IV. MATERIAL Y MÉTODOS · 2020. 2. 21. · IV.$Material$y$Métodos$ 65$...

IV. Material y Métodos

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1. DISEÑO EXPERIMENTAL.

Esta tesis doctoral forma parte del proyecto de investigación concedido

por el Ministerio de Educación y Ciencia titulado “Ingredientes funcionales en

fórmulas infantiles que afectan al equilibrio de la flora intestinal del lactante y la

absorción y disponibilidad de nutrientes” (Referencia: AGL2007-‐63504).

Los grupos de investigación que intervinieron durante el desarrollo del

ensayo fueron el Servicio de Pediatría del Hospital Universitario Virgen de la

Arrixaca, el Servicio de Microbiología del mismo hospital, el grupo de

Investigación E098-‐02 del Área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de

Veterinaria (Universidad de Murcia), el Departamento de Bioquímica y Biología

Molecular de la Universidad de Salamanca, el Departamento de Bioquímica y

Biología Molecular II del Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos,

Centro de Investigación Biomédica de la Universidad de Granada y el

Departamento de Calidad, Investigación y Desarrollo de la empresa Hero España,

S.A.

1.1. Justificación del ensayo clínico.

Las fórmulas infantiles juegan un papel indispensable en la nutrición infantil

cuando la lactancia materna no es posible o deseable. Aunque se han diseñado

para proporcionar los nutrientes necesarios para que el crecimiento y desarrollo

del recién nacido sea óptimo, hoy en día la investigación en fórmulas infantiles

tiene como objeto desarrollar productos que realicen los mismos efectos

beneficiosos que la leche materna. Uno de estos efectos recae en la particular

microbiota intestinal de los niños alimentados a pecho, que está dominada por

Bifidobacterias.

Por tanto, con este estudio se pretende investigar las posibles mo-‐

dificaciones en la microbiota intestinal infantil debido al consumo de fórmulas


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enriquecidas en nutrientes que de forma natural se encuentran en la leche

materna y que son de gran interés para el bienestar intestinal del lactante. Como

una parte del proyecto, en esta tesis se va a estudiar la colonización intestinal

por Enterobacterias así como determinar la dinámica de colonización y

diferentes características de E. coli, especie de Enterobacteria predominante en

la flora intestinal.

Para ello se plantea un estudio de intervención nutricional como ensayo

clínico abierto, aleatorizado, doble ciego y comparativo en fase III, en 3 grupos

de niños según tipo de alimentación recibida. Dos grupos tomaron fórmulas

infantiles, una enriquecida y otra estándar, y el tercer grupo de alimentación con

leche materna. Estas condiciones del ensayo aseguraron la rigurosidad de la

investigación y la veracidad de los resultados obtenidos.

1.2. Hipótesis de nuestro estudio experimental.

1.2.1. Hipótesis nula.

La alimentación del recién nacido sano con una fórmula infantil

suplementada con alfa-‐lactoalbúmina, nucleótidos y con ácido docoxahexanoico

(DHA), un ácido graso poliinsaturado de cadena larga, no induce al desarrollo de

una microbiota intestinal, concretamente en cuanto a colonización por

Enterobacterias, similar a la de los niños con lactancia materna durante un

periodo de 12 semanas, y no son diferentes a los producidos con una

alimentación a base de una fórmula estándar no adicionada.

1.2.2. Hipótesis alternativa.

La alimentación del recién nacido sano con una fórmula infantil

suplementada con alfa-‐lactoalbúmina, nucleótidos y DHA induce al desarrollo de

una microbiota intestinal, concretamente en cuanto a colonización por

Enterobacterias, similar a la de los niños con lactancia materna durante un


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periodo de 12 semanas y son diferentes a los producidos con una alimentación a

base de una fórmula estándar no adicionada.

1.3. Sujetos de estudio.

Se han estudiado un total de 62 recién nacidos a término. Estos niños

forman parte de un ensayo de intervención nutricional en el cuál se estudió la

composición de la flora fecal en neonatos durante un periodo aproximado de

tres meses y su variación según el tipo de alimentación. El reclutamiento de los

participantes se realizó en el Hospital Materno-‐Infantil Virgen de la Arrixaca

(Murcia).

Para el desarrollo del ensayo clínico se programaron 4 visitas al pediatra

durante las cuales se realizaron las diferentes evaluaciones y se recogieron las

muestras fecales. El periodo de estudio se dividió en cuatro intervalos de tiempo,

iniciándose entre los primeros 12-‐15 días de vida del niño. Los siguientes

intervalos de tiempo estuvieron comprendidos entre los 26-‐29 días, 47-‐51 días y

finalmente entre los 86-‐91 días de vida. Durante estos periodos se programaron

controles médicos en los que se realizaban las tomas de muestras de heces para

el estudio.

Los niños fueron clasificados en tres grupos según el tipo de alimentación

que iban a recibir.

1. Grupo FS (fórmula suplementada): Niños que fueron alimentados

con fórmula infantil de inicio enriquecida con ingredientes funcionales, tales

como alfa-‐lactoalbúmina, DHA y nucleótidos.

2. Grupo FE (fórmula estándar): Niños que fueron alimentados con

fórmula estándar sin dichos ingredientes funcionales.

3. Grupo LM (lactancia materna): Niños que fueron alimentados con

leche materna.


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1.4. Criterios de inclusión.

Los criterios que debían cumplir los niños para ser incluidos en el estudio

fueron:

- Edad comprendida entre 7 y 10 días.

- Recién nacidos a término con edad gestacional entre 37 y 42 semanas.

- Percentil al nacer en peso y altura entre 10 y 90.

- Test Apgar ≥ 8 a los cinco minutos del nacimiento.

- No tener antecedentes familiares de intolerancia a la proteína de leche

de vaca.

- Los padres debían de estar de acuerdo en no administrar al recién nacido

ninguna medicación, suplementos minerales o vitamínicos (excepto

vitamina D) y en alimentar al niño sólo con las fórmulas en estudio

durante la duración del mismo.

- Firma del consentimiento informado por parte de los padres

- Compromiso por parte de los padres de completar los formularios,

realizar la recogida de muestras y acudir a las visitas previstas en el

estudio.

- Las madres lactantes deberían tener buena salud, y no tomar ninguna

medicación con agentes antimicrobianos ni antifúngicos, laxantes o

medicamentos que supriman la secreción ácido-‐gástrica.

1.5. Criterios de exclusión.

- Niños alérgicos a la proteína de leche de vaca o con historia familiar de

alergia a la proteína de leche de vaca.

- Parto con cesárea.

- Recién nacidos con episodios de diarrea desde el nacimiento.

- Recién nacidos con infecciones sistémicas o congénitas, desórdenes

cardiacos, respiratorios, hematológicos y gastrointestinales.


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- Niños que han recibido suplementos de hierro, agentes antimicrobianos,

medicación antifúngica, supositorios, medicamentos con bismuto o

cualquier otra medicación que pudiera neutralizar o suspender la

secreción ácido-‐gástrica.

1.6. Criterios de retirada.

Durante el estudio los niños recibieron las fórmulas infantiles y atención

médica gratuita. La retirada del estudio fue bien de forma voluntaria o por

alguna de las siguientes causas:

- Cumplimiento insuficiente de los protocolos.

- Vómitos, diarreas y/o constipación debido a una enfermedad

diagnosticada

- Aparición de alguna dolencia orgánica, sistémica o de otro tipo que

pueda dificultar la valoración de la respuesta del recién nacido a la

formulación del estudio.

- Cualquier enfermedad que exija un cambio en la dieta durante más de 24

horas.

- Administración de medicamentos.

1.7. Aleatorización

Para asegurar una evaluación no sesgada de las intervenciones, los

grupos de estudio deben ser equivalentes en todo excepto en la intervención

asignada. Esto se consigue mediante la aleatorización, procedimiento que

equilibra entre los grupos las posibles variables no controladas, de tal manera

que si las diferencias son significativas se pueda concluir que la intervención las

ha producido (Lazcano-‐Ponce y col., 2004).


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En este estudio, para tratar de limitar la posibilidad de desequilibrios en la

asignación de tratamientos, la aleatorización se realizó en bloques equilibrados

de 4 individuos. Una vez generada la secuencia de aleatorización, se prepararon

sobres cerrados que contenían una tarjeta con el código que indicaba el tipo de

fórmula y que serviría para identificar al participante. Se adjudicó al primer

sujeto participante el tipo de fórmula y el código de identificación señalado en la

tarjeta extraída del interior del primer sobre de aleatorización. A continuación se

guardó la tarjeta como parte de la documentación del estudio que se archivaba

en el hospital. A partir de ese momento, los sujetos participantes serían

identificados con sus iniciales y código de aleatorización. En relación a los niños

alimentados con leche materna se les asignaba un número para ser identificados

junto a sus iniciales.

Tanto el participante como el pediatra desconocían la fórmula asignada a

cada individuo estando sólo en conocimiento del monitor la correspondencia

entre el número de aleatorización y el tipo de fórmula. Para asegurar el

enmascaramiento de los productos estudiados, las fórmulas se envasaron en

envases idénticos.

1.8. Esquema del ensayo.

El reclutamiento de los participantes se realizó en el Hospital Materno-‐

Infantil Virgen de la Arrixaca (Murcia) durante la estancia de las madres tras el

parto. Los pediatras fueron los encargados de informar a los padres de los

objetivos y desarrollo del ensayo entregándole un tríptico informativo (Figura 3),

además de entrevistarse con ellos para resolver las dudas que les pudieran

surgir en ese momento. En la mayoría de los casos, la decisión de participar la

tomaban una vez en casa tras el alta. Por tanto, previo al alta hospitalaria se les

asignaba aleatoriamente una de las fórmulas y se les entregaba un bote de

fórmula. Aquellos padres que decidían participar, firmaban el consentimiento

informado y se les citaba para su primera visita alrededor de los 10 días.


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Figura 3. Tríptico informativo del ensayo clínico.

Como se ha comentado anteriormente para el desarrollo del ensayo clínico

se programaron 4 visitas al pediatra durante las cuales se realizaron las


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diferentes evaluaciones y se recogieron las muestras fecales. En cada visita se les

entregaba un cuadernillo de título “7 días de Ingesta y Tolerancia” que se recogía,

una vez cumplimentado, en la siguiente visita. También se les entregaba el

material de toma de muestras de heces para que pudieran recogerlas en casa y

entregarlas en la siguiente visita programada.

Igualmente, eran las pediatras las encargadas de entregarles la fórmula

asignada en cantidad suficiente para alimentar a sus bebés durante el periodo de

tiempo transcurrido entre visitas (Figura 4).

ReclutamientoDía 1-2

Visita 1Día 8-10

Visita 2Día 22-24

Visita 3Día 43-45

Visita 4Día 85-87

Se entrega a los participantes:

ØCuadernillo “7 días de Ingesta y tolerancia”

ØMaterial de toma de muestras

ØFórmulas Infantiles

Los participantes entregan:

ØCuadernillo “7 días de Ingesta y tolerancia” cumplimentados

ØMuestras de heces

ØMuestras de leche materna

Extracción de sangre

Consentimiento informado

Figura 4. Organigrama del ensayo clínico. Los días corresponden a la edad de los

lactantes.

1.9. Aspectos éticos.

Este estudio se realizó de acuerdo con las Normas de Helsinki y las ICH

Guidelines (International Conference of Harmonization) establecidas en cuanto a

la realización de estudios clínicos en seres humanos. Además, siguió las

directrices publicadas por la EFSA (European Food Security Authority) para la

Heces

Días 12-15

Días 26-29

Días 47-51

Días 86-91


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preparación y presentación de aplicaciones, alimentos o ingredientes para

autorización de propiedades saludables.

