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Interrupción farmacológica del tráfico de los canales de calcio por el ligando α2δ, Gabapentina Jan Hendrich*, Alexandra Tran Van Minh*, Fay Heblich*, Manuela Nieto-Rostro*, Katrin Watschinger†, Jo rg Striessnig†, Jack Wratten*, Anthony Davies*, and Annette C. Dolphin*‡

*Laboratorio para la Neurociencia Celular y Molecular, Departamento de Farmacología, UniversityCollege London, Londres WC1E 6BT, Reino Unido; e†Institutfu¨rPharmazie, Abteilungfu¨rPharmakologieundToxikologie, Universita¨t Innsbruck, A-6020 Innsbruck, Austria.

Editado por Richard W. Tsien, Escuela de Medicina Universidad de Stanford , Stanford, CA, y aprobado en Enero 15, 2008 (recibido para revisión Septiembre 20, 2007)

El mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos y antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco conocido. La gabapentina (GBP) se une a un epítopo exofacial de las subunidades auxiliares α2δ-1 y α2δ-2 de los canales de calcio dependientes de voltaje, sin embargo la inhibición aguda de las corrientes de calcio por GBP es muy baja o ausente. Formulamos la hipótesis de que GBP deteriora la capacidad de las subunidades α2δpara mejorar la densidad en la membrana plasmática de los canales de Ca2+ abiertos por voltaje a través de un efecto sobre el tráfico. Nuestros resultados demuestran de forma concluyente que GBP inhibe las corrientes de calcio, imitando una falta de α2δsólo cuando se aplica crónicamente, pero no agudamente, tanto en sistemas de expresión heteróloga como en neuronas ganglionares de la raíz dorsal. GBP actúa principalmente en una localización intracelular, lo que requiere su captación, debido a que el efecto de GBP aplicado crónicamente es bloqueado por un inhibidor de los transportadores de aminoácidos neutros del sistema-L y reforzado por coexpresión de un transportador. Sin embargo, está mediado por las subunidades α2δ, siendo impedido por mutaciones en ambos α2δ-1 ó α2δ-2 que suprimen la unión de GBP, lo que no se observa para α2δ-3, al cual no se une GBP. Por otra parte, el tráfico de los canals α2δ-2 y Cav2 se interrumpe tanto por GBP como por la mutación en α2δ-2, lo que impide la unión de GBP, encontrándose también que GBP reduce la expresión en la superficie celular de las subunidades α2δ-2 y Cav2.1. Nuestra evidencia indica que GBP puede actuar crónicamente mediante el desplazamiento de un ligando endógeno el cual es normalmente un modulador positivo de la función de la subunidad α2δ, afectando de esta manera la función de tráfico de las subunidades α2δa las que se une.

os canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VGCCs) son

complejos heteroméricos. Las subfamilias CaV1 y CaV2 se

componen de una subunidad α1 formadora del poro, asociada con una

subunidad α2δ anclada a membrana, predominantemente extracelular

(para revisar ver ref. 1) y una subunidad β intracelular (para revisar

ver ref. 2). Los genes de mamíferos que codifican las cuatro

subunidades α2δ han sido identificados (para revisar ver refs. 2 y 3).

La topología de la proteína α2δ se determinó primero para α2δ-1 y se

cree que generaliza a todas las subunidades α2δ (para revisar ver refs.

1 y 4). Ellas son proteínas transmembrana de tipo I, donde la

subunidad exofacial α2 está unida por un puente disulfuro a una

subunidad δ transmembrana, formado por la escisión post-

traduccional de la preproteína α2δ (5).

El mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos y

antinociceptivos de la familia gabapentinoide sigue siendo poco

conocido. La gabapentina (GBP) en sí fue desarrollada originalmente

como un análogo del ácido γ-amino-butírico (GABA), pero ahora se

cree que no tienen ningún efecto sobre los receptores GABA o

transportadores (para revisar ver ref. 6). La primera clave para

entender el mecanismo de acción de GBP vino de la purificación de la

proteína donde se une GBP de cerebro porcino (7), la cual se identificó

como la subunidad auxiliar α2δ-1 de VGCCs. Ahora se sabe que la

GBP se une a un epítopo exofacial presente tanto en las subunidades

α2δ-1 y α2δ-2 (para revisar, véanse las referencias. 1 y 8). Sin embargo,

a pesar de que originalmente se reportó que la aplicación de GBP re-

sulta en la inhibición aguda de las corrientes de calcio (9, 10), en la

mayoría de los estudios, la inhibición aguda por GBP es o bien muy menor

o ausente (para revisión ver ref. 1). Además, los estudios

electrofisiológicos de la transmisión sináptica son también equívocos, con

algunos estudios reportando inhibición por GBP (11), y otros estudios

reportando ninguna inhibición (12).

Cuando la liberación de neurotransmisores es medida, al parecer hay

poco o ningún efecto sobre la liberación cuando es estimulada por la

despolarización de varios neurotransmisores diferentes, a menos que se

haya mejorado la inhibición de la liberación por mediadores específicos

(13-15). En general, ninguno de estos estudios apunta al mecanismo de

acción siendo una simple inhibición de las corrientes de calcio.

Formulamos la hipótesis de que GBP deteriora la capacidad de las

subunidades α2δ para mejorar la densidad de la membrana plasmática de

VGCC, a través de un efecto sobre el tráfico. Esto estaría de acuerdo con

la conclusión de que la respuesta in vivo a las drogas gabapentinoides sea

bastante lenta al inicio (16), y que GBP no inhiba el dolor agudo (para

revisar ver refs. 6 y 17).

Resultados

La Inhibición de las corrientes de Cav2.1 y Cav2.2 por GBP es crónica

pero no aguda. Primero comparamos la habilidad de GBP para inhibir

las corrientes de calcio, ya sea de forma aguda, o cuando se le incluye

por 40 h en el medio de cultivo después de la transfección de células

tsA-201 con Cav2.1/β4 y α2δ-2. La incubación crónica con GBP (1 mM)

redujo las corrientes formadas con él WT α2δ-2 de 72.2 ± 4.2% a +15

mV (Fig. 1A). Además, mientras la coexpresión de las subunidades α2δ

normalmente desplaza la dependencia de voltaje del estado de

equilibrio de inactivación a potenciales más negativos (Fig. 1B), este

fue despolarizado por 9.3 mV en la presencia continua de GBP (Fig.

1B). En consecuencia, GBP crónica imitó una disminución en la

influencia de α2δ en las corrientes. Como confirmación, un efecto

similar de GBP crónica se observó cuando Cav2.1/β4 fue transfectado

en una línea celular estable que expresa α2δ-2, donde los peaks de

corrientes fueron 53.4 ± 14.0% más pequeños cuando las células

fueron cultivadas con 1 mM de GBP. [información de apoyo (SI) Fig.

5A]. Además, el estado de equilibrio de inactivación fue de nuevo

depolarizado en 11 mV por GBP (SI Fig. 5B), y las corrientes

mostraron significativas reducciones en la inactivación (Fig. 5C y D).

En contraste, cuando GBP fue aplicado ya sea de forma aguda por 10

min (Fig. 1C), o por 3-6 h antes del registro (n=8, datos no mostrados),

no tuvo efecto en IBa en el mismo sistema.

Author contributions: J.H. and A.T.V.M. contributed equally to this work; J.H., A.T.V.M.,

and A.C.D. designed research; J.H., A.T.V.M., F.H., J.W., and A.C.D. performed research; J.H.,

A.T.V.M., M.N.-R., K.W., J.S., and A.D. contributed new reagents/analytic tools; F.H. and

A.C.D. analyzed data; and A.C.D. wrote the paper.

The authors declare no conflict of interest.

This article is a PNAS Direct Submission.

Freely available online through the PNAS open access option.

‡To whom correspondence should be addressed at: Department of Pharmacology, Univer-

sity College London, Gower Street, London, WC1E 6BT, United Kingdom. E-mail:

a.dolphin@ucl.ac.uk.

This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/

0708930105/DC1.

