Investiga acerca del origen genético de la obesidadExtrae tu propio ADN

Taller de experimentaciónPROTOCOLO

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En general, la incidencia de la obesidad es cada vez mayor en todo el mundo. Los científicos y los médicos, preocupados por la amenaza que conlleva para la salud, intentan comprender por qué la gente se vuelve obesa y así ser capaces de diseñar estrategias de tratamiento y prevención.

En algunos casos, la obesidad puede conducir al desarrollo de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2). La diabetes es una enfermedad que provoca unos niveles elevados de glucosa en la sangre.

Las personas con sobrepeso tienen más grasa alrededor de las células, lo que hace que el cuerpo tenga más dificultades para utilizar correctamente la insulina. La insulina es una hormona que hace que las células del hígado, los músculos y el tejido adiposo tomen la glucosa de la sangre, que esta glucosa se almacene en el hígado y en los músculos en forma de glucógeno y que se detenga el uso de grasa como fuente de energía.

Los antecedentes familiares son un factor importante desde el punto de vista de la predisposición a la obesidad y a la diabetes tipo 2. Tener familiares con obesidad y con este tipo de diabetes aumenta de forma considerable el riesgo de desarrollar la enfermedad.

Datos clave sobre la obesidad y el sobrepeso:

• La obesidad se ha más que duplicado en todo el mundo desde 1980.

• En 2008, 1.500 millones de adultos de 20 años en adelante tenían sobrepeso.

• El 65% de la población mundial vive en países donde el sobrepeso y la obesidad son una de las causas principales de mortalidad.

• Alrededor de 43 millones de niños menores de cinco años tenían sobrepeso en 2010. (Datos de la ONU, marzo de 2011.)

Introducción

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La investigación del origen genético de la obesidad

Para estudiar el riesgo potencial asociado a los factores hereditarios en el caso de la diabetes mellitus tipo 2, los científicos basan su investi-gación en el ADN. Estudian muestras de ADN de individuos obesos y diabéticos y las comparan con muestras de individuos normales en busca de diferencias.

La investigación se lleva a cabo primero en ratas, de las que se extrae ADN de las células musculares y del tejido adiposo. Se secuencia el

ADN de las ratas para obtener el orden lineal de los nucleótidos.

Esta línea de investigación ya ha permitido identificar un gen, al que se ha denominado DOR (Diabetes and Obesity Regulated, regulado por obesidad y diabetes), que actúa de manera diferente en ratas obesas y diabéticas que en ratas normales (en las que el gen se expresa en menor grado).

Para secuenciar estos genes, los científicos primero tienen que extraer el ADN.

CéLuLA

Núcleo

Pares de bases

ADN(doble hélice)

Histonas

Telómero

Telómero

Centrómero

Cromátida

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¿Qué es el ADN?

El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es una molécula orgánica responsable de almacenar la información genética necesaria para el desarro-llo y el funcionamiento de todos los seres vivos, a excepción de algunos virus.

¿Dónde se encuentra?

Se encuentra en todos los seres vivos. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplas-ma, mientras que en organismos más com-plejos, como las plantas, los animales y otros organismos multicelulares, la mayor parte se encuentra en el núcleo. El ADN está compac-tado en cromosomas en los que se encuentran codificadas las instrucciones esenciales para que un organismo se desarrolle y sea capaz

de vivir. Estas instrucciones son los genes, las unidades que almacenan la información y la transmiten a los descendientes.

¿De qué está hecho?

El ADN es una molécula compuesta de repeti-ciones de tres tipos de moléculas: una base ni-trogenada, un grupo fosfato y una pentosa. Cada unidad formada por tres tipos de moléculas se llama monómero y, dado que el ADN presenta muchas repeticiones de monómeros, decimos que se trata de un polímero.Cada uno de esos monómeros es lo que conoce-mos como nucleótido. Los nucleótidos contie-nen diferentes bases (conocidas como A, C, G y T) ordenadas en secuencia para formar una especie de código de barras.

Esqueleto de desoxirribosa-fosfato

Desoxirribosa(pentosa)

Guanina

Adenina

Timina

Fosfato

CitosinaExtremo 3’

Extremo 3’

Extremo 5’

Extremo 5’

5

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a su vez también se degradan otras moléculas orgánicas de nuestra muestra, como las DNa-sas, unas enzimas cuya función es seccionar el ADN.

3. Neutralizar la carga del ADN: este proceso se realiza utilizando una sal con muchos usos diferentes: el acetato de sodio (NaAc). Los iones Na+ se unen a los grupos fosfato del ADN, que tienen una fuerte carga negativa.

Precipitar el ADN

El paso final es la precipitación del ADN, que nos permitirá hacer visible lo invisible. Para esto utilizamos el etanol. El ADN es soluble en agua, pero cuando añadimos etanol, se desenrolla y precipita. Tras añadir el etanol, observamos hebras blancas que empiezan a aparecer en suspensión. Es nuestro ADN.

Nuestro objetivo es extraer el ADN de nuestras propias células de manera rápida y fácil.

¿Alguna vez te has preguntado cómo extrae la policía el ADN de las muestras que encuentra en la escena de un crimen? ¿Cómo consiguen los científicos separar el ADN de las células y aislarlo de los lípidos, proteínas, glúcidos y sales?

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Objetivos

Metodología

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Obtener la muestra

El primer paso es obtener las células de las cuales extraeremos el ADN. Estas células se obtienen muy fácilmente rascando la lengua y las paredes interiores de la boca.

Liberar el contenido de las células

Inmediatamente, empezamos a procesar nuestra muestra en el siguiente orden:

1. Lisis: este es el proceso mediante el cual se rompen las membranas celulares y nucleares. Esto se con-sigue con detergentes, que permiten liberar el ADN en la solución.

2. Descompactar el ADN: utilizamos la pro-teinasa K, una enzima que degrada proteínas que estaban ligadas al ADN y que lo mante-nían compactado. Así que cuando actúa, el ADN se descompacta y

DespuésAntes de añadir etanol

ADN precipitado

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Instrumentos y utensilios de laboratorio

Material fungible

Equipo y material necesario

micropipeta de 20 a 200 μl

Asa para rascar el interior de la boca

Puntas para micropipeta

Guantes, gafas y bata

Temporizador

Tubo Falcon de 15 ml

Puntas para micropipetamás grande

micropipeta de 1 a 5 ml

Pipetas Pasteur de plástico

Rotulador permanente

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NaA

cP

rote

inas

a K

Reactivos y disolventes

Solución de lisis hecha con sales y detergentes

Etanol frío (en congelador a -20ºC)

Solución de acetato de sodio (NaAc)

Solución de proteinasa K -20ºC

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Procedimiento

A Extraer las células epiteliales

Rasca con fuerza el interior de tu boca durante dos minutos, arrastrando la punta del asa a lo largo del interior de las mejillas y especialmente a lo largo de la superficie de la lengua. De esta manera, conseguirás suficientes células.

Coloca el rascador en el tubo Falcon con la solución de lisis y mézclalo ligeramente.

Saca el rascador del tubo y tíralo inmediatamente (es importante no volver a metérselo en la boca).

Prepara un tubo Falcon con 1 ml de solución de lisis. Deja el tubo abierto para facilitar los siguientes pasos.

Segrega saliva para ayudar a arrastrar las células que se han desprendido del epitelio.Recoge la saliva con una pipeta Pasteur y coloca todo el contenido en el tubo con la primera muestra.

Tapa bien el tubo y mezcla su contenido por inversión.

1

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El primer paso siempre es obtener una buena muestra. Esto se consigue obteniendo muestras de la boca, donde encontramos muchas células muertas que se desprenden con facilidad y que contienen gran cantidad de ADN.

¡Cuanta más saliva, más ADN tendremos!

1 ml de solución de lisis

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B

C

Liberar el contenido de las células

Precipitar el ADN

Tapa bien el tubo y mezcla por inversión. Déjalo incubar durante 10 minutos.

Añade 20 µl de proteinasa K para romper las proteínas: apoya la pipeta en la pared del tubo y deja que el líquido resbale.

Calcula la cantidad de volumen (V) recogido aproximado mediante la gradación del tubo.

Escribe el volumen aquí:

V=____________ml

1

1

2

10

Cierra bien el tubo y agítalo bien por inversión.

Añade tres veces el volumen inicial (Vx3) de etanol frío.

Por ejemplo, si el volumen inicial de la muestra era de 1 ml, tienes que añadir 3 ml de etanol. 1 ml x 3 = 3 ml de etanol

Haz los cálculos aquí:

Mézclalo muy lentamente por inversión.Tu ADN aparecerá en forma de precipitado blanquecino.

Añade una décima parte del volumen (V/10) de la solución de NaAc a la muestra.

Por ejemplo, si tienes 1 ml de volumen inicial, añade 100 µl de acetato de sodio:1 ml=1000 µl 1000 µl/10= 100 µl que se tienen que añadir.

