Cuando se pretende analizar una muestra colorida como el azul de timol para conocer su concentración es necesario recordar la ley de la absorción, postulada por Lambert y Beer dice que “una solución da información cuantitativa de cómo es que la atenuación de la radiación depende de la concentración de las moléculas que la absorben y de la distancia que recorre el rayo en el medio absorbente” (SKOOG 2001), es decir, cuando la luz atraviesa una solución contenedora de una analito, azul de timol para este caso, la intensidad de la misma disminuye a consecuencia de la excitación del analito. Dicha respuesta es medida como absorbancia (A) y transmitancia (T) ambas expresadas como:

A=log P0/P T = P/P0

Donde P0 es la intensidad de la radiación infligida sobre la muestra y P la radiación saliente de la muestra.

Esto nos lleva a recurrir a un espectrofotómetro de luz visible, instrumento mediante el cual se inflige un haz de luz de determinada longitud de onda (λ) a la solución de Azul de timol con el fin de excitar las moléculas del mismo. Las moléculas a l ser excitadas por radiación visible experimentan un cambio energético, un electrón situado en un nivel bajo de energía molecular u orbital atómico es trasferido a un orbital atómico de mayor energía.

De esta manera se sabe que para el azul de timol en la solución problema debe de existir un nivel de radiación o longitud de onda en la que el nivel de excitación de las moléculas constituyente para generar una respuesta analítica (absorbancia y transmitancia). Cabe mencionar que en el espectro de luz visible existen intervalos de longitud de onda que trasmiten un color de luz la cual será absorbida y posteriormente trasmitida en un color complementario.

Intervalo de longitudes color de la luz absorbida color complementario transmitido

400-435 violeta amarillo-verdoso

435-480 azul amarillo

480-490 azul-verde anaranjado

490-500 verde-azul rojo

500-560 verde purpura

560-580 amarillo-verdoso violeta

580-595 amarillo azul

595-650 anaranjado azul-verdoso

650-750 rojo verde-azul

Para poder hacer uso de espectrofotómetro para cuantificar la solución de azul de timol es necesario precisar una longitud de onda de trabajo. Existe una manera de conocer la longitud óptima de trabajo misma longitud a la cual el azul de timol es mayormente excitado por el haz de luz, encontrando el intervalo de longitudes de onda donde el color complementario transmitido

por la solución sea azul y realizar un espectro de absorción. Un espectro de absorción es una grafico de la absorbancia o transmitancia en función de la longitud de onda en donde el punto más alto (para absorbancia) y el más bajo (para transmitancia) cortado en el eje de la absorbancia será la longitud de onda optima de trabajo.

Para la construcción de un espectro de absorción de debe evaluar la respuesta analítica en función de la longitud de onda haciendo uno de la solución más concentrada de la serie de soluciones de la curva de calibración puesto que al ser la contenedora de azul de timol en mayor proporción es la que nos brindara una mejor respuesta pues al estar en mayor concentración habrá más moléculas absorbiendo radiación lo que se traduce en un mayor respuesta analítica, abosrbancia para este caso.

Como se puede observar en los espectros de absorción realizados el punto más para la absorción y el más bajo para la transmitancia al cortarlo con el eje de la longitud de onda es de 595nm valor que se encuentra dentro del intervalo de longitud correspondiente al el color trasmitido por la solución el cual va de 580nm a 595nm eso quiere decir que en todo este rango la solución se encuentra excitada en mayor proporción que a otras longitudes de onda pero a 595nm en la longitud donde su nivel de energía es superior y por lo tanto la longitud de onda optima de trabajo.

Se pueden establecer algunas condiciones para construir un espectro de absorción lo cuales son:

Concentración del analito a medir caiga dentro del rango de medición del equipo Solución no sea de un color cuyas longitudes de onda estén cercanas a las de otro color Que el analito sea químicamente estable Si los sistemas de la curva de valoración contienen una solución a parte de la de interés

cuantitativo que esta no interfiera con el mismo

El azul de timol es un analito poseedor de dos pka’s y tres colores dependiendo en el pH en que se encuentre la solución, rojo para un pH de 0 a 2, amarillo de 2 a 8.7 y azul a pH de 8.7 a 14. Según SKOOG el color complementario expresado por una solución está dado por el color absorbido por la misma; si el azul de timol se pretende analizarlo en sus formas coloridas roja o amarilla encontramos que la longitud de onda de trabajo tendría que estar contenida en un intervalo de 435 a 500 nm, intervalo en el cual tanto el color rojo y amarillo trasmitido por la solución absorben longitudes de onda bastante cercanas haciendo que la longitud optima de trabajo sea inexistente provocando interferencias unas con otras lo que lleva a la obtención de valores inexactos motivo suficiente para trabajar con el azul de timol en su forma colorida azul la cual es asegurada al estar contenido en el solución básica, por esta razón todos los sistemas de la curva de calibracion contienen 4 ml de NaOH 9.8659x10-3 asegurando así el amortiguamiento del pH y la forma colorida del azul de timol.

Al agregar 4 ml de NaOH de concentración 9.8659x10-3 volúmenes de 1 a 5 ml de la solución de azul de timol y aforar a 10 ml el pH de las soluciones de la curva de calibracion es calculado de la siguiente manera:

4 ml de NaOH x 9.8659x10-3 mol de NaOH/1000 ml = 3.9463x10-5 mol de NaOH contenidos en un volumen total de 10 ml

3.9463x10-5 mol de NaOH/10ml x 1000 ml / 1L =3.9463x10-3 M

Según la ecuación 14 = pH + pOH realizando un despeje podemos calcular el pH

PH = 14 – pOH pOH = -log (3.9463x10-3) pH = 14 – 2.41 = 11.59

Si en un intervalo de pH de 8.7 a 14 el color del azul de timol es azul y el pH de la solución es de 11.59 entonces el color del azul de timol en las soluciones de la curva de calibracion es ese, motivo por el cual la curva de calibracion es preparada añadiendo 4 ml de NaOH.

En base a las gráficas anteriores donde se grafica la absorbancia (A) en función de la concentración expresada en µg/ml y M(molar) se puede el tratamiento estadístico conocido como regresión lineal para cada una de las graficas obteniendo los valores siguientes:

A= f(M) A=f(µg7ml)

Y=mx+b b= -1.79x10-3 b=-1.81x10-3

M=25072.1660 m=0.0537

Dadp que la ecuación de la línea recta esta expreseda como y=mx+b la absorbancia puede se adecuada a este modelo matemático. La abosrbancia se expresa como A=CK debido a que C esta representando la concentración y K la constante de proporcionalidad si tomamos en cuenta que y representa la abosrbancia entonces m, la pendiente, representada por CK y tomando en cuenta que K siempre siempre será constante entonces la concentración es representada por X obteniendo la ecuación siguiente A=CK+b donde A=Y K=m C=X, caben mencionar que debido a l que la absorbancia no posee unidades K debe estar expresada en las unidades correspondientes para que al ser multiplicada por la concentración estas sean eliminadas de la ecuación y de un resultado adimensional.

En relación a las pendientes de las gráficas obtenidas por regresión lineal la unidades correspondientes son m=25072.1660mol-1L para A=f(M) y m=0.0537 para A=f(µg/ml) asi al multiplicar por la concentración estas unidades se cancelan y se obtiene la absorbancia sin unidades.

Haciendo uso de este modelo matemático podemos cuantificar el azul de timol contenido en la solución problema. La absorbancia reportada por el espectrofotómetro fue de 0.743 entonces la ecuación para la determinación de la concentración queda como:

0.743=25072.1660mol-1LC-1.7939x10-3 para A=f (M) y 0.732=0.0537µg-1mlC-1.8x10-3 despejando la concentración de la ecuación tenemos que

C=0.743-1.7939x10-3/25072.1660mol-1L=2.9563x10-5mol/L

C=0.743-1.8x10-3/0.0537µg-1ml=13.8026µg/ml

Debido a que para el análisis espectrofotométrico del sistema numero 6(sistema contenedor de la muestra problema) fue necesario hacer una dilución 1:10 puesto que el color de la solución

problema en el sistema no entraba dentro de la curva de calibración en realidad la concentración total de la muestra problema es 10 veces más alta que la obtenida en el cálculo, por lo tanto

13.8026µg/ml x 10 = 138.026 µg/ml

2.9562x10-5Mx10=2.9562x10-4M

De esta forma se cuantifica el contenido de azul de timol dentro de la solución problema.