© 2008 by The National Academy of Sciences of the USA

3628 –3633 1 PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105

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Fig. 1. GBP es efectivo para inhibir IBa después de una expresión heteróloga, cuando es aplicado de manera crónica pero no aguda. (A) (izquierda) Relaciones densidad de corrientes-voltaje (IV) para corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2 en ausencia o presencia de GBP crónico (1 mM, círculos rojos, n=11) por ≈40 h (o H2O como control, cuadrados negros, n=13) de inmediato después de la transfección de células tsA-201 hasta que los registros fueron realizados. La reducción en los peaks de IBa fue estadísticamente significativa (P=0.0013 en un test t-Student). (derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de pasos de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en incrementos de 5-mV, bajo condiciones control y en la presencia de GBP. Las barras de calibración se refieren a ambos conjuntos de trazas. (B) Datos del estado de equilibrio de inactivación obtenidos de células tratadas como se describió en A. GBP crónico (1 mM, círculos rojos, n=12) y control (círculos negros, n=13). El estado de equilibrio de inactivación en la ausencia de subunidades α2δ se entrega para comparación (línea discontinua, n=11). Los datos encajan en una única ecuación de Boltzmann. El V50, inact fue de 37.6 ± 2.1 mV en la presencia de α2δ-2, -30.8 ± 4.4 mV en la ausencia de α2δ (línea punteada), y -28.3 ± 2.7 mV en la presencia continua de GBP (P=0.0103 comparado con la ausencia de GBP, en un test t-student). (C) GBP (1 mM) aplicada de forma aguda por 10 min no tiene efecto en las corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2. Ejemplos de corrientes resultantes del paso de potenciales desde -90 mV a +10 mV, bajo condiciones control y después de la aplicación de GBP por 10 min, a una célula cuya amplitud inicial de corriente estaba estabilizada. Las corrientes son representativas de n=5 células, donde los peaks de corrientes (trazo rojo) después de la aplicación de GBP fueron 99.0 ± 7.1% de su valor inicial, antes de la aplicación de GBP (trazo negro). (D) Relaciones IV para las corrientes de Cav2.1/β4/α2δ-2 a partir de células cultivadas en ausencia o presencia de 100 µM de GBP aplicada crónicamente como se describe en A. GBP (círculos rojos, n=10) y control (cuadrados negros, n=14). La reducción en el peak IBa a +15 mV fue estadísticamente significativa (P=0.0215, en un test t-student). (E) El porcentaje de inhibición del peak de densidad de corriente por GBP (100 µM, barra roja rayada, n=10; y 1 mM, barra roja solida, n=11) fue determinada para cada experimento y comparada con la reducción observada en la ausencia de α2δ (barras gris, n=14). La significancia estadística de la reducción fue determinada respecto a los datos en la presencia de α2δ-2 y ausencia de GBP para cada set individual de experimentos; *, P=0.0013; **, P=0.021; ***, P=0.00004, en un test t-student. (F) (izquierda) Relaciones IV para las corrientes de Cav2.2/β1b/α2δ-1 en la ausencia o presencia de GBP crónico (1 mM, círculos rojos,=10) por ≈40 h o la cantidad equivalente de H2O como control (cuadrados negros, n=8). (derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de pasos de potenciales desde -90 mV a entre -15 y +15 mV en incrementos de 5-mV, bajo condiciones control (trazos negros) y en la presencia de GBP (trazos rojos).

Una alta concentración de GBP fue usada inicialmente, porque

nuestra hipótesis requería que GBP fuera tomada ya sea por los

transportadores del sistema L y subsecuentemente se uniera a las

subunidades α2δ intracelulares y afectara el tráfico hacia adelante, o,

alternativamente, unirse directamente a las subunidades α2δ de la

superficie celular y afectar el tráfico a nivel de la endocitosis o el

reciclaje. Para ambos sitios, estará compitiendo con otros aminoácidos

neutros grandes presentes en el medio de cultivo, isoleucina y leucina

ambas presentes a 800 µM y valina presente a 400 µM. Sin embargo,

las concentraciones en el plasma de 70-120 µM de GBP son

clínicamente relevantes, y la aplicación crónica de 100 µM de GBP

también produce una reducción significativa de IBa, a 45.0 ± 9.9% (Fig.

1E y D). También disminuyo la inactivación de las corrientes,

nuevamente un sello distintivo de las corrientes de los canales de

calcio que no son influenciadas por α2δ (SI Fig. 6A y B). Ante la

presencia prolongada de GBP, la densidad de corriente de

Cav2.1/β4/α2δ-2 se aproximó a la observada en ausencia de las

subunidades α2δ (Fig. 1E).

El efecto crónico de GBP también fue observado en la presencia de

α2δ-1 porque 1 mM de GBP redujo los peaks de corrientes de

Cav2.1/β1b/α2δ-1 a 70.5 ± 7.3% (Fig. 1F), y depolarizó el punto medio

para el estado de equilibrio de inactivación de -55.5 ±3.4 mV a -39.7 ±

2.6 mV (n=4 para ambos, datos no mostrados). Estos resultados

también proveen evidencia de que GBP no es selectivo para un subtipo

en particular de composición de canal de Cav2.

Prevención del efecto crónico de GBP por mutación de α2δ-1 ó α2δ-2. La mutación de un único aminoácido, R217A, en una forma RRR en

α2δ-1, o el residuo equivalente R282A en α2δ-2, se ha descubierto que

es casi completamente capaz de suprimir la unión de GBP. Para

demostrar que el efecto crónico de GBP era en efecto debido a la unión

a las subunidades α2δ, nosotros examinamos si podía haber algún

efecto en las corrientes formadas por Cav2.1/β4 cotransfectados con

R282A-α2δ-2. La incubación crónica con GBP (1 mM) no inhibió estas

corrientes (Fig. 2A) o resultó en ningún cambio en el estado de

equilibrio de inactivación (Fig.2B). Además, no hubo efecto de GBP en

las corrientes formadas por Cav2.2/β1b/R217A-α2δ-1 (Fig. 2C), o

Cav2.1/β4/α2δ-3 (los peaks IBa fueron -286.58 ± 32.3 pA/pF a +15 mV

para el control, n=8; comparado con -258.7 ± 46.8 pA/pF para GBP

crónico, n=9). Estos resultados están de acuerdo con el hecho de que

ninguna de estas subunidades α2δ une GBP (datos no mostrados).

Evidencia para un sitio de acción intracelular de GBP. La potencia in

vivo de GBP ha mostrado depender tanto de unión a la subunidad α2δ

y en la actividad como sustrato de sistemas transportadores de L-

aminoácidos, atribuido a los requerimientos de drogas Zwitterionicas

para atravesar BHE. Para determinar si el efecto crónico de GBP

requiere su recaptura en un único nivel celular (como se ha esbozado

en la Fig.2D), hemos incluido el inhibidor 2-(-)-endoamino-

bicyloheptane-2-carboxylic acid (BCH) en el medio, tanto solo como

junto a GBP por 40 h. BCH tiene muy baja afinidad para en el

desplazamiento de la unión de GBP a las subunidades α2δ y α2δ-2, y

esto no tuvo efecto en la aplitud de IBa (Fig. 2E) cuando se aplica solo,

a una concentración 10 mM. El peak de densidad de corriente a +15

mV fue -330,2 ±84,7 pA/pF (n=7) para el control y -330,0 ± 73,2 pA/pF

(n=8) en presencia de BCH. Sin embargo, BCH crónico previno el

efecto de GBP crónico tanto reduciendo IBA expresado (Fig. 2E) y

depolarizando el estado estacionario de inactivación (datos no se

muestran). Este efecto de BCH es probablemente resultado de su

habilidad para bloquear la recaptura de GBP.

Para obtener más evidencia de que la recaptura de GBP es

necesaria para su efecto, usamos oocytos de Xenopus, que expresaran

solo a un bajo nivel de actividad del sistema de L-transportadores.

Encontramos que la incubación crónica con 200 µM de GBP sólo

disminuyó significativamente las corrientes de Cav2.2/β1b/α2δ-2 (en

un 57%, Fig. 2F) cuando la proteína LAT4 del sistema de L-

transportadores fue coexpresada. Expresión de LAT4 no tuvo efecto

significativo en el peak de Iba a +5mV, la cual fue -0,49 ±0,12 µA

(n=34) y -0,41 ±0,06 µA (n=41) en ausencia y presencia de LAT4 res-

Hendrich et al. PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 1 3629

Fig. 2. El efecto de GBP requiere tanto unión a la subunidad α2δ como recaptura por un transportador de aminoácido neutro. (A) (Izquierda) Relación IV para corrientes de Cav2.1/β4/R282-α2δ-2 en ausencia o presencia de GBP crónica (1mM, círculos rojos, n=12) por 40 h o cantidad equivalente de H2O como control (cuadrados negros, n=12), desde transfección, inmediatamente hasta que los registros fueron realizados. (Derecha) Ejemplos de corrientes resultantes de potenciales desde -90 mV hasta (entre) -15 y +15 mV en incrementos de 5 mV bajo condiciones control y en presencia de 1 mM GBP. Barras de calibración refieren a ambos sets de señales. (D) Diagrama que ilustra algunos de varios sitios en los que GBP (círculos rojos) o el ligando putativo endógeno (círculos verdes) podría actuar en las subunidades α2δ. El efecto de GBP podría ser por desplazamiento de un ligando endógeno e impedir la habilidad de α2δ-1 y α2δ-2 de incrementar la concentración de VGCC en la membrana plasmática. De este modo, GBP ejercería su efecto en las subunidades α2δ intracelulares durante la maduración y el tráfico del complejo VGCC a la membrana y/o unir a subunidades α2δ superficiales, afectando el reciclaje desde la membrana plasmática. BCH es un inhibidor competitivo de del sistema L-transportador. (E) Relación IV para corrientes de Cav2.1/β4/ α2δ-2 tanto en condiciones control (cuadrados negros, n=8) y luego de tratamiento crónico con GBP (1mM), en ausencia (círculos rojos rellenos, n=7) o presencia (círculos rojos sin pintar, n=10) del inhibidor del sistema L-transportador, BCH (10 mM) aplicado crónicamente desde una hora antes que GBP. La reducción en el peak IBa por GBP sola a +10mV fue estadísticamente significativa comparando con el control. (F) IBa fue medido en oocytos de Xenopus luego de la inyección de cDNA para Cav2.2/qb/α2δ-2, junto con ya sea, cDNA control (Kir-2.1-AAA no conductor (Izquierda)) o con mLAT4 (derecha).