El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del

Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia) y por el Comité Ético de la

Universidad de Murcia.

Confidencialidad.

El tratamiento, comunicación y cesión de los datos de carácter personal de

los sujetos participantes en el ensayo se ajustó a lo dispuesto en la Ley Orgánica

15/1999, de 13 de Diciembre, de Protección de datos de Carácter Personal, y

dicha información constó expresamente en el consentimiento informado.

Así mismo, los participantes se comprometieron a mantener la

confidencialidad sobre la información que se les proporcionó relativa al estudio.

Seguro de Responsabilidad Civil.

El Promotor del estudio, Hero España S.A. contaba con una póliza de seguro

de responsabilidad civil que amparaba al número total de voluntarios del estudio.

A continuación se anexa la hoja de información al participante así como la

hoja del consentimiento informado (Figura 5).

INFORMACION PARA EL PARTICIPANTE

Estudio clínico: Efecto bifidogénico, nutricional y sobre la tolerancia en recién nacidos

a término de dos fórmulas infantiles que difieren en su contenido de prebióticos,

tomando como referencia a los recién nacidos alimentados con leche materna.

Nº de protocolo: CT 03-‐05 Código de Identificación del

niño Iniciales

Objetivos:

El objetivo de este estudio es evaluar el efecto que producen sobre la flora

intestinal del recién nacido dos fórmulas infantiles que se diferencian en algunos de sus


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ingredientes con el fin de parecerse lo máximo posible a la leche materna.

Cuando es posible recurrir a ella, la leche materna es el mejor alimento para su

hijo/a y sólo cuando no sea posible dar de mamar al niño/a o cuando la madre rechace

esta posibilidad se alimentará al bebé con leche de fórmula.

Duración del estudio:

La duración del estudio será de 12 semanas

Procedimientos:

Si ha decidido no darle pecho a su hijo/a, cuando tenga entre 7 y 10 días de

edad, se le atribuirá una de las dos leches del estudio, dicha leche le será facilitada

gratuitamente durante 6 meses.

El estudio consiste en alimentar a su bebé con la fórmula asignada o con leche

materna, como único alimento, durante 3 meses desde el primer día del estudio y en

analizar muestras de heces y de sangre de su hijo/a. Así mismo se evaluará el

crecimiento de su bebé (peso, estatura y perímetro cefálico) y su estado de salud y se

realizará un seguimiento de la cantidad de leche ingerida así como de las características

de las deposiciones mediante anotación en los diarios de ingesta y tolerancia.

Durante los 3 primeros meses, se han programado 4 visitas al pediatra según el

esquema siguiente.

Esquema del estudio

Reclutamiento Día 1

Visita 1 Día 12-‐ 15 ©

Visita 2 Día 26 –

29 ©

Visita 3 Día 47 -‐

51 ©

Visita 4 Día 86 –

91 ©

Consentimiento informado

X

Aleatorización X Entrega de fórmula X X X X X Cumplimiento de los requerimientos del estudio

X X X X X

Evaluaciones Peso, estatura, perímetro cefálico

X X X X

Cuadernillo de ingesta y tolerancia (a)

X X X X

Muestras de heces (b)

X X X X

Muestras de leche materna (d)

X X X X

Muestras de sangre X (a)Registro diario durante los 7 días anteriores a la visita programada de la cantidad de formula ingerida, del momento en que se administra la alimentación, el número


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de deposiciones diarias, así como su consistencia, olor y color. (b)La recogida de las muestras de heces se llevará a cabo durante dos días antes de cada visita. ©Las visitas se pueden realizar en un periodo de 3 días para dar mayor flexibilidad al estudio.

(d)Las madres lactantes deben entregar 10 ml de leche materna extraída en total de ambos pechos.

Deberá recoger las muestras de heces de su bebé según las instrucciones del

pediatra, así como rellenar los cuadernillos “Diarios de ingesta y tolerancia”.

Si durante el estudio acude a su pediatra del Centro de Salud, le solicitará un

informe con el motivo de su visita que deberá entregar al pediatra responsable del

estudio en la siguiente visita programada.

Toma de muestras de las heces.

Se tomarán 2 muestras de heces:

Muestra 1.

En un tubo estéril que se le facilitará recogerá las heces de su hijo durante uno

o dos días antes de la visita y lo guardará en el congelador hasta el día de la visita.

Muestra 2.

En un tubo estéril recogerá las heces de una deposición el mismo día de la visita

y una vez cerrado lo introducirá en la bolsa de anaerobiosis con el sobre de

anaerobiosis y el indicador de oxígeno. Lo cerrará con el cierre hermético y lo guardará

en el frigorífico hasta la hora de la visita.

Durante cada visita deberá entregar los cuadernos de ingesta y tolerancia y las

muestras de heces. Su hijo/a recibirá la atención médica prevista y se le entregará la

leche necesaria para alimentar a su hijo hasta la siguiente visita. Durante la última visita

se realizará la extracción de sangre.

Durante el estudio se deben seguir las instrucciones del pediatra en cuanto a la

administración de vitaminas y otros suplementos al niño y seguir las indicaciones en

cuanto a la cantidad de leche que debe tomar su hijo.

Beneficios del estudio:

Mientras participe en el estudio recibirá la fórmula infantil de forma gratuita.

El beneficio general derivado de este estudio es mejorar las formulaciones de

leche infantil hacia un parecido mayor con los beneficios que proporciona la leche

materna.

Riesgos:

No se prevé ningún riesgo al utilizar las fórmulas infantiles de este estudio.


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Compensaciones:

Tal y como establece la legislación española en estudios de este tipo, el

Promotor tiene contratado un seguro que cubre cualquier eventualidad que surja

durante la realización del estudio.

