, kutsatzaile organikoaren presentziak

ez zuen Cd-aren metaketa oztopatu liseri-

guruinean (Marigómez et al., 2005; 1. Kapitulua).

Bestalde, keroseno eta Cd nahasketa pean

jarritako bareetan, azil-KoA oxidasa (AOX) jarduera

bare kontroletan baino altuagoa izan zen

esperimentuko 3. egunean, bareak kutsatzaile

organikoen pean (kasu honetan kerosenoa) egon

izanaren seinale (Cancio & Cajaraville, 2000). AOX

jarduera estabulazio denborarekin jaitsi zen,


177

5. Irudia: Arion ater barearen liseri-guruinaren ebakiak, hematoxilina-eosinaz tindatuak: bare kontrolak (A); Cd + keroseno pean18 egunez mantendutako bareak (B); Cd + keroseno pean 27 egunez mantendutako bareak (C eta irudi txikia); eta 7 egunekoarazte-aldia jaso duten bareak (D). Asteriskoak, iraizte-zelulak; geziak, kaltzio-zelulak; gezi-buruak, askatzen ari diren kaltzio-zelulak; L, liseri-azinoen lumena. Eskala-marra: 50 µm (A,-D); 25 µm (irudi txikia).


178

kutsatzaile pean egondako bare zein bare

kontroletan antzeko jarduerak neurtu zirelarik

esperimentuko 3. egunetik aurrera. Optimoak ez

diren elikatze- eta mantenu-egoera esperimental

luze hauetank, AOX jarduera induzitu ez izana ez

da harrigarria. Dakigunaren arabera, peroxisomen

proliferazioaren adierazlea den AOX jarduera

(Cajaraville et al., 2003) honako honetan erabili da

lehenendo aldiz lehorreko gastropodoetan

kutsatzaile organikoen esposizio-biomarkatzaile

gisa. Bibalbioen AOX jardueran, indibiduoen

elikadura-egoerak, maneiu-esperimentalak eta

6. Irudia: Bare kontrol (zutabe zuria) eta kutsatzaile peanmantendutako (zutabe grisa) bareen zelula-moten osaketarenaldaketak. (A) Liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (B) Liseri-zelulen kopurua. (C) Iraizte-zelulen dentsitate bolumetrikoa. (D)Iraizte-zelulen kopurua. (E) Kaltzio-zelulen dentsitatebolumetrikoa. (F) Kaltzio-zelulen kopurua. (G) Zelulen kopurutotala. Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazidituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasunesangarriak adierazi dituzte (p<0.05). Kutsatzaile peanmantendutako bareen arazte-aldian animalia bakarrazegoenez, ez dago desbidazio estandarrik.

ugalketa-zikloak eragina izan dezakete (Cancio et

al., 1999; Cancio & Cajaraville, 2000; Orbea et al.,

2002). Bareetan, ugal-garapenaren aldaketak aste

gutxiren buruan gerta daitezke (Marigómez et al.,

1986; Zubiaga, 1986) eta beraz, uztailan zehar,

feminizazioaren aurretik, non gameto arrak ia guztiz

garatuak dauden, AOX jardueran aldaketak

gertatzea ezin daiteke baztertu. Ikerlan honetan

gertatu den bezala, Cd eta BaP nahasketaren pean

mantendutako muskuiluetan, AOX jarduera soilik

esposizio-egun baten ondoren erantzuteko gai izan

zen, momentu horretatik aurrera, AOX jarduerak

baxuak izan ziren, muskuilu tratatui eta muskuilu

kontrolen artean berdintsuak izan zirelarik (Orbea et


179

7. Irudia: Arion ater barearen liseri-azinoen epitelioan eta urdaileko-epitelioan egindako BrdU immunohistokimika: Bare kontrola(A); Cd + keroseno pean 27 egunez egondako barea (B); 7 eguneko arazte-aldia jaso duten bareak (C-G). Gezi-buruak, nukleoBrdU-positiboak; zirkuluak, lipofuszinek sortutako marka sasipositiboak. Eskala-marra: 50 µm (A-E); 25 µm (F & G).

al., 2002). Era berean, BaP pean jarritako bareetan,

kutsatzaile kimikoen esposizio-biomarkatzaile gisa

erabilitako benzo(a)pireno hidroxilasa (BPH)

jarduera, soilik esperimentuko 3. egunean induzitu

zen, baina ez esposizio-denbora luzeagoetan

(Hamers et al., 2004). Halaber, BaP pean jarritako

muskuiluetan, esposizio osteko egun gutxitara

bakarrik induzitzen da BHP jarduera (Okay et al.,

2000). Beraz, nahiz eta esposizioaren 3. egunetik

aurrera erregistratutako AOX jarduera baxua izan,

AOXren indukzio azkarrak, ikerlan honetan

erabilitako kerosenoaren esposizio-modua

eraginkorra izan zela argiro erakutsi du.

Elikatze-jarduera eta hazkuntza, neurri osagarri

gisa erregistratu ziren esperimentuan zehar. Bare

zein barraskiloetan, kutsatzaile pean egoteak

elikatze-jardueran eta hazkuntzan beherakada

esangarriak sor ditzake (Russell et al., 1981;

Marigómez et al., 1986b; Laskowski & Hopkin,

1996; Swaileh & Ezzughayyar, 2000; 5. Kapitulua).

Hortaz, metalez (Cu, Zn eta Cd) kutsatutako

tokietatik hartutako bareek, kutsatugabeko tokietan

hartutako bareekin alderatuz, gorputz osoaren eta

liseri-guruinaren pisu lehorrean %50-eko

murrizketa erakutsi zuten (Marigómez et al.,

1998a). Efektu horri dagokionez, eragite-maila

metalez-metal alda daitekeela esan baharra dago.

Helix aspersa barraskiloan behatutakoaren

arabera, Cd-a, Zn-a eta Pb-a baino toxikoagoa da

elikatze-jarduera, hazkuntza eta heriotza-tasari

dagokienez (Laskowski & Hopkin, 1996).

Kutsatzaile organikoek ere, elikatze-jarduera zein

hazkuntzaren gainean eragina dute, laborategian

BaP pean jarritako bareek erakutsi zutenez

(Hamers et al., 2004). BaP pean jarritako bareetan,

elikatze-jarduera modu azkarrean txikiagotu zen,

baina gorputzaren pisuan aldaketak soilik

hirugarren egunetik aurrera gertatu ziren (Hamers

et al., 2004). Modu berean, ikerlan honetan Cd +

keroseno pean jarritako bareetan, elikatze-jarduera

aste batetik aurrera txikiagotu zen, hazkuntzaren

murrizpena bakarrik 3. astetik aurrera ikusgarria

izan zen bitartean.

Metal pean jarritako lehorreko gastropodoen

liseri-guruinaren xafla basalak loditu egiten dira,

liseri-zelulak lehendabizi bakuolizatuak ageri eta

beranduago urriagoak bilakatzen dira, kaltzio-

zelulak hipertrofiatu egiten dira, kaltzio-zelulak eta

iraizte-zelulak erlatiboki ugariagoak bilakatzen dira,

eta odol-zelulak eta ehun konektiboko zelula

migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatzen dira

(Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a;

Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez;

1992, Chabikovsky et al., 2004; Snyman et al.,

2005; 6. Kapitulua). Oro har, Cd + keroseno pean

jarritako bareetan irudi beretsua ikusi da,

erantzuna, beraz, orokorra dela dirudi, eta ez metal-

kutsaduraren espezifikoa. Horrela, emaitza horiek,

behatutako aldaketak kutsatzaile espezifiko batek

sorterazitako erantzunak baino gehiago, estres-

egoera orokorraren aurrean gauzatutako

erantzunak direla konfirmatu dute, aldez aurretik

Marigómez et al.-ek, (1996) proposatu bezala. Hala

ere, kutsatzaile organikoek beraien kabuz efektu

berdinak, modu kualitatiboan behintzat, sortarazten

ote dituzten zehazteko ikerlan gehiagoren beharra

dago.


180

Efektu horien artean, deigarrienak liseri-

guruinaren epitelioan behatutako zelula-moten

osaketari dagozkionak dira. Aldez aurretik

laborategian egindako ikerlanek agerian utzi

dutenez, moluskuen liseri-guruinean zelula-moten

osaketan aldaketa esangarriak 3 eta 21 egun

bitartean, espeziearen, kutsatzaile, dosi eta

esposizio-moduaren arabera eta baita ingurumen-

egoeraren arabera, gerta daitezke (Marigómez et

al., 1996; 1 eta 4. Kapituluak). Ikerlan honetan

erabilitako esposizio-modu bera erabiliz, Cu eta Hg-

z tratatutako bareetan, liseri-epitelioa osatzen duten

zelula-moten proportzio erlatiboan aldaketak

behatu dira, iraizpen-jarduera eta estrusio apokrino

areagotuen ondorioz (Marigómez et al., 1986b;

1996). 1000 µg Hg/g janari dosiaz 27-30 egunez

elikatutako bareetan, liseri-zelulen kopurua izugarri

jaitsi zen, liseri-epitelioa funtsean kaltzio-zelulez eta

iraizte-zelulez osaturik geratuz (Marigómez et al.,

1996). Cd kontzentrazio subletalen pean

mantendutako magurioetan antzeko prozesua

deskribatu da (Marigómez et al., 1990). Ikerlan

honetan, VvDIG eta VvEXC modu esangarrian

aldatu ziren, Cd + keroseno esposizio zein 7

eguneko arazte-aldiaren eraginez. VvCAL balioak,

ordea, ez ziren esangarriki aldatu. Horrela, Cd +

kerosenoz tratatutako bareetan, VvDIGesperimentuko hirugarren egunetik aurrera jaitsi

zen, eta 7 eguneko arazte-aldiaren ondoren berriro

ere bare kontroletan neurtutako balioetara itzuli

zen. VvEXC balioen aldaketak nabarmenagoak

izan ziren, 3. tratamendu-egunetik aurrera

tratatutako bareetan, kontroletan baino hiru aldiz

handiagoak izatera iritsiz baina, VvDIG-ren kasuan

bezalaxe, arazte-aldiaren ondoren kontrol-mailetara

itzuli ziren. VvCAL balioei dagokienez, ez dirudi

tratamenduak kaltzio-zelulen proportzioaren gain

eragin esangarria izan zuenik. Aitzitik, Cu, Hg eta

metaleen nahasketan (Cu, Cd, Zn) peko

esposizioek kaltzio-zelulen dentsitate erlatiboaren

emendioa eragiten dutela deskribatu da

(Marigómez et al., 1986b; 1996; 1998). Ikerlan

honetan, VvCAL modu esangarrian aldatu ez zen

arren, itxurazko kaltzio-zelulen presentzia

erlatiboaren igoera susma zitekeen, mikroskopioan

egindako behaketa zuzenak kontuan hartuz,

behintzat. Horrekin bat, Cd + kerosenoz tratatutako

VvCAL balioen igoerako joera ageri zen,

estatistikoki esangarria izan ez arren. Edozein

kasutan, kaltzio-zelulen proportzioan behatutako

igoerak iraizte-zeluletan behatutakoen aurrean

garrantzi gutxikoak izango ziren, beste

moluskuetan ez bezala (Cajaraville et al., 1990a;

Marigómez et al., 1990; 1998b; 2005; Soto et al.,

2002; 1 eta 4. Kapituluak).

Liseri-zelulen batezbesteko tamaina kontuan

hartuta, beraien kopurua (DCN) 17.8 x 106 µm3-ko

liseri-guruineko ehun-zati arbitrario batetarako

(bolumen unitate arbitrarioa) kalkulatu zen. Bare

kontroletan, DCN ez zen esangarriki aldatu

esperimentuak iraun bitartean, batezbesteko balioa

unitate arbitrario horretan 4500 zelula baino apur

bat altuagoa izanik. Cd + keroseno tratamenduaren

eraginez, 750 (%17) liseri-zelula inguru galdu ziren,

7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz unitate

arbitrario bakoitzeko 1500 liseri-zelula berri agertuz.

Era berean, Cd pean jarritako magurioetan 1850

(%13) liseri-zelula galdu ziren, 7 eguneko arazte-


181

aldiaren ondorioz 2600 liseri-zelula berri sortu

zirelarik 17.8 x 106 µm3-ko liseri-guruineko unitate

arbitrarioko (4. Kapitulua). Cd pean jarritako

magurioetan, VvBAS eta zelula basofilikoen

bolumen absolutua handitu zen, baina ez zen

aldaketarik behatu zelula basofilikoen kopuruan (4.

Kapitulua), ikerlan honetan Cd + keroseno pean

jarritako bareetan behatutako emaitzekin bat

datorrena. Bestalde, Cd + keroseno pean 27

egunez mantendutako bareetan 500 (%300) iraizte-

zelula berri agertu ziren bolumen unitate

arbitrarioko, 7 eguneko arazte-aldiaren ondorioz

galdu zirenak, hain zuzen. Aipagarria da, muskuilu

eta magurioetan gertatu ez bezala, epitelio-zelulen

kopuru totala kutsatzaileen zein arazte-aldiaren

eraginez ez zela aldatu. Iraizte-zelula, zelula-mota

desberdina baino bizi-zikloaren amaieran dagoen

liseri-zelula dela proposatu da (Porcel et al., 1996;

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Liseri- eta

iraizte-zelulen proportzio erlatiboek kontrako

zentzuan mugitzen dira baraualdian eta

kutsatzaileen esposizio pean (Porcel et al. 1996;

Marigómez et al. 1998; Dimitriadis & Konstantinidou

2002; 6. Kapitulua). Testuinguru horretan, ikerlan

honen emaitzek, iraizte-zelulak liseri-zelula “zahar”

edo “erabiliak” direnaren hipotesia sendotzen dute,

liseri-zelulen eta iraizte-zelulen kopuru absolutuek,

tratamendu eta arazte-aldiaren eraginez kontrako

zentzua jarraitzen baitute. Metalek, bareen liseri-

guruineko zelulen zahartzapen goiztiarra eragin

dezaketela aurretik ere proposatu da (Marigómez et

al., 1986b), Cu pean (dietan zein uretango

esposizioa) jarritako bareak aztertuz, hain zuzen

ere. Orokorki, lehorreko gastropodoen liseri-

guruinean ematen diren iraizte-jarduera eta estrusio

apokrino areagotuek, alterazio lisosomikoek eta

lipofuszinen metaketek, kutsatzaileen eragin

orokorren adierazgarritzat har ditzakegu

(Marigómez et al., 1996; 1998; Chandran et al.,

2005). Kuprez trataturiko bareetan, jarduera

fisiologikoaren fase desberdinak histokimikoki

determinatu ondoren, xurgapena, liseriketa eta

jariapena tratamenduko lehenengo egunetan

bizkortu ziren, fase bakoitzak gutxiago irauten

zuelarik; 300 eta 1000 µg Hg/g janari tratatutako

bareetan 15. egunetik aurrera, berriz, epitelioa

atrofiko edo, behintzat, ez horren aktibo bilakatu

zen (Marigómez et al., 1986b). Hiperaktibitate

horrek, zergaitik Cd + keroseno tratamenduaren 3.

egunetik aurrera liseri-zelula gehiago iraizte-zelula

bilakatzen joatea azalduko luke. Ondorioz, nahiz

eta magurioetan kutsatzaileek liseri-zelulen galera

netoa sortarazi, konplexuagoa den bareen liseri-

guruinean badirudi liseri-zelulak, galdu beharrean,

iraizte-zelulak bilakatzen direla. Hortaz, bareen

liseri-guruinean zelula-moten osaketan aldaketak

nabarmenago irudikatzeko, iraizte-zelula/liseri-

zelula ratioa (ECR; ingeleraz, Excretory to Digestive

Cell Ratio) parametro sentikorrago gisa proposatu

dugu, soilik liseri-zelula eta zelula basofilikoz

osatutako magurioen liseri-guruinean

proposatutako DCL parametroaren baliokidetzat

har genezakeena (4. Kapitulua).

Azkenik, zelula proliferatzaileak BrdU

immunohistokimika bitartez identifikatu ziren liseri-

guruineko epitelioan. Hainbat saiakera burutu

ondoren, fosfatasa alkalinoa (AlP; Chabicovsky et

al., 2003) aukeratu zen BrdU/anti-BrdU konplexuak


182

ikustarazteko, aldez aurretik magurio eta

muskuiluetan erabilitako diamino benzidinak

bareen liseri-guruinean pikor zitoplasmatiko eta

lipofuszina ugariekin erreakzionatzen baitzuen

(Zaldibar et al., 2004; 3 eta 4. Kapituluak). Hala ere,

iraizte-zelulen bakuoloen lipofuszinen zenbait

substantzia AlPrekin erreakzionagarriak badira.

Edonola ere, lipofuszina sasipositibook, liseri-

guruin eta urdaileko epitelioan behatutako nukleo

BrdU-positiboetatik zailtasun handirik gabe bereiztu

genituen. Muskuilu eta magurioetan gertatu zen

moduan, bareen kasuan ere, urdaileko epitelioan

liseri-guruineko epitelioan baino BrdU-markaketa

nabariagoa topatu dugu (Zaldibar et al., 2004; 4.

Kapitulua). Liseri-guruineko epitelioan, BrdU-

markaketa batez ere liseri-zeluletan behatu zen,

kaltzio-zelula urrietan markaketa ahula behatu zen

bitartean. Iraizte-zelulen nukleoan ez zen BrdU-

markaketa positiborik aurkitu. Hala ere,

bakuoloetako lipofuszinen markaketek nukleo

BrdU-positiboak itzal zitzaketeenez, iraizte-zelulak

proliferatzeko gai direnentz egiaztatzeko, behaketa

zehatzagoak egitea ezinbestekoa izango litzateke.

Edonola ere, Cd + keroseno tratamenduak eta

ondorengo arazte-aldiak, bareen liseri-zelulen

proliferazio-intentsitatearen areagotzea eragin dute,

ikusi dugunez. Izan ere, tratatutako zein araztutatko

bareetan nukleo BrdU-positibo gehiago daude talde

kontroleko bareetan baino. Era berean,

magurioetan, Cd-ak liseri-zelulen proliferazioa

areagotu zuen, eta proliferazio-tasa altu hori 7

eguneko arazte-aldiaren ondoren ere antzeko

mailan mantendu zen (4. Kapitulua).