pectivamente, en 4 experimentos separados. También encontramos que la incubación crónica de oocytos por 40 h

en presencia de L-leucina (400 µM) aumentó significativamente Iba

solo cuando LAT4 fue coexpreseada (Fig. 2G). Más aun, L-leucina no

aumentó las pequeñas corrientes obtenidas en ausencia de α2δ, a

pesar de la presencia de LAT4 (Fig. 2G). Esto es compatible con la

idea de que un ligando endógeno de bajo peso molecular, como la

misma L-leucina, podría ocupar normalmente los sitios de unión de

GBP en α2δ y α2δ-2 y ser un modulador positivo requerido en la

funcionalidad total de las subunidades α2δ. La existencia de un

ligando endógeno fue previamente sugerida por la observación de que

la afinidad aparente por GBP aumenta en un factor de 5 a 10 ante

una diálisis o una purificación parcial de las subunidades α2δ.

De acuerdo con estas hipótesis, tanto para R217-α2δ-1 y R282A- α2δ-

2, el peak de corriente fue consistentemente más pequeño, comparado

con las subunidades α2δ WT, por 62,5% y 34,5% respectivamente (ver

también refs. 23 y 28). Sin embargo, fueron significativamente

mayores que en ausencia total de subunidades α2δ, donde IBa a +15mV

fue -33,9 ± 5,8 pA/pF para Cav2.2/β1b (n=9, P<0,05) y -65,1 ± 8,8

pA/pF para Cav2.1/β4 (n=13, de ref. 24). Esto es compatible con la

hipótesis de que las subunidades α2δ mutantes RRA son deficientes ya

sea en el tráfico frontal o en el mantenimiento de complejos VGCC

maduros en la membrana plasmática.

GBP crónica reduce la expresión de los canales de calcio en la

membrana plasmática. Para investigar más a fondo si GBP afecta el

tráfico de VGCC, hemos examinado a continuación la distribución

subcelular de las subunidades de VGCC, utilizando doble tag Cav2.1

con un hemaglutinina (HA) exofacial (Cav2.1-2HA, Fig. 3 CA). Bajo

condiciones de control, Cav2.1 y alfa2delta-2 fueron localizados, tanto

intracelularmente (Fig. 3A) y también en la membrana plasmática,

como se ve más claramente en las células no permeabilizadas (Fig.

3B).La expresión en la membrana plasmática en las células no

permeabilizadas se cuantificó a partir de imágenes de baja

magnificación, incluyendo los de la figura 3C, en el que la expresión de

la superficie celular se ve a través de toda la célula debido a la

profundidad de la sección óptica (4.5 µm para éstas imágenes) y

aplanado natural de las células. La incubación crónica con 100 µM y 1

mM de GBP redujo significativamente la expresión de ambos Cav2.1 y

alfa2delta-2 en la membrana plasmática (Fig. 3C) así como el

aumento de la agrupación intracelular no uniforme de las dos

subunidades (Fig. 3A).Un resultado similar se observó para

Cav2.2,que se expresa en todas las células transfectadas Cos-7,por lo

general muestran una distribución bastante uniforme (fig. SI.

7(29).Usando células permeabilizadas, encontramos que WT

alfa2delta-2 localizada con GFP-Cav2.2, tanto intracelularmente como

en la mebrana plasmática (SI fig 7Ai).La aplicación crónica de GBP

resultó en regiones de la agrupación intracelular en la mayoría de las

células, tanto para alfa2delta-2 y para GFP-Cav2.2 (SI fig 7Aii y iii),

cuantificado en la fig SI 7 B).

Para cuantificar aún más el efecto de GBP en las expresión de

alfa2delta2-2 en la membrana celular.Se utilizó biotinilización en la

membrana celular y se encontró que la incubación crónica con GBP( 100

µM y 1 mM), redujola proporción de alfa2delta-2 expresada en la

membrana celular(fig 3D).El procedimiento de biotinilación no induce la

permeabilización celular,y esto no se vio afectada por la incubación

crónica con GBP,Debido a que no se observó biotinilación de la proteína

intracelular Akt (fig.3D).

cDNA (nonconducting Kir2.1-AAA (30) (Left) or with mLAT4 (27) (Right).

Oocytes were incubated without (black bars) or with 200 µM GBP (red bars)

from 1 h after the time of injection until recording between 40 and 48 h later.

To combine data from several experiments, the mean peak control IBa at +5

mV was normalized and the effect of GBP determined relative to control. The

numbers of determinations are shown on the bars. Statistical significance: **,

P = 0.0042 for the effect of GBP in the mLAT4 condition only (two-way ANOVA

and Bonferroni’s post hoc test). (G) As in E, with the combinations of trans-

fected subunits indicated below the bars. Oocytes were incubated without

(black bars) or with (white bars) 400 µM L-leucine. The statistical significance

is P = 0.011 (*) for the effect of L-leucine in the mLAT4 condition and only in

the presence of a28-2.