Confidencialidad:

El tratamiento de comunicación y cesión de los datos de carácter personal de

los sujetos participantes en el ensayo se ajustarán a lo dispuesto en la Ley Orgánica

15/1999 de Protección de Datos de Carácter Personal. El personal médico, sin

embargo, puede enseñar los datos de su hijo a los representantes autorizados de las

Autoridades Sanitarias, al Investigador o personas que el Promotor designe, los cuales

tienen el derecho de verificar todos los datos del estudio. El personal autorizado por

Hero España puede igualmente controlar las historias médicas para comprobar el

cumplimiento del protocolo. En las publicaciones de los resultados de este estudio se

mantendrá en todo momento el anonimato de los sujetos participantes en el ensayo.

Finalización del estudio:

Tanto el médico como el Promotor del estudio pueden dar fin a la participación

de su hijo en este estudio en cualquier momento, si lo consideran apropiado, debido a

la falta de los procedimientos o en beneficio del niño. Podrá abandonar el estudio en

cualquier momento sin que esto repercuta en la atención que reciba por parte del

personal sanitario.

Información adicional.

Cualquier pregunta que desee plantear en relación con el estudio o con los

derechos de su hijo será atendida telefónicamente los Martes y Jueves de 12 a14 horas

por las pediatras Mary Ballesta, Inma Vives y Ana Almansa en los números 638124623

y 638124725 y durante las visitas programadas en el estudio. También podrá llamar

cualquier día al número de teléfono 638123996 y le atenderá la coordinadora del

estudio Mª Isabel Vasallo.

CONSENTIMIENTO INFORMADO

Título del ensayo: Efecto bifidogénico, nutricional y sobre la tolerancia en

recién nacidos a término de dos fórmulas infantiles que difieren en su contenido de

prebióticos, tomando como referencia a los recién nacidos alimentados con leche

materna.

Yo,…………………………………………………………………………………...


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-‐ He leído la hoja de información que se me ha entregado

-‐ He podido hacer preguntas sobre el estudio

-‐ He recibido suficiente información sobre el estudio

-‐ He hablado con……………………………………………………………

Comprendo que mi participación es voluntaria

Comprendo que puedo retirarme del estudio:

-‐Cuando quiera

-‐Sin que esto repercuta en los cuidados médicos de mi hijo/a

Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio.

________________________________________

___________________

Firma de los padres o el representante legal Fecha

________________________________________

___________________

Firma del Investigador Fecha

Figura 5. Hoja de Información al participante y consentimiento informado.

2. Muestras.

2.1. Muestras de alimentación: Fórmulas infantiles

Para la realización de este estudio se seleccionaron dos fórmulas infantiles

de la marca Hero (Hero España S.A.). Dichas fórmulas, elaboradas a base de leche

de vaca, han sido denominadas, para la presentación de los resultados como

Fórmula estándar (FE) y Fórmula suplementada (FS) con objeto de diferenciar la

fórmula adicionada (FS) con nucleótidos, alfa-‐lactoalbúmina y un ácido graso

poliinsaturado de cadena larga (LCPUFA), el DHA de la que no contiene dichos

ingredientes (FE).

La FS contiene 5.1 g de suero lácteo, de los cuales el 27.84% es suero

enriquecido en alfa-‐lactoalbúmina resultando un contenido de, al menos 13 g de


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alfa-‐lactoalbúmina por 100 g de suero lácteo (14.3%). El contenido de alfa-‐

alctoalbúmina por 100 g de leche en polvo sería 0.7 g. El contenido total de

nucleótidos de la FS es 3.2 mg/100 ml lo que supone un 44% del aporte de

nucleótidos de la leche materna. Además contiene un 1% de ácido

docosahexaenoico (DHA) como ácido graso. Posee 4.12 g de grasa láctea por

100g de leche en polvo (15% del total de la grasa).

En las tablas 2 y 3 se muestra la composición nutricional de la FE y de la

FS respectivamente.

Tabla 2. Composición nutricional de la fórmula estándar (FE) por 100 g y por 100 ml de

fórmula reconstituida.

COMPOSISICIÓN NUTRICIONAL

Valores medios Por 100 g Por 100 ml de fórmula

VALOR ENERGÉTICO KJ Kcal

2184 522

285 68

NUTRIENTES

Proteínas G 10.2 1.3 Caseína G 5.1 0.7 Suero G 5.1 0.7 Hidratos de Carbono G 55.2 7.2 Grasas G 29.0 3.8 Ácido linoléico Mg 4510.0 586.3 Ácido α-‐linolénico Mg 430.0 55.9 Relación 10.5 10.5

MINERALES

Sodio Mg 130.0 16.9 Potasio Mg 497.0 64.6 Cloro Mg 366.0 47.6 Calcio Mg 392.0 51.0 Fósforo Mg 220.0 28.6 Relación Ca/P 1.8 1.8 Magnesio Mg 42.0 5.5 Hierro Mg 6.3 0.8 Cinc Mg 4.2 0.5 Cobre µg 314.0 40.8 Yodo µg 78.0 10.1 Selenio µg 7.0 0.9 VITAMINAS

Vitamina A µg 523.0 68.0 Vitamina D µg 7.8 1.0 Vitamina E Mg 7.8 1.0


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Vitamin K µg 52.0 6.8 Vitamina C Mg 52.0 6.8 Vitamina B1 µg 523.0 68 Vitamina B2 µg 785.0 102.0 Niacina Mg 5.2 0.7 Vitamina B6 µg 523.0 68.0 Ac. Fólico µg 78.0 10.1 Vitamina B12 µg 2.1 0.3 Biotina µg 16.0 2.1 Ac. Pantoténico µg 2353.0 305.9 OTROS L-‐Carnitina Mg 7.8 1.0 Taurina Mg 42.0 5.5 Inositol Mg 26.1 3.4 Colina Mg 63.0 8.2

Tabla 3. Composición nutricional de fórmula suplementada (FS) por 100 g y por 100 ml

de fórmula reconstituida.

COMPOSISICIÓN NUTRICIONAL

Valores medios Por 100 g Por 100 ml de fórmula

VALOR ENERGÉTICO KJ Kcal

2159 516

281 67

NUTRIENTES

Proteínas G 10,2 1,3 Caseína G 5,1 0,7 Suero G 5,1 0,7 Hidratos de Carbono G 56,9 7,4 Grasas G 27,5 3,8 Ácido linoleico Mg 4067,2 528,7 Ácido α-‐linolénico Mg 335,5 43,6 Relación 12,1 12,1

MINERALES

Sodio Mg 154 21 Potasio Mg 495 67 Cloro Mg 326 44 Calcio Mg 387 52 Fósforo Mg 246 33 Relación Ca/P 1.6 1.6 Magnesio Mg 47 6,4 Hierro Mg 6.6 0.9 Cinc Mg 4.2 0.5 Cobre µg 314 40.8 Yodo µg 78 11 Selenio µg 7.0 0.9


78

VITAMINAS

Vitamina A µg 523.0 68.0 Vitamina D µg 7.8 1.0 Vitamina E Mg 7.8 1.0 Vitamin K µg 52.0 6.8 Vitamina C Mg 52.0 6.8 Vitamina B1 µg 523.0 68 Vitamina B2 µg 785.0 102.1 Niacina Mg 5.2 0.7 Vitamina B6 µg 523.0 68.3 Ac. Fólico µg 78.0 10.1 Biotina µg 16.0 2.1 Ac. Pantoténico µg 2353.0 305.1 OTROS L-‐Carnitina Mg 8.1 1.1 Taurina Mg 44.1 6.0 Inositol Mg 29.3 4.0 Colina Mg 60.2 8.2 Adenosin 5’-‐monofosfato Mg 3.6 0.5 Citidina 5’-‐monofosfato Mg 12.4 1.6 Uridina 5’ monofosfato Mg 6.5 0.8 Guanosina 5’-‐monofosfato

Mg 2.1 0.3

Los lactantes participantes en el estudio ingirieron dichas fórmulas

reconstituidas según las indicaciones del fabricante y en la cantidad indicada por

sus pediatras.

2.2. Muestras para análisis de la microbiota fecal: Heces.

Durante el periodo de estudio se diseñó la recogida de 4 muestras de

heces a los neonatos, con la siguiente periodicidad: la primera muestra se

recogió entre los primeros 12-‐15 días, la segunda a los 26-‐29 días, la tercera a los

47-‐51 días, y la cuarta y última muestra entre los 86 y 91 días. Las muestras

fueron introducidas en un recipiente estéril y refrigeradas hasta su

procesamiento en el laboratorio.

Se estudiaron un total de 194 muestras de heces procedentes de 62 niños

nacidos en el Hospital “Virgen de la Arrixaca” de Murcia. De estos 62, 48 fueron

alimentados con lactancia materna (LM) y 14 con fórmula infantil. Del grupo de


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fórmula infantil, 8 niños recibieron fórmula infantil estándar (FE), y el resto (6

niños), fórmula infantil enriquecida (FS). La primera muestra, obtenida a los 12-‐

15 días de edad fue recogida en todos los niños. La segunda muestra (entre los

26-‐29 días) fue enviada en 49 niños (79%). La tercera muestra, entre los 47 y 51

días, y la cuarta, aproximadamente a los tres meses (entre los 86-‐91 días), fue

enviada en 44 (71%) y 39 (63%) niños, respectivamente. Por tanto, el estudio fue

completado en el 63% de los niños.

2.2.1. Recogida y tratamiento de las muestras fecales.

Las muestras fecales se recogieron el mismo día de la visita para llevar a

cabo el análisis de la microbiota fecal. El transporte de las muestras se realizó en

neveras portátiles y una vez entregadas al pediatra, fueron codificadas con la

identificación del sujeto manteniéndose en las mismas condiciones de

temperatura (4ºC). Las muestras se recogieron en condiciones de esterilidad y en

anaerobiosis con el material proporcionado por el pediatra manteniéndose en

refrigeración hasta su entrega (no más de 4 horas después de la recogida).

Posteriormente se realizó el transporte de las muestras al laboratorio de

Microbiología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca en Murcia, lugar

donde se realizaron los análisis que se detallan a continuación.

2.2.2. Recuento en placa

Una cantidad inicial de 1 g de heces fue diluida en 9 mL de PBS

(enriquecido con cisteína) para así obtener una dilución de las muestras de 10-‐1-‐

A partir de ésta se prepararon diluciones seriadas hasta conseguir una dilución

de 10-‐3. Cuando el recuento no era posible con la dilución inicial de 10-‐3, se

realizó una nueva dilución. De cada muestra diluida se sembraron 10µl en una

placa de agar MacConkey (BioMèrieux). Las placas se incubaron en aerobiosis a

37ºC durante 24 horas. Tras la incubación, se anotó el recuento total de los

microorganismos y se procedió a realizar un subcultivo de las diferentes colonias


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aisladas en el medio de cultivo agar CPS-‐3 (BioMérieux), medio cromogénico que

permite la identificación directa de Escherichia coli, y de especies pertenecientes

al grupo KESC (Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Citrobacter) y Proteus spp. El

subcultivo en CPS-‐3 de los diferentes tipos de colonias según tamaño, color,

apariencia mucosa, etc, permitió obtener cultivos puros y llevar a cabo la

identificación y antibiograma de cada una de ellas. Paralelamente, como control

de esterilidad, y en cada recepción de muestras, se cultivó el disolvente donde

eran diluidas las heces.

Adicionalmente fueron incluidas en el estudio 19 cepas de Escherichia coli

aisladas de sangre de neonatos ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos

neonatal del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. Estos aislamientos se

obtuvieron de hemocultivos de neonatos con sospecha de sepsis que fueron

procesados según los protocolos habituales del Servicio de Microbiología. Se

estudiaron las resistencias antimicrobianas de estas cepas, junto con la

distribución filogenética y detección de genes de virulencia y se compararon con

los datos obtenidos de las cepas de E. coli comensales aisladas de las muestras

fecales de los niños del estudio.

3. DETERMINACIONES ANALÍTICAS.

3.1. Estudios de identificación de las cepas y sensibilidad antibiótica.

La identificación de los diferentes aislados, obtenidos tras la siembra en

placa de las muestras de heces se realizó, inicialmente, por la coloración de las

colonias en medio cromogénico CPS-‐3 según indicación del fabricante

(BioMérieux) (Figura 6). La coloración de las colonias fue rosa, verde o

transparente. Las colonias rosas fueron directamente identificadas como

Escherichia coli. A las colonias de color diferente al rosa se les realizó la

identificación bioquímica mediante el sistema automatizado VITEK-‐2 (BioMérieux)

con tarjetas de identificación de bacilos gramnegativos.


81

Figura 6. Placa cromogénica de CPS-‐3 con crecimiento de diferentes especies

bacterianas identificadas por su color.

La sensibilidad antibiótica de los microorganismos aislados se realizó

mediante tarjetas de sensibilidad de bacilos gramnegativos de Enterobacterias y

de bacilos gramnegativos no fermentadores. Estas tarjetas incluyen los

siguientes antibióticos: Ampicilina, Amoxicilina/clavulánico,

Piperacilina/tazobactam, Cefalotina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftazidima,

Cefepime, Meropenem, Imipenem, Ácido nalidíxico, Ciprofloxacino, Cotrimoxazol,

Gentamicina, Tobramicina, Amikacina y Nitrofurantoína.

3.2. Detección fenotípica de la producción de betalactamasas de espectro

extendido (BLEEs).

Se sospechó de la producción de betalactamasas de espectro extendido

según los criterios del CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute, 2005) en

aquellas cepas en las que las concentraciones mínimas inhibitorias para

cefotaxima y ceftazidima fueron iguales o superiores a 2 µg/ml. La confirmación

fenotípica se realizó mediante el método de sinergia con doble-‐disco basado en

el efecto inhibitorio del ácido clavulánico de acuerdo al CLSI. Para ello, una

suspensión bacteriana ajustada al patrón de 0.5 de la escala de McFarland fue

inoculada sobre una placa de agar Mueller-‐Hinton (BioMérieux), medio

empleado para el estudio de sensibilidades antibióticas, disponiéndose sobre ella


82

discos de amoxicilina-‐clavulánico, cefpodoxima, ceftazidima, cefotaxima,

cefepime y aztreonam. Los discos de cefalosporinas y aztreonam se colocaron a

una distancia de 20 mm del disco de amoxicilina-‐clavulánico. Las placas se

incubaron a 37ºC durante 24 h. La presencia de una ampliación o distorsión del

halo de inhibición (sinergia) entre el disco de amoxicilina-‐clavulánico y alguno de

los otros antibióticos se consideró indicativo de la presencia de una BLEE (Figura

7).

Figura 7. Prueba de doble difusión con discos. Extensión del halo de inhibición debido a

la inhibición de la betalactamasa plasmídica de espectro extendido por la acción del

ácido clavulánico contenido en el disco de amoxicilina-‐clavulánico (en el centro del

antibiograma).

3.3. Extracción del ADN.

El ADN total se extrajo mediante una técnica basada en la centrifugación

y en un proceso de choque térmico según el método descrito por Fernández y

Chávez (1999).

Las cepas fueron sembradas en agar Mueller-‐Hinton (BioMérieux) y se

incubaron durante 18-‐24 h a 35-‐37ºC. Transcurrido este tiempo,

aproximadamente tres cuartas partes de las colonias de la placa fueron recogidas


83

y transferidas a un tubo eppendorf que contenía 1 ml de tampón TE (50 mM

Tris-‐ClH (pH 8,0) y 1 mM EDTA (pH 8.0)). La suspensión resultante se agitó en

vortex y se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos. A continuación, se retiró

el sobrenadante y se repitió este paso dos veces. Tras la última centrifugación, el

sedimento fue resuspendido con 300 µl del mismo tampón TE, incubándose

durante 10 minutos a 100ºC. Tras esta incubación, la suspensión fue enfriada en

hielo durante 20 minutos. Posteriormente se centrifugó a 13.000 rpm durante 10

minutos y se recogió el sobrenadante. El extracto de ADN fue congelado a -‐20ºC

si no iba a ser procesado en ese momento.

3.4. Técnicas moleculares basadas en la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) para el estudio de la cepa de E. coli.

3.4.1. Caracterización filogenética de los aislados de E. coli.

La determinación del grupo filogenético de E. coli se realizó basándose en

el protocolo descrito por Clermont y col., (2000) que permite la clasificación en

cuatro grupos filogenéticos de (A, B1, B2 y D), según la presencia de los tres

genes de ADN, chuA, yjaA, y el fragmento de ADN TspE.4C2. Para la

amplificación de estos marcadores se utilizaron los iniciadores que figuran en la

Tabla 4.

Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados en la caracterización del grupo filogenético.

Gen

Iniciadores

Secuencia (5`-‐3`)

Tamaño fragmento

(pb)

ChuA

ChuA.f GACGAACCAACGGTCAGGAT

279 ChuA.r TGCCGCCAGTACCAAAGACA

YjaA

YjaA.f TGAAGTGTCAGGAGACGCTG

211 YjaA.r ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC

TspE4C2

TspE4C2.f GAGTAATGTCGGGGCATTCA

152 TspE4C2.r CGCGCCAACAAAGTATTACG


84

Las reacciones de PCR se realizaron para cada uno de los genes(chuA,

yjaA, TspE.4C2) en un volumen final de 25 µl en tubos de 200 µl que contenía:

12.5 µl PCR Master Mix 2X (Promega, Madison, WI, USA, constituido por una

mezcla de 50 U/ml de Taq DNA polimerasa, dATP, dGTP, dCTP, dTTP a una

concentración 0.4 mM y tampón MgCl2 a una concentración 3 mM), 2 µl de cada

oligonucleótido iniciador, a una concentración sintetizada inicial de 10 pmoles,

comercializados por Sigma-‐Aldrich, 3 µl de ADN extraído y 5.5 µl de agua libre de

nucleasas.

La amplificación se realizó en un termociclador (Mastercycler epgradient,

Eppendorf) con un programa de: 1 ciclo de 5 minutos a 94ºC, seguido de 30

ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 30 segundos a 72ºC y,

finalmente, 2 ciclos de extensión de 7 minutos a 72ºC.

Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al

1,5%, con una fuente de corriente eléctrica cuyo voltaje fue de 90 V durante

aproximadamente 100 minutos.

La clasificación de las cepas en los diferentes grupos filogenéticos se

realizó siguiendo el algoritmo representado en la Figura 8, según la presencia de

los genes chuA e yjaA y TSPE4.C2 detectada (Clermont y col., 2000).


85

Figura 8. Algoritmo dicotómico para determinación del grupo filogenético

(Clermont y col., 2000).

3.4.2. Detección de genes que codifican factores de virulencia.

Se estudiaron 6 genes de virulencia: papA (que codifica para la subunidad

estructural de la fimbria P), papC (montaje de fimbria P), sfa/foc DE (región

consenso de la fimbria S y F1C), afa/dra BC (adhesinas de la familia Dr), iutA,

(aerobactina), y Kps MT-‐II (síntesis de la cápsula del grupo II). La detección de

estos genes de virulencia se realizó mediante 2 reacciones de amplificación

múltiples según el protocolo previamente descrito por Johnson y Stell (2000).

Para la amplificación de estos genes se utilizaron los iniciadores que figuran en la

Tabla 5.

En cada reacción de PCR se amplificaron 3 factores de virulencia

atendiendo a su tamaño, según número de pares de bases, por lo que se

realizaron dos reacciones de amplificación. Una primera reacción contenía los

B1 o A B2 o D

yjaA TspE4.C2

B2 D A

B1

+ + - -

ChuA

+ -


86

iniciadores correspondientes a los genes afa/dra, sfa/foc y papC, mientras que la

segunda contenía los iniciadores de los genes iutA, papA y Kps MT-‐II.

Tabla 5. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los genes que codifican

diferentes factores de virulencia.

Gen

Iniciadores


Tamaño fragmento

(bp)

afa/dra

afa/dra BC.f GGCAGAGGGCCGGCAACAGGC

594 afa/dra BC.r CCCGTAACGCGCCAGCATCTC

iutA

iutA.f GGCTGGACATCATGGGAACTGG

302 iutA.r CGTCGGGAACGGGTAGAATCG

KpsMT-‐II

Kps MT II.f GCGCATTTGCTGATACTGTTG

272 Kps MT II.r CATCCAGACGATAAGCATGAGCA

papA

papA.f ATGGCAGTGGTGTCTTTTGGTG

717 papA.r CGTCCCACCATACGTGCTTC

papC

papC.f GTGGCAGTATGAGTAATGACCGTTA

205 papC.r ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA

sfa/foc

sfa/foc.f CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC

410 sfa/foc.r CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA

Para cada reacción de amplificación, las concentraciones finales en la

mezcla de reacción fueron: 12.5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, Madison, WI,

USA), 0.90 µl de cada oligonucleótido iniciador de Sigma-‐Aldrich, 6 cebadores por

reacción, 3 µl de ADN extraído y 4.1 µl agua libre de nucleasas para un volumen

final de 25 µl.


Eppendorf) con un programa de: 1 ciclo de 12 minutos a 95ºC, 25 ciclos de 30

segundos a 94ºC, 30 segundos a 63ºC; extensión 3 minutos a 68ºC, y finalmente

1 ciclo de 10 minutos a 72ºC.


87

Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa

al 2%, con una fuente de corriente eléctrica cuyo voltaje fue de 90 V durante


3.4.3. Caracterización de BLEEs.

En las cepas de E. coli en las que fenotípicamente se detectó la presencia

de betalactamasas de espectro extendido (BLEEs), se estudió la caracterización

de las mismas en los tipos CTX-‐M, TEM y SHV, mediante la detección de los

genes blaCTX-‐M, blaTEM y blaSHV según el protocolo descrito por Sabaté y col.

(2002). Para cada uno de los tres genes las condiciones de amplificación en el

termociclador fueron diferentes, por lo que se realizaron tres reacciones por

separado. La secuencia de los iniciadores utilizados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados en la caracterización molecular de las BLEEs.

Gen

Iniciadores


Tamaño fragmento

(pb)

blaTEM

TEM.f ATGAGTATTCAACATTTCCGTG

931

TEM.r TTACCAATGCTTAATCAGTGAG

blaSHV

SHV.f ATGCGTTATATTCGCCTGTG

868

SHV.r TTAGCGGTTGCCAGTGCTC

blaCTX-‐M

CTXM.f GCGATGTGCAGCACCAGTAA

909

CTXM.r CCGCAATATGATTGGTGGTG

Para cada reacción de amplificación, las concentraciones finales en la

mezcla de reacción fueron: 12.5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, Madison, WI,

USA), 2 µl de cada oligonucleótido iniciador de Sigma-Aldrich; 3 µl de ADN

extraído y 5.5 µl de agua libre de nucleasas para un volumen final de 25 µl.


88


Eppendorf) con las siguientes condiciones, siendo diferentes según fuera el gen a

amplificar:

• blaTEM : Desnaturalización durante 3 minutos a 94ºC; 35 ciclos

(desnaturalización 45 segundos a 94ºC; renaturalización 1 minuto a 59ºC;

extensión 1 minuto y 30 segundos a 72ºC); extensión 10 minutos a 72ºC y

parada de la reacción a 4ºC.