Kutsatzaileek zelulen proliferazioa eragin

dezaketena jakina da (Beyersmann & Hechtenberg,

1997; Habeebu et al., 1998; Piechotta et al., 1999;

Chabicovsky et al., 2004). Magurioetan, Cd pean

egoteak, arazte-prozesuei aurre egin ahal izateko,

areagotutako liseri-zelulen berriztapena dakar,

zelulen heriotza eta proliferazioaren arteko balantze

gisa interpreta daitekeena (4. Kapitulua). Bareetan,

areagotutako liseri-zelulen proliferazioa iraizte-

zelula faseranzko progresio areagotuarekin batera

gertatu zela dirudi. Zentzu horretan, Cu-meatze

abandonatu batean hainbat belaunaldiz (kutsadura

kronikoa) bizi izan diren bareen liseri-guruinean,

iraizte-zelulen kopuru erlatibo altuaren berri eman

da; non liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen

iraizpenean bortizki baitziharduten eta oso

bakuolizaturik ageri baitziren (Marigómez et al.,

1998a).

Aldez aurretik metal pean jarritako magurio eta

muskuiluetan deskribatu den moduan (1 eta 4.

Kapituluak), Cd + keroseno nahasturaz trataturiko

bareetan suertatutako zelula-moten osaketaren

aldaketak ere, 7 eguneko arazte-aldiaren ostean

itzulgarriak izan ziren. Liseri-zelulen proliferazioa

tratatu eta araztutako bareen artean desberdina ez

dela dirudienez, behatutako leheneratzea liseri-

zeluletatik iraizte-zeluletaranzko progresioa

moteltzean datzala pentsa genezake, eta hori

epitelio-jarduera kutzatsailea ez egotean moteldu

izanarekin bat letorke (Marigómez et al., 1986b;

1998a; Chandran et al., 2005; 4. Kapitulua). Beraz,

ingurumen-baldintz jakin bakoitzari zelula-moten

osaketa bereizgarri bat eslei lekioke.


183

Liseri-zelulen kopuru erlatiboaren murrizpen eta

kaltzio-zelulen, eta batez ere, iraizte-zelulen kopuru

erlatiboaren emendioaren berri, metalez

kutsatutako ingurunetan bizitako lehorreko bareen

liseri-guruinean ere eman da (Marigómez et al.

1998a). Ikerlan honek, zelula-moten osaketaren

aldaketok itzulgarriak direla erakutsi du,

laborategiko baldintzetan behintzat. Dena den,

ingurumen naturaletan animaliak beren bizitza

osoan zehar metal pean kronikoki egon daitezke,

eta beren erantzunak deskribatutakoen antzekoak

liratekeenentz argitu beharrean gaude oraindik ere

(Wang & Rainbow, 2005), hurrengo kapituluan

jorratuko denez.

Azkenik, zelula-moten osaketan metal-

esposizioak eragindako aldaketek, BSD-hedapena

gisako esposizio-biomarkatzaileen gainean eragina

izan ditzaketeenaren berri eman da muskuiluen

kasuan (Soto et al., 2002; 1. Kapitulua). Aitzitik, ez

dirudi Cd + keroseno esposizio eta ondoko arazte-

aldian zehar bareetan suertatutako aldaketek, BSD-

hedapena parametroaren gainean eragina izan

zutenik, VvBSD aldaketak dosi eta denboraren

menpekoak baitziren. Arrazoia, magurioetan

gertatzen den moduan, bareen liseri-guruinaren

epitelioko ezaugarri berezietan datza, non

lisosomen barneko metalen neurketa

mikroskopikoak liseri-zelulen gainean zuzenean

egin baitaitezken (4. Kapitulua), liseri-zelula

kopurua basala izanik ere.

BIBLIOGRAFIA

Beeby A, Richmond L (2002) Evaluation of Helix aspersa as a

sentinel for mapping metal pollution. Ecol. Indt. 1:261-270.

Beyersmann D, Hechtenberg S (1997) Cadmium, gene regula-

tion, and cellular signalling in mammalian cells. Toxicol.

Appl. Pharmacol. 144:247-261.




Org. 9:221-228.





24.

Cajaraville MP, Cancio I, Ibabe I, Orbea A (2003) Peroxisome

proliferation as a biomarker in environmental pollution

assessment. Micr. Res. Tech. 61:191-202.

Cancio I, Ibabe A, Cajaraville MP (1999) Seasonal variation of

peroxisomal enzyme activities and peroxisomal structure in

mussels Mytilus galloprovincialis and its relationship with

the lipid content. Comp. Biochem. Physiol. C 123:135-144.

Cancio I, Cajaraville MP (2000) Cell biology of peroxisomes

and their characteristics in aquatic organisms. Int. Rev.

Cytol. 199:201-293.

Chabicovsky M, Niederstätter H, Thaler R, Hödl E, Parson W,

Rossmanith W, Dallinger R (2003) Localization and quanti-

fication of Cd- and Cu-specific metallothionein isoform

mRNA in cells and organs of the terrestrial gastropod Helix

aspersa. Toxicol. Appl. Pharmacol. 190:25-36.




Chem. 23:648-655.

Chandran A, Sivakumar AA, Mohandass S, Aruchami M (2005)

Effect of cadmium and zinc on antioxidant enzyme activity

in the gastropod, Achatina fulica. Comp. Biochem. Physiol.

C 140:422-426.





Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory

cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum.


Habeebu SSM, Liu J, Klaassen CD (1998) Cadmium-induced

apoptosis in mouse liver. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153:48-

58.


184


185

Hamers T, Kalis EJJ, Van den Berg JHJ, Maas LM, Schooten

FJV, Murk AJ (2004) Applicability of the black slug Arion

ater for monitoring exposure to polycyclic aromatic hydro-

carbons and their subsequent bioactivation into DNA bin-

ding metabolites. Mut. Res. 552:219-233.

Ireland MP (1981) Uptake and distribution of cadmium in the

terrestrial slug Arion ater (L). Comp. Biochem. Physiol. A

73:855-858.

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary cal-

cium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and his-

tological changes in the digestive cells in the snail Achatina

fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168.

Laskowski R, Hopkin SP (1996) Effect of Zn, Cu, Pb, and Cd on

fitness in snails (Helix aspersa). Ecotoxicol. Environ. Saf.

34:59-69.


digestive cells in mussels: quantitative alterations in cellu-

lar and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: 213-226.




Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951)

Protein measurement with the Folin phenol reagent. J.

Biochem. Chem. 193:265-275.

Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986a) Copper treatment of

the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Bioassay

conduction and histochemical analysis. Bull. Environ.


Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986b) Copper treatment of

the digestive gland of the slug Arion ater L. 2.

Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 36:608-615.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990) Histopathology of

the digestive gland-gonad complex of the marine proso-


Org. 9: 229-238.




Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998a) Tissue-

level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to


Toxicol. 34:167-176.


type replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt

to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol.

18:431-435.



molluscs. Micr. Res. Tech. 56:358-392.

Marigómez I, Izagirre U, Lekube X (2005) Lysosomal

enlargement in digestive cells of mussels exposed to

cadmium, benzo[a]pyrene and their combination. Comp.

Biochem. Physiol. C 141:188-193.

Müller S (1984) Lindanuntersuchungen im Aquatischen und

Terrestrischen Bereich in Bilbao (Nordostspanien).

Lizentziatura-Tesia. Universität Karlsruhe. 93 orr.

Orbea A, Ortiz-Zarragoitia M, Cajaraville MP (2002) Interactive

effects of benzo(a)pyrene and cadmium and effects od

di(2-ethylexyl) phtalate on antioxydant and peroxisomal

enzymes and peroxisomal volume density in digestive

gland of mussel Mytilus galloprovincialis Lmk. Biomarkers

7:33-48.

Okay OS, Donkin P, Peters LD, Livingstone DR (2000) The role

of algae (Isochrysis galbana) enrichment on the

bioaccumulation of benzo[a]pyrene and its effects on the

blue mussel Mytilus edulis. Environ. Poll. 110:103-113.

Piechotta G, Lacorn M, Lang T, Kammann U, Simat T, Jenke

HS, Steinhart H (1999) Apoptosis in dab (Limanda liman-

da) as possible new biomarker for anthropogenic stress.


Popham JD, D'Auria M (1980) Arion ater (Mollusca: Pulmonata)

as an indicator of terrestrial environmental pollution. Water

Air Soil Poll. 14:115-124.

Porcel D, Bueno JD, Almendros A (1996) Alterations in the

digestive gland and shell of the snail Helix aspersa Muller

(Gastropoda, Pulmonata) after prolonged starvation.

Comp. Biochem. Physiol. A 115:11-17.





Toxicol. 3:301-311.

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988a) Zinc treatment


distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 41:858-864.

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988b) Zinc treatment

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Sublethal

effects at the histological level. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 41:865-871.

Runham NW, Hunter PJ (1970) Terrestrial Slugs. Hutchinson

University Library, London 184 orr.

Russell LK, DeHaven JI, Botts RP (1981) Toxic effects of cad-

mium on the garden snail (Helix aspersa). Bull. Environ.


Small GM, Burdett K, Connock MJ (1985) A sensitive spectro-

photometric assay for peroxisomal Acyl-CoA oxidase.

Biochem. J. 227:205-210.






in “mussel-watch” programmes by automated image analy-

sis of autometallographical black silver deposits (BSD) in


150.

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigómez I (1998)

Autometallographical procedure for the localization of trace

metals in molluscan tissue by lighht microscopy. J.

Histotech. 21:123-127.






Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the

digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106:173-

192.

Swaileh KM, Ezzughayyar A (2000) Effects of dietary Cd and

Cu on feecing and growth rates of the landsnail Helix

engaddensis. Ecotox. Environ. Saf. 47:253-260.

Thompson RJ, Ratcliffe NA, Bayne BL (1974) Effects of starva-

tion on structure and function of the digestive gland of the

mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 54:699-

712.

Wang WX, Rainbow PS (2005) Influence of metal exposure

history on trace metal uptake and accumulation by marine

invertebrates. Sci. China C. Life Sci. 48:110-117.

Weibel ER (1979) Stereological Methods. Vol. 1. Academic

Press. London 415 orr.








Zubiaga AM (1986) Histofisiología dcel aparato reproductor de

Arion subfuscus (Draparnaud, 1805) (Gastropoda,

Stylomatophora). Doktoradutza-Tesia. UPV/EHU. 316 orr.


186

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean eta bere eragina biomarkatzaileengainean: metalez kutsatutako eta kutsatu gabekotokien artean lekuzaldatze-esperimentuak

Laburpena: Zelula-moten ordezkapena (CTR; ingeleraz, cell type replacement) estresatutakomoluskuen liseri-guruineko epitelioan ematen den fenomeno orokorra da. Aldez aurretik laborategianegindako ikerlanek, CTRk biometatze-prozesu eta biomarkatzaileen neurketen gainean eragina duelaerakutsi dute. Lan honen helburua CTR prozesua kutsadura metaliko pean kronikoki egondako bareetanitzulgarria ote den eta biometaketa-parametro eta esposizio- zein efektu- biomarkatzaileen gainean CTRkzer nolako eragina duen aztertzea da. Horretarako, Arion ater bareak, abandonatutako zink meatze batetik(Karrantza) eta kutsatugabeko toki batetik (Bakio) jaso ziren eta leku batetik bestera 3, 10 eta 28 egunezlekuzaldatu ziren. Metal-zama, absortzio atomikozko espektrofotometria (AAS) erabiliz kalkulatu zen.Lisosomen egitura-aldaketa, zelula-moten dentsitate bolumetrikoa, autometalografiko hauspeakinak etametalotioneinen mailak esposizio- eta efektu-biomarkatzaile gisa neurtu ziren. Ikerlan honen emaitzek,metal-kutsadura kroniko pean egondako bareen liseri-guruinak, laborategian hainbat astez metalen peanjarritako bareen liseri-guruinen antzekoak direla erakutsi dute. Hala ere, kronikoki kutsatutako liseri-guruinak, laborategian epe laburrean kutsatutakoen bareenak ez bezala, kutsadura-iturria etenez gero ezdira erantzunkorrak, edo behintzat, erantzuteko gaitasun murritzagoa dute. Bestalde, kutsatugabeko tokitikmeatzera lekuzaldatutako bareek, 3 eguneko lekuzaldatze ostean jada laborategian metal pean jarritakobareek bezala erantzun zuten; beraz, lan honek, erabilitako prozedura analitikoak eta biomarkatzaileaklurzorutan noizbehinkako metal-esposizioak detektatzeko egokiak direla demostratu du.

Gako-hitzak: lekuzaldatzea, zelula-moten ordezkapena, metalak, kutsadura kronikoa, liseri-guruina,bareak.

Zelula-moten ordezkapena bareen liseri-guruinean: lekuzaldatze-ikerketa

187

Cell-type replacement in the digestive gland of slugs and its influence inbiomarkers after transplantation between clean and metal-polluted sites

Abstract: Cell-type raplacement (CTR) is a general phenomenon that takes place in the digestive glandepithelium of stressed molluscs. Previous laboratory studies have demontrated that CTR influencesbioaccumulation processes and biomarker measurements. The aim of this work is to determine wether CTRis a reversible process is slugs exposed to chronic metal pollution and to investigate the influence of CTRin metal accumulation parametres and in effect and exposure biomarkers. For this purpouse slugs, Arionater, were transplanted from an abandoned Zn mine (Karrantza) to a non-polluted site (Bakio) and the otherway round for 3, 10 and 28 days. Metal burdens were measured by atomic absorption spectrophotomtry(AAS). Lysosomal structural changes, volume density of cell-types, autometallographical deposits andmetallothionein levels were calculated as exposure and effect biomarkers. The results of this study, showedthat the digestive gland of slugs chronically exposed to metal pollution is similar to the digestive gland ofslugs exposed to metals for some weeks under laboratory conditions. However, chronically polluteddigestive glands, are not responsible, or at least, are less responsible than short-term exposed ones whenthe pollution source disappears. On the other hand, slugs tranplanted from the reference site to the minerespond simmilarly to slugs exposed to metals in the laboratory after 3 days of transplantation, whichindicates that the analitical procedure and biomarkers employed in this work are able to detect eventualmetal exposures in soils.

Key Words transplant, cell-type replacement, metals, chronic pollution, digestive gland, slugs.

Sustitución de tipos celulares en la glándula digestiva de limacos y suinfluencia sobre biomarcadores después de un transplante entre un lugarlimpio y uno con contaminación metálica

Resumen El recambio de tipos celulares (CTR; del inglés, cell-type replacement) es un fenómenogeneral que se da en la glándula digestiva de moluscos en situaciones de estrés. Experimentos previosrealizados en el laboratorio, demostraron que CTR influye sobre las medidas de los procesos debioacumulación y biomarcadores. El objetivo del presente estudio es investigar si CTR es un procesoreversible en limacos crónicamente expuestos a contaminación metálica y determinar su influencia sobrelos parámetros de acumulación y biomarcadores de exposición y efecto. Para ello, se recogieron limacosArion ater en una mina de zinc abandonada (Karrantza) y en un lugar sin contaminar (Bakio) y setransplantaron de un lugar a otro durante 3, 10 y 28 días. La carga de metal se calculó medianteespectrofotometría de absorción atómica (AAS). Como biomarcadores de exposición y efecto seestudiaron los cambios estructurales de lisosomas, la densidad volumétrica de tipos celulares, losdepósitos autometalográficos y los niveles de metalotioneinas. Los resultados demuestran que los limacoscrónicamente expuestos a metales presentan una glándula digestiva similar a la de los limacos expuestosen el laboratorio durante semanas a metales. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en la glánduladigestiva de limacos expuestos a metales por un corto período de tiempo, cuando termina la exposición laglándula digestiva de limacos crónicamente expuestos a metales no responden o presentan una capacidadde respuesta limitada. Por otro lado, en los limacos tranplantados del lugar sin contaminar a la mina 3 díasson suficientes para observar respuestas similares a las obtenidas tras la exposición a metales en ellaboratorio, indicando que el procedimiento analítico y los biomarcadores empleados en el presente trabajoson válidos para detectar exposiciones puntuales a metales en suelos.

Palabras clave: transplante, sustitución de tipos celulares, metales, contaminación cronica, glánduladigestiva, limacos.


188


189

SARRERA

Lehorreko gastropodoak metalen metatzaile

eraginkorrak direnez eta kutsaduraren aurrean

modu sentikor eta neurgarrian erantzuten dutenez,

lurzoruen kutsaduraren begirale moduan erabiliak

izan dira oso (Coughtrey & Martin, 1977; Popham

& D'Auria, 1980; Marigómez et al., 1998a; Pihan &

de Vaufleury, 2000; Viard et al., 2004; Snyman et

al., 2005). Liseri-guruina, metaleen metatze-toki

garrantzitsuena da bare eta barraskiloetan (Ireland,

1979; 1984a; 1994; Beeby & Richmond, 1987;

Berger & Dallinger, 1993; Marigómez et al., 1998a;

2002), metalen prozesatze eta detoxifikazioan

gako-funtzioak betetzen dituelarik (Kammenga et

al., 2000). Metalak, iraizte-zelulen lipofuszina

pikorretan (Marigómez et al., 1986a; 1996; 1998a;

Recio et al., 1988a) eta maiztasun gutxiagoz kaltzio

zeluletan (Schoettli & Seiler, 1977; Marigómez et

al., 1986a) lokaliza daitezke, baina metatze-

konpartimentu nagusia liseri-zelulen sistema endo-

lisosomikoa dugu, non metalak metalotioneinei

lotuta bahitzen baitira (Schoettli & Seiler, 1977;

Ireland, 1981; 1982; 1984a; Dallinger & Wieser,

1984; Marigómez et al., 1986a; 2002; Recio et al.,

1988a; Janssen & Dallinger, 1991;1995).

Metal pean egoteak, iraizte-jardueraren

emendioa sortarazi dezake liseri-zeluletan

(Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; Recio et

al., 1988a; 1988b), zeintzuetatik lisosoma eta

hondakin-gorputzen barruan dauden proteinei

lotutako metalak jariapen apokrino edo holokrino

prozesuen bidez gorotzetara aska baitaitezke

(Marigómez et al., 1986a; 1990a; Recio et al.,

1988a; Ireland & Marigómez, 1992). Iraizte-

jarduera emendatu horren ondorioz, liseri-

guruinaren epitelioaren zelula-osaketan aldaketa

latzak sor daitezke kutsatzailepeko esposizio

subletala pairatu ondoren (Rasmussen et al., 1983;

Widdows et al., 1984; Lowe & Clarke, 1989;


1990b; 1996; 1998a; 1998b; Soto et al., 2002).

Efektu horri zelula-moten ordezkapena (ingeleraz,

Cell Type Replacement; CTR) deritzo, eta toxiko

zein bestelako estres-iturri pean mantendutako

molusku itsastarretan egindako lan aurrendarietan

zelula basofilikoen dentsitate bolumetriko edo

kopuru erlatiboaren igoera gisa neurtu da

(Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984;


1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996; 1998a;

1998b).

