IQAC-CSIC...propietats anticoagulants interessants. Inhibeix de forma específica la trombina...
Transcript of IQAC-CSIC...propietats anticoagulants interessants. Inhibeix de forma específica la trombina...
IQAC-CSIC
Ismail Amghar Maach
Memòria Estades Cerca 2017
1.Introducció
L'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC), és un centre de recerca adscrit al CSIC (Consejo
Superior de Investigaciones Científicas), considerat l’organisme públic d’investigació més gran
d’Espanya i el tercer a nivell europeu. L’IQAC-CSIC fou creat per fer investigació d’excel·lència en
ciències químiques bàsiques, així com per resoldre problemes específics de la nostra societat, tot
utilitzant eines que provenen de la interfase de la química-biologia, de la química teòrica, de la
nanotecnologia química i biomolecular i de la química sostenible.
Amb el projecte que vaig dur a terme durant el transcurs de les 4 setmanes de la meva estada a
l’IQAC, vaig poder conèixer de primera mà els principis de la síntesi química, tant de pèptids com
oligonucleòtids, així com aprendre a estudiar l’estructura molecular i la interacció de la trombina
amb un conjugat oligonucleòtid (aptàmer d’unió a la trombina, TBA)-pèptid, de forma
computacional.
2. Fitxa tècnica
- Nom: Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC)
- Adreça: Carrer Jordi Girona, 18-26, 08034, Barcelona.
- Línies d’investigació:
• Química Biològica i Modelització Molecular
• Química Biomèdica
• Nanotecnologia Química i Biomolecular
• Tecnologia Química i de Tensioactius
- Àrea o departament: Departament de Nanotecnologia Química i Biomolecular – Grup de Química
d’Àcids Nucleics.
Altres grups relacionats amb el departament:
• Nanobiotecnologia pel Diagnòstic
• Química Col·loïdal i Interficial
• Química de Superfícies
- Investigadors al càrrec: Ramon Eritja i Carme Fàbrega
- Projecte: Síntesi d’un conjugat oligonucleòtid-pèptid
- Període de realització de l’estada: Del 3 de juliol al 31 de juliol de 2017
3. Objectius del projecte
L’objectiu de l’estada era sintetitzar i analitzar el conjugat oligonucleòtid-pèptid TBA-C6-G3EPPEFIE.
Per fer-ho, s’han utilitzat les tècniques de síntesi de pèptids en fase sòlida (SPFS) i cromatografia
analítica HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Paral·lelament, ha sigut necessària la
integració i familiarització amb els procediments bàsics d’un laboratori de química orgànica.
4. Activitats desenvolupades
Durant el transcurs de l’estada, vaig aprendre a utilitzar dos visors moleculars com PyMOL i
Avogadro, per dissenyar un conjugat oligonucleòtid-pèptid que pogués interaccionar amb la
trombina. Posteriorment, es va sintetitzar aquest conjugat oligonucleòtid-pèptid i es va analitzar
mitjançant cromatografia analítica HPLC. Per aquesta raó, vaig aprendre els fonaments bàsics tant
de la síntesi de pèptids com d’oligonucleòtids, així com la seva anàlisi i purificació per HPLC. Per altra
banda, vaig participar en un projecte desenvolupat en el grup de recerca que tractava del disseny i
la síntesi d’ADN origamis de forma rectangular, modificats per poder ser utilitzats en la teràpia del
càncer.
5. Valoració
L’experiència d’aquesta estada a l’IQAC ha sigut molt bona en tots els sentits. Per una banda, em va
agradar molt poder aplicar els coneixements teòrics en química i bioquímica a un treball molt pràctic
i autònom. D’aquesta manera, vaig poder conèixer i aplicar moltes tècniques i procediments que
abans no coneixia. Per altra banda, vaig disposar d’una flexibilitat d’horari que em va permetre
distribuir la realització del projecte al meu ritme i al mateix temps, podia preguntar tots els dubtes
que m’anaven sorgint durant cadascun dels passos que feia.
En resum, vaig poder gaudir d’una estada excel·lent i vaig poder integrar-me al laboratori d’una
forma total i molt ràpida, gràcies a la Carme Fàbrega, en Ramon Eritja i la resta d’investigadors del
grup.
Annexos
1. Representació de l’estructura conjugat TBA-pèptid i interacció amb la trombina
Diferents estudis han descrit l’estructura compacta i amb forma de cadira de l’aptàmer d’unió a la
trombina (TBA), de quàdruplex antiparal·lel unimolecular. La seva estructura, de seqüència:
5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’, es compon de dues tètrades G connectades a dues voltes o bucles
superiors: dues seqüències TT (T3-T4 i T12-T13) i una volta TGT a l'altre extrem (Fig.1).
Aquest oligonucleòtid de 15 bases interacciona específicament amb la trombina i per tant, posseeix
propietats anticoagulants interessants. Inhibeix de forma específica la trombina lligada al coàgul i
redueix la formació de trombes arterials.
L’objectiu és dissenyar un conjugat oligonucleòtid-pèptid, entre el TBA i una seqüència peptídica
(Fig.2A) que també se sap que interacciona amb la trombina (Figs. 2B i 2C), per incrementar la seva
afinitat per la trombina, i així millorar les seves propietats anticoagulants.
Fig.1: A) Estructura plegada del quàdruplex intramolecular adoptat pel TBA. B) Estructura de la G-
tètrada amb la disposició cíclica de 4 guanines formant ponts d’hidrogen de tipus Hoogsteen.
A) B)
A la representació de l’estructura del TBA-espaiador-pèptid (Fig.2A) podem observar la disposició
del pèptid que volem sintetitzar. El pèptid es pot reconèixer perquè produeix una gran desviació en
forma de volta. La figura mostra l’orientació i disposició de l’espaiador, constituït per una cadena de
6 carbonis, juntament amb l’oligopèptid.
Fig.2: Representació d’estructures químiques amb PyMOL A) Estructura del TBA-C6-G3EPPEFIE. B)
Estructura de la interacció entre el TBA i la trombina. C) Representació de la superposició de la
trombina amb TBA-C6-G3EPPEFIE.
Pèptid
TBA
TBA + pèptid
A)
B) C) Trombina
TBA
2.Síntesi d’un conjugat oligonucleòtid-pèptid
Els conjugats oligonucleòtid-pèptid són molècules quimèriques constituïdes per oligonucleòtids
enllaçats covalentment a pèptids. A la figura 3 es detalla l’esquema general del procés de síntesi que
hem utilitzat.
Un dels problemes en la síntesi d’aquest tipus de conjugats és la incompatibilitat dels esquemes
estàndard de protecció per pèptids i oligonucleòtids. Per exemple, al final de la SPFS es requereix
un tractament amb un àcid fort (TFA, àcid trifluoroacètic), que pot provocar una despurinització de
l’ADN. Per tant, en aquesta síntesi es van emprar àcids més suaus com l’àcid tricloroacètic (TCA).
Per evitar reaccions secundàries, també és necessari que l’extrem amino de cada aminoàcid es trobi
protegit, de la mateixa manera que ho han d’estar les seves cadenes laterals si estan
funcionalitzades. En aquesta síntesi, es van utilitzar aminoàcids protegits amb el grup Fmoc en el
seu extrem amino i l’aminoàcid àcid glutàmic (Glu, E) portava un grup protector en la seva cadena
lateral, com és el grup 2-fenilisopropil (PhiPr) èster.
El conjugat oligonucleòtid 5’ pèptid va ser sintetitzat pas a pas en un suport sòlid CPG (controlled
pore glass). Primer, es va sintetitzar la cadena de TBA mitjançant un sintetitzador automàtic i
fosforamidits degudament protegits. Posteriorment, se li va incorporar un espaiador format per una
cadena de 6 carbonis (C6) i acabat en un grup amino, i finalment es va incorporar la cadena peptídica
G3EPPEFIE. El conjugat oligonucleòtid-pèptid que es va obtenir finalment és: TBA-C6-G3EPPEFIE.
Durant tot el procés, es van realitzar rentats de la resina amb diferents dissolvents orgànics com la
N,N’-dimetilformamida (DMF), acetonitril (ACN) o el diclorometà (DCM), per assegurar la completa
eliminació dels excessos de reactius i poder facilitar els acoblaments entre aminoàcids.
Fig.3: Esquema del procediment de síntesi
2.1 Procediment
Sobre el TBA (sintetitzat anteriorment amb un sintetitzador automàtic d’ADN) unit a la resina es va
afegir l’espaiador acabat en un grup amino en el seu extrem 5’, utilitzant N-6-MMT-aminohexil
fosforamidit. A continuació, l’oligopèptid restant es va sintetitzar seguint l’esquema Fmoc, tal com
s’ha explicat prèviament.
• Preparem el següent sistema:
• Traiem els agents de bloqueig presents a sobre de la resina amb un rentat de piperidina al
20% en DMF. Escala de síntesi utilitzada: 0,5µmols.
• Rentem diverses vegades amb DMF i DCM.
• Traiem el grup MMT (monometoxitritil, de color groguenc) amb 3% TCA en DCM durant 10’.
• Afegim a la resina una solució 5% N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA) en DCM durant poc
temps, només per neutralitzar el pH i fer-lo bàsic.
• Fem diversos rentats amb ACN i amb DMF.
• Per a l’acoblament de cadascun dels aminoàcids:
Reactor
Col·lector de buit
Clau de pas
Bomba de buit
Fig.4: Esquema del sistema emprat al laboratori per la incorporació de la cadena peptídica
Flascó de recollida
de residus
- En un eppendorf, pesem la quantitat d’aminoàcid protegit necessària, i en un altre
pesem l’agent acoblant adequat (PyBOP, 5,20 mg o HATU, 3,80 mg).
- Dissolem tant l’aminoàcid com l’agent acoblant en DMF i vortexem per homogeneïtzar
les solucions.
- Afegim DIPEA (base, 3,48 µl) a l’eppendorf que conté la solució amb l’aminoàcid. A
continuació, afegim a sobre la solució amb l’agent acoblant i esperem 1’.
- Afegim aquesta solució dins del reactor que conté la resina.
- Realitzem dos acoblaments de cada aminoàcid (amb l’excepció de Gly3), un al matí i un
altre a la tarda, amb un interval de 4-5 hores entre acoblaments.
Nº
residu
AA MW Nº
eq.
Massa
(mg)
Agent
acoblant/Activador
Observacions
1 Fmoc-(Gly)3-OH 411,41 20 4,11 PyBOP/DIPEA
2 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA Color gris fosc de la
resina
3 Fmoc-Pro-OH 337,37 20 3,37 PyBOP/DIPEA
4 Fmoc-Pro-OH 337,37 20 3,37 PyBOP/DIPEA
5 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA
6 Fmoc-Phe-OH 387,43 20 3,87 PyBOP/DIPEA 1r acoblament Overnight
7 Fmoc-Ile-OH 353,41 20 3,53 PyBOP/DIPEA
8 Fmoc-Glu-OH (PhiPr) 487,55 20 4,87 HATU/DIPEA
• Fem diversos rentats amb ACN i DMF.
• Desprotegim l’extrem N-terminal de l’aminoàcid acoblat amb 20% piperidina en DMF (2x5’).
- Aquesta reacció allibera el grup protector Fmoc (Fig.5 passos 1 i 2), i deixa lliure l’extrem
amino de l’aminoàcid perquè pugui reaccionar amb l’aminoàcid següent (Fig.5 pas 3).
En la reacció, s’obté dibenzofulvè com a subproducte (Fig.5 pas 4).
Taula 1: Acoblaments dels aminoàcids de la seqüència polipeptídica
• Per comprovar que la síntesi es duia a terme correctament es va fer un test de ninhidrina:
- Amb l’ajuda d’una espàtula, introduïm algunes perles de la resina a un tub d’assaig petit.
- Afegim 3 gotes del reactiu A i 3 gotes del reactiu B pel test de ninhidrina.
- Posem la mostra dins d’un Thermoblock que està a 110°C.
- Si el color de les boles de resina és groc (resultat negatiu, indicador de l’absència de
grups amino lliures), significa que l’acoblament s’ha dut a terme correctament i s’ha
acoblat totalment l’aminoàcid protegit amb Fmoc. En canvi, si presenten un color blavós
(resultat positiu, indicador de la presència de grups amino lliures), voldrà dir que no s’ha
acoblat l’aminoàcid de forma satisfactòria o que només ho ha fet parcialment, fet que
indicarà la necessitat de reacoblar l’aminoàcid.
• Fem diversos rentats amb ACN i DMF.
• Repetim tot el procés per acoblar el següent aminoàcid, i successivament amb la seqüència
peptídica restant (Taula 1).
• Un cop acabada la síntesi de tota la seqüència peptídica, passem a acetilar l’extrem N-terminal
del conjugat oligonucleòtid-pèptid. Per fer-ho, dissolem la resina en una solució d’anhídrid
acètic (Ac2O, 100 µl): DIPEA (170 µl): DMF (1,53 ml) durant 10’. D’aquesta manera, evitem que
l’extrem N-terminal pugui reaccionar i ciclar-se amb les cadenes laterals dels diferents àcids
glutàmics presents en aquesta seqüència. Posteriorment, rentem la resina amb DMF i ACN.
• Agafem la meitat de la resina i desprotegim les cadenes laterals dels Glu amb 5% TCA en DCM
durant 1h i després rentem amb ACN.
Fig.5: Mecanisme de desprotecció del grup Fmoc amb la piperidina
Fmoc
Aminoàcid protegit
Piperidina
Dibenzofulvè
Aminoàcid
desprotegit Subproducte
4
1 2
3
• Deixem assecar la resina a temperatura ambient. La traspassem a un vial i afegim amoníac
(Overnight a temperatura ambient, o bé 1h a 55°C) per desprotegir les cadenes laterals de
l’oligonucleòtid i separar el suport sòlid del conjugat oligonucleòtid-pèptid desitjat (Fig.6).
• Separem el suport i les sals de desprotecció, del conjugat en una columna Sephadex eluïda amb
aigua (Fig.7). Els producte resultant va ser purificat per HPLC de fase inversa.
2.2 Resultats HPLC
Injectem en una columna XBridgeTM OST C18 2,5µm 10x50mm la mostra obtinguda prèviament a un
gradient 0-30% ACN 20’.
En el cromatograma obtingut (Fig.8) observem un pic pronunciat entre 6 i 9 min, que correspondria
al conjugat oligonucleòtid-pèptid desitjat. Els altres subpics de menys intensitat observats en el
cromatograma corresponen probablement a subproductes o residus acumulats durant el procés de
síntesi (seqüències truncades durant els bloquejos...).
Fig.6: Escalfament del vial amb
l’amoníac a 55°C en un Thermoblock Fig.7: Pas de la resina i el conjugat per
la columna Sephadex
Fig.8: Cromatograma HPLC del conjugat oligonucleòtid-pèptid
Després de 3 injeccions, es van recollir en diferents vials els pics més destacats del cromatograma i
es va mesurar l’absorbància a 260 nm amb un espectrofotòmetre (en OD, 1 ml), per tal de calcular
la quantitat de conjugat obtinguda.
• Pic 6 min – 0,16
• Pic 6,5 min – 0,19/0,18/0,24
• Pic 7 min – 0,15/0,20/0,29
• Pic 7,5 min – 0,14/0,11/0,25
• Pic 8 min – 0,09
• Pic 12 min – 0,07/0,10/0,17
Per últim, és necessari realitzar una espectrometria de masses MALDI-TOF per identificar quin
d’aquests pics correspon al conjugat desitjat per així poder purificar-lo.
Fig.10: Instrument d’HPLC Fig.9: Àrea dels pics del cromatograma
Fig.11: Model espectrometria de masses MALDI-TOF. Es mostra un model de caràcter
representatiu, ja que durant la meva estada no vaig tenir temps de realitzar els espectres de
masses dels nostres productes obtinguts.
3. Disseny i síntesi d’ADN origamis
La síntesi d’ADN origamis permet plegar cadenes simples i llargues de molècules d’ADN aconseguint
formes bidimensionals i tridimensionals (Fig.12). El disseny de la forma desitjada s’aconsegueix
omplint un patró amb un base constituïda
per una molècula d’ADN de cadena simple
(M13), anomenada motllo, i escollint més de
200 cadenes curtes lineals d'oligonucleòtids
(staples o cadenes grapa) complementaris al
motllo que, establint unions per
complementarietat, ajuden a subjectar i
compactar l’estructura final de l’ADN origami
desitjat.
Un cop sintetitzats i barrejats en dissolució, les cadenes de staples i el motllo M13 s’autoensamblen
en un sol pas, mitjançant un procés d’escalfament ràpid a 85°C i un refredament lent.
En el grup de recerca s’estava realitzant un estudi de la utilització dels ADN origamis com a vehicles
nanomètrics per a la introducció de drogues antiproliferatives. Aquest tema em va interessar i vaig
poder participar en alguns experiments que es van dur a terme mitjançant cultius cel·lulars.
Es van sintetitzar 3 models diferents d’ADN origami:
• N origami: Cadena M13 i 250 staples normals (grup origami control).
• F origami: M13, 242 staples, 4 cadenes amb 13-14 subunitats X i 4 staples amb una molècula de
colesterol.
• T origami: M13, 236 staples, 6 cadenes amb 13-14 subunitats X i 8 staples amb una molècula de
colesterol.
El colesterol és una molècula emprada fer facilitar l’entrada i internalitació dels ADN origamis a les
cèl·lules.
Per comprovar l’efectivitat d’aquests origamis es van realitzar diferents experiments:
Fig.12: Diferents formes que poden adoptar els
ADN origamis 1
3.1 Experiment d’apoptosi
Una de les formes més fiables de detectar l’apoptosi en estats primerencs és comprovar la
localitació de la fosfatidilserina a la membrana plasmàtica. La fosfatidilserina és un tipus de
fosfolípid que en cèl·lules viables es manté a la monocapa interior de la membrana plasmàtica.
Tanmateix, quan es comença a desencadenar el procés d’apoptosi, la fosfatidilserina migra a la capa
externa de la mateixa membrana (Fig.13).
Aquesta localitació pot ser detectada fàcilment, ja que l’annexina V s’uneix específicament a la
fosfatidilserina en una reacció dependent del calci. Les molècules d’annexina V es marquen amb
diferents fluoròfors per detectar apoptosi mitjançant tècniques com la citometria de flux.
En estats tardans d’apoptosi, un cop la membrana plasmàtica ha perdut la seva integritat i el DNA
es fa accesible, s’empren molècules fluorescents que actuen com agents intercalants del DNA, com
el iodur de propidi (PI, propidium iodide).
Els experiments es van dur a terme en 2 línies cel·lulars de càncer colorrectal:
HTB 38:
• Control
• DMSO (Dissolvent orgànic, dimetilsulfòxid)
• PBS
• X 10 nM
HCC2998:
• Origami N
• Origami F
• Origami T
• Staples
• X’ 10 nM
• X 10 nM
Fig.13: Procés d’externalització de la fosfatidilserina durant l’apoptosi primerenca
L’objectiu principal d’aquest experiment és analitzar l’efectivitat dels origamis. Per fer-ho, els dos
darrers experiments amb els fàrmacs X’ i un derivat X administrats de forma independent actuen
com a grups control.
Per mesurar l’efectivitat es va realitzar una citometria de
flux (guava easyCyteTM), on es classifiquen les cèl·lules en
4 subtipus, depenent del seu grau de viabilitat, associat a
la interacció amb els dos fluoròfors, associats a l’annexina
V i al iodur de propidi. Aquesta distribució be
representada en un diagrama de 4 quadrants (Fig.14):
• Cèl·lules viables: Part inferior esquerra.
• Cèl·lules en apoptosi primerenca: Part inferior
dreta.
• Cèl·lules en apoptosi tardana: Part superior dreta.
• Cèl·lules necròtiques: Part superior esquerra.
Resultats en la línia cel·lular HTB-38
80
,1
6,0
4
13
,69
0,1
7
86
,49
6,5
3
6,8
6
0,1
3
84
,53
5,6
4 9,4
5
0,3
7
81
,41
5,6
3 12
,65
0,3
2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cèl·lules viables Apoptosiprimerenca
Apoptosi tardana Necrosi
Pe
rce
nta
tge
cè
l·lu
les
HTB
-38
Control
PBS
DMSO
FdU 10 nM
Fig.15: Gràfic comparatiu del percentatge de cèl·lules HTB-38 en cada estadi.