• blaSHV : Desnaturalización durante 3 minutos a 94ºC; 35 ciclos

(desnaturalización 45 segundos a 94ºC; renaturalización 1 minuto a 59ºC;

extensión 1 minuto y 30 segundos a 72ºC); extensión 10 minutos a 72ºC y

parada de la reacción a 4ºC.

• blaCTX-‐M : Desnaturalización durante 4 minutos a 94ºC; 35 ciclos

(desnaturalización 1 minuto a 94ºC; renaturalización 2 minutos a 48ºC;

extensión 2 minutos a 72ºC); extensión 10 minutos a 72ºC y parada de la

reacción a 4ºC.

Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa

al 2%, con una fuente de corriente eléctrica cuyo voltaje fue de 85 V durante


Para la secuenciación de las BLEEs previamente se realizó la purificación

de los amplicones, se utilizó el kit de purificación de ADN ExoSap-‐IT Clean up

(USB Corporation, Ohio, USA). Los amplificados purificados se enviaron a

secuenciar a la empresa Sistemas genómicos® en Valencia. La visualización de las

secuencias se realizó mediante el programa Chromas Lite v.2.0. Por último, la

secuencia obtenida se introdujo en la base de datos pública GenBank NCBI

(National Center for Biotechnology Information) mediante el programa BLAST

para compararlas con las incluidas en dicha base de datos.


89

3.4.4. Tipificación molecular de aislamientos de Escherichia coli mediante la

técnica REP-‐PCR.

La REP-‐PCR es una técnica de tipificación genotípica que se realizó para

determinar la relación clonal que existía entre los diferentes aislados de una

misma especie. En nuestro caso se realizó la REP-‐PCR a todos los aislamientos de

E. coli obtenidos de las diferentes muestras de heces de un mismo niño.

En la REP-‐PCR se utilizan cebadores que hibridan con secuencias de ADN

repetidas o repetitivas (secuencias REP) que se encuentran distribuidas en el

cromosoma de muchas Enterobacterias entre otros microorganismos

(Mohapatra y col., 2007). Los iniciadores que se emplearon en la REP-‐PCR se

muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en la REP-‐PCR.

Iniciadores Secuencia (5`-‐ 3`)

REP-‐1 NNNGCGCCGNCATCAGGC

REP-‐2 ACGTCTTATCAGGCCTAC

Para la reacción de amplificación, las concentraciones finales de la mezcla

de reacción fueron: 12.5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, Madison, WI, USA),

2 µl de cada oligonucleótido iniciador comercializados por Sigma-‐Aldrich, 3 µl de

ADN extraído y 5.5 µl de agua libre de nucleasas para un volumen final de 25 µl.


Eppendorf) con un programa de 1 ciclo de 3 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 1

minuto a 94ºC, 1 minuto a 40ºC, 8 minutos a 65ºC y, finalmente 2 ciclos de 16

minutos a 65ºC.


90

Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de

agarosa al 2%, con una fuente de corriente eléctrica cuyo voltaje fue de 90 V

durante aproximadamente 140 minutos.

3.5. Detección y separación de los amplificados en gel de agarosa.

En todas las técnicas de PCR utilizadas, los productos de amplificación

fueron separados por electroforesis convencional en geles de agarosa. La

electroforesis en geles de agarosa es una técnica muy útil para la separación

analítica o preparativa de fragmentos de ADN de tamaño entre 0.1 y 25 Kb. Esta

se basa en la migración unidireccional del ADN a través de una matriz porosa

cuando se le aplica un campo eléctrico.

Los geles de agarosa se prepararon a una concentración de 1.5% y 2%

dependiendo de los genes a amplificar. Para ello se mezclaron 200 mL de

tampón TAE 1X (preparado a partir de TAE 50X, cogiendo 242 g de Tris-‐base 890

mM, 57,1 mL de ácido acético glacial, 100 mL de EDTA 0.5 M y hasta 1 L

completando con agua destilada), con 3 g de agarosa para obtener el gel al 1.5%,

y con 4 g de agarosa para obtener el gel al 2%. Una vez enfriado el gel, se

cargaron los pocillos con las muestras, constituidas por 10 µl del amplificado con

10 µl del tampón de carga Blue/Orange Loading Dye 6X (Promega, Madison, WI,

USA), previamente diluido según instrucciones del fabricante. Como marcador

de peso molecular se utilizó PCR MarkerR (50-‐2.000 bp) de Sigma-‐Aldrich.

La visualización de los fragmentos de ADN se consigue mediante la

incorporación al gel de un colorante fluorescente que se intercala entra las dos

cadenas de ADN. El colorante bromuro de etidio, que fue el empleado, revela la

presencia de una banda de ADN o ARN al ser iluminada con luz ultravioleta de

longitud de onda corta (310 nm). La solución de bromuro de etidio se preparó

con 0.5 µg/mL de bromuro en el buffer correspondiente, en este caso TAE, y a

partir de una solución patrón de 10 mg/ml.


91

4. ANALISIS ESTADÍSTICO.

Los análisis estadísticos fueron realizados con el programa estadístico

SPSS versión 13.0. Los contrastes para las variables cualitativas se realizaron

utilizando la prueba de chi cuadrado o la prueba del test exacto de Fisher

cuando alguna de las frecuencias de las células era < 5.

En las variables cuantitativas, para el estudio de la media del número de

factores de virulencia entre dos poblaciones se utilizó la U de Mann Whitney test.

Para comparar recuentos de poblaciones bacterianas se utilizó ANOVA de un

factor, y para analizar diferencias entre diferentes grupos por parejas se realizó

un Test Post Hoc de Tukey.

El grado de significación estadística fue de p ≤ 0.05.

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