INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALtesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/13347/1... · Yautepec,...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

IDENTIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE COMPUESTOS

MAYORITARIOS EN PLANTAS SILVESTRES DE

Castilleja tenuiflora Benth Y SU ACUMULACIÓN EN

CULTIVOS DE RAÍCES in vitro.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORADO EN CIENCIAS

EN

DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

YENNY ADRIANA GÓMEZ AGUIRRE

DIRECTORES

GABRIELA TREJO TAPIA

ALEJANDRO ZAMILPA ALVAREZ

Yautepec, Morelos, México Diciembre 2011

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del

Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del

Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Gabriela Trejo Tapia y en el

Centro de Investigación Biomédica del Sur del Instituto Mexicano del Seguro Social,

bajo la dirección del Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez.

Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico del Consejo

Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) (No. becario: 215309) y del Programa

Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) de la Secretaría de investigación

y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento

otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090311, 20100308 y 20110153) y del

CONACyT (Proyecto No.100202).

AGRADECIMIENTOS

Expreso sinceros agradecimientos a:

A mis directores:

Dr. Gabriela Trejo Tapia. Investigadora del Departamento de Biotecnología. Centro

de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi) – Instituto Politécnico Nacional (IPN).

Dr. Alejandro Zamilpa Alvarez. Investigador del Centro de Investigación Biomédica

del Sur (CIBIS) - Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).

Al comité tutorial y revisor:

Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio. Investigador del Departamento de

Biotecnología. CeProBi-IPN.

Dra. Kalina Bermúdez Torres. Investigadora del Departamento de Biotecnología.

CeProBi-IPN.

Dr. Federico Castrejón Ayala. Investigador del Departamento de Interacciones

Planta-Insecto. CeProBi-IPN.

Dra. Elsa Ventura Zapata. Investigadora del Departamento de Biotecnología.

CeProBi-IPN.

Dr. Mario Rodríguez Monroy. Investigador del Departamento de Biotecnología.

CeProBi-IPN.

Dr. Manasés González Cortazar. Investigador del CIBIS-MSS.

A mis compañeros y profesores del CeProBi y del CIBIS.

CONTENIDO

Páginas

ÍNDICE DE CUADROS i

ÍNDICE DE FIGURAS iii

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS v

RESUMEN vi

ABSTRACT vii

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................1

2. ANTECEDENTES..................................................................................................3

2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional Mexicana .................... 3

2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja .......................... 6

2.3. Iridoides glucosilados .................................................................................................. 11

2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados ................................................................... 12

2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados....................................................... 16

2.4. Feniletanoides glicosilados ......................................................................................... 17

2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados ........................................................... 18

2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados .......................................... 21

2.5. Cultivos in vitro de raíces ............................................................................................ 22

2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y feniletanoides

glicosilados ........................................................................................................................... 23

2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora .................................. 25

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 26

4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 27

4.1. Objetivo general .......................................................................................................... 27

4.2. Objetivos específicos .................................................................................................. 27

5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 28

5.1. Material vegetal silvestre ............................................................................................. 28

5.2. Evaluación de protocolos de extracción ...................................................................... 29

5.3. Cromatografía de capa fina (CCF) .............................................................................. 29

5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora. .................... 31

5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22 .................................................................... 33

5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C. tenuiflora.................. 34

5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces ........................................................... 34

5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces .......................................... 34

5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del extracto metanólico

de raíces silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................... 36

5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces

silvestre de C. tenuiflora ......................................................................................................................... 37

5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces


5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto metanólico de raíces


5.6. Cuantificación de aucubina ......................................................................................... 40

5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido ...................................................... 41

5.8. Cuantificación de apigenina ........................................................................................ 42

5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora ................................ 43

5.10. Determinación de parámetros cinéticos .................................................................... 44

5.11. Análisis estadístico .................................................................................................... 45