Haz los cálculos aquí:

3 4

2

ADN precipitado

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1 – Al final de la práctica, ¿qué has visto? ¿Qué es lo que ha causado el resultado al final? ¿Por qué?

3 – Si no hubieras llevado a cabo el primer paso de lisis, ¿qué crees que habría pasado?

2 – ¿Qué habría pasado si hubieras llevado a cabo el último paso de la precipitación con agua fría en lugar de etanol?

4 – ¿Por qué crees que es importante añadir la proteinasa K? Haz un dibujo de lo que crees que ha pasado cuando la añadiste.

Resultados y conclusiones

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5. ¿Qué componente realiza la neutralización de las cargas? ¿Por qué crees que es importante este paso?

7. Existe un protocolo de extracción de ADN parecido que utiliza agua con sal, jabón para platos y etanol. Relaciona estos componentes con los que has usado en esta práctica.

6. ¿Crees que este protocolo funcionaría con un cabello? ¿Y con células vegetales?

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Anexo 1 PRECAuCIONES DE SEGuRIDAD

InfórmateLocaliza los elementos de seguridad del laboratorio o el espacio habilitado para experimentar (extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee atentamente las instrucciones antes de realizar un experimento. No olvides leer las etiquetas de seguridad de reactivos y aparatos.

utiliza la vestimenta adecuadaGuantes, bata y gafas de protección.

Normas generalesEstá prohibido fumar, comer y beber en el laboratorio o en el lugar acondicionado para realizar experimentos. Trabaja de manera ordenada, limpia y sin prisas. Si se derrama un producto, recógelo inmediatamente. Deja siempre el material ordenado y limpio. Nunca uses equipos o aparatos sin saber cómo funcionan exactamente. Lávate las manos antes de abandonar el laboratorio.

Manipulación de vidrioProtege tus manos cuando manipules materiales de vidrio y ten presente la

temperatura, ya que no se puede distinguir si está caliente o frío a simple vista. No uses vidrio agrietado.

Productos químicosNo utilices ningún frasco de reactivos que no tenga etiqueta o que no esté debidamente identificado. No huelas, inhales, pruebes ni toques los productos químicos. Nunca pipetees con la boca. Usa guantes y lávate las manos con frecuencia cuando utilices productos tóxicos o corrosivos. Si estos productos entran en contacto con tus ojos, lávalos inmediatamente con abundante agua. No coloques envases de reactivos cerca de una llama. No calientes líquidos inflamables. Transporta las botellas sujetándolas siempre por la base, y no por la boca.

Eliminación de residuosDesecha en contenedores especiales debidamente identificados los residuos sólidos y líquidos que así lo requieran. Si tienes dudas, pregunta al educador. Nunca eches residuos sólidos por el fregadero.

RecuerdaSi ocurre un accidente, informa de inmediato al educador.

PRECAuCIONES ESPECÍFICAS PARA ESTE TALLER

• SDS: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel.

• Tris-Base: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Irritante.

• HCl: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Irritante y corrosivo.

• Acetato de sodio: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel.

• Proteinasa K: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel.

• Etanol: inflamable.

 

   

   

 

 

 

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Anexo 2

Anexo 3

Receta para la solución de lisis (dada la toxicidad de algunos de los componentes a concentraciones altas, recomendamos que el educador prepare la solución previamente. Usa una mascarilla mientras preparas la solución. Una vez la solución se disuelva, ya no es necesario llevar mascarilla).

Para 50 ml:- NaCl = 0,292 g- SDS = 5 ml SDS 10%- Tris HCl = 2,5 ml pH 8

Receta para NaAc

Para 40 ml:- 9,84 g de NaAc. Añade HCl hasta conseguir un pH de 5,2

Receta para proteinasa K

- 100 µg/ml (mantenerla congelada)

NOMBRE REFERENCIA FABRICANTE

NaCl 71381 Fluka-Sigma

SDS 71725 Fluka-Sigma

Tris-Base 93350 Fluka-Sigma

HCl 320331 Sigma-Aldrich

NaAc S2889-250G Sigma-Aldrich

Proteinasa K P6556-100mg Sigma

Etanol 141086.1214 Panreac

Asa de siembra estéril Sanilabo

Procedimientos para preparar las soluciones

Referencias para adquirir los reactivos y algunos de los materiales necesarios

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Investigadores que han contribuido con contenidos: Lorena Valverde, investigadora en la universitat de Barcelona