Liseri-guruineko epitelioaren zelula-moten

ordezkapena, habitat eta kokapen taxonomiko

desberdinetako molusku estresatuetan gertatzen

den fenomeno orokorra dela dirudi. (Marigómez et

al., 1998a). Kutsatzaile organokimiko edo

metalikoen kontzentrazio subletal pean

mantendutako muskuilu itsastarrek, batez ere

zelula basofilikoz osatutako liseri-tepitelioa agertu

dute (Rasmussen et al., 1983; Lowe & Clarke,

1989; Cajaraville et al., 1990a; Soto & Marigómez,

1997a; 1997b; Soto et al., 2002; 1. Kapitulua).

Modu berean, gastropodo itsastarrek zelula

basofiliko hipertrofiatuz osatutako liseri-tubuluen

epitelioa erakutsi dute, laborategian Cd zein

hidrokarburo aromatikoen pean mantenduz gero

(Cajaraville et al., 1990a; Marigómez et al., 1990b).


190

Lehorreko bareetan, liseri-guruinaren epitelioa

desberdintzatutako hiru zelula-motez osaturik dago,

esaterako: liseri-zelula (ugariena), iraizte-zelula eta

kaltzio-zelula (zelula basofilikoa; Sumner, 1965).

Gainerako molusku taldeetan bezala, metalez

kutsatutako eskualdeetan bizi diren bare en liseri-

guruinean ere, zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen)

kopuru erlatibo altuak eta hipertrofia aurkitu dira

(Marigómez et al., 1998a), eta baita laborategian

metalen pean mantendutakoetan ere (Marigómez

et al., 1996; 4. Kapitulua). Halaber, metalezko

kutsadura kronikoaren baldintzetan, iraizte-zelulen

kopuru erlatiboa ere emenda daiteke (Marigómez et

al., 1998a).

CTR, kutsatzaile peko esposizioari erantzunez

zelula basofilikoen (kaltzio-zelulen) proliferazioaren

ondorioa dela proposatu da (Thompson et al., 1974;

Rasmussen et al., 1983; Widdows et al., 1984;


1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996). Widdows et

al.-ek (1984), aldaketa horrek liseriketa-prozesuan

zein bioenergetikan berebiziko eragina izan

dezakeen moldarazpen-erantzuna dela

kontsideratu zuten. Izan ere, liseri-zelulen

berriztapena, zelula ama moduan jokatuko luketen

zelula basofilikoen zatiketaren bidez suertatuko

litzatekeela orokorki onartuta zegoen (Yonge, 1926;

Mix & Sparks, 1971; Thompson et al., 1974) eta,

zentzu horretan, zelula basofilikoen proliferazioak,

liseri-zelulen galerak ekarritako zelulen berriztapen

areagotua bermatuko luke (Cajaraville et al.,

1990a). Haatik, oraintsuko ikerketek, muskuiluen

liseri-guruinean liseri-zelulek zein zelula

basofilikoek, ziklo zelularra norberak bere aldetik

jarraitzen duela frogatu dute (Marigómez et al.

1999; Zaldibar et al., 2004), eta beraz, liseri-zelulak

zatitzeko gai direnez, beraiek ordezkatzeko zelula

basofilikoek proliferatzea gertagaitza litzateke. Are

gehiago, metal eta konposatu organikoen

kutsadura peko baldintzetan epitelioaren masa-

murrizpen netoa gertatzen da, liseri-zelulen

galeraren ondorioz seguru asko, murrizpen horrek

zelula basofilikoen kopuru erlatiboaren itxurazko

gorakada ekarriz (Vega et al., 1989; Marigómez et

al., 1990b; 1995; 1996; 1998b; Zaldibar et al.,

2002). Aitzitik, kutsadura peko baldintzetan zein

ingurumen-kaltea eteterakoan liseri-zelulek

proliferatzen dute, BrdU immunohistokimika bidez

magurio eta bareen kasuan laborategiko

esperimentuetan frogatu den moduan (Zaldibar et

al., 2002, 4. eta 5. kapituluak). Beraz, zelula

basofilikoen kopuru erlatiboaren emendioa, batez

ere liseri-zelulen galeraren ondorioa dela onar

genezake. Modu berean, iraizte- eta kaltzio-zelulen

kopuru erlatibo altuak, abandonatutako Cu

meatzean hainbat belaunaldiz (kutsadura kronikoa)

bizi izan diren bareetan aurkitu ziren, liseri-zelulak

pikor zitoplasmikoen iraizpenean oso aktiboak eta

oso bakuolizatuak agertu zirelarik (Marigómez et

al., 1998a). Egoera horrek liseri-zelulen etengabeko

askatzeak azalduko luke. Ildo beretik, iraizte-

zelulak, bizi-zikloaren azken urratsetan dauden

liseri-zelulak izango liratekeela proposatu da, eta ez

beste zelula-mota ezberdina (Porcel et al., 1996;

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002). Horrek,

baraualdian eta kutsadurapean liseri- eta iraizte-

zelulen proportzio erlatiboek jarraitzen dituzten

jokabideak kontrajarriak izatea azalduko luke


191

(Porcel et al., 1996; Marigómez et al., 1998a;

Dimitriadis & Konstantinidou, 2002; 5. Kapitulua).

Are gehiago, zelula basofilikoen presentzia

erlatiboaren gorakada, euren hiperplasia eta ez

euren kopuruaren emendioaren ondorioa izango

litzateke batik bat (Marigómez et al., 1990b; 1996;

Chabicovsky et al., 2004; 4. Kapitulua).

Liseri-zelula, ingurumen-kutsaduraren ebalua-

ketarako itu-konpartimentua nagusietarikoa denez,

kutsatzaileen pean egoteak bultzatutako liseri-

zelulen galerak, biometaketa-parametro eta

biomarkatzaileak neurtu direneko zelai- eta epe

luzeko ikerketen emaitza polemikoak azalduko

lituzke. Epe luzeko esposizio (kroniko) ostean,

metalak ez dira liseri-epitelioan metatzen, epitelio

horrek metatze-toki nagusia diren lisosomak

dituzten liseri-zelula urriak baititu (Marigómez et al.,

1996; 1998a; Soto et al., 1998; 2002; Soto &

Marigómez, 1997b). Aldez aurretik burututako

ikerlanek, laborategian metal pean mantendutako

muskuilu eta magurioetan neurtutako

biomarkatzaileen gainean CTRk zer nolako eragina

duen finkatu dute (Soto & Marigómez, 1997b; Soto

et al., 2002; 1. eta 4. Kapituluak), bareen inguruan

dagoen informazioa, berriz, bakana da (Marigómez

et al., 1996; 1998a; 5. Kapitulua).

Metalen pean kronikoki egondako bareen liseri-

guruinean CTR prozesu itzulgarria den finkatzea,

alde batetik, eta CTRk metaleen biometaketa eta

efektu- zein esposizio-biomarkatzaileen gainean

nolako eragina duen ezagutzea, bestetik, ikerlan

honen helburuak dira. Asmo horrekin, Karrantzako

Zn-meatze abandonatu baten inguruko bareak

(Arion ater) hartu eta Bakioko toki kutsatu gabe

batera lekuzaldatu ziren 3, 10 eta 28 egunez, eta

vice versa, Bakiotik Karrantzara. Gorputzeko

metal-zamak absortzio atomikozko

espektrofotometria (AAS) bitartez neurtu ziren.

Bareen liseri-guruinaren epitelioa osatzen duten 3

zelula-moten dentsitate bolumetrikoa estereologia

erabiliz kalkulatu zen (VvDIG, VvEXC, VvCAL)

hematoxilina-eosinaz tindatutako parafinazko

ebakien gainean. Autometalografiaz (AMG)

errebelatutako zilarrezko hauspeakin beltzen

dentsitate bolumetrikoa (VvBSD) eta

espektrofotometria bitartez neurtutako

metalotioneinen (MT) maila esposizio-

biomarkatzaile gisa erabili ziren. Efektu-

biomarkatzaile gisa lisosomen handiagotzea

aukeratu zen, kriostato-ebakien gainean, liseri-

lisosomen bolumenezko, azalerazko eta

zenbakizko dentsitateak (VvLYS, SvLYS eta

NvLYS) eta azalera/bolumena ratioa (S/VLYS)

irudi-analisi bidez neurtuz gero estimatu zelarik.


Erreaktibo kimikoak





Diseinu esperimentala eta laginen prozesatzea

50 Arion ater bare ar, Euskal Herriko 2 herri

desberdinetan jaso ziren 2002.ko ekainaren 1ean

(1. Ird.): (a) Karrantzako bailaran abandonatutako

Zn-meatze zahar baten inguruan; eta (b)

kutsatugabeko toki batean Bakion, meatzetik aski

urruti dagoen landa-herria dena. Bareak toki batetik

bestera 3, 10 eta 28 egunez lekuzaldatu ziren, eta

baldintza naturaletan mantendu ziren lurzoruari

atxikitako saredun kutxen bitartez. Horretaz gain,

bai Bakion zein Karrantzan lurzorua eta bareak

lagindu ziren, transplantea egin zeneko egun

berean (0. eguna). Bareak (10 talde

esperimentaleko), laginketa-egunetan sakrifikatu

ziren, eta segidan azalduko den moduan prozesatu

ziren. Liseri-guruinaren zati bat, Carnoy likidoan

fixatu, parafinan inkluditu eta 7 µm-ko lodierako

ebakietan moztu zen, azterketa histologikoak eta

analisi histokimikoak egiteko. Bigarren zati bat,

glutaraldehidoan fixatu eta EPON erretxinan

inkluditu zen, ebaki semifinen behaketa egiteko.

Hirugarren zati bat, nitrogeno likidotan izoztu zen. 8

µm-ko lodierako ebakiak, kriostatoan moztu, eta

ondoren ß-glukuronidasa entzimaren jardueraren

demostrazio histokimikoa egiteko prozesatu ziren.

Liseri-guruinaren beste zati bat nitrogeno likidotan

izoztu zen, metalotioneinen neurketa

espektrofotometrikoa burutzeko. Azkenik, geratzen

zen liseri-guruinaren zatia, metalen analisi kimikoak

egiteko liseriketa azidoaren bitartez prozesatu zen.

Prozedura bakoitzaren nondik norakoak,

zehaztasun gehiagoz jarraian azalduko dira.

Analisi kimikoak

Liseri-guruinak ur distilatuan garbitu, eta labean

120ºC-tara lehortu ziren 48 orduz, pisua egonkortu

zen arte (Ireland, 1979). Lehortutako ehunak azido

nitriko kontzentratuan liseritu ziren. Gerora, ur

distilatuan disolbatutako azido nitrikotan (0.1 M)

diluitu ondoren, laginak absortzio atomikozko

espektrofotometroan (PerkinElmer 2280, Wellesley,

Massachusetts, Amerikako Estatu Batuak) neurtu

ziren, aldi bereko atzealdeko zuzenketaz eta 0.3

mg/l-ko sentikortasunaz. Merck merkatal-etxeko


Amerikako Estatu Batuak) disoluzio estandarrak

(zertifikatutakoak) 0.1 M azido nitrikotan diluitu ziren

kalibrazioa burutzeko. 7 metal analizatu ziren:

kadmioa (Cd), kromoa (Cr), kuprea (Cu), burdina


192

1. Irudia: Erreferentzia tokia(Bakio) eta antzinako meatze-tokiaren (Karrantza)kokapenaren irudi eskematikoa.Geziek bareenlekuzaldatzearen nondiknorakoak islatzen dituztekutxen barruan agertutakoegun kopuruen zehar

(Fe), beruna (Pb), nikela (Ni) eta zinka (Zn).

Lurzoruaren laginak modu berean prozesatu ziren.

Metalotioneina-mailen determinazio

espektrofotometrikoa

MT-mailak sulfidrilo taldeen (-SH) determinazio

espektrofotometrikoaren bitartez estimatu ziren

(UNEP/RAMOGE, 1999). MTen kontzentrazioa,

laginaren -SH edukina espertrofotometro bitartez

kuantifikatu da, Ellman erreaktiboa (5,5 ditiobis 2

azido nitrobenzoikoa; DTNB) erabiliz. Laburki,

liseri-guruinaren zatiak 1 g ehun emateko taldekatu

ziren, eta motoreak gidatutako teflonezko

homogeneizagailuan ß-merkaptoetanola,

fenilmetanosulfonilfluorido (PMSF) eta

leupeptinadun indargetzaile homogeneizatzai-

learen 3 bolumenetan homogeneizatu ziren.

Homogeneizatuak 30000x g-tan 20 min 0-4ºC-tan

zentrifugatu ziren. Gainjalkinean zeuden pisu

molekular baxuko proteinak etanol absolutu

hotzean (-20ºC), eta ondoz ondoko 6000x g-ko

zentrifugazioaren bitartez prezipitatu ziren. MTtan

joria zen pisu molekular baxuko frakzioa 0.25 M

NaCl, 1 N HCl eta 4 nM EDTA zuen indargetzailean

berresekitu zen. Erreferentziazko kurba

estandarrak, 1 mg glutation/ml 0.25 M NaCl stock

disoluzioa erabiliz sortu ziren. MTen ebaluazio

espektrofotometrikoa 0.43 mM DTNB 0.2 M fosfato

indargetzailean erreaktibo gisa erabiliz egin zen,

absorbantzia 412 nm-tan neurtuz.

Autometalografia

Parafinazko ebakien talde bat

autometalografiaz tindatu zen. Autometalografia

metalak zilarrezko hauspeakin beltz gisa

ikustarazteko argazkilaritzan oinarritutako teknika

da (Danscher, 1984). Ebakiak (7 µm), xilenoz

desparafinatu ziren, beheranzko graduazioko

etanolezko bainu-serie batean hidratatu eta labean

(40ºC) utzi ziren guztiz lehortu arte. Laginak

ondoren, eta gela ilunean, argazki-emultsio geruza

fin eta uniforme batez estali ziren (Ilford Nuclear


Laginak ilunpean mantendu ziren lehortu bitartean

(30 minutu) eta Ultrafin Tetenal SF (1:5 diluzioa ur

distilatuan) (Tetenal AG & Co, Norderstedt,

Alemania) errebelatzaile komertziala erabiliz

errebelatu ziren 15 minutuz. Ondoren,

errebelatzailearen erreakzioa %1 azido azetikoa

zuen diluzio batean geldiarazi zen minutu batez eta,

azkenik, erreakzioa fixatzailean (Agfa Agefix, Agfa-

Gevaert N.V., Mortsel, Belgika, 1:9 uretan) fixatu

zen 10 minutuz. Laginak, Kaiser gelatina

glizerinatuan muntatu ziren.

BSDen kuantifikazioa argi-mikroskopioan

irudi-analisi bitartez


azalera irudi-analisia erabiliz kuantifikatu zen (Soto

& Marigómez, 1997a; 1997b), emaitzak BSDen

dentsitate bolumetriko gisa adieraziz (VvBSD). Argi-





eta Sevisan (Bilbo, Espainia) entrepresak




193



Neurketak bare bakoitzean 5 eremutan burutu

ziren, eta talde esperimental bakoitzean 10 bare

erabili ziren; tratamendu bakoitzeko guztira 50

neurketa eginez. Kalkuluak, Lowe et al.-ek (1981)

proposatutako formulak erabiliz egin ziren. Hau da,

BSD partikulen tamaina ebakiaren lodiera baino

txikiagoa zela kontutan hartuz, Holmes efektua

zuzentzeko faktorea kontuan hartu zen.

Azterketa histologikoa eta analisi histologiko

kuantitatiboak

Parafinan inkluditutako ebakiak (7 µm)

Hematoxilina-eosinaz tindatu ziren eta EPON

erretxinan inkluditutako ebaki semifinak (3-4 µm)

toluidina urdinez tindatu ziren, talde desberdinetako

bareen liseri-guruineko epitelioaren eta bertoko

zelula-moten deskribapen morfologikoa argi-

mikroskopioaren bitartez egiteko.

Liseri-zelulen, iraizte-zelulen eta kaltzio-zelulen

dentsitate bolumetrikoa kalkulatzeko (VvDIG,

VvEXC, VvCAL) prozedura estereologikoa aplikatu

zen. Horretarako, lagin bakoitzean azarez

aukeratutako zelai batetan egin ziren kontaketak

guztira talde esperimental bakoitzeko 10 kontaketa

burutuz. Analisi estereologikoak burutzeko, Nikon

Optiphot mikroskopioari atxikitako irudi-hodia

erabili zen (amaierako handipena 670x). Zelulen

VvDIG, VvEXC eta VvCAL Delesse printzipioan

oinarrituz (Weibel, 1979) kalkulatu zen. Lortutako

datu horietan oinarrituta, zelula-mota bakoitzaren

proportzio erlatiboa portzentaietan kalkulatu zen.

Lisosomen egitura-aldaketak

Liseri-zelulen lisosomen ikustaraztea ß-

glukuronidasa (ß-GUS) entzimaren jardueraren

agerketa histokimikoa burutuz egin zen, Cajaraville

et al.-en (1991) prozedura jarraituz. Ebakiak, egin

berria zen ß-GUS inkubazio-medioan (28 mg

naphtol AS-BI-ß-D-glucuronide 1.2 ml 50 mM sodio

bikarbonatoan disolbatuta eta 100 ml-arte %2.5

NaCl eta %15 polibinilo alkohola zuen azetato

indargetzailean, pH 4.5) murgildu ziren 10 minutuz

37ºC-tan, etengabe irabiatuz. Inkubazioaren

ondoren, laginak %2.5 NaCl gatz-disoluzioan

garbitu ziren 2 minutuz 37ºC-tan, etengabe

irabiatuz. Laburki, ebakiak disoluzio ikustarazlean

sartu ziren (0.1 g Fast Garnet GBC % 2.5 NaCl

zuen 0.1 M fosfato indargetzaileko (pH 7.4) 100 ml-

tan disolbatuak) 10 minutuz eta ilunpean. Ondoren,

laginak %2.5 NaCl zuen Baker formol kaltzikoan

fixatu ziren 10 minutuz 4ºC-tan, eta uretan labur

garbitu ziren. Azkenik, laginak % 0.1 Fast Green

disoluzio batean kontrastatu ziren bi minutuz, ur

distilatuan hainbat aldiz garbitu, Kaiser gelatina

glizerinatuan montatu eta azazkalen esmalteaz

zigilatu ziren.

Lisosomen egitura, automatizatutako irudi-

analisi (Biological Measurement System software-

BMS- Sevisan; Cajaraville et al., 1991) bitartez

neurtu zen. Ebakiak, x100 handipeneko objektiboa

erabiliz aztertu ziren Leitz argi-mikroskopioan. 5

neurketa burutu ziren ebaki bakoitzean, hurrengo

parametro estereologikoak kalkulatuz: lisosomen

dentsitate bolumetrikoa (VvLYS = V(L)/V(C)),

dentsitate superfiziala (SvLYS = S(L)/V(C)),

azalera/bolumena ratioa (S/VLYS = S(L)/V(L)) eta


194

dentsitate numerikoa (NvLYS = N(L)/V(L)); non V =

bolumena, S = azalera, N = kopurua, L = lisosomak

eta C = liseri-zelulen zitoplasma baitira.

Estatistika

Emaitzak estatistikoki aztertzeko SPSS/PC+


erabili zen. VvLYS eta NvLYS datuak logaritmikoki

transformatu ziren azterketa estatistikoa egin

aurretik, indibiduoen barne-bariantza

batezbestekoaren menpekoa zelako. Aldagai

esperimentalen esangarritasuna bide bateko

bariantzaren analisia (ANOVA) erabiliz estimatu

zen, eta parekatutako batezbestekoak Duncan

testa erabiliz konparatu ziren.

EMAITZAK

Talde esperimental desberdinen metalen

kontzentrazio totala (Cd + Cu + Cr + Fe + Ni + Pb +

Zn), lurzoruan eta liseri-guruinean µM gisa neurtu

zen, AAS bitartez. Metalen mailak, meatzeko

lurzoruan kutsatugabeko tokikoan baino hiru aldiz

handiagoak izan ziren (2. Ird.). Liseri-guruinean

neurtutako metalen mailak emaitza horrekin bat

etorri ziren, Karrantzako bareen liseri-guruinean

Bakioko bareetan baino hiru aldiz metal gehiago

zegoen (2. Ird.). Karrantzatik Bakiora

lekuzaldatutako bareen liseri-guruinean, ordea,

neurtutako metal kontzentrazioak Zn-meatzean

neurtutakoak baino altuagoak izan ziren, gainera

metal kontzentrazio hauek erreferentzi-tokian

denbora gehiago egon heinean igoz joan zirelarik

(2B Ird.).

Oro har, lurzoruan neurtutako metal

desberdinen kontzentrazioa, Karrantzan Bakion

baino altuagoa izan zen, Cu eta Fe salbu (1. Taula).

Haatik, desberdintasun esangarrienak, Zn eta Pb

kontzentrazioetan aurkitu ziren, metal horiek metal

kontzentrazio osoaren partaide nagusiak izanik.

Karrantzako bareen liseri-guruinean, Pb eta Zn

kontzentrazioak Bakiokoak baino hamar eta bost

aldiz handiagoak izan ziren, hurrenez hurren (1.

Taula). Bakiotik Karrantzara 3 egunez

lekuzaldatutako bareetan, Karrantzako zelaiko

bareen liseri-guruinean neurtutakoen Pb eta Zn


195

2. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzareninguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruineko lurzoruetako metaleen kontzentrazioa (µMmetaletan). (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzeralekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazioestandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan. M)Mehatzeko lurzoruko metaleen kontzentrazioa; E) Erreferentziatokiko lurzoruko metaleen kontzentrazioa.

kontzentrazioen balioetara heldu ziren (3A eta 3C

Ird.). Karrantzatik Bakiora lekuzaldatutako bareek,

neurtutako Pb eta Zn kontzentrazio-balioak iturriko

bareetan neurtutako balioen antzekoak erakutsi

zituzten (3B eta 3D Ird.). Are gehiago, Bakion 3

egun igaro ondoren, Pb kontzentrazioak Karrantzan

baino 3 aldiz altuagoak izan ziren (3B Ird.), eta

Bakion 28 egun igaro ondoren, Zn kontzentrazioa

Karrantzako bareetan neurtutako baino altuagoa

izan zen (3D Ird.).

Autometalografiak, metalen presentzia

zilarrezko hauspeakin beltz (BSD) moduan erakutsi

zuen, liseri-zelulen lisosometan, iraizte-zelulen

lipofuszina-pikorretan eta, maila baxuagoan,


196

1. Taula: Erreferentzizko tokian (Bakio) eta antzinako meatzearen inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruineko eta lurzoruetako metalen kontzentrazioa (mg/kg). BBZ, Bakioko bareak; BB3, Bakioko bareak 3 egunez Bakion kutxetansartuak; BB10, Bakioko bareak 10 egunez Bakion kutxetan sartuak; BB28, Bakioko bareak 28 egunez Bakion kutxetan sartuak;BUR, Bakioko bareak urrian hartuak; BL3, Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareak; LB3, Karrantzatik Bakiora 3egunez lekuzaldatutako bareak, LB10, Karrantzatik Bakiora 10 egunez lekuzaldatutako bareak; LB28, Karrantzatik Bakiora 28egunez lekuzaldatutako bareak; LLZ, Karrantzako bareak; LL3, Karrantzako bareak 3 egunez Karrantzan kutxetan sartuak; LUR,Karrantzako bareak urrian hartuak

Cu Pb Fe Cd Ni Cr Zn Lurra Bakio

231.63 (±38.93)

44.12 (±6.47)

1265.43 (±263.21)

6.59 (±2.96)

2.58 (±3.58)

9.66 (±3.76)

352.70 (±320.60)

Lurra Mehatza

26.18 (±12.78)

321.75 (±142.18)

616.09 (±189.72)

14.26 (±6.42)

1.47 (±1.13)

15.728 (±7.76)

6981.99 (±2375.41)

BBZ 147.02 (±87.3)

26.13 (±25.61)

599.19 (±726.92)

5.6 (±1.68)

5.99 (±9.28)

9.37 (±10.06)

929.64 (±1050.32)

BB3 166.08 (±108.16)

29.44 (±15.13)

494.83 (±260.83)

14.03 (±11.56)

2.23 (±4.2)

9.47 (±11.87)

498.41 (±323.52)

BB10* 360 23.84 882.12 9.1 1.59 9.54 596

BB28* 290 51.78 1187.82 16.19 0 12.18 1584

BUR 213.77 (±208.89)

16.19 (±6.81)

495.78 (±656.99)

3.53 (±2.53)

3.39 (±4.03)

3.72 (±4.58)

635.04 (±464.65)

BL3 290.48 (±191.7)

317.63 (±317.58)

461.06 (±230.72)

48.39 (±41.93)

2.82 (±6.69)

11.64 (±15.66)

3348.23 (±3090.55)

LB3 81.60 (±51.01)

517.62 (±360.46)

454.79 (±285.46)

11.33 (±4.2)

5.84 (±8.29)

5.12 (±7.37)

6723.45 (±3662.18)

LB10 113.42 (±79.44)

305.23 (±214.53)

1662.38 (±2220.98)

25.78 (±16.6)

4.82 (±7.07)

4.01 (±7.65)

5653.01 (±4357.54)

LB28 138.75 (±59.27)

285.14 (±72.95)

878.46 (±846.29)

18.65 (±10.94)

2.51 (±4.34) 5.82 (±9.3)

10157.3 (±5875.64)

LLZ 61.97 (±36.42)

291.53 (±301.29)

224.57 (±211.81)

15.47 (±9.73)

2.98 (±3.23)

2.28 (±3.46)

4480.9 (±2914.12)

LL3 14.77 (±9.13)

109.99 (±250.82)

251.53 (±182.77)

24.17 (±16.94)

1.45 (±2.15)

3.98 (±2.72)

2133.44 (±761.97)

LUR 16.84 (±5.87)

81.09 (±78.03)

46.44 (±38.92)

9.44 (±8.92)

1.27 (±1.53)

4.84 (±3.67)

2280.43 (±578.12)

* Ez dago erreplikarik

kaltzio-zelulen kaltzio-esferuletan (4. Ird.).

Behaketa mikroskopikoa burutu ondoren, BSD,

Karrantzako bareetan kutsatu gabeko tokian baino

ugariagoak zirela argi agertu zen (4A eta 4B Ird.).

Bakioko bareetan, BSD, liseri-epitelioko xafla

basalean (zentzu histologikoan) eta liseri-zelulen

erpinaldeko lisosoma (pikor berdeak) gutxi batzutan

behatu ziren (4A Ird.). Kutsatutako tokiko bareetan,

eta kutsatu gabeko tokira 3 egunez

lekuzaldatutakoetan BSD xafla basalean urriagoak

izan ziren arren, sistema endo-lisosomikoaren

bolumen gehiena betetzen agertu ziren (pikor berde

eta horiak), eta iraizte-zelulen lipofuszinetan ere

konspikuoak gertatu ziren (4B eta 4D Ird.).

BSDen hedapen-balioak, irudi-analisi bitartez

VvBSD gisa kuantifikatuak, Karrantzako bareetan

Bakioko bareetan baino 10 aldiz handiagoak izan

ziren. Bakiotik Karrantzara 3 egunez

lekuzaldatutako bareetan tarteko balioak

kuantifikatu ziren (5A Ird.). Kutsatutako tokitik

kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen liseri-

guruinean, VvBSD balioa ez zen jaitsi. Aitzitik, 3 eta

10 egunez lekuzaldatu ondoren balio handiagoak

suertatu ziren (5B Ird.).


197

3. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruinekoehunetako eta lurzoruetako Pb (A eta B) eta Zn (C eta D) kontzentrazioak (µg/g ehun-pisu lehor).( A) eta (C) Kutsatu gabeko tokitikmeatzera lekuzaldatutako bareak; (B) eta (D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05mailan. M) Mehatzeko lurzoruko Pb eta Zn kontzentrazioa; E) Erreferentzia tokiko lurzoruko Pb eta Zn kontzentrazioa.

Bi tokietan determinazio espektrofotometrikoz

kuantifikatutako metalotioneinen (MT)

kontzentrazioa ez zen esangarriki desberdina izan

(6A Ird.). Era berean, Bakiotik Karrantzara

lekuzaldatutako bareetan MT kontzentrazioa ez zen

esangarriki aldatu. Bestalde, kutsatu gabeko tokian

3 egunez mantendutako bareetan MT

kontzentrazioa esangarriki jaitsi zen (6B Ird.).

ß-glukuronidasaren histokimika burutu ondoren,

liseri-zelulen lisosomak arre-purpura koloreko

hauspeakin modura behatu ziren (4E eta F Ird.).

Karrantzako bareetan (4F Ird.), lisosomak


198

4. Irudia: Arion ater barearen liseri-epitelioan metalen lokalizazio autometalografikoa (A-D) eta ß-glukuronidasa entzima-jardueraren detekzio histokimikoa (E-F). (A) Kutsatu gabeko tokian hartutako barea; (B) Zn-meatzetik hartutako barea; (C) Kutsatugabeko tokitik meatzera 10 egunez lekuzaldatutako barea; (D) Zn-meatzetik kutsatu gabeko tokira 3 egunez lekuzaldatutako barea.Geziek liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelulen barruan dauden metalak adierazten dituzte. Gezi-buruek liseri-azinoetakoxafla-basalean metatutako metalak adierazten dituzte. Eskala-marra: 50 µm. (E) Kutsatu gabeko bareen liseri-guruineantopatutako ß-glukuronidasa entzimaren jarduera; (F) Zn-meatzeko bareen ß-glukuronidasa entzimaren jarduera. Geziek ß-glukuronidasa jarduera adierazten dute. Eskala-marra: 25 µm.

nabarmenki handiagoak izan ziren Bakiokoetan

baino (4E Ird.). Estereologia bidez egindako analisi

kuantitatiboek emaitza hauek baieztatu zituzten:

VvLYS eta SvLYS altuagoak eta S/VLYSbaxuagoak neurtu ziren Karrantzako laginetan

Bakioko laginetan baino (7. Ird.). Bakiotik

Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako bareetan,

VvLYS eta SvLYS parametroak aldatu ez ziren

arren, lisosomen tamainaren handiagotzea

(S/VLYS baxua) kopuruaren txikipen

esangarriarekin batera (NvLYS baxua) gertatu zen.

Kontrako lekuzaldatzea egiterakoan, lisosomek ez

zuten inolako erantzunik eman 28 egunez (7B Ird.).

Karrantzako liseri-guruineko azinoek,

Bakiokoek baino epitelio meheagoa erakutsi zuten;

gainera, argia handiagoa eta azinoen kalibrea ere

txikiagoa izan ziren (8. Irudia). Are gehiago,

loditutako xafla basala eta odol hodiak eratzen

duten Leydig zelula puztuak aurkitu ziren (8. Ird.).

Liseri-zelulak, kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak

errez identifikatu ziren bi tokietako bareen liseri-

guruineko epitelioan; hala ere, zelula-mota

bakoitzaren maiztasun erlatiboa desberdina izan

zen bi tokietan (8. eta 9. Ird.). Eskuarki, kaltzio-

zelulen proportzio erlatiboa konstante mantendu

zen lagin desberdinetan, liseri-zelula eta iraizte-

zelulena esangarriki aldatu ziren bitartean. Iraizte-

zelulak, toki kutsatuan kutsatu gabeko tokian baino

bost aldiz ugariagoak izan ziren (%60 vs %12), eta

liseri-zelulak, ordea, askoz urriagoak (%30 vs %80;

9. Ird) Gainera, kutsatu gabeko tokitik toki

kutsatura 3 egunez lekuzaldatutako bareetan

zelula-mota desberdinen proportzioek tarteko

balioak erakutsi zituzten; hau da, batez ere iraizte-

zelulen emendioa gertatu zen (9A Ird.). Toki

kutsatutik kutsatugabekora lekuzaldatutako bareen

liseri-guruinean pareko erantzuna behatu zen, non

kaltzio-zelulen proportzioan aldaketarik behatu ez

zen bitartean iraizte-zelulen gutxiagotze graduala

aurkitu baitzen (9B Ird.). Aldaketa horiek parametro

adierazgarrietan islatzeko asmoz, VvDIG eta

VvEXC/VvDIG ratioa hautatu egin dugu (10. Ird.).

Bakion, VvDIG Karrantzan baino bi aldiz altuagoa

hain zuzen, eta 3 egunez Bakiotik Karrantzara


199

5. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzareninguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruinean neurtutako zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitatebolumetrikoa. (A) Kutsatu gabeko tokitik meatzeralekuzaldatutako bareak; (B) Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalek desbidazioestandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05 mailan.


200

lekuzaldatu ondoren tarteko balioak agertu ziren

(10A Ird.). VvEXC/VvDIG ratioari dagokionez,

Karrantzako balioak Bakiokoak baino 8 aldiz

handiagoak dira (10B Ird.). Halaber, Karrantzatik

Bakiora 28 egunez lekuzaldatutako bareetan

VvDIG Bakioko jatorrizko balioetaraino igo ez

bazen ere, igoera gradualaren ebidentzia argiak

topatu ziren (10C Ird.). VvEXC/VvDIG ratioak ere

joera horren aztarnak islatzen ditu (10D Ird.).

EZTABAIDA

Metal-kutsadura kronikoaren aurreko

moldarazpena

Metal-kutsadura kronikoa eta bere efektua

lehorreko organismoen gainean, utzitako meatzeak

zelai-laborategi merke eta eraginkor gisa erabiliz

iker daiteke (Ireland & Wootton, 1975; Dallinger et

al., 1989; Marigómez et al., 1998a). Ikerlan

honetan, Zn-meatze batean (Karrantzan) hainbat

hamarkadaz bizitako bareen populazioek Pb eta Zn

kontzentrazio esangarriki altuagoak erakutsi

zituzten, erreferentziazko tokikoekin alderatzekotan

(Bakio). Ehunetako metalen kontzentrazioak

lurzoruan neurtutakoekin bat datoz. Behaketa

horiek, lehorreko gastropodoen liseri-guruinean

neurtutako metalen kontzentrazioak ingurumeneko

metalen mailekin erlazionaturik daudela baieztatu

dute (Ireland, 1981; 1982; Marigómez et al., 1998a;

Beeby & Richmond, 2002). Karrantzako bareek, Pb

eta Zn kutsadura kronikoaren pean egonik, hainbat

belaunalditan zehar bizirik irautea lortu dute. Hala

ere, Zn-meatzean bareek bizirik jarraitu arren,

nolabaiteko estres kronikoa pairatu dutela espero

daiteke, biomarkatzaile lisosomikoek agerian utzi

dutenez (ikus aurrerago).

Bizirauteko gaitasun hori ez zaigu horren

deigarria iruditu, euren ehunetan oso metal

kantitate altuak metatu dituzten metal kutsatzailen

pean egondako barraskilo eta bareetan garrantzi

gutxiko hilkortasuna aurkitu baita (Russell et al.,

1981; Marigómez et al., 1986c; 1998a; Greville &

Morgan, 1991; Berger & Dallinger, 1993; Dallinger,

1994). Gainera, metal batetik bestera

6. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzareninguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruinean neurtutako metalotioneinen (MT) kontzentrazioa. (A)Kutsatu gabeko tokitik meatzera lekuzaldatutako bareak; (B)Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak.Segmentu bertikalek desbidazio estandarrak adierazi dituzte.Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriakadierazi dituzte p<0.05 mailan.

sentikortasuna eta tolerantzia alda daitezke

(Laskowski & Hopkin, 1996). Pb/Zn-z kutsatutako

eta kutsatu gabeko tokien arteko lekuzaldatze-

esperimentuetan oinarrituz, bareen metalekiko

tolerantziaren berri aurretikoz argitaratu da.