3630 1 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0708930105 Hendrich et al.

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Fig. 3. Efecto de GBP crónica en la localización de Cav 2.1 y alfa 2delta-2 en la membrana plasmática en células Cos-7. (A) Cav2.1-2HA se cotransfectó con beta4 y alfa-2 delta-2 y se cultivaron durante 48hrs. Ya eea en ausencia o en presencia de GBP (100 µM y 1 mM).Las células fueron fijadas y permeabilizadas antes de la localizacion inmunocitoquímica de Cav 2.1(HA Ab,izq.) y alfa-2-delta-2 ( Ab, centro), utilizando una amplificación objetvo × 63. Imagenes fusionadas se muestran ( derecha),(Cav2.1 se muestran en verde y alfa-2-delta-2 en rojo, con las regiones de colocalización de color naranja-amarillo). Tincion nuclear (azul, DAPI)

se muestra en las imagenes fusionadas. (B) Las imágenes se obtuvieron como en A, pero las células no se permeabilizaron.La células transfectadas en cada imagen se identifican por una flecha, se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos

independientes (Barra Escala: 30 µm.) (C) (Izquierda). .) imagenes de celulas fusionadas no permeabilizadas tomadas con una ampliacion de objetivo ×20 para mostrar un mayor campo de visión para las células transfectadas como en A y se cultivaron durante 48hrs ya sea en presencia o ausencia de GBP( 100 µM y 1 mM). La seccion optica para estas imagenes es de 4,5 micras y como las celulas son aplanadas, la tincion se ve en la mayor parte de la membrana celular (derecha). La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de celulas de la superficie por unidad de superficie celular de Cav2.1 (barras blancas) y alfa-2-delta-2 (barras grises) para magnificacion X20 imagenes bajo

condiciones de control (n = 22 cells) and in the presence of 100 µM GBP (n = 19

cells) and 1 mM GBP (n = 24 cells). **, P < 0.01; ***, P < 0.001; one-way ANOVA,

with Bonferroni’s post hoc test. (D) The effect of GBP (100 µM and 1 mM) was

determined on cell-surface expression of a28-2 (Upper), with the intracellular

protein Akt as control (Lower). (Left) Whole-cell lysate (WCL). (Right) Streptavidin pull-down of biotinylated proteins, immunoblotted with a2-2 (102–117) or Akt Ab. The leftmost lane is from nonbiotinylated control cells (con). The proportion of a28-2 at the cell surface was estimated from the ratio of the biotinylated a28-2 to the amount of a28-2 in the WCL. Data are from five experiments; 4.93 ± 1.92% of total a28-2 was at the plasma membrane, and this was reduced compared with control by 19.8 ± 7.6% and 30.4 ± 14.4% in the

chronic presence of 100 µM and 1 mM GBP, respectively (n = 5, P < 0.05, repeated-measures ANOVA and Bonferroni’s post hoc test).

En contraste, GBP crónica no redujo el nivel de R282A-alfa2delta-2

expresada en la membrana celular (SI fig.8A). Además, en la

presencia de R282A-alfa-2-delta-2,hubo una distribución menos

uniforme tanto de la mutación alfa-2-delta y GFP Cav 2.2, que la ob-

Fig. 4. Efecto de la GBP en las corrientes de Ca nativos con DRGs.(A) ( superior izq).La relación de IV para HVA Iga registrados para ratas DRGscultivados por 3 días en ausencia (cuadrados negros) o presencia de GBP (1 mM,circulos rojos).Ejemplo HVA corrientes de uu potencial de reposo (Vh) de -40mV a entre -30 y +10mV en rangos de 10mV.Trazos superiores (negro) de control; trazos menores (rojo) GBP crónico (1 mM).Iga se midió a 20ms, como se indicaven la línea punteada.Iga a 0mV

fue significativamente inhibida por GBP crónica.(B) (P = 0.02, Student’s

two-tailed t test). (Lower) As above, except VH was -80 mV, and IBa

amplitude was measured at the end of the 220-ms step, as indicated by the

dotted line. IBa was obtained in the absence (black squares, n = 12), or presence of GBP (1 mM, red circles, n = 13). (B) la aplicación aguda de GBP (1mM) no tuvo efecto sobre las corrientes HVA nativos DRGs.(izq) Gráfico de barras muestra la falta de activados por la corrientes de calcio ( HVA),cuando los DGR se incubaron con 1mM de GBP por 3 días (fig.4A).La contaminación con corriente T se evitó por la medición de corriente del mantenimiento del pick de potencial en -40mV,aunque un resultado similar se obtuvo cuando se mide Iga al final de un rando de 50-ms desde -80mV(fig. 4A).En contraste, la aplicación aguda de GBP durante 10min, no tuvo efecto en adultos DRG Iga (fig. 4B)..

servada con WT alfa2delta-2 y localizacion menos uniforme del la

subunidad R282A-alfa-2-delta y GBP Cav 2.2 (SI fig. 8B yC), no

tuvo ningún efecto adicional sobre la distribución de la subunidad

R282Aalfa-2-delta-2 (SI fig.8 B y C).

GBP crónico inhibe las corrientes de calcio nativas en las neuronas

DRG. Para determinar la relevancia de nuestros hallazgos a VGCCs

nativas en un sistema neuronal relevante para el uso terapéutico de

GBP, se examinó si GBP tuvo un efecto crónico similar en la densidad

de IBA en cultivos de neuronas de raíz dorsal ganglionar adultas

(DRG). Se encontró una marcada reducción en el peak de las

corrientes de calcio activadas por alto voltaje (HVA) (por 50,7 ± 11,2%

a 0 mV, n=19), cuando los GRD se incubaron con 1 mM de GBP

durante 3 días (Fig. 4A). La contaminación con corriente tipo T se

evitó mediante la medición de la corriente peak desde un potencial de

mantenimiento de 40 mV, aunque se obtuvo un resultado similar se

obtuvo cuando se midió IBa al final de una etapa de 50 ms a partir de

80 mV (Fig. 4A). En contraste, la aplicación aguda de GBP durante 10

minutos no tuvo ningún efecto en DRG Iba adultas (Fig. 4B).

Hendrich et al. PNAS 1 March 4, 2008 1 vol. 105 1 no. 9 1 3631

Discusión

Luego del descubrimiento de que GBP se une a cierta subunidad

VGCC α2, la evidencia de que las drogas gabapentinoides tienen su

efecto terapéutico a través de esta ruta es muy fuerte ahora, ya que

un ratón R217A knockin-α21 desarrolla dolor neuropático en

respuesta a la lesión del nervio, pero esto no responde a cualquier

GBP o su análogo pregabalina. Ahora se muestraa que GBP es un

inhibidor del tráfico de VGCC, en lugar de un inhibidor directo de las

corrientes de calcio, y por lo tanto ejerce sus efectos inhibidores sobre

todo en subunidades α2 intracelulares. Hemos demostrado que las

subunidades α2 tienen su efecto principal sobre el tráfico de VGCC, y

que el factor de von Willebrand-Un dominio (VWA) es clave para este

proceso. Es notable que GBP se une a las dos subunidades α2 que

tienen dominios VWA con sitios de adhesión ión-metal perfectos

(MIDAS). Se ha postulado que todos esos dominios VWA se someten a

un cambio conformacional durante la unión de la proteína ligando a

este dominio, y se podría especular que los fármacos gabapentinoides

podrían interferir con esta función del dominio VWA. La reducción en

la expresión de α2 y Cav2.1 en la superficie celular en presencia de

GBP y la disminución en la colocalización de α2 de R282A con Cav2.2

proporciona evidencia de apoyo para esta hipótesis. Los resultados presentados aquí podrían explicar la falta de efecto, o

respuestas pequeñas, informadas con GBP aguda en diferentes sistemas

experimentales, tanto en las corrientes de calcio como la la transmisión

sináptica. Estudios previos que examinan la exposición más prolongada a

GBP también han demostrado ya sea ninguna inhibición o poca inhibición

de la amplitud de la corriente. Nuestra conclusión de que el efecto de GBP

requiere su captación en las células individuales explica el requisito de

una concentración relativamente alta de GBP, ya que tendrá que competir

con grandes aminoácidos neutros para la captación en este sitio. Es claro

que el tráfico de VGCCs y su inserción y extracción de la membrana

plasmática procede dinámicamente, y estas tasas probablemente

dependerán del estado fisiológico de las neuronas, y la cantidad de

subunidades α2 presentes, que mejorarán el tráfico y disminuirán el

cambio de VGCCs. La inserción de VGCCs en la membrana plasmática de

las terminales presinápticas o axones puede ocurrir rápidamente bajo

ciertas condiciones, por ejemplo, después de la inducción de dolor

neuropático, cuando los niveles de las subunidades α2-1 están elevados.

Respecto a esto, se ha informado que GBP inhibe las corrientes de calcio

lentamente durante un período de minutos en DRGs de ratones que

sobreexpresan α2-1 (imitando el estado de dolor neuropático), pero no los

ratones WT. (36).

