1

INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA MOLECULAR Al estudiar los contenidos teóricos de esta asignatura te habrás sorprendido por la complejidad de ciertos procesos inmunológicos y la minuciosidad y el detalle con el que los mismos han sido descriptos. ¿Te has preguntado cómo se ha adquirido tanta valiosa información? Generalmente, el esquema simplificado de un mecanismo (por ejemplo, ontogenia de la célula T y/o B, procesamiento antigénico, cooperación T-B, activación linfocitaria, entre otros) ocupa no más de la mitad de una página en cualquier libro de texto, pero es el producto de muchos años de investigación por parte de miles de investigadores de todo el mundo. Y sólo se ha logrado acceder al conocimiento necesario para poder elaborar ese esquema simplificado con el desarrollo inteligente de estrategias experimentales. Del mismo modo, sólo con el perfeccionamiento de estas estrategias experimentales se han podido generar aplicaciones de gran relevancia en el diagnóstico, terapéutica y profilaxis. En este seminario pretendemos que el alumno se familiarice con estas estrategias experimentales, desde las más simples hasta las más sofisticadas y que al desarrollar problemas en el que se aplican estas metodologías, el alumno se sienta, al menos por algunas horas, como un inmunólogo desenmarañando un intrincado mecanismo.

2

A. TÉCNICAS Y METODOLOGÍAS QUE CONSIDERAMOS QUE EL ALUMNO DEBE YA CONOCER PARA PODER DESARROLLAR ESTE SEMINARIO

1. Técnicas para evaluar la inmunidad celular in vitro a. incorporación de timidina tritiada b. pruebas para evaluar citotoxicidad c. dosaje de citoquinas d. purificación de subpoblaciones celulares

2. Técnicas para evaluar la inmunidad humoral a. ELISA b. Western blot

3. Purificación de proteínas por técnica fisicoquímicas 4. Nociones básicas de clonado y expresión de genes

a. Southern Blot b. Northern blot c. Librerias de DNA, cDNA d. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

5. Generación de antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales 6. Generación de anticuerpos quimericos y humanizados

B. EL USO DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN: El primer desafío con el que se enfrentaron aquellos estudiosos de nuestro sistema inmune (SI), fue comprender cómo se genera una respuesta inmune en un organismo vivo (“in vivo”). Para esto, ha sido esencial el uso de animales de laboratorio, entre ellos ratas y ratones. En un primer lugar, se utilizaron cepas endocriadas normales (wild type) y se desarrollaron técnicas para poder manipular su SI. Posteriormente, se utilizaron cepas de animales que poseían mutaciones naturales que le conferían algún fenotipo particular, útil para el estudio de algún aspecto de la respuesta. Con el advenimiento de la biología molecular se generó una verdadera revolución: la creación de nuevas cepas genéticamente modificadas según las necesidades del problema a investigar. I. Técnicas para modificar el funcionamiento del SI en un animal normal. Irradiación: las radiaciones X o γ matan a las células linfoides en dosis a las cuales no afectan a otros tejidos del organismo. Irradiando un animal (receptor) con una dosis apropiada para eliminar las células linfoides, se puede evaluar la habilidad de distintas poblaciones de linfocitos de un ratón singénico* (donante) para transferir funciones inmunes. Irradiaciones más elevadas eliminan todas las células de origen hematopoyético (incluido los linfocitos) del animal receptor, permitiendo el reemplazo de todo el

* singénico: dos individuos son singénicos si son genéticamente iguales; es importante distinguir el concepto de singénico y congénico. Este último término se aplica a individuos que sólo difieren en un locus o región genética (en inmunología, son particularmente útiles los animales que sólo difieren en los genes del CMH)

3

sistema hematocitopoyético con células progenitoras de un donante. Asi se generan los animales quiméricos: animales letalmente irradiados y posteriormente reconstituidos con células de medula ósea de otra cepa (una definición más exhaustiva de quimeras se verá más adelante). Como los linfocitos derivan de células stem de médula ósea, estos animales contienen eventualmente linfocitos derivados del donante pero todos sus tejidos son del receptor irradiado. Esta técnica permite evaluar el desarrollo de los linfocitos y ha sido particularmente importante en el estudio de la diferenciación de la célula T. Timectomía: extirpación quirúrgica del timo obteniendo animales deficientes de células T. Tratamiento con anticuerpos “in vivo”: consiste en la inyección de animales o humanos con un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula particular de la superficie celular. Este anticuerpo va a actúar sobre las células que expresan esta molécula llevando a su eliminación o a la inhibición de la función, dependiendo del isotipo del anticuerpo utilizado. La eliminación de un determinado tipo celular o la inhibición de la función de una determinada molécula puede proveer información sobre su rol y relevancia. El tratamiento con anticuerpos monoclonales también se utiliza en humanos con fines terapéuticos. Debido a que generalmente se requieren de tratamientos crónicos para ver efectos, es frecuente que los humanos desarrollen anticuerpos contra las inmunoglobulinas de ratón. Es por eso, que en la actualidad se utilizan anticuerpos humanizados o quiméricos. II. Animales que portan mutaciones naturales: Dentro de las cepas de animales que presentan mutaciones naturales, los más utilizados para el estudio de la función de las células del SI son:

-ratones SCID: en estos ratones no se produce la diferenciación de los linfocitos y por ellos son altamente sensibles a infecciones por una gran variedad de agentes infecciosos. El defecto genético se localiza a nivel de los genes que codifican para RAG1 y RAG2, enzimas involucradas en los rearreglos genéticos de las porciones variables del TCR y las Igs. Sin embargo el estroma de sus órganos linfáticos primario es perfectamente normal. Puesto que el defecto radica en sus propias células linfoides y debido a que presentan un microambiente estromal normal, el injerto de médula ósea (células stem) de animales normales permite la correcta diferenciación de células T y B inmunocompetentes generando de esa manera un sistema inmune intacto. Estos animales que poseen parte de su SI proveniente de un animal, por ej. A, madurando en órganos linfáticos de otro animal receptor, por ej. B, se denominan quimeras (en alusión a aquellos animales fantásticos de la mitología griega). Generalmente la nomenclatura utilizada para las quimeras es la siguiente: A B, que indica la inyección de médula ósea (o células de algún otro órgano linfoide) de la cepa A en la cepa B

4

Los animales SCID son excelente receptores de subpoblaciones purificadas. -Ratones Nude: en estos ratones el defecto radica en el epitelio cortical tímico por lo que carecen de células T y por ello son muy útiles para estudiar el rol que cumplen dichas células. El hecho de repoblar estos animales con distintas subpoblaciones de células T (CD4-CD8) permite evaluar la función individual de cada una de estas poblaciones.

III. Animales genéticamente modificados:

Animales transgénicos Se denominan animales transgénicos a aquellos a los cuales se les ha introducido una copia extra o una copia alterada de un determinado gen en su genoma. Para producir estos animales el gen clonado es introducido en el genoma del ratón mediante una microinyección dentro del pronúcleo masculino del huevo fertilizado, el cual es luego implantado dentro del útero de una hembra pseudo preñada. En algunos huevos así tratados, el DNA extraño se integra AL AZAR en el genoma dando lugar a ratones que tienen una estructura extra en el genoma conocida como TRANSGEN (Fig.1) Figura. 1

Rata hembra es inducida a Rata hembra es inducida a

superovular con hormona FSH

y gonadotrofina corionica y posteriormente puesta a cruzar

Un huevo fertilizado es extraido de la hembra y el DNA elegido es inyectado

en el pronucleo masculino.

El huevo inyectado es transferido a una hembra pseudopreñada

Alguna de las crías seguramente portará el transgen

La cría transgénica se cruza con una cepa a elección para obtener un lineade ratones transgénicos

superovular con hormona FSH y gonadotrofina corionica y

posteriormente puesta a cruzar

Un huevo fertilizado es extraido de la hembra y el DNA elegido es inyectado

en el pronucleo masculino.

El huevo inyectado es transferido a una hembra pseudopreñada

Alguna de las crías seguramente portará el transgen

La cría transgénica se cruza con una cepa a elección para obtener un lineade ratones transgénicos

Esta técnica permite estudiar el impacto de un gen recientemente descubierto en el desarrollo de un organismo vivo, identificar regiones regulatorias necesarias para la normal expresión de la proteína en los tejidos y determinar los efectos de la sobre-expresión o de la expresión de esta proteína en tejidos en los que generalmente está ausente. Los ratones transgénicos han sido muy útiles para el estudio del rol de los receptores de las células T y B en el desarrollo y selección de las poblaciones.

5

Los ratones transgénicos han sido particularmente útiles para estudiar la diferenciación de la célula T. Si un gen ya rearreglado de la cadena α o β se inserta en el genoma de ratón, en general ocurre la exclusión alélica de los genes α y β endógenos. Esto hace que el repertorio de célula T de un animal transgénico esté formado prácticamente en su totalidad por el TCR transgénico. Esto implica que en vez de tener un determinado TCR en una frecuencia normal que oscila 1 en 104-106, la especificidad del TCR transgénico puede representar hasta un 90% del repertorio dependiendo del grado de exclusión alélica del TCR endógeno. Animales knock out En algunos casos las funciones de un gen particular sólo puede dilucidarse si se obtiene un animal carente de dicho gen. La obtención de estos animales ha sido posible ya que existen líneas celulares de células progenitoras embrionarias (ES) que pueden ser mantenidas en cultivo en un estado indiferenciado y que son capaces de generar todos los linajes celulares cuando se los coloca dentro de un embrión de ratón que es implantado en útero. Dichas líneas celulares se obtienen de tumores embrionarios que pueden ser inducidos artificialmente en algunas cepas de ratones. Para obtener ratones deficientes en un gen particular (ratones “knock out”) se reemplaza el gen en estudio mediante recombinación homóloga en estas líneas celulares embrionarias (Fig.2a). Posteriormente se seleccionan las células mutadas (sólo una copia del gen debe estar mutado). La célula embrionaria mutada es inyectada dentro de un embrión temprano donde es incorporada al embrión en desarrollo, contribuyendo a todos los tejidos del animal resultante. El gen mutado puede ser así transmitido a algunas crías y por entrecruzamiento entre éstas, obtener animales homocigotas para la mutación (Fig. 2b). Recombinación homóloga: esta metodología consiste en alterar las copias de un gen clonado in vitro de manera que sean no funcionales e introducirlas en la célula en estudio donde se recombinará en el genoma celular con el gen homólogo, reemplazando al gen normal. Debido a que la recombinación homóloga es un evento raro en células de mamíferos, es necesario una buena herramienta para seleccionar a las células que han incorporado el gen mutado en el lugar del gen normal. Generalmente, la construcción genética utilizada es mutada por la interrupción de la secuencia del gen en estudio con la introducción del gen funcional de resistencia a algún antibiótico, por ej. la neomicina, que permite luego la selección de las células que lo han incorporado. Además la construcción tiene también la secuencia del gen de la timidin kinasa del virus herpes simple (HSV-TK). Las células que incorporan el DNA al azar retienen tanto la resistencia a la neomicina como la actividad de TK, mientras que las que lo integran por recombinación homóloga retienen la resistencia a la neomicina pero no el gen HSV-TK. Por otro lado, las células que contienen el gen HSV-TK son susceptibles a la droga ganciclovir. Por eso las células que han integrado el DNA foráneo por recombinación homóloga tienen la particularidad de ser resistentes a neomicina y a ganciclovir y de esa forma son eficientemente seleccionadas. (Fig.2a)

6

Figura 2: Obtención de animales knock out a) b)

Construcción genética que contieneConstrucción genética que contiene Transfectar la construcción con el gen B2-Transfectar la construcción con el gen B2-

El problema con la deleción de genes se presenta cuando estos son esenciales para la supervivencia del animal. En estos casos los genes son llamados genes letales recesivos y por lo tanto es imposible generar animales homocigotos para estos genes. En el caso de querer analizar genes letales recesivos de células

exones del gen de la B2-microglobulina junto con el gen del HSV-TK

El gen deseado (B2-microglobulina) es interrumpido por la inserción del gen de resistencia

a la neomicina (neo r)

El DNA es introducido a la célula

El DNA no se integra

Las células se mueren por la

neomicina (G418).

El DNA se integra al AZAR en el genoma, las

células expresan los genes neor y HSV-TK

Las células se mueren por el

ganciclovir

La recombinación homóloga reemplaza al gen endógeno con la copia interrumpida

La célula expresará el gen neor pero no

HSV-TK; no morirá ni por G418 ni por

ganciclovir

exones del gen de la B2-microglobulina junto con el gen del HSV-TK

El gen deseado (B2-microglobulina) es interrumpido por la inserción del gen de resistencia

a la neomicina (neo r)

El DNA es introducido a la célula

El DNA no se integra

Las células se mueren por la

neomicina (G418).

El DNA se integra al AZAR en el genoma, las

células expresan los genes neor y HSV-TK

Las células se mueren por el

ganciclovir

La recombinación homóloga reemplaza al gen endógeno con la copia interrumpida

La célula expresará el gen neor pero no

HSV-TK; no morirá ni por G418 ni por

ganciclovir

microglobulina mutado en células ES

Inyectar las células ES transfectadas a un blastocitode ratón

Reimplantar el blastocito en una hembra pseudopreñada

Seleccionar la cría que porte tejido y células germinales que deriven de las células inyectadas

Cruzar estos animales para generar una l ínea homocigota en la deficiencia en B2-

microglobulina

microglobulina mutado en células ES

Inyectar las células ES transfectadas a un blastocitode ratón

Reimplantar el blastocito en una hembra pseudopreñada

Seleccionar la cría que porte tejido y células germinales que deriven de las células inyectadas

Cruzar estos animales para generar una l ínea homocigota en la deficiencia en B2-

microglobulina

7

linfoides se aplica la siguiente estrategia: células ES homocigotas para la mutación letal son inyectadas en blastocitos de ratones deficientes en la enzima RAG (al no tener la enzima RAG, estos ratones no rearreglan los genes de la inmunoglobulinas ni del TCR y por lo tanto no tienen ni linfocitos B ni T). Mientras estos ratones quiméricos se desarrollan, las células deficientes en RAG compensan cualquier falla en el desarrollo causada por el gen knock out en las células ES, excepto aquellas fallas que afecten la diferenciación del tejido linfoide. Si esas células ES son capaces de diferenciarse a progenitoras hematopoyéticas en médula ósea los embriones sobrevivirán y todos sus linfocitos se diferenciarán a partir de las células ES (Fig.3) Figura 3

Células ES con una mutación letal en homocigotas son inyectadas en

blastocitos RAG-

El ratón resultante es quimérico con linfocitos derivados de las celulas ES

Las células RAG- no pueden generar linfocitos. Los linfocitos de sólo

provienen de las células ES

Células ES con una mutación letal en homocigotas son inyectadas en

blastocitos RAG-

El ratón resultante es quimérico con linfocitos derivados de las celulas ES

Las células RAG- no pueden generar linfocitos. Los linfocitos de sólo

provienen de las células ES

8

Otra forma de solucionar el problema de los genes letales recesivos es utilizando el sistema de recombinación del bacteriófago P1. Este bacteriófago tiene una proteína que actúa como recombinasa, la enzima Cre. Cre es capaz de escindir regiones del DNA que se encuentren flanqueadas por secuencias que señalizan la recombinación (secuencias señal) que se denominan lox p. Por técnicas de biología molecular, se pueden realizar construcciones en donde el gen que se quiere anular se encuentre flanqueado por secuencias lox p. Luego por recombinación homóloga esta construcción se introduce en células ES y se genera un ratón que posee el gen inyectado y las secuencias lox p (que se introducen regiones intrónicas o que no alteren la funcionalidad normal del gen. Por otro lado, se hacen ratones transgénicos para la recombinasa Cre, pero el gen Cre se coloca bajo la acción de promotores específicos de tejido. Posteriomente, se cruzan estas dos líneas de animales y se seleccionan aquellos transgénicos para la Cre recombinasa y que posean el gen con los sitios lox p. La recombinasa actuará sólo en los tejidos en donde su promotor sea activado y escindirá el gen en cuestión. Asi, por ejemplo, usando un promotor específico de las células B para dirijir la expresión de la recombinasa Cre, un gen puede ser eliminado solo en las células B, mientras que en todas las otras células del animal permanecerá funcional. (Figura 5)

Cromosoma

Cromosoma

Cromosoma

Factores de transcripción específicos para el linfocito

B

PlásmidoSecuencia blanco

Gen endógeno

Gen endógeno modificado pero funcional

Knock out de B7.2 específico para células B

recombinasa

eliminado

Cromosoma

Cromosoma

Cromosoma

Factores de transcripción específicos para el linfocito

B

PlásmidoSecuencia blanco

Gen endógeno

Gen endógeno modificado pero funcional

Knock out de B7.2 específico para células B

Secuencia blanco

Gen endógeno

Gen endógeno modificado pero funcional

Knock out de B7.2 específico para células B

recombinasarecombinasa

eliminado

9

II. Análisis de la respuesta inmune in vivo: Durante el transcurso de las clases teóricas de la asignatura , se ha estudiado cómo se generan las dos ramas efectoras que generalmente coexisten en una respuesta inmune: la generación de anticuerpos (inmunidad humoral) y la activación de células T cooperadoras y células T citotóxicas (inmunidad celular). Aunque generalmente en todas las respuesta inmunes ambas poblaciones celulares (linfocitos T y B) son activadas, el rol efector puede implicar una u otra rama de la respuesta o ambas. Para determinar si dicho rol efector es ejercido a través de la respuesta inmune humoral (anticuerpos) o celular (linfocitos T) o ambas en conjunto, es posible transferir suero o diferentes sub-poblaciones celulares ( Li T, Li T CD4+, Li T CD8+ , Li B) de animales inmunizados a animales receptores normales. Si el rol efector es conferido luego de la transferencia de suero, decimos que el mismo está ejercido por la “inmunidad humoral”. La transferencia de inmunidad por antisueros o anticuerpos purificados, provee protección inmediata contra algunos microorganismos patógenos, contra toxinas liberadas por microorganismos patógenos (toxina tetánica) o el veneno de ofidios. Esta inmunidad conferida es temporal dependiendo del tiempo de vida media de las inmunoglobulinas transferidas. Este tipo de transferencia es denominada inmunización pasiva. Sólo la inmunización activa (aquella que se genera al inyectar una antígeno) es capaz de generar inmunidad a largo plazo.(Fig. 4) La protección contra otros microorganismos patógenos no se transfiere a través del suero, pero si puede transferirse a través de la inoculación de células mononucleares de animales inmunizados a animales normales genéticamente idénticos. Este tipo de transferencia es denominada transferencia adoptiva o inmunización adoptiva y la inmunidad transferida es denominada inmunidad adoptiva. Este tipo de estrategia es utilizada en forma experimental en humanos para tratamiento de cáncer o luego de un transplante de médula ósea en donde se transfieren células T del paciente o de un donante de médula ósea (Fig 4)

10

Figura 4 La presencia de inmuanimales de experimeluego de un determinapresencia de anticuerpantígeno inyectado. La presencia de lininyectando una pequrespuesta aparece 24 de la inoculación. A etipo demorada ( ej: reaLa presencia de anticpuede determinarse hipersensibilidad inmesubcutánea del antíge

nidad activa puede determinarse in vivo en humanos y en ntación mediante pruebas cutáneas. Si la reacción aparece do tiempo de inyectado el antígeno, nos está indicando la os o linfocitos efectores o de memoria específicos contra el

focitos efectores o de memoria se puede determinar eña dosis del antígeno deseado por vía subcutánea. La o 48 hs después como un área roja e indurada en el lugar sta prueba se la denomina prueba de hipersensibilidad d e cción de Mantoux ). uerpos específicos, principalmente de tipo de IgE también mediante pruebas cutáneas denominadas pruebas de diata. Esta prueba consiste en la inoculación por vía

no (alergeno) en muy baja concentración. La respuesta local

Patógenos muertos

Desafío(patógenos vivos)

Animal vivo

Inmunización activa

Suero Esplenocitos

Desafío con dosis letal de patógenos

Inmunización pasiva Inmunización adoptiva

Animal vivoAnimal vivo

Patógenos muertos

Desafío(patógenos vivos)

Animal vivo

Inmunización activa

Suero Esplenocitos

Desafío con dosis letal de patógenos

Inmunización pasiva Inmunización adoptiva

Animal vivoAnimal vivo

11

caracterizada por un enrojecimiento y edema en el lugar de la inoculación se puede observar entre 15 a 20 minutos después de la inyección. Luego de la infección con algunos microorganismos patógenos (bacterias, virus, hongos o parásitos) se genera una respuesta inmune específica que es capaz de proteger al huésped de futuras infecciones con el mismo microorganismo. Mediante la inyección de microorganismos vivos atenuados, microorganismos muertos o antígenos purificados de microorganismos en presencia de adyuvantes (vacunación), se trata de imitar el efecto de la infección natural sobre el sistema inmune induciendo la generación de inmunidad protectora en ausencia de infección. La determinación de la eficacia de la vacunación se realiza infectando lotes de animales vacunados y controles y determinando la prevalencia, severidad y sobrevida luego de la infección (Fig. 5)

Solución salina Patógenos muertos

Después de 10 días, desafío con dosis letal

Muerte Sobrevida

Infección Inmunización activa

Solución salina Patógenos muertos

Después de 10 días, desafío con dosis letal

Muerte Sobrevida

Infección Inmunización activa

12

Problemas:

1. Luego de la infección con Trypanosoma cruzi, un parásito protozoario flagelado causante la Enfermedad de Chagas se produce una importante respuesta inmune capaz de controlar la parasitemia. Además de esta respuesta protectora. A tiempos variables luego de la infección, tanto los humanos como los animales de experimentación presentan alteraciones que afectan el normal funcionamiento del músculo cardíaco. En la etiopatogenia de esta enfermedad infecciosa muchos investigadores asignan al sistema inmune un rol patogénico.

Para dirigir la investigación sobre los mecanismos involucrados en la protección (disminución de la parasitemia y sobrevida de los animales infectados) o en la patogénesis (alteraciones del funcionamiento cardíaco):

a) Cómo obtendría un antígeno soluble de T. cruzi? b) Cómo induciría inmunidad específica en animales de laboratorio contra

el antígeno obtenido purificado? c) Cómo demostraría la presencia de inmunidad específica en los animales

de experimentación • pruebas "in vivo" • pruebas "in vitro"

d) Cómo demostraría que la inmunidad inducida es capaz de proteger contra la infección.

e) Cómo demostraría que la inmunidad inducida es capaz de generar patogénesis (daño).

f) Cómo demostraría si la protección es ejercida por la inmunidad humoral o la celular?

Cómo demostraría si la inmunidad humoral o la celular es la responsable de la patogénesis en esta enfermedad ?

13

2. Se ha generado un ratón que posee un TCR transgénico que reconoce un antígeno presente únicamente en los machos, el antígeno H-Y, en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I, H2-Db (recordar que en ratón las

moléculas del MHC tipo I se denominan H2-K, H2-D, H2-L) Utilizando un anticuerpo anti-CD4 marcado con un fluorescente verde (FITC) y otro anti-CD8, marcado con un fluorescente rojo (rodamina), se analizó la maduración de timocitos en machos y en hembras transgénicos por citometría de flujo. Los resultados obtenidos se graficaron en gráfico de dot-plot: Responda las siguientes preguntas:

a) ¿Cuáles son las 4 poblaciones mayoritarias de timocitos que pueden establecerse según la expresión de los marcadores CD4 y CD8 en timo?.

b) Analice los porcentajes de las 4 poblaciones en cada uno de los tres paneles (hembra y macho transgénicos y ratón wild-type (normal)

c) ¿Que población está sensiblemente modificada en el macho? ¿A qué se debe este fenómeno?