Tolerantzia hori, metalen metaketaren murrizpenaz

fenotipikoki adierazten da; Cd moduko beste metal

astunekiko tolerantzia, ordea, metatze-gaitasun

areagotuaz karakterizatzen den bitartean (Greville

& Morgan, 1991). Eskuarki, metal-kutsadura


201

7. Irudia: Erreferentzia tokian(Bakio) eta antzinako meatzareninguruan (Karrantza) hartutakoArion ater bare arren liseri-guruinean neurtutako ß-glukuronidasa jarduerarenparametro estereologikoak. (A)Kutsatu gabeko tokitik meatzeralekuzaldatutako bareen dentsitatebolumetrikoa; (B) Meatzetikkutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareen dentsitatebolumetrikoa; (C) Kutsatu gabekotokitik meatzera lekuzaldatutakobareen dentsitate superfiziala; (D)Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareendentsitate superfiziala; (E)Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareenAzalera/Bolumena ratioa; (F)Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareenAzalera/Bolumena ratioa; (G)Kutsatu gabeko tokitik meatzeralekuzaldatutako bareen dentsitatenumerikoa; (H) Meatzetik kutsatugabeko tokira lekuzaldatutakobareen dentsitate numerikoa.Segmentu bertikalek desbidazioestandarra adierazi dituzte. Goikoasteriskoek taldeen artekodesberdintasun esangarriakadierazi dituzte p<0.05 mailan.

zelaian pairatzekotan, hautespen-presioak

animalien gainean eragin esanguratsua izan

dezake; kutsatzaileen harrera murrizteak eta iraizte

edo eta metatze bidezko detoxifikazio-tasak

areagotzeak, hautespenerako abantaila ekar

lezaketelarik (Wang & Rainbow, 2005). Bare eta

barraskiloek toki kutsatuetan bizirauteko duten

ahalmena, metalak detoxifikatu edo gehiegizko

esposizioa ekiditeko duten gaitasunean oinarritzen

dela dirudi. Oro har, metalekiko erresistentzia,

metal-ioiak (Cd, Cu, Zn) estuki bahitzen dituzten

metalotioneinen ekoizpenarekin zein liseri-

guruineko lisosometan eta pikor mineralizatuetan

metal toxikoen bahiketarekin erlazionatuta dago

(Hopkin et al., 1989; Dallinger, 1993; Marigómez et

al., 2002; Dallinger et al., 2004). Hirigunetako

barraskilo eta meatzetako bareen kasuan

proposatu denez, Pb- eta Zn-esposizio kronikoak

hautespen naturalerantz darama, mekanismo

genetiko edo eta anbientalen bitartez (Beeby &

Richmond, 1987; Greville & Morgan, 1991).

Fenotipo tolerante hautatuak, beste

bereizgarrien artean, liseri-guruineko epitelioko

zelula-moten banaketa eta presentzia erlatiboan

islatutako desberdintasunez karakterizatuta daude

(Marigómez et al., 1998a). Lehorreko

gastropodoetan, metalen metaketa eta

detoxifikaziorako toki nagusia liseri-guruina dugu,

eta bere epitelioa 3 zelula-motez osaturik dago:

liseri-zelula, iraizte-zelula eta kaltzio-zelula

(Sumner, 1965). Egoera normaletan, liseri-zelulak

ugarienak dira, baina Cd-z kutsatutako tokietan bizi


202

8. Irudia: Kutsatu gabeko tokiko (A eta C irudiak) eta Zn-meatzeko bareen (B eta D irudiak) irudi histologikoak, bai Hematoxilina-eosinaz (A eta B) zein toluidina urdinez (C eta D) tindatutako ebakietan. DC) liseri-zelula, EC) iraizte-zelula, eta CC) kaltzio-zelulaadierazten dute. Eskala-marra: 50 µm (A eta B irudiak); 20 µm (C eta D irudiak).

diren bareetan kaltzio-zelulak eta iraizte-zelulak

zelula-mota nagusiak bilaka daitezke (Marigómez

et al., 1998a). Epe luzeko/kronikoak diren

kutsatzaile-esposizioen ondorioz, zelula-moten

osaketaren halako aldaketak, moluskuen erantzun

orokortzat har daitezkeela dirudi (Rasmussen et al.,

1983; Widdows et al., 1984; Cajaraville et al.,

1990a; 1990b; Marigómez et al., 1990b; 1996;

1998a), azken finean kutsatzaileen aurreko

erantzuna zein erantzun horren zenbait parametro

adierazle ere eragin ditzaketelarik (Marigómez et

al., 1998b).

Laborategiko baldintzetan metal-kutsadura

pean jarritako lehorreko gastropodoen liseri-

guruinean, xafla basalak loditu, liseri-zelulak

lehendabizi bakuolizatu eta ondoren gutxiagotu,

kaltzio-zelulak hipertrofiatu, kaltzio- eta iraizte-

zelulak erlatiboki ugaritu, epitelioa mehetu, eta

odol-zelulak zein ehun konektiboko zelula

migratzaileak liseri-azinoen inguruan metatu egiten

dira (Marigómez et al., 1986a; 1986b; 1996; 1998a;

Recio et al., 1988a; 1988b; Ireland & Marigómez,

1992). Metal-kutsadurarekiko moldarazpenaren

“steady state” hori, metal toxikoen maila subletalen

pean kronikoki egondako zelaiko bareen

populazioetan ere gerta daiteke (Marigómez et al.,

1998a). Ikerlan honetan, Karrantzako bareetan

(utzitako zink-meatzea) aldez aurretik


203

9. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) etaantzinako meatzaren inguruan(Karrantza) hartutako Arion ater barearren liseri-guruinean neurtutako osaketazelularra. (A) Kutsatu gabeko tokitikmeatzera lekuzaldatutako bareak; (B)Meatzetik kutsatu gabeko tokiralekuzaldatutako bareak.

deskribatutako liseri-guruinaren antolakuntz

histologikoaren patroi berbera aurkitu dugu.

Bakioko bareen liseri-azinoak liseri-zelula ugariz,

erlatiboki urriagoak ziren iraizte-zelulez eta oso

urriak ziren kaltzio-zelulez osaturik agertu

zitzaizkigun. Karrantzan iraizte-zelulen dentsitate

bolumetrikoa Bakion baino altuagoa izan zen, eta

horretaz gain, liseri-zelulek pikor zitoplasmatikoen

iraiztean biziki ziharduten, eta bakuolizazio

nabarmena erakutsi zuten. Antzeko emaitzak

laborategian Cu eta Hg pean jarritako bareetan ere

lortu ziren (Marigómez et al., 1986b; 1996), eta

baita Cd pean eta baraurik mantendutako

barraskiloetan ere (Porcel et al., 1996; Dimitriadis &

Konstatinidou, 2002; Chabicovsky et al., 2004).

Metal-esposizio zein baraualdi ostean deskribatu

diren alterazioak antzerakoak izanik, CTR eta

asoziaturiko aldaketa histologikoak, metalen

ekintza toxiko zuzenaren ondorioa baino gehiago

metal-esposizioak eragindako liseri-prozesuen

narriaduraren ondorioa izan daitezkeela ezin da

baztertu. Izatez, bare eta barraskiloak kutsatzaileen


204

10. Irudia: Erreferentzia tokian (Bakio) eta antzinako meatzaren inguruan (Karrantza) hartutako Arion ater bare arren liseri-guruinean neurtutako liseri-zelulen dentsitate bolumetrikoa eta iraizte-zelula/liseri-zelula ratioa. (A eta B) Kutsatu gabeko tokitikmeatzera lekuzaldatutako bareak; (C eta D) Meatzetik kutsatu gabeko tokira lekuzaldatutako bareak. Segmentu bertikalekdesbidazio estandarrak adierazi dituzte. Goiko asteriskoek taldeen arteko desberdintasun esangarriak adierazi dituzte p<0.05mailan.

pean mantentzeak, elikatze-jarduera eta

hazkuntzaren murrizpen esangarria eragin dezake

(Russell et al., 1981; Marigómez et al., 1986c;

Laskowski & Hopkin, 1996; 5. Kapitulua). Dena den,

Pb eta Zn, Cu eta Cd baino toxizitate txikiagokoak

dira Helix aspersa barraskiloentzat, eta Cu eta Hg

baino toxizitate txikiagokoak A. ater bareentzat,

behintzat elikatze-jarduera, hazkuntza eta

hilkortasunari dagokienez (Marigómez et al., 1986c;

Laskowski & Hopkin, 1996). Izan ere, bareen

kasuan, janariango 300 µg/kg goragoko Zn

kontzentrazioek baino ez dute eragina liseri-

guruinaren histologian eta glukogeno-gordekinetan

(Recio et al., 1988b). Kurioski, utzitako Cu-meatze

baten aldameneko bareek, Cu, Zn eta Cd

kontzentrazio tisular altuekin batera, gorputz

osoaren eta liseri-guruinaren pisu lehorraren %50-

eko murrizpena erakutsi zuten, leku kutsatu gabeko

erreferentzia-bareekin konparatu zirenean

(Marigómez et al., 1998a). Azkenik, Cu-

(Marigómez et al., 1998a) eta Zn-meatze (ikerlan

hau) abandonatuetako bareek, liseri-zelulen

presentzia erlatiboaren murrizpenaren ezaugarri

amankomuna duten arren, metal-esposizio

kronikoaren bi egoera horietan zelula-moten

osaketa ez da berbera. Cu-meatzeko bareetan,

kaltzio-zelulek liseri-zelulak ordezkatzen dituzte

(Marigómez et al., 1998a); eta Zn-meatzekoetan,

berriz, iraizte-zelulek burutzen dute ordezkapena

(ikerlan hau). Cu eta Zn, beranduago eztabaidatuko

den moduan, bareen liseri-guruineko konpartimentu

zelular desberdinetan lokalizatzen direnez, metal-

kutsadura kronikoaren iturri desberdinen pean

egondako bareen zelula-mota osaketaren

dibergentzia, hori bi detoxifikazio-mekanismo

desberdinen existentziaren ondorioa izan liteke.

Dena dela, liseri-zelulen galera erantzun orokorra

dela dirudi (Porcel et al., 1996; 1., 4. eta 5.

Kapituluak), eta beraz CTRren parametro adierazle

orokor gisa, gaur egun erabilitako VvBAS-en ordez,

VvDIG erabiltzea gomendatuko genuke (4.

Kapitulua) edo VvEXC/VvDIG ratioa (5. Kapitulua).

Kutsatu gabeko tokiko (Bakio) bareen iraizte-

zeluletako lipofuszinetan eta liseri-zeluletako

hondakin-gorputz gutxi batzuetan AMGren bidez

ikustarazitako metalen mailak ertain eta baxuak

bitartean suertatu ziren. Halaber, odol-hodiaren

inguruko ehun konektiboko geruzan BSD

konspikuoak behatu ziren. Egoera hori

erreferentziazko oinarri-balioak dira, eta aldez

aurretik egindako zelai-ikerketa eta laborategiko

esperimentuetan lortutako emaitzekin bat dator

(Marigómez et al., 1996; 1998a). Bestalde,

Karrantzako bareetan iraizte-zelulen lipofuszina-

pikorrek zein liseri-zelulen lisosoma eta hondakin-

gorputzek, eta baita kaltzio-zelulek ere, oso AMG-

markaketa intentsoa erakutsi zuten. AMGk

eskainitako datuen arabera, bareetan Pb

lehendabizi liseri-zelulen lisosometan metatzen da

(argitaratu gabe), beste metalen kasuan, Hg eta Cd

alegia, gertatu bezala (Marigómez et al., 1996;

1998a; 5. Kapitulua). Haatik, Zn liseri-, iraizte- eta

kaltzio-zeluletan lokalizatu da (Schoettli & Seiler

1977; Recio et al. 1988a; Almendros & Porcel,

1992; Triebskorn & Köhler, 1996), esperimentu

honetan egindako AMG bidezko behaketekin bat

datorrena. Lotugai-multzoak zelulaz-zelula

desberdinak dira, eta beraz metal ezberdinak


205

zelula-mota ezberdinetan bahitzen dira (Marigómez

et al., 2002). Are gehiago, oxigeno zein sufre

emailekiko elkarkidetasuna duen mugaldeko

metala den Zn-aren metatze-tokiak, espezieen

arabera ere desberdinak izan daitezke (Marigómez

et al., 2002). Esaterako, muskuilu eta magurioetan,

non zelula basofilikoen fosfato-pikorrak bare eta

barraskiloetan bezain garatuak ez baitaude, Zn-a

nagusiki liseri-zelulen lisosometan lokalizatu da

(Soto et al., 1998; 1. Kapitulua). Azkenik, liseri-

azinoen lumenean askatutako pikor zitoplasmatiko

eta lipofuszinetan BSD behatu izanak, liseri-

guruineko zelulak metatzaile baino gehiago

konpartimentu iraizleak direla sustatuko luke

(Marigómez et al., 1990a; 1996; Soto et al. 1996;

Soto & Marigómez, 1997a; 1997b). Gorotzekin

batera metalak kanporatzeak berebiziko garrantzia

du lehorreko gastropodoetan, zeintzuei lehorrean

bizitzeko moldarazpenak deshidratazio-arriskua

baitakarkie, iraizte-fluidoen kanporatzea ahalik eta

murritzen mantentzera behartuta egonik (Riddle,

1981).

VvBSD balioak Karrantzan 10 aldiz altuagoak

dira Bakion baino, AAS bitartez lortutako datuekin

bat datorrena, eta CTRk VvBSD gainean eraginik

ez duela iradoki dezakeena. Aitzitik, bareen kasuan

liseri-zeluletan modu selektiboan metatzen diren

Hg eta Cd moduko metalen pean luzaroan

egondakoan bareetan, BSDen presentzia espero

baino baxuagoa da CTR dela eta (Marigómez et al.,

1996). Ikerlan honetan, non Zn-a liseri-guruinean

metatutako metal nagusia baita (>10 aldiz Pb

kontzentrazio tisularraren gainetik), ez dirudi CTRk

VvBSD eragiten duenik, AMG bitartez Zn-a zelula-

mota guztietan lokalizatu baita.

Metalotioneinak (MT) zeluletan metal-ioi askeen

maila baxuak mantentzeaz arduratzen dira, eta

beraien ekoizpena metaleen presentziaren aurrean

induzigarria da (Dallinger, 1995; Langston et al.,

1998). Metalotioneinak, Cu, Zn, Hg eta Cd ioiei

modu espezifikoan lotzen zaizkie eta, beraz,

eraenketa- (Cu eta Zn metaletarako) edo

detoxifikazio-molekulatzat (Hg edo Cd-rako) jo dira,

moluskuetan hainbatetan erakutsi den moduan

(Ireland, 1981; Roesijadi, 1982; Dallinger et al.,

1989; Bebianno & Langston, 1989; Dallinger, 1993;

Berger & Dallinger, 1993). Ikerlan honetan,

meatzeko eta kutsatu gabeko tokiko bareen liseri-

guruinean espertrofotometrikoki kuantifikatutako

MT- kontzentrazioak ez dira esangarriki

desberdinak. Zn- eta Pb-esposizio kronikoa, MTen

indukzioari asoziatuta ez legokeela pentsa daiteke,

metal hauek fosfato moduko bestelako lotugai

zelularrei lotuta ere egon ahal diren arren. Honekin

lotuta, aipatu beharra dago Zn askotan kaltzio-

zelulen fosfato kaltzikoko pikorretan lokalizatu dela

(Taylor et al., 1990).

Karrantzako bareen liseri-zelulen lisosomak

Bakioko bareenak baino handiagoak izan ziren,

behaketa zuzenen bitartez zein estereologia

aplikatuz frogatu den bezala. Ingurumen-estresaren

neurketa orokorra den lisosomen handiagotzea

(Cajaraville et al., 1995), efektu aski ezaguna da

moluskuen liseri-guruinean (Viarengo et al., 1984;

Marigómez et al., 2005). Zehazkiago, lindanoz

kutsatutako tokietan, lisosomen handiagotzea

lindano kutsadura gradientearekin erlazionatu da


206

(Müller, 1994). NvLYS parametroan desberdintasun

esangarriak egon barik, tamaina handiagoko

lisosomek (S/V balio baxuak adierazi duenez),

Karrantzako VvLYS balioak Bakiokoak baino 5 aldiz

handiagoak izatea eragin dute. Efektu hori, BSD

balio altuekin estuki lotuta egon daiteke, eta

kronikoki mantendutako detoxifikazio-jarduera

areagotuaren isla izan daiteke. Kutsatzaileen peko

egoerak jarduera katalitikoen areagotzea eragiten

du moluskuen liseri-zeluletan, zeinek lisosomen

forma eta funtzioen aldaketak azalduko bailituzke

(Marigómez et al., 1986a; Moore & Viarengo, 1990).

Lisosomen handiagotzea, induzitutako autofagia

prozesuen nabaritasuna izan daitekeela iradoki da;

azkenean, induzitutako autofagia horrek, kinadak

behar adina irautekotan, zelulei kaltea eta heriotza

sortarazi diezaiekeelarik (Allen & Moore, 2005).

Testuinguru honetan, afera interesgarri bat

plazaratu da. Halako lisosomen handiagotzeari,

bizialdi osoan zehar eta baita, kronikoki kutsatutako

lekuetako bareetan, belaunaldiz-belaunaldi ere

eutsi dakioke. Beraz, kalte eta heriotza zelularraren

azalpena tentuz aztertu beharko genuke.

Azkenik, muskuiluetan gertatu ez bezala (1.

Kapitulua), ez dirudi CTRk lisosomen gainean

eragina duenik. Arrazoia nagusiki metodologikoa

dela dirudi. Bibalbioetan liseri-zelulak eta zelula

basofilikoak tartekatuta agertzen dira, eta irudi-

analisian neurketak egiten direnean neurtutako

eremuan zelula basofilikoen zatiak erortzea ez da

batere arraroa. Horrela, zelula basofilikoen kopurua

altuagoa den heinean, parametro lisosomikoak

azpiestimatuak izan daitezke sistematikoki.

Gastropodoetan, bestalde, kaltzio-zelulak urriagoak

dira eta taldekaturik agertzen dira; beraz, neurketa-

eremua soilik liseri-zeluletara mugatzea errazagoa

da, baita VvDIG balioa %50 baino baxuago denean

ere.

Metal-kutsadura berriaren aurreko erantzuna

Laborategiko ikerlanetan metalen pean egon

izanak eragindako aldaketa gehienak

probokatzeko, 3 eguneko esposizio-denbora

nahikoa izan zen zelaiko baldintzetan (Marigómez

et al., 1996); ikerlan honetan erabilitako analisi

kimikoak eta esposizio- zein efektu-

biomarkatzaileak, noizbehinkako metal-kutsadura

lurzoruan detektatzeko egokiak direla erakutsiz.

Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatu

ondoren, liseri-guruineko Pb eta Zn kontzentrazioak

Karrantzako meatzeko bareetan neurtutako

kontzentrazioen mailetara heldu ziren. Bakiotik

Karrantzara lekuzaldatu ondoren, BSDetan

behatutako aldaketak metal-kutsadura berriaren

aurrean ere erantzunkorrak izan ziren. VvBSDbalioak, Karrantzan Bakion baino 10 aldiz altuagoak

zirenak, toki kutsatura 3 egunez lekuzaldatutako

bareetan 3 aldiz altuagoak suertatu ziren. Metalen

metaketa moluskuen liseri-guruinean erantzun

azkarra dena jakina da, egun batez Cd pean

egondako muskuiluen VvBSD balio emendatuek

adierazi duten legez (1. Kapitulua). Aitzitik, Bakiotik

Karrantzara lekuzaldatutako bareetan, liseri-

guruinaren MT kontzentrazioa ez zuen aldaketarik

pairatu, Zn-k eta Pb-k MTen sintesirik eragiten ez

dutenaren seinaletzat har litekeena.

Toki kutsatura 3 egunez transplantatu ondoren,

liseri-zelulen proportzio erlatiboa esangarriki jaitsi


207

zen, Karrantzako VvDC balioetara hurbilduz.

Emaitza horiek, aldez aurretiko laborategiko

datuekin bat datoz, non 3 eta 21 egun bitartean

CTR eragiten baita, espezie, kutsatzaile, dosi eta

esposizio-modu eta ingurumen-baldintzen arabera

(1., 4. eta 5. Kapituluak). Liseri-zelulen

proportzioaren beherapena, epe labur eta ertainez

Hg zein Cd + keroseno nahasketaren pean

mantentzean ere behatu da bareen liseri-guruinean

(Marigómez et al., 1996; 5. Kapitulua).

Epe laburreko forma eta tamainaren aldaketa

lisosomikoak, ustekabekoak izan litezke nolabait;

zenbait egun eta zenbait astetako tartean

kutsatzaile pean egonez gero, behin-behineko

aldaketak gerta baitaitezke (Marigómez & Baybay-

Villacorta, 2003). Oro har, kutsatzaile-esposizioak

lisosomen handiagotzea eragiten du (Viarengo et

al., 1984; Marigómez et al., 2005), baina esposizio-

denbora jakinetan lisosomen txikiagotzea

handiagotzearen aurretik joan daiteke (Marigómez

& Baybay-Villacorta, 2003). Ikerlan honetan,

Bakiotik Karrantzara 3 egunez lekuzaldatutako

bareetan, VvLYS eta SvLYS ez ziren aldatu,

handiagotzea (S/VLYS baxua) lisosomen

kopuruaren jaitsiera esangarriarekin batera gertatu

baitzen (NvLYS baxua). Ondorioz, lisosomen

handiagotzea suertatu zen, baina seguruenik

detoxifikatzeko iraizte-jarduera areagotu

izanagaitik, lisosomak gutxiagotu ere egin ziren.

Zoritxarrez, hurrengo egunetako laginak istripuz

galdu ziren, eta beraz lisosomen kopurua

Karrantzako bareetan erregistratu ziren balioetara

beranduago helduko ote zitekeen ezin izan dugu

ikusi.

Kutsadura etetearen aurreko erantzuna

kronikoki kutsatutako bareetan

Toki kutsatutik kutsatu gabeko tokira

lekuzaldatutako bareetan ustekabeko emaitzak

eskuratu ziren.

Hasteko, kutsatu gabeko tokira lekuzaldatu

ondoren, liseri-guruineko metalen orotariko

kontzentrazioa aldaketarik gabe mantendu zen edo

are altuagoa bilakatu zen, meatzeko bareetan

erregistratukoekin alderatuz. Adibidez, Bakion 3

egunez egon eta gero, Pb kontzentrazioa

Karrantzan baino 3 aldiz altuagoa izan zen, eta

Bakion 28 egunez egon ostean Zn kontzentrazioa

jatorrizko lurzoru kutsatuan baino altuagoa ere

suertatu zen. Halaber, VvBSD ez zen txikiagotu.

Aitzitik, kutsatu gabeko tokira 3-10 egunez

transplantatu ondoren, VvBSD jatorrizko leku

kutsatuan baino are altuagoa bilakatu zen.

Bederen, MT kontzentrazioak esangarriki altuagoak

agertu ziren leku kutsatutik kutsatu gabeko tokira 10

egunez lekuzaldatu ondoren. Bitartean,

Karrantzatik Bakiora transplantatutako bareen

liseri-guruineko Cu kontzentrazioak gradualki gora

egin zuen 28 egunetan zehar, erreferentziazko

mailetara heldu arte. Demagun metal kutsatzaileek

lotugai zelularrei lotzeko Cu-arekin lehiatzen baitute

bare kutsatuetan baxua den liseri-guruineko Cu-

zama, kutsadura eten eta 10 egunetara maila

normaletara itzuli zela; nola ahal izan ziren

mantendu Zn eta Pb mailak jatorrizko bare

kutsatuetan bezain altu edo are altuagoak? Zn eta

Pb-aren kanpo-iturri bat ez bazegoen, metal horiek

liseri-guruinera beste ehunetatik heldu behar izan


208

zuten. Gastropodoetan, nefrozitoek, errogozitoek

eta hemozitoek Zn eta Pb metatzen dutena jakina

da (Soto et al., 1996). Hemozito eta errogozito

bidezko metalen mobilizazioa liseri-guruinerantz,

metal toxikoen kanporatze masiborako mekanismo

gisa proposatu da (Marigómez et al., 2002). Izatez,

liseri-guruinaren funtzio nagusia metalen metaketa

izan ezik metalen iraizpena dela iradoki da

(Marigómez et al., 2002). Hori dela eta, liseri-

guruineko Zn- eta Pb-zama altuek, metalen

mobilizazio areagotu izana islatuko lukete,

gorotzekin batera kanporatuak izateko organo

honetaranzko metalen mobilizazio intentsifikatua

adieraziko luketena. Horrekin bat, Karrantzara

lekuzaldatutako bareen liseri-dibertikuluetako

lumenera askatutako hondakin zelularretan

metalen presentzia nabarmena adierazi du AMGk.

Metalen mobilizazio areagotuak ere, kutsadura eten

osteko liseri-guruineko Cu kontzentrazioaren

emendioa azal lezake. Emaitza interesgarria, liseri-

guruineko Pb kontzentrazioaren piko maximoa (3.

eguna) Zn-arenaren (28. eguna) aurretik joan izana

dugu, Pb errezago detoxifikatuko balitz azaldu

litekeena, hain zuzen. Izatez, Pb kontzentrazioa

ehunetan Zn-arena baino askoz baxuagoa da, eta

gainera, bion konpartimentu zelularrak eta lotugaiak

desberdinak izan daitezke (Marigómez et al., 2002).

Metal-kontzentrazioen igoera horiek behin-

behinekoak diren ala kronikoki kutsatutako bareek,

metal-kutsatzailerik gabe mantenduta ere, metalak

liseri-guruinetik kanporatu ezin dituztenez behin

betikoak diren finkatzeko, kutsadura eten ondoko

epe esperimental luzeagoak ezinbestekoak dira.

Bigarrenez, CTR, aldez aurretik eztabaidatu

bezala, kronikoki kutsatutako bareetan mantentzen

den erantzun azkarra izan arren, VvDIG-ren igoera

gradualak patroi korapilotsuagoa jarrai dezakeela

dirudi. 10 egunez kutsatu gabeko tokira

transplantatutako bareetan VvDIG baxuagoa da 3

eta 28 egunez transplantatutakoetan baino eta, are

gehiago, ez da Zn-meatzeko bareen VvDIG-ren

esangarriki desberdina. Liseri-guruinaren zelula-

moten osaketa normala berreskuratzea liseri-

zelulen proliferazio gaitasunean oinarritzen bada,

prozesu hau erritmikoa izango litzateke, eta

ingurugiro aldagaien eta aldagai indibidualen

menpean egongo litzateke, muskuiluen liseri-

guruinean deskribatu den bezala (Zaldibar et al.,

2004; 3. Kapitulua). Lehorreko gastropodoetan,

giltzurruneko histofisiologian ziklo semilunarrak

deskribatu dira (Capellán et al., 1990), eta beraz

liseri-guruinean antzeko aldamoldeen presentzia

ezin da baztertu. Horrek, Zn-meatzetik kutsatu

gabeko tokira lekuzaldatutako bareen liseri-

guruinean behatutako VvDIG-ren patroi

korapilotsua azal lezake. Are gehiago, Karrantzatik

Bakiora 28 egunez lekuzaldatutako bareetan ere,

VvDIG balioek Bakion neurtutakoen desberdinak

izaten zerraiten. Laborategian metal pean 3-4 astez

mantendutako eta, detoxifikatzeko asmoz, 1-2

astez kutsatzailerik gabe mantendutako bare eta

magurioetan, detoxifikazio-denbora hori nahikoa

izan zen liseri-guruinak kontrolen antzeko zelula-

moten osaketa berreskuratzeko (4. eta 5.

Kapituluak). Kutsadura kronikoaren ostean, CTR

guztiz itzulgarria denentz ikusteko, kutsadura eten


209

osteko denbora esperimental luzeagoak

ezinbestekoak dira.

Azkenik, toki kutsatutik kutsatu gabeko tokira 28

egunez lekuzaldatutako bareen liseri-zelulen

lisosomek ez zuten inolako erantzunik eman.

Haatik, Cd pean jarritako eta ondoren 14 egunez ur

garbitan arazten utzitako magurioen lisosomak

kontrol taldearen berdintsuak bilakatu ziren (4.

Kapitulua). Metal-kutsadura kroniko pean egondako

bareak, berriz, ez dirudi berreskuratzeko gai direnik,

edo behintzat 28 egun ez dirudi nahiko direnik, eta

lisosomek handiak izaten eta metal-iraizteak

areagoturik egoten darraite.

Ingurumen-biojarraipenerako garrantzizko

gogoetak

Aldez aurretik egindako ikerlanetan, animaliak

metal kontzentrazio desberdinen pean asteetan

zehar mantendu dira, baina ingurumen naturaletan

animaliak bizialdi osoan zehar metalen eragin

kroniko pean egon daitezke, euren erantzunak

nolakoak diren aztertzea jite oso interesgarria izanik

(Wang & Rainbow, 2005). Ikerlan honetan lortutako

emaitzen arabera, bareen liseri-guruinean behatu

diren ezaugarriak, metalen eragin pean aste

batzuetan zehar behatutako erantzunetatik oso

desberdinak ez dira izan. (Marigómez et al., 1986a;

1986b; 1996). Aitzitik, kronikoki kutsatutako bareen

liseri-guruinak ez du erantzun kutsadura eten

denean, edo behintzat erantzuteko gaitasun

murritzagoa adierazi du (5. Kapitulua). Hortaz,

antzekotasunak soilik azaleko ezaugarriei

legokieke, izan ere, erantzuteko gaitasuna eta

plastizitatea nabarmenki afektaturik geratu dira, eta

horrek organismoaren fisiologian eta baita

biomarkatzaileen eta bestelako kutsaduraren

esposizioaren eta efektuen neurketetan ere eragina

izan lezake. Aspaldidanik dakigunez, aldez

aurretiko metal-esposizioek hurrengo esposizioen

aurrean babes-mekanismoen areagotzea eragin

dezakete (Wang & Rainbow, 2005); baina,

berreskuratzeko gaitasun hori laborategiko

esposizio-esperimentuetan erregistratutakoa baino

mugatuagoa izatearen berri ez da oraingo lan

honetararte azaldu. Hortaz, kronikoki kutsatutako

populazioetan espero daitekeen suspertzea

laborategiko esperimentuetan oinarrituz

aurresateko, kontu handiz ibili beharra dago .

Bigarren ondorio deigarria kutsadura

kronikoaren inguruan biomarkatzaileen erabilerak

sor ditzaketen ondorioen oker eta mugen ingurukoa

da. Laborategiko esperimentuetan oinarrituz, Wu et

al.-ek (2005) kutsadura eteten denean

biomarkatzaile batzuk (entzimen indukzioa,

lisosomen integritatea) zeharo itzulgarriak direla eta

beste batzuk (kalte zelularra, patologiak), ordea,

itzulezinak edo iraunkorrak direla ondorioztatu

zuten. Autore horiek azpimarratu zutenez, nahiz eta

biomarkatzaile gehienak itzulgarriak izan,

itzulezinak direnak emaitza sasipositiboak eman

ditzakete, baldin eta ingurumen-baldintzak

nabarmenki ez hobetzekotan behintzat. Ikerlan

honetan, laborategian zenbait astetako

esposizioaren ondorioz itzulgarriak diren hainbat

erantzun biologiko (erantzun lisosomikoak,

adibidez), kutsadura kronikoaren ostean itzulgarriak

ez direla, edo behintzat modu azkarrean itzulgarriak

ez direla egiaztatu da. Kutsatzaileen aurreko


210

erantzun lisosomikoak ordu gutxiren buruan induzi

daitezkeena badakigunez, ikerlan honetan Bakiotik

Karrantzara lekuzaldatu ondoren erantzun

lisosomikoak eta metaleen metaketa

intralisosomikoa 3 egunetan gertatu izanak

egiaztatu duen bezala, 28 egunez Karrantzatik

Bakiora lekuzaldatzean inolako erantzunkortasunik

aurkitu ez izana harrigarria suertatu zaigu. Izan ere,

moldarazpen genetikoak metalen presentzian

bizirauteko gai ziren indibiduoak hautatu izan balitu,

susperketa ez zitekeen inoiz gertatuko. Hala ere,

erantzunkaiztasun hori, susperraldia luza dezakeen

plastizitatearen galeraren ondorioa ere izan

daiteke. Galdera horri erantzuteko asmoz,

susperraldi luzeagoko esperimentuak martxan

jarriko dira kronikoki kutsatutako bareak erabiliz.

Dena den, erantzuna zein den jakin ala ez,

biomarkatzaileak interpretatzean daukagun arazoa

ezin dugu gainetik kendu: biomarkatzaileak ez dira

euren maila basaletara itzultzen edo, behintzat, oso

astiro itzultzen dira. Susperraldia, biomarkatzaile,

kutsatzaile eta espeziearen sentikortasunaren

arabera aldakorra dela ere deskribatu da (Wu et al.

2005). Hala ere, gure ekarpenaren arabera,

susperraldia kutsadurak zenbat denboraz eragin

duen araberakoa izan daiteke. Beraz, kontu handiz

ibili beharra dago "Slug-Watch" moduko

biojarraipen-programetan biomarkatzaileak

kronikoki kutsatutako populazioetan aplikatzen

direnean: (a) biomarkatzaileen erantzuna

motelduta/aldatuta egon daiteke kutsadurarekiko

moldarazpenaren ondorioz (Wu et al., 2005); eta (b)

biomarkatzaileak kutsadura kronikoaren ondorioz

ez dira lehengoratzen, edo behintzat, ingurumen-

baldintzak hobatzekotan, kronikoki eta noizbehinka

edo behin-behinekoz kutsatutako populazioetan

susperraldia desberdina da (Wu et al., 2005; 5.

Kapitulua). Biomarkatzaileen gaineko

interpretazioak egiteko datu gehiago ezinbestekoak

dira. Bareetan, beste datu osagarrien artean, liseri-

guruinaren azterketa histopatologikoek bareak

kutsadura kroniko pean egon direnentz argitzeko

oso tresna baliagarria eskaini diezaigukete

(Marigómez et al., 1998a).

BIBLIOGRAFIA

Allen JI, Moore MN (2005) Environmental prognostics: Is the

current use of biomarkers appropiate for environmental risk

evaluation?. Mar. Environ. Res. 58:227-232.

Almendros A, Porcel D (1992) Phosphatase activity in the

hepatopancreas of Helix aspersa. Comp. Biochem.

Physiol. A 103:455-460.

Bebianno MJ, Langston WJ (1989) Concentration of metals

and metallothioneins in marine invertebrates using

differential pulse polarography. Portugaliae Electrochimica

Acta 7:511-524.

Beeby A, Richmond L (1987) Adaptation by an urban population

of the snail Helix aspersa to a diet contaminated with lead.

Environ. Pollut. 46:73-82.

Beeby A, Richmond L (2002) Evaluation of Helix aspersa as a

sentinel for mapping metal pollution. Ecol. Int. 1:261-270.

Berger B, Dallinger R (1989) Accumulation of cadmium and

copper by the terrestrial snail Arianta arbustorum L.:

kinetics and budgets. Oecologia 79:60-65.

Berger B, Dallinger R (1993) Terrestrial snails as quantitative

indicators of environmental metal pollution. Environ.

Monitor. Assess. 25:65-84.




Org. 9:221-228.





24.


211

Cajaraville MP, Marigómez JA, Angulo E (1991) Automated

measurement of lysosomal structure alterations in oocytes

of mussels exposed to petroleum hydrocarbons. Arch.


Cajaraville MP, Marigómez I, Díez G, Angulo E (1992)

Comparative effects of the water accommodated fractions

(WAF) of three oils on mussels. 2.- Quantitative alterations

in the structure of the digestive tubules. Comp. Biochem.

Physiol C 102:113-123.

Cajaraville MP, Marigómez I, Angulo E (1993) Correlation

between cellular and organismic responses to oil-induced

environmental stress in mussels. Sci. Tot. Environ. Suppl.

1:1353-1371.

Cajaraville MP, Abascal I, Etxeberria M, Marigómez I (1995)

Lysosomes as cellular markers of environmental pollution:

time- and dose-dependent responses of the digestive lyso-

somal system of mussels after petroleum hydrocarbon

exposure. Environ. Toxicol. Water Qual. 10:1-8.

Capellán A, Angulo E, Mateo A (1990) Histochemistry of glyco-

gen and uric acid in the kidney sac of Cernuella virgata (da

Costa, 1778) (Mollusca, Pulmonata): monthly and daily

variations. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 104:147-154.




Chem. 23:648-655.

Coughtrey PJ, Martin MH (1977) The uptake of lead, zinc,

cadmium, and copper by the pulmonate mollusc, Helix

aspersa Müller, and its relevance to the monitoring of

heavy metal contamination of the environment. Oecologia

27:65-74.

Dallinger R, Wieser W (1984) Patterns of accumulation,

distribution and liberation of zinc, copper, cadmium, and

lead in different organs of the land snail Helix pomatia L.

Comp. Biochem. Physiol. C 79:117-124.

Dallinger R, Janssen HH, Bauer-Hilty A, Berber B (1989)

Characterization of an inducible cadmium-binding protein

from hepatopancreas of metal exposed slugs (Arionidae,

Mollusca). Comp Biochem Physiol C 92:355-360.

Dallinger R (1993) Strategies of metal detoxification in

terrestrial invertebrates. 245-289 orr. Non: Dallinger R

Rainbow PS (ed) Ecotoxicology of metals in invertebrates,

Lewis Publ., Boca Raton, FL.

Dallinger R. (1994) Invertebrate organisms as biological

indicators of heavy metal pollution. Appl. Biochem.

Biotechnol. 48:27-31.

Dallinger R (1995). Mechanisms of metal incorporation into

cells. 135-154 orr. Non: Cajaraville MP (ed.) Cell biology in

environmental toxicology, University of the Basque Country

Press Serv, Bilbo, Basque Country.

Dallinger R, Chabicovsky M, Berger B (2004) Isoform-specific

quantification of metallothionein in the terrestrial gastropod

Helix pomatia. I. Molecular, biochemical, and

methodological background. Environ. Toxicol. Chem.

23:890-901.


light and electron microscopic visualization of metals in

biological tissues (gold, silver, metal sulphides and metal

selenides). Histochemistry 81:331-335.