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La inserción de VGCCs en la membrana plasmática de las terminales

presinápticas o axones puede ocurrir rápidamente bajo ciertas

condiciones, por ejemplo, después de la inducción de dolor neuropático,

cuando están elevados? 2? -1 Niveles de subunidades. A este respecto, se

ha informado de que GBP inhibe las corrientes de calcio lentamente

durante un período de minutos en GRD de 2 -1 -? Ratones que

sobreexpresan (imitando el estado de dolor neuropático), pero no los

ratones WT. (36)

En conclusión, la acción de GBP dilucidada aquí, para inhibir el tráfico

de VGCC y la expresión en la membrana plasmática, representa un

mecanismo de acción de fármaco no caracterizado previamente, y señala

el camino a seguir para el desarrollo de fármacos.

Métodos Cultivo de tejidos y expresión heteróloga de ADNc. Los detalles figuran en Métodos SI.

Electrofisiología. Las corrientes de los canales de calcio se registraron

esencialmente como se describe y detalla en Métodos SI.

Inmunotransferencia. El análisis por inmunotransferencia se realizó

esencialmente como se ha descrito. Muestras de SDS / PAGE resueltas se

transfirieron a membranas de PVDF y se probaron con Abs primarias como se

describió y con las Abs secundarias conjugadas con peroxidasa de rábano

picante respectivamente, seguida de detección de quimioluminiscencia.

Inmunocitoquímica e Imagen. El método utilizado es esencialmente como se describe y detalla en Métodos SI.

Ensayo de Bioquinilación. A las 72 h después de la transfección con los

ADNc descritos, las células fueron lavadas tres veces con PBS y después se

incubaron con PBS que contenía 1 mg / ml de Sulfo-NHS-SS-biotina (Pierce)

durante 30 min a 4 ° C. La solución de biotina se eliminó y se enjuagó dos

veces con PBS que con glicina 100mM (pH 8,0) a temperatura ambiente

para enfriar la reacción. Las células se lavaron suavemente tres veces con

PBS y se lisaron a continuación. La mitad del lisado celular se cargó en un

gel de Tris-Acetato de 3-8% para determinar la expresión de proteína total.

Igual cantidad de proteínas biotiniladas se precipitaron mediante la adición

de 50microL de perlas de estreptavidina-agarosa (Pierce) y se incubaron

durante la noche a 4 ° C. Las perlas de estreptavidina-agarosa se lavaron

tres veces y se incubaron con DTT 100 mM en 2x Tampón de muestra

Laemmli durante 1 hora a 37 ° C. Las proteínas eluidas fueron resueltas por

SDS / PAGE. La inmunotransferencia para la proteína citosólica de Akt se

utilizó como control para determinar que las proteínas intracelulares no se

biotiñeron como resultado de daño celular.

Statistical Analysis Data are given as means ± SEM, and the statistical tests

used are either ANOVA with Bonferroni’s post hoc test or Student’s two-tailed

t test, as stated.

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Norm

aliz

ed

Curr

ent

I (pA

/pF

) B

a

I/I

(m

s)

max

in

inact

ac

A Step potential (mV)

-40 -20 20 40 60 80

B

1.0

-100

transient Ca 2.1/

0.8

0.6

V 4

-200

-300

* *

stable -2 cell line 2

Control

chronic GBP (1 mM)

0.4

0.2

0.0

-120 -80 -40 0 40

Conditioning potential (mV)

C 0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

+20 mV

control

chronic GBP (1 mM)

0 250 500 750 1000

Time (ms)

440000

330000

220000

110000

00

D

control

*

1 mM GBP

(m

s)

act

Norm

aliz

ed C

urr

ent

in

A 0.0

-0.2

+20 mV

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

control

chronic GBP

(100 M)

0 250 500 750 1000

Time (ms)

B 500

*

400

300

200

100

0

control

100 M GBP

% o

f ce

lls w

ith

no

n-u

niform

dis

trib

ution

ii

A

i

Con

α2-2

(102-117 Ab) GFP-Cav2.2

merge

regions of B co-localization

60

50

***

control

+ 1mM GBP

***

40

30

+ GBP 20

iii

10

0

WT -2 GFP-Ca 2.2 + GBP V

% o

f ce

lls w

ith n

on

-unifo

rm d

istr

ibutio

n

C

A

R282A biotinylated

R282A biotinylated

GBP (mM) 0

kDa

0.1 1

0 0.1 1

IB

160

WCL Pull-down

B α -2 (102-117 Ab) GFP-Ca 2.2 merge 2 v

control

R282A- -2

controlll 70 + 1mM GBP

60

R282A

α2δ-2

50

40

+ GBP 30

20

10

0

-2 GFP-Ca 2.2 V