UNIVERSIDAD PEDRO RUIZ GALLOMICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS I

INTRODUCCIN

Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias(UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP).El Mtodo del Nmero Ms Probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales.Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichiacoli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

OBJETIVOS Detectar si lamuestratrada es apta para elconsumohumano. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales. Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales.

MARCO TERICO Nmero ms Probable (NMP)

El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos especficos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El mtodo requiere la realizacin de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o ms clulas microbianas procedentes de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna clula permanecern transparentes.Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos no contendrn ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna clula, se puede estimar el nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadstica.La precisin del mtodo del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan; cinco tubos por dilucin se considera como una relacin adecuada entre precisin y economa.Una condicin del mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo especfico de la poblacin en el medio de crecimiento que se emplee. La estimacin de la densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del clculo probabilstico.Hay muchas entidades discretas que son fciles de detectar pero difciles de contar. Una aplicacin es el de cualquier clase de reaccin de amplificacin o reaccin de catlisis que impide una cuantificacin fcil, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microoganismos, accin enzimtica, o catlisis qumica. El mtodo del NMP supone tomar la disolucin original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces, o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia en mltiples subdivisiones.El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentracin dada permite una resolucin ms fina, para usar el nmero de muestras positivas y negativas que estiman la concentracin original dentro del apropiado orden de magnitud.

Coliformes totales

Son las Enterobacterias lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C.Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.Una elevada proporcin de los coliformes que existen en los sistemas de distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.

Coliformes fecales

Son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichiacoli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal es Escherichiacoli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodolgico Escherichiacoli es el Coliforme ms es positivo a la prueba del Indol.

Materiales Muestra: Jugo de manzana Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB. Caldo EC Tubos de dilucin Pipetas Bombilla de aspiracin Placas de Petri Mechero Bunsen Bao Mara Estufa Gradillas Ansas microbiolgicas

Procedimiento Coliformes Totales:

Tomar 3 mL de muestra y realizar 3 diluciones sucesivas.

Sembrar 3 tubos por cada dilucin.

Incubar a 37C1C y observar a las 24 y 48 horas.

Determinar turbidez y produccin de gas.

De los tubos positivos, sembrar en placas con agar ENDO o ABRV.

Coliformes fecales

De los tubos positivos para Coliformes Totales, tomar una asada y sembrar en Caldo E.C. Incubar a 45.5 C 0,2 C por 24-48 horas. El resultado positivo es determinado por la produccin de gas.

RESULTADOSColiformes totales:

Prueba Presuntiva:

Resultados a las 48 horas de incubacin a 35C en Caldo Lauril Sulfato. Turbidez: Positivo (+)Gas: Positivo (+)Combinacin de tubos positivos: 2-2-2

-2-3-3-2-1-1

Prueba Confirmativa:

Lectura: Los coliformes presentan una caracterstica cuando se siembran en Agar Bilis Rojo Violeta, diferencindolos en lactosa positiva (color rojo) y negativa (color amarillo).

Lectura: usando el mtodo de NMP.

Lectura: NMP DE COLIFORMES TOTALES = 14/mLColiformes Fecales

Lectura: Turbidez y gas positivos en los 4 tubos a las 24 horas. Indica la presencia de coliformes termotolerantes o fecales.Caldo EC

CONCLUSIONES

El ceviche analizado no es apto para el consumo, debido a su contenido de coliformes fecales.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Forbes, B. (2009)Bailey y Scott: Diagnstico microbiolgico. 12va Edicin. Ed. Panamericana. Argentina.

REFERENCIAS LINCOGRFICAS

http://fos.panalimentos.org/LinkClick.aspx?fileticket=NmZogH4P%2Bmk%3D&tabid=120&mid=460&language=es-ES

http://bscw.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311306-3/*/*/*/normictb.htm

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_AgarEndo.pdf

http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan/013761/013761-02.pdf