Dimitriadis VK, Konstantinidou V (2002) Origin of excretory

cells in the digestive gland of the land snail Helix lucorum.


Greville RW, Morgan AJ (1991) A comparison of (Pb, Cd and Z)

accumulation in terrestrial slugs maintained in microcosms:

Evidence for metal tolerance. Environ. Poll. 74:115-127.

Hopkin SP, Hames CAC, Dray A (1989) X-ray microanalytical

mapping of the intracellular distribution of pollutant metals.

Eur. J. Microsc. Anal. 11:19-23.

Ireland MP, Wootton RJ (1975) Variation in the lead, zinc and

calcium content of Dendrobaena rubida (Oligochaeta) in a

base metal mining area. Environ. Pollut. 10:201-208.

Ireland MP (1979) Distribution of essential and toxic metals in

the terrestrial gastropod Arion ater. Environ. Pollut. 20:271-

278.

Ireland MP (1981) Uptake and distribution of cadmium in the

terrestrial slug Arion ater (L). Comp. Biochem. Physiol. A

73:855-858.

Ireland MP (1982) Sites of water, zinc and calcium uptake and

distribution of these metals after cadmium administration in

Arion ater (Gastropoda: Pulmonata). Comp. Biochem.

Physiol. A 73:217-221.

Ireland MP (1984a) Seasonal changes in zinc, manganese,

magnesium, copper and calcium contents in the digestive

gland of the slugs Arion ater. Comp. Biochem. Physiol. A

74:855-858.

Ireland MP (1984b) Effect of chronic and acute lead treatment

in the slug Arion ater on calcium and d-aminolaevulinic acid

dehydratase activity. Comp. Biochem. Physiol. C 79:287-

290.

Ireland MP, Marigómez I (1992) The influence of dietary

calcium on the tissue distribution of Cu, Zn, Mn and P and


212

histological changes in the digestive cells in the snail

Achatina fulica Bowdich. J. Moll. Stud. 58:157-168.

Ireland MP (1994) Interaction and effects of molybdenum

compounds on growth and mineral content of Achatina

fulica and Arion ater (Gastropoda: Pulmonata). Comp.

Biochem. Physiol. C 107:441-446.

Janssen HH, Dallinger R (1991) Diversification of cadmium-

binding proteins due to different levels of contamination in

Arion lusitanicus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20:132-

137.

Kammenga JE, Dallinger R, Donker MH, Kohler HR, Simonsen

V, Triebskorn R, Weeks JM (2000) Biomarkers in terrestrial

invertebrates for ecotoxicological soil risk assessment.

Rev. Environ. Contam. Toxicol. 164:93-147.

Langston WJ, Bebianno MJ, Burt GB (1998) Metal handling

strategies in mollouscs. 219-293 orr. Non: Langston WJ &

Bebbiano MJ (ed). Metal metabolism in aquatic

environments. Chapman & Hall, London.

Laskowski R, Hopkin SP (1996) Effect of Zn, Cu, Pb, and Cd on

fitness in snails (Helix aspersa). Ecotoxicol. Environ. Saf.

34:59-69.


digestive cells in mussels: quantitative alterations in

cellular and lysosomal structure. Aquat. Toxicol. 1: 213-

226.




Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986a) Copper treatment of

the digestive gland of the slug Arion ater L. 1. Bioassay

conduction and histochemical analysis. Bull. Environ.


Marigómez I, Angulo E, Moya J (1986b) Copper treatment of

the digestive gland of the slug Arion ater L. 2.

Morphometrics and histophysiology. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 36:608-615.

Marigómez I, Angulo E, Saez V (1986c) Feeding and growth

responses to copper, zinc, mercury and lead in the

terrestrial gastropod Arion ater (Linné). J. Moll. Stud.

52:68-78.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990a) Cellular

cadmium distribution in the common winkle, Littorina

littorea (L.) determined by X-ray microprobe analysis and

histochemistry. Histochemistry 94:191-199.

Marigómez I, Cajaraville MP, Angulo E (1990b) Histopathology

of the digestive gland-gonad complex of the marine

prosobranch Littorina littorea exposed to cadmium. Dis.

Aquat. Org. 9: 229-238.

Marigómez I, Soto M, Angulo E (1992) Seasonal variability in

the quantitative structure of the digestive tubules of

Littorina littorea. Aquat. Living. Resour. 2:299-305.

Marigómez I, Soto M, Etxeberria M, Angulo E (1993) Effects of

size, sex, reproduction, and trematode infestation on the

quantitative structure of digestive tubules in stressed

winkles. Zool. Jb. Anat. 123:319-336.

Marigómez I, Cajaraville MP, Quincoces I, Salisbury JR (1995)

Computer assisted 3-d reconstruction techniques may

provide new insides into the pattern of histological

organization of the bivalvian digestive gland. 12th Int.

Malacol. Congr. Vigo.

Marigómez I, Soto M, Cajaraville MP (1995) Morphofunctional

patterns of cell and tissue systems involved in metal

handling and metabolism. 89-134 orr. Non: Cajaraville MP

(ed.) Cell biology in environmental toxicology, University of

the Basque Country Press Serv, Bilbo, Basque Country.

Marigómez I, Soto M, Kortabitarte M (1996) Tissue-level

biomarkers of biological effect of mercury on sentinel slugs,


Marigómez I, Kortabitarte M, Dussart, GBJ (1998a) Tissue-

level biomarkers in sentinel slugs as cost-effective tools to


Toxicol. 34:167-176.


type replacement, a succesful strategy of molluscs to adapt

to chronic exposure to pollutants. Cuad. Invest. Biol.

18:431-435.

Marigómez I, Lekube X, Cancio I (1999) Immunochemical loca-

lisation of proliferating cells in mussel digestive gland tis-

sue. Histochem. J. 31:781-788.



molluscs. Micr. Res. Tech. 56:358-392.

Marigómez I, Baybay-Villacorta L (2003) Pollutant-specific and

general lysosomal responses in digestive cells of mussels

exposed to model organic chemicals. Aquat. Toxicol.

64:235-257.

Marigómez I, Soto M, Cancio I, Orbea A, Garmendia L,

Cajaraville MP (2005) Cell and tissue biomarkers in mus-

sel, anh histopathology in hake and anchovy from Bay of

Biscay after the Prestige oil spill (Monitoring Campaign

2003). Mar. Poll. Bull. (prentsan).


213


214


the pacific oyster, Crassostrea gigas, damaged by ionizing


Moore MN, Viarengo A (1990) Lysosomal membrane fragility

and catabolism of cytosolic proteins: evidence for a direct

relationship. Experientia 43:320-323.

Müller S (1984) Lindanuntersuchungen im Aquatischen und

Terrestrischen Bereich in Bilbao (nordostspanien).

Lizentziatura-Tesia. Universität Karlsruhe. 93 orr.

Pihan F, de Vaufleury A (2000) The snail as a target organism

for the evaluation of industrial waste dump contamination

and the efficiency of its remediation. Ecotoxicol. Environ.

Saf. 46:137-147.

Popham JD, D'Auria M (1980) Arion ater (Mollusca: Pulmonata)

as an indicator of terrestrial environmental pollution. Water

Air Soil Poll. 14:115-124.

Porcel D, Bueno JD, Almendros A (1996) Alterations in the

digestive gland and shell of the snail Helix aspersa Muller

(Gastropoda, Pulmonata) after prolonged starvation.

Comp. Biochem. Physiol. A 115:11-17.





Toxicol. 3:301-311.

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988a) Zinc treatment


distribution of zinc and calcium. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 41:858-864.

Recio A, Marigómez I, Angulo E, Moya J (1988b) Zinc treatment

of the digestive gland of the slug Arion ater L. 2. Sublethal

effects at the histological level. Bull. Environ. Contam.

Toxicol. 41:865-871.

Riddle WA (1981) Cold-hardiness in several species of land

snail. J. Ther. Biol.13:163-167.

Roesijadi G (1982) Uptake and incorporation of mercury into

mercury-binding proteins of gills of Mytilus edulis as a

function of time. Mar. Biol. 66:151-157.

Russell LK, DeHaven JI, Botts RP (1981) Toxic effects of

cadmium on the garden snail (Helix aspersa). Bull.


Schoettli G, Seiler HG (1977) Uptake and localization of

radioactive zinc in the visceral complex of the land

pulmonate Arion rufus. Experientia 26:1212-1213.





Soto M (1995) Simultaneous quantification of bioavailable

metals in mollusks by means of cellular and tissue

analysis. Implications for monitoring metal pollution in

water quality assessment. Doktoradutza-Tesia 330 orr.

Soto M, Agirregoikoa MG, Pérez MA, Marigómez I (1990) A

planimetric study of morphological variability in the

digestive diverticula of Littorina littorea (Linnaeus) and

Mytilus edulis Linnaeus. J. Moll. Stud. 56:339-344.

Soto M, Kortabitarte M, Marigómez I (1995) Bioavailable heavy

metals in estuarine waters as assessed by metal/shell-

weight indices in sentinel mussels Mytilus galloprovincialis.

Mar. Ecol. Prog. Ser. 125:127-136.

Soto M, Cajaraville MP, Angulo E, Marigómez I (1996)

Autometallographic localization of protein-bound copper

and zink in the common winkle, Litttorina littorea: a light

microscopical study. Histochem. J. 28:689-701.

Soto M, Marigomez I (1997a) BSD extent, an index for metal




Soto M, Marigomez I (1997b) BSD extent, an index for metal



autometallography. Mar. Ecol. Prog. Ser. 156:141-150.

Soto M, Quincoces I, Lekube X, Marigomez I (1998)

Autometallographed metal content in digestive cells of

winkles: a cost-effective screening tool for monitoring Cu

and Zn pollution. Aquat. Toxicol. 40:123-140.






Sumner AT (1965) The cytology and histochemistry of the

digestive gland cells of Helix. Q. J. Microsc. Sci. 106:173-

192.

Taylor MG, Graves GN, Simkiss K (1990) Biotransformation of

intracellular minerals by zinc ions in vivo and in vitro. Eur.

J. Biochem. 192:783-789.


starvation on structure and function of the digestive gland

of the mussel (Mytilus edulis L) J. Mar. Biol. Assoc. U.K.

54:699-712.

Triebskorn R, Köhler HR (1996) The impact of heavy metals on

the grey garden slug, Deroceras reticulatum (Muller): Metal

storage, cellular effects and semi-quantitative evaluation of

metal toxicity. Environ. Poll. 93:323-343.

UNEP/RAMOGE (1999) Manual on the biomarkers recommen-

ded for the MED POL biomonitoring programme. Athens.

UNEP.

Vega MM, Marigómez I, Angulo E (1989) Quantitative

alterations in the structure of the digestive cell of Littorina

littorea on exposure to cadmium. Mar. Biol. 103:547-553.

Viard B, Pihan F, Promeyrat S, Pihan JC (2004) Integrated

assessment of heavy metal (Pb, Zn, Cd) highway pollution:

bioaccumulation in soil, Graminaceae and land snails.

Chemosphere 55:1349-1359.

Viarengo A, Pertica M, Mancinelli G, Orunesu M, Zanichi G,

Moore MN, Pipe RK (1984) Posible role of lysosomes in

the detoxication of copper in digestive gland cells of metal

exposed mussels. Mar. Environ. Res. 14:469-470.

Wang WX, Rainbow PS (2005) Influence of metal exposure

history on trace metal uptake and accumulation by marine

invertebrates. Sci. China C. Life Sci. 48: 110-117.

Weibel ER (1979) Stereological Methods. 1. Academic Press,

London 415 orr.





Wu RSS, Siu WHL, Shin PKS (2005) Induction, adaptation and

recovery of biological responses: Implications for

environmental monitoring. Mar. Poll. Bull. 51:623-634.


Trans. Roy. Soc. Edin. 54: 703-718.

Zaldibar B, Cancio I, Marigómez I (2002) Model slug to investi-

gatethe role of calcium cells in adaptation in chronic metal-

pollution. SETAC Europe 12th Meeting. Viena.





215


216

1.- Kutsatzaile organiko, ez-organiko zein bien nahasketaren pean jartzen direnean,

Mytilus galloprovincialis muskuiluan zelula-moten ordezkapena ematen da, zelula

basofilikoak liseri-zelulak ordezkatzen dituztelarik; dena den, ordezkapen zelularra

emateko beharrezkoa den kontzentrazio eraginkorra kutsatzaile bakoitzarentzat

desberdina da.

2.- Mytilus galloprovincialis muskuiluan kutsatzaileek eragindako zelula-moten

ordezkapena, estres-iturria eteten denean itzulgarria da; hala ere, zelula-moten

ordezkapenaren gainean, kutsatzaileak nahasketetan agertzearen eta muskuiluak aldez

aurretik estres-egoeran egotearen gisako faktoreek erantzun-patroian eragina eduki

dezakete.

3.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruinaren ehunean kadmioa

detektatzeko erabili den autometalografia bitartez errebelatutako zilarrezko hauspeakin

beltzak, liseri-zelulen lisosomen barnean espezifikoki lokalizatu dira. Lokalizazio espezifiko

hori dela eta, zelula-moten ordezkapenak zilarrezko hauspeakin beltzen dentsitate

bolumetrikoaren balioen gainean eragina dauka, metala metatzeko konpartimentuaren

txikitzearen ondorioz.

4.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruineko liseri-zeluletan irudi mitotikoak

behatu izanak eta BrdU immunohistokimikaren emaitzek, zelulen berriztapena liseri-

guruineko zelula helduen zatiketa autologoaren bitartez gauzatzen dela egiaztatu dute.

Urdaileko eta liseri-guruineko unitate albeolotubularretako epitelioek, zelulen berriztapen-

tasa ertaina eta altua bitartekoa dute. Epitelio-zelulen berriztapen hori sinkronizatuta dago,

24 ordutan 2 ziklo osoak bete dituen aldamolde zirkamareala jarraituz.

5.- Mytilus galloprovincialis muskuiluaren liseri-guruineko epitelioaren berriztapena,

muskuiluaren itsasaldi-erregimen eta urteko sasoiaren arabera alda daiteke. Horrela,

mareazpiko muskuiluetan egunero 2 ziklo ikusi diren bitartean, marearteko muskuiluetan

beti uretatik kanpo ematen den zelula proliferazioaren piko bakarra ikusi da, epitelioaren

berriztapen-dinamika desberdina izanik. Gainera liseri-guruineko zelulek, udazkenean eta

neguan baino proliferazio-jarduera bortitzagoa udan erakutsi dute; areagotutako

berriztapena, seguruenik, udan ematen den metabolismo-tasa altuarekin eralzionatuta

egonik. Muskuilu gazte eta helduek, proliferazio-maila eta berriztapen-dinamikaren

aldamolde beretsua agertu dute, urte-sasoi zein itsasaldi-erregimen desberdinetan.

219

Ondorioak eta tesia

6.- Kadmio pean jarritako Littorina littorea magurioan behatutako zelula-moten

ordezkapena, liseri-zelulen galerak eta aldibereko zelula basofilikoen hipertrofiak sortua

da; prozesu hori, muskuiluetan gertatzen den moduan, estres-iturria etetean itzulgarria

delarik. Liseri-zelulen proliferazioa, kadmio pean mantendutako magurioetan areagotua

agertu da, eta tendentzia hori, arazte-aldiaren ondoren mantendu da. Gainera, liseri-

zelulen galerak eta berreskurapenak, ikerlan honetan erabilitako maila zelular eta

tisularreko biomarkatzaileen gainean eraginik ez duela dirudi; seguruenik, magurioen

kasuan zelula basofilikoak taldekaturik agertzen direlako eta, beraz, mikroskopioa erabiliz

neurketak egiteko errez bazter daitezkeelako.

7.- Kutsatzaile organiko eta ez-organikoen nahasketa pean jarritako Arion ater bareen

liseri-guruinean zelula-moten ordezkapena gertatu da. Dena den, zelula-moten osaketa

berriak, ez du liseri-guruinaren metaketa-gaitasunean eta erabilitako maila zelular eta

tisularreko biomarkatzaileen gainean eraginik izan. Hiru zelula-motez osatutako bareen

liseri-guruinean, liseri-zelulen galera netoa suertatu beharrean, liseri-zelulak iraizte-zelula

faserantz pasatzea areagotu egin da.

8.- Metal-kutsadura kroniko pean hainbat belaunaldiz egondako Arion ater bareetan

liseri-guruineko epitelioa zelula-moten osaketan aldatutak gertatu dira. Hala ere, liseri-

zelulen galerak, erabilitako zelula- eta ehun-maileko biomarkatzaileen gainean ez du

eraginik izan, zelula-mota guztiak aztertutako metaleen (Zn, Pb) metatzaileak baitira.

Bestalde, kronikoki kutsatutako bareen populazioak kutsatu gabeko tokira

lekuzaldatutakoan, biomarkatzaileen erantzuna motelduta/aldatuta ageri da, seguruenik

kutsadurarekiko moldarazpenaren ondorioz. Gainera, biomarkatzaileak, kutsadura

kronikoaren ostean ez dira lehengoratzen; edo behintzat, ingurumen-baldintzak

hobatzekotan susperraldiaren iraupena, kronikoki eta noizbehinka kutsatutako

populazioetan desberdina da.

220

Ondorioak eta tesia

TESIA

Moluskuen liseri-guruinaren berriztapena, epitelioa osatzen duten zelulen zatiketa

autologoa dela medio burutzen da. Muskuiluetan, berriztapen horrek itsasaldiekin eta

fotoperiodoarekin erlazionatutako zikloak jarraitzen ditu. Dena den, itsasaldi-

erregimenaren eta urteko sasoiaren moduko ingurumen-faktoreek zikloen gainean eragina

dute. Ingurumenean dauden kutsatzaileek ere, liseri-epitelioa osatzen duten zelulen

proliferazio-jarduera areago dezakete, muskuilu, magurio zein bareetan, liseri-epitelioaren

osaketa-zelularrean aldaketak sorreraziz, liseri-zelulen kopuru erlatiboaren jaitsiera barne.

Aldaketa horiek, laborategiko egoeretan itzulgarriak diren arren, kronikoki metalen pean

egondako bareetan itzulgarritasun hori motelduta ageri da. Liseri-guruineko epitelioan

gerta daitezkeen zelula-moten osaketaren aldaketak, ingurumen-toxikologian erabilitako

biojarraipen-programetako esposizio- eta efektu-biomarkatzaileak aplikatzerakoan

kontuan hartu beharreko fenomenoa da, zenbait kasutan biomarkatzaile desberdinen

gainean eragina dutelako.

221

Ondorioak eta tesia

METODOLOGI-ERANSKINA

GERTAKUNTZA HISTOLOGIKOA

1.- Disekzionatu berri diren laginak Carnoy fixatzailean fixatu ordu batez.