El problema que Ud. acaba de resolver y discutir con el docente es el experimento realizado por Harold von Boehemer y publicado en la revista Nature 333; 742, 1988. Es unos de los experimentos clásicos que permitió dilucidar el mecanismo de selección negativa en timo

3. Se han generado ratones knock out para β2-microglobulina, para la cadena

β de las moléculas del CMH II o para ambas moléculas. A continuación se muestra los patrones de expresión de células mononucleares de nódulo linfático en dichos animales teñidas con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 marcados con FITC y rodamina respectivamente y analizados por citometría de flujo. Los resultados presentados en gráficos de dot-plot fueron los siguientes:

MachoHembra

Ant

i-CD

4

62.3% 6.3%

10.8%21.6%

Ant

i-CD

4

Anti -CD8

11.1% 19.4%

60%9,5%

Ant

i-CD

48% 5%

72%15%

Distribución de las poblaciones de timocitosEn ratones wild typeMachoHembra

Ant

i-CD

4

62.3% 6.3%

10.8%21.6%

Ant

i-CD

4

Anti -CD8

11.1% 19.4%

60%9,5%

Ant

i-CD

4

Anti -CD8

11.1% 19.4%

60%9,5%

Ant

i-CD

48% 5%

72%15%

Distribución de las poblaciones de timocitosEn ratones wild type

14

a) ¿Qué proteínas verán afectada su expresión en estos ratones? b) Indique cuál de los paneles (a, b, c y d) corresponde al patrón de expresión

de linfocitos CD4 y CD8 en nódulo linfático de ratones de los distintos lotes: Lote 1: MHC clase I +; MHC clase II - (I+ II-) Lote 2: MHC clase I -; MHC clase II + (I- II+) Lote 3: MHC clase I -; MHC clase II - (I- II-) Lote 4: wild type c) Indique (en forma semicuantitativa, con cruces) cuál de los siguientes

parámetros estará alterado en estos animales (I+II-; I-II+; I-II-; wt)

a b

c dCD4

CD8

a b

c dCD4

CD8

15

Lote1 I+II-

Lote2 I-II+

Lote3 I-II-

Lote4 wt

Vía exógena del procesamiento antigénico Respuesta inmune a infecciones virales Respuesta de anticuerpos fijadores de complemento

Respuesta inmune a Mycobacterium tuberculosis

Respuesta inmune de mucosas (niveles de IgA)

4. En este problema te contamos los experimentos realizados por Rolf Zinkernagel y sus col. Ellos realizaron la primera serie de experimentos con quimeras de medula ósea y timo a fines de los `70. De estos experimentos se pudieron extraer importantes conclusiones. A modo general, el experimento consiste en infectar ratones de un determinado haplotipo (para simplificar A, B o AxB) con un virus. Posteriormente, se extraen linfocitos de estos ratones infectados con dicho virus a células blanco infectadas con el mismo virus y marcadas con 51Cr. Estas células blanco pueden presentar antígenos virales en el contexto de estos supuestos alelos A o B. Se mide así la liberación del radioactivo como una medida de la citotoxicidad o lisis de los linfocitos a las células blanco. Experimento 4 y 5: ratones letalmente irradiados y reconstituidos con medula ósea (depletada de células T maduras) proveniente de ratones F1 (cruza de A x B) Experimento 6 y 7: igual que en las lineas 4 y 5 excepto que los ratones receptores fueron timectomizados (línea 6 y 7) y posteriormente transplantados con timos de ratones F1 (línea 6).

P orcentaje de lis is de c élulas marcad as con 51 Cr , expres ando alelos MHC tipo A o B s egún se indica

P orcentaje de lis is de c élulas marcad as con 51 Cr , expres ando alelos MHC tipo A o B s egún se indica

16

Para responder y discutir con el docente:

a) ¿qué conclusiones puede establecer de los experimentos 1 y 2 ?¿Qué indican los valores obtenidos en el experimento 3?

b) ¿qué conclusiones puede establecer de los experimentos 4 y 5? c) ¿ por qué cree Ud, que en la experiencia 4 los linfocitos provenientes de

stem cells A x B sólo lisan las células de haplotipo A? d) ¿En qué experimento se demuestra que es en timo donde se moldea o se

“educa” la restricción MHC?

5. Los ratones homocigotas para la mutación en el gen gld (gld-/gld-)son deficientes en la expresión de la molécula FasL y presentan enfermedades autoinmunes y linfoproliferativas como consecuencia de una falla en los mecanismos apoptóticos. Utilizando estos ratones se realizaron los siguientes diseños experimentales: células stem normales 1) ratón scid células T normales 2) ratón nude células stem gld-/gld- 3) ratón scid células T gld-/gld- 4) ratón nude A) Teniendo en cuenta que tanto el ratón 3 como el 4 desarrollaron las manifestaciones desarrolladas en los animales gld-/gld-. Qué podría concluir acerca de la expresión y/o funcionalidad de la molécula FasL presente en células B? JSR B) Los ratones 1 y 3 fueron infectados con Trypanosoma cruzi y en ellos se determinaron (por ELISA) los niveles de citoquinas en suero, la parasitemia y la sobrevida obteniendo los siguientes resultados: INF γ (DO) IL4 (DO) N0 de

parásitos/ml mortalidad

ratón 1 1200 ND 0,5 x 106 1/5 ratón 3 213 1310 4,8 x 106 5/5 i) Según estos resultados que subpoblación de cel T CD4 (Th1 o Th2) sería mas suceptible a la muerte gatillada por FasL durante la infección con Trypanosoma cruzi? JSR.

17

6. Se injecta un ratón de la cepa Balb/c con células mononucleares

humanas, luego de la tercera inyección se preparan Acs monoclonales a partir del bazo de estos ratones. Uno de los Acs monoclonales obtenido reacciona con una molécula presente en la superficie de células B activadas, macrófagos (M) y células dendríticas. a) Qué técnicas utilizaría para caracterizar a la proteína reconocida por el Ac.

monoclonal. b) Cómo llegaría a obtener la secuencia del gen que la codifica? c) Cómo produciría mutaciones del gen en cuestión en una línea celular de

macrófagos que expresa la proteína de superficie. d) En el siguiente experimento se cultivan M intactos o modificados pulsados con

el antígeno OVA con una línea celular de linfocitos T específicos para OVA en presencia o ausencia de diferentes anticuerpos monoclonales. Luego de 48 hs de cultivo se mide en el sobrenadante de cultivo la liberación de IL2. Considerando los siguientes resultados, indique que molécula de superficie podría ser la reconocida por el anticuerpo.

M pulsados con OVA

Li T específiocos para OVA

Anticuerpo monoclonal

Liberación de IL-2

Normales + - +++ Gen X mutado + - - Normales + anti X + Gen X mutado + anti CD28 +++

BIBLIOGRAFIA - Watson, JD, Gilman, M, Witkowski, J, Zoller, M. (1992). Recombinant DNA.

Second Edition. Scientific American Books, Freeman, New York. - Janeway, CA, Travers, P. (1996, 1997, 1999). INMUNOBIOLOGY. The

immune system in health and disease. Second, Third, and Fourth Edition. Garland Publishing.

- Paul, WE. (1998) Fundamental Immunology. Fourth Edition. Lippincot, Williams &Wilkins.

- Roitt IM (2001) Essential Immunology. Décima edición. Blackwell Science Ltd. Traducido por Editorial Médica Panamericana.

- Golub E. (1991) Immunology. A synthesis. Second edition. Sinauer Associates, INC. Publishers

-

18