Fig.14: Exemple d’un diagrama de 4
quadrants obtingut en una citometria
de flux
Viables
Apoptosi
primerenca
Apoptosi
tardana
Necrosi
X 10nM
Podem observar percentatges similars en els 4 estadis cel·lulars diferents, ja que són considerats
controls per a un posterior assaig.
A) Control B) PBS
C) DMSO D) X 10nM
Fig.16: Anàlisi de mostres per citometria de flux (guava easyCyteTM Software)
Resultats en línia cel·lular HCC-2998
Els resultats obtinguts mostren que el percentatge de cèl·lules viables en les mostres tractades amb
els ADN origamis és superior a les de cèl·lules que s’obtenen amb X’ i X. En canvi, és inferior que les
obtingudes en les mostres amb els staples. Per consolidar els resultats obtinguts seria necessari
realitzar rèpliques de l’experiment. De moment, es pot concloure que els ADN origamis amb X’/X i
colesterol tenen una eficàcia inferior a la dels fàrmacs administrats de forma independent. Dels
34
,88 43
,36
63
,04
55
9,9
8,8
3
0,0
1
0
49
,56
44
,31
0,0
3 8,7
5
5,6
5
3,5
1
36
,92
36
,25
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
FU 10nM FdU 10 nM Staple Staple 1
Pe
rce
nta
tge
cè
l·lu
les
HC
C-2
99
8
Cèl·lules viables Apoptosi primerenca Apoptosi tardana Necrosi
53
,61
52
,4
46
,69
45
,71
13
,86
8,8
1
17
,92
18
,42
31
,54
36
,43
33
,7
34
,22
0,9
8
2,3
5
1,6
9
1,6
5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Origami N Origami F Origami T Origami T1
Pe
rce
nta
tge
cè
l·lu
les
HC
C-2
99
8
Cèl·lules viables Apoptosi primerenca Apoptosi tardana Necrosi
Fig.17: Gràfic comparatiu del percentatge de cèl·lules HCC-2998 en cada estadi A) Grups control i B)
ADN origamis
A)
B)
X’ X
origamis T i dels staples es van realitzar dues rèpliques, per obtenir resultats més precisos respecte
a la seva eficàcia.
Origami N Origami F
Origami T Origami T1 (Rèplica)
Staples Staples1 (Rèplica)
2.2 Experiment colorimètric MTT (Mort cel·lular)
El principi d’aquest experiment es basa en el colorant 3-
(4,5-dimetilazol-2-il)2,5 bromur difeniltetrazol (MTT), que
és reduït per deshidrogenases mitocondrials de cèl·lules
vives a formazan de color porpra (Fig.20). El resultant
formazan de color porpa pot ser solubilitzat i quantificat a
través de mètodes espectrofotomètrics.
Es van establir 4 grups:
• Control
• PBS (Control)
• Origami F
• Origami T
X’ 10nM X 10nM
Mitochondrial
reductase
Fig.20: Procés de reducció del MTT a Formazan
Fig.18: Anàlisi mostres per citometria de flux (guava easyCyteTM Software)
Fig.19: Anàlisi de les plaques en un
fluoròmetre
Resultats:
Podem observar com els ADN origamis F i T mostren una viabilitat de les cèl·lules lleugerament
inferior que no pas en el medi amb PBS. Tanmateix, la incorporació de 2 cadenes més de X a l’origami
T no sembla disminuir la viabilitat de les cèl·lules de forma proporcional. A més, el fet d’afegir 4
colesterols més a aquest origami T tampoc sembla afavorir de forma significativa la internalització
de X a les cèl·lules i conseqüentment, l’efectivitat del compost. Per tant, serien necessàries més
rèpliques de l’experiment per acabar de comprovar l’efectivitat dels ADN origamis.
Referències
1. Rothemund PW. Folding DNA to create nanoscale shapes and paterns. Nature. 2006;440:297-302.
0
20
40
60
80
100
120
PBS origami F origami TP
orc
en
tatg
e d
e
viab
ilita
t d
e c
èl·
lule
s
Fig.21: Gràfic de viabilitat de cèl·lules en el bioassaig MTT