Carnoy Fixatzailea (100 ml)Etanol absolutua 60 mlKloroformoa 30 mlAzido azetiko glaziala 10 ml

2.- Laginak deshidratatu eta parafinan inkluditu.

%80 etanola 45 min%100 etanola 2 x 45 minMetilo bentzoatoa Gau osoaBentzenoa 2 x 45 minParafina 4 ordu 60ºC-tan

HEMATOXILINA-EOSINA TINDAKETA

7 µm-ko lodierako ebakiak hurrengo protokoloa jarraituz tindatu.

Xilola 2 x 10 min%100 etanola 2 x 2 min%96 etanola 2 min%70 etanola 2 minH2O distilatua 5 minHarris Hematoxilina 4 minH2O distilatua 2 minH2O distilatua 10 seg

H2O distilatua 10 segAlkohol azidoa 10 segH2O distilatua 5 min

Litio karbonatoa 10 segH2O distilatua min 1%70 etanola 3 min%80 etanola min 1Eosina min 1%96 etanola 2 x 2 min%100 etanola 2 x 2 minXilola 2 x 2 minEbakiak DPX (Fluka 44581) muntai-medioan montatu.

225

Metodologi-eranskina

Harris HematoxilinaHematoxilina 5 g%100 etanola 37 mlPotasio aluminio oxidoa 75 gOxido merkurikoa 2.5 gH2O distilatua 500 ml

Osagaiak nahastu. Nahasketa, irakite punturaino berotu eta giro tenperaturaraino hoztendenean 5 ml azido azetiko glaziala gehitu.

EosinaDisoluzio amaEosina (horia) 10 gH2O distilatua 200 ml

Disoluzioa pixkanaka berotu, eta ondoren hoztu denean

%96 etanola 800 ml

Lan disoluzioaDisoluzio ama 100 ml%80 etanola 300 mlAzido azetiko glaziala 2 ml

Alkohol azidoaAzido klorhidrikoa 1N 5 ml%70 etanola 100 ml

Litio karbonatoaLitio karbonatozko disoluzio saturatua H2O distilatuan.

226


MASSON-GOLDNER TRIKROMIKOA TINDAKETA


Xilola 2 x 10 min%100 etanola 2 x 2 min%96 etanola 2 min%70 etanola 2 minH2O distilatua 5 min

Groat Hematoxilina 4 minDabilura 5 minPonceau fuzsina azidoa 5 min%1 azido azetiko H2O disoluzioa 10 seg

Laranja G molibdikoa 5 min%1 azido azetiko H2O disoluzioa 10 segBerde argia 5 min%1 azido azetiko H2O disoluzioa 10 seg%70 etanola 2 min%96 etanola 2 x 2 min%100 etanola 2 x 2 minXilola 2 x 2 minEbakiak DPX muntai-medioan montatu.

Groat Hematoxilina (100 ml)Hematoxilina 0.5 g%96 etanola 50 mlAzido sulfurikoa 0.8 mlAlunbre ferrikoa 1 gH2O distilatua 50 ml

Ponceau fuszina azidoa (300 ml)Fuszina basikoa 1 gPonceau 0.2 gAzido azetikoa 0.6 mlH2O distilatua 300 ml

Laranja G molibdikoa (100 ml)Laranja G 2 gAzido fosfomolibdikoa 4 gH2O distilatua 100 ml

Berde argia (100 ml)Berde argia 1 gAzido azetikoa 2 mlH2O distilatua 100 ml

227


AUTOMETALOGRAFIA

A) PARAFINAZKO EBAKIAK


Xilola 2 x 10 min%100 etanola 2 x 2 min%96 etanola 2 min%70 etanola 2 minH2O distilatua 5 minLehorketa Gau osoa 37ºC-tanEmultsioa 30 minErrebelatzailea 15 minGelsitze-soluzioa 1 minFixatzailea 10 minEbakiak Kaiser gelatina glizerinatua (Merck 1.09242.0100) muntai-medioan

montatu.

Errebelatzailea (100 ml)Errebelatzailea (Tetenal ultrafilm B/W developer) 20 mlH2O distilatua 80 ml

Gelditze-soluzioa (100 ml)Azido azetiko glaziala 1 mlH2O distilatua 99 ml

Fixatzailea (100 ml)Fixatzailea (Agefix B&W fixer) 10 mlH2O distilatua 90 ml

B) ERRETXINAZKO EBAKIAK

B-1) EBAKI SEMIFINAK

3-4 µm-tako lodierako ebakiak hurrengo protokoloa jarraituz tindatu ziren.

Emultsioa 30 minErrebelatzailea 30-45 minGelditze-soluzioa 1 minFixatzailea 10 minEbakiak Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.

Errebelatzailea (100 ml)Errebelatzailea (KODAK D-19) 15 gH2O distilatua 100 ml

228


Gelditze-soluzioa (100 ml)Azido azetiko glaziala 1 mlH2O distilatua 99 ml

Fixatzailea (100 ml)Fixatzailea (Agefix B&W fixer) 10 mlH2O distilatua 90 ml

B-2) EBAKI ULTRAFINAK

3-4 µm-ko lodierako ebakiak aurretik azaldu bezala tindatu. Ondoren, tindatutako laginakberriro ere EPON erretxinan inkluditu, erretxina polimerizatu, ebaki ultrafinak eskuratu eta azetatouraniloz tindatu.

IMMUNOHISTOKIMIKA

A) PCNA IMMUNOHISTOKIMIKA (Marigómez et al., 1999)

1.- Disekzionatutako laginak aurretik azaldu bezala prestatu.

2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren ebakiakxiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu.

Porten silanizazioaPortak ur detergentea duen ur distilatuan garbitu 30 min-ordu 1.Uretan garbitu.Portak 130ºC-tan lehortu.Portak %2 3-aminopropiltrietoxisilano (Sigma A-3648) azetonatan 5 segunduz murgildu. Azetonan bi bainu azkarretan garbitu. Ur bidistilatuan garbitu.37ºC-tan gau osoan lehortu.

Desparafinazioa eta hidratazioaXilola 2 x 10 min%100 etanola 2 x 2 min%96 etanola 2 min%70 etanola 2 minH2O distilatua 5 min

3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuratzea egin daiteke.Horretarako ebakiak %0.5 tripsina duen TBS-tan 5 minutuz murgildu ziren.

TBS, pH 7.6 (100 ml)Tris 0.605 gNaCl 0.877 gH2O distilatua 100 ml

229


4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa jarduera endogenoa %3 H2O2 duen

metanola 10 minutuz erabiliz blokeatu.

PBSNaCl 16 gKCl 0.4 gNaH2PO4 H2O 0.46 gNa2HPO4 12H2O 6.8 g

H2O distilatua 2 l

5.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-tan ordu batez inkubatu.

6.- Ondoren, ebakiak PCNA antigorputzarekin (PC10 klona) (Sigma P-8825) inkubatu(1:1500 diluzioa), %0.1 BSA duen PBS-tan, 4ºC-tan eta gau osoan.

7.- Ebakiak PBS-tan garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiakbiotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-tan garbitu eta gero (3 x 10 min) ABC erreaktiboan inkubatu 25 minutuz eta giro-tenperaturan.

8.- PBS-tan garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera diaminobenzidina(DAB) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi.

DAB disoluzio kromogenoaDAB 0.06 gPBS 75 mlH2O2 25 µl

9.- Ebakiak Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatzen dira eta ur distila-tuan garbitu onodoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.

B) BrdU IMMUNOHISTOKIMIKA

B-1) Peroxidasa bidezko detekzioa.


2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren ebakiakxiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu.

3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuratzea egin daiteke.Horretarako ebakiak %0,5 tripsina duen TBS-tan 5 minutuz murgildu.

230



4.- Ebakiak PBS-an garbitu eta peroxidasa aktibitate endogenoa %3 H2O2 duen

metanola 10 minutuz erabiliz blokeatzen da.

5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan DNA harizpien bereizketa lortzeko. Ondoren sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min).

Sodio tetraboratoa 0.1 M, pH 8.5 (100ml)B4O7Na2 3.814 g

H2O distilatua 100 ml

6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %0.1 BSA duen PBS-an ordu batez inkubatu.

7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) (1:100 diluzioa) inkubatu %0.1 BSAduen PBS-an, ordu batez eta giro tenperaturan.

8.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta antigorputza abidina-biotina entzima konplexuaren bitartez ikustarazi Vectastain Elite ABC Kit-a (Burlingame) erabiliz. Horrela, ebakiakbiotinilatutako arratoiaren aurkako zaldiaren antigorputz sekundarioan inkubatu (1:200 diluzioa) 30minutuz giro tenperaturan. Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (3 x 10 min), ABC erreaktiboan 25 minutuz inkubatu giro-tenperaturan.

9.- PBS-an garbiketak egin ondoren, ebakien peroxidasa jarduera 3 amino 9 etilkarbazol(AEC) (Sigma A-6926) disoluzio kromogenoa erabiliz ikustarazi.

AEC kromogenoaren disoluzioaAEC disoluzioa 200 µlSodio azetatoa 0.05 M 4 mlH2O2 2 µl

AEC DisoluzioaAEC 20 mgDimetilformamida 2.5 ml

Sodio azetatoa 0.05 M, pH 5.2 (100 ml)Sodio azetatoa 0.6804 gH2O distilatua 100 ml

10.- Ebakiak, Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur distilatuangarbitu eta ondoren Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.

231


B-2) Fosfatasa alkalino bidezko detekzioa.


2.- Ebakiak silanizatutako portaobjektuetan itsatsi eta 60ºC-tan lehortu. Ondoren, ebakiakxiloletan eta etanolezko bainutan desparafinatu eta hidratatu.

3.- Beharrezkoa bada laginetan antigenizitatearen berreskuraketa burutu daiteke.Horretarako ebakiak %0.5 tripsina duen TBS-an 5 minutuz murgildu.


4.- Ebakiak PBS-an garbitu.

5.- Ebakiak 11.36 N HCl-an ordu batez inkubatu 37ºC-tan, DNA harizpien bereizketa lort-zeko. Ondoren, sodio tetraborato indargetzailean inkubatu (2 x 5 min).

Sodio tetraboratoa 0.1M, pH 8.5 (100ml)B4O7Na2 3.814 gH2O distilatua 100 ml

6.- Ebakiak PBS-an garbitu (3 x 10 min) eta %5 BSA duen PBS-an 20 minutuz inkubatu.

7.- Ondoren, ebakiak BrdU antigorputzarekin (Roche) inkubatu (1:100 diluzioa) %1 BSAduen PBS-an, ordu batez eta giro-tenperaturan.

8.- Ebakiak PBS-an garbitu (5 minutuz etangabe irabiatzen) eta antigorputza abidina-biotina-entzima konplexuaren bitartez ikustarazi, Sigma Mouse Extravidin Alkaline PhosphataseStaining Kit-a (Sigma EXTRA 2A) erabiliz. Horrela, ebakiak biotinilatutako arratoiaren aurkakoahuntzaren antigorputz sekundarioarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz giro-tenperaturan.Ondoren, ebakiak PBS-an garbitu ostean (5 minutuz etengabe irabiatzen) Fosfatasa alkalinoanitsatsita daraman extrabidinarekin inkubatu (1:20 diluzioa) 20 minutuz eta giro-tenperaturan.

9.- Laginak TBS-an garbitu 5 minutuz eta fosfatasa alkalino jarduera Fast Red TR/Naphtoltabletak sustrato gisa erabiliz ikustarazi (Sigma F-4523).

10.- Ebakiak Mayer Hematoxilinaren bainu azkar baten bitartez kontrastatu eta ur distilatuan garbitu ostean Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.

232


Mayer Hematoxilina (1l)Hematoxilina 1 gAlunbre potasikoa 50 gSodio Iodatoa 0.2 gAzido Zitrikoa 1 gKloral hidratoa 30 gH2O distilatua 1 l

ß GLUKURONIDASA HISTOKIMIKA (Cajaraville et al., 1991)

1.- Disekzionatu berri diren laginak % 2.5 NaCl eta %10 sakarosa duen fosfato indarget-zailean (0.1 M) 15 minutuz murgildu.

Fosfato indargetzailea 0.1 M, pH 7.4 (100ml)NaH2PO4 H2O 0.256 gNa2HPO4 12H2O 2.892 g


2.- Laginak nitrogeno likidotan izoztu.

3.- Kriostatoan eskuratutako 8 µm-ko lodierako ebakiak izozkailutik hozkailura eraman etabertatik giro tenperaturara igaro bertan hainbat minutu utziz.

4.- Ebakiak inkubazio-medioan inkubatu 37ºC-tan, eta 40 minutuz muskuilu, 20 minutuzmagurio eta 10 minutuz bareen kasuan, hain zuzen.

Inkubazio-medioaAzetato indargetzailea 285 mlNaftola (Sigma N-1875)) 0.081 gSodio bikarbonatoa 3.468 mlPolibinilo alkohola 30.60 g

Azetato indargetzailea 0.1 M, pH 4.5 (600 ml)NaCl 15 g Sodio azetatoa 7.344 gAzido azetikoa 3.78 mlH2O distilatua 600 ml

Sodio bikarbonatoa (100 ml)NaHCO3 0.42 gH2O distilatua 100 ml

5.- Ebakiak azetato indargetzailean 2 minutuz garbitu 37ºC-tan.

6.- Ebakiak %0.1 Fast Garner GBC (Sigma F-6504) eta %2.5 NaCl duen fosfato

233


indargetzailean 10 minutuz sartu.

7.- Ebakiak, Baker formol kaltzikoan fixatu 10 minutuz. Formol kaltzikoak hotza egonbehar du.

Baker formol kaltzikoa (100 ml)Formaldehidoa (%40) 10 ml (pH = 7)CaCl2 3 gNaCl 7.5 gH2O distilatua 100 ml

8.- Ebakiak, ur distilatuko hainbat bainu azkarretan garbitu ondoren %1 Fast Green FCF(Sigma F-7252) duen ur distilatuan 2 minutuz kontrastatu giro-tenperaturan.

9.- Ebakiak, Kaiser gelatina glizerinatua muntai-medioan montatu.

X IZPIEN MIKROANALISIA ETA MAPAKETA

Erretxinan inkluditutako ebakiak, formvar/karbonoz estalitako aluminio eta titaniozkosaretxotan bildu. Ondoren, berriro ere, eta kontrastatu gabe, karbonoz estali ziren X izpien mikroanalisia egiteko.

X izpien mikronanalisia, energi dispertsiorako espektrometroa lotuta zeukan JEOL 1210STEM mikroskopioan burutu zen (kontaketa-denbora: 100 segundu). X izpien mapaketa Ag (Lα1-2.984 keV-, Lß1 -3.151 keV-), Cd (Lß1 -3.316 keV-) eta S (Kα -2.308 keV-) seinaleak batera lokalizatzeko burutu zen. Horretarako Link ISIS v1.04A softwarea erabili zen. Analisi hauek Cardiff-eko Galeseko Unibertsitatean egin ziren.

ABSORTZIO ATOMIKOZKO ESPEKTROFOTOMETRIA

1.- Disekzionatu berri ziren laginak, ur distilatuarekin garbitu eta 120ºC-tan 48 orduz lehortu.

2.- Dagoeneko guztiz lehorturik zeuden laginak pisatu.

3.- Beharrezkoa izatekotan, beirazko hodi baten laguntzaz laginak txikitu.

4.- Laginak azido nitriko kontzentratuan liseritu. Horretarako Erlenmeyer hodietan azidonitrikoa apurka isuri lagina guztiz disolbatu arte eta Erlenmeyer hodiak puxtarri batez estali liseriketa egokiagoa lortzeko.

5.- Laginen liseriketa amaituta dagoela egiaztatu ondoren, azido nitrikoa 80ºC-tan lurrundu.

6.- Lehor zeuden laginak azido nitriko diluituan (0.65 eta 0.1 M) berresekitu eta 4000 rpm-ra 4 minutuz zentrifugatu, gainjalkina eskuratu, eta neurtu bitartean hozkailuan gorde.

234


AZIL KoA-OXIDASA (AOX) JARDUERAREN NEURKETA (Small et al., 1985).

1.- Bareen liseri-guruinak TVBE indargetzailean homogenizatu eta 500 g-tan zentrifugatu,15 minutuz eta 4ºC-tan.

TVBE indargetzailea pH 7.6 (100 ml)NaHCO3 8.4 mg0.1M EDTA 1 ml%0.1 etanol 0.1 ml%10 Triton X-100 0.1 mlH2O distilatua 100 ml

2.- Gainjalkinaren 100 µl (beharrezko diluzioan) hartu eta 1.9 ml inkubazio-mediora gehi-tu. Nahasketa 5 minutuz eta 25ºC-tan iluntasunean mantendu. Substratuaren (Palmitoil-KoA(Sigma P-9276) 3 mM) 10 µl gehitu, nahastu eta absorbantziaren aldaketa neurtu 502 nm-tan 3minutuz.

Inkubazio-medioa0.5M potasio fosfato indargetzailea 2 mlDCF disoluzioa* 2 mlErrefrau peroxidasa 1200 mU/ml (Sigma P-8250) 1 ml4 M NaN3 (Sigma S-2002) 1 ml%10 Triton X-100 (Sigma X-100) 2 mlH2O distilatua 100 ml arte

*1 ml egiteko: 1.3 mg diklorofluoreszeina (DCF) (Molecular Probes D-399) 100 µl dimetilformamida + 900 µl 0.01 N NaOH-an disolbatu.

Potasio fosfato indargetzailea 0.5 M pH 7.4KH2PO4 680 mg

H2O distilatua 10 mlK2HPO4 3H2O 1140 mg


KH2PO4 disoluzioa K2HPO4 3H2O disluzioari gehitu pH 7.4 lortu arte.

Substratu disoluzioa (3 mM palmitoil-KoA oxidasa)Palmitoil-KoA (Sigma, P-9276) ur distilatuan disolbatu, beharrezko kontzentrazioa

lortu arte. 0.5 ml-tako alikuotetan izoztu eta gorde.

3.- AOX jardueraren neurketa honela burutu:mUnitate/ml = (Absorbantziaren aldaketa/minutu) x (erreakzio-bolumena/lagin-bolumena)

x (mg proteina/ml).

mUnitate/mg proteina = (mUnitate/ml) / ( mg proteina/ml)

235


236


Jakintza-arloa: Natur Zientziak MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO … · adierazi dugu. Halaber,...

Documents

Transcript of Jakintza-arloa: Natur Zientziak MOLUSKUEN LISERI-GURUINEKO … · adierazi dugu. Halaber,...