6. RESULTADOS .................................................................................................... 46

6.1. Evaluación de protocolos de extracción ...................................................................... 46

6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora ................................... 48

6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C. tenuiflora ............... 48

6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C. tenuiflora ........ 50

6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina en plantas

silvestres ............................................................................................................................... 63

6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora ............................... 64

6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en cultivos in vitro de

raíces adventicias de C. tenuiflora ........................................................................................ 68

7. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 71

8. CONCLUSIONES ................................................................................................ 76

9. PERSPECTIVAS ................................................................................................. 77

10. LITERATURA CITADA ....................................................................................... 78

ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (fracción T19b) 89

ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a) 90

ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido 91

ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido 92

ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados

de la fracción C4R2 (posible feniletanoide glicosilado) 93

ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados

de la fracción C4R4 (posible feniletanoide glicosilado) 94

ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanólico del

tallo de C. tenuiflora 95

ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis 96

i

ÍNDICE DE CUADROS

Páginas

1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina

tradicional

5

2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja 7

3.

Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el

género Castilleja

10

4.

Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen

verbascósido

24

5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C.

tenuiflora

28

6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos

silvestres de C. tenuiflora

33

7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto

metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora

36

8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la

fracción acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C.

tenuiflora

37

9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción

acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora

38



39

ii



40

12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides

glucosilados por HPLC

41

13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides

glicosilados por HPLC

42

14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC 43

15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubina

(CD3OD)

49

16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósido

(CD3OD)

50

17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de

verbascósido e isoverbascósido (CD3OD)

52

18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los

diferentes órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora

64

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Páginas

1. Castilleja tenuiflora 4

2. Iridoides 12

3.

Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para

Scrophularia umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c)

y Scrophularia racemosa (d)

14

4. Estructura general de los feniletanoides 18

5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en

Olea europea (Oleaceae) y Cintasche deserticola (Orobanchaceae)

20

6.

Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento

de flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a)

32

7.

Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de

raíces de C. tenuiflora

35

8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e

infusiones de C. tenuiflora

46

9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas


47

10.

Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV

365 nm)

48

11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos


49

12.

Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido

e isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora

51

iv

13.

Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del

extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora

53

14.

Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la

secuencia de espines de la glucosa

57

15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido

mostrando la secuencia de espines de la ramnosa

58

16. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la

secuencia de espines de la aglicona

60

17. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la

secuencia de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos

61

18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura

del verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido

cafeico con el hidrogeno H-4 de glucosa

62

19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión

del carbono e hidrogeno de glucosa y ramnosa

63

20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora 65

21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro 66

22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio

líquido B5 suplementado con 10 M de AIA, ANA ó sin regulador de

crecimiento (control)

67

23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos

metanólicos de C. tenuiflora

69

24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C.

tenuiflora cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA

ó SRC

70

v

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

AIA Ácido indol 3-acético

ANA Ácido -naftalenacético

BF Biomasa fresca

BS Biomasa seca

CCF-FN Cromatografía en capa fina en fase normal

CCF-FR Cromatografía en capa fina en fase reversa

CLAR-FR Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

COSY Correlation spectroscopy

δ Desplazamiento químico

d Día

FG Feniletanoides glicosilados

IG Iridoides glucosilados

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

HSQC Heteronuclear single quantum correlation

MS Metabolitos secundarios

NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy

Rf Factor de retención

RMN 1H Resonancia magnética nuclear de protón

RMN 13C Resonancia magnética nuclear del isótopo de carbono

rpm Revoluciones por minutos

TFA Trifluoracetic acid

td Tiempo de duplicación

µ Velocidad específica de crecimiento (días-1)

W/m2 Vatios por metro cuadrado

vi

RESUMEN

En este estudio, por primera vez se identificaron el verbascósido e isoverbascósido

como los principales feniletanoides glicosilados (FG) en plantas silvestres de

Castilleja tenuiflora. Se identificaron dos iridoides glucosilados (IG) aucubina y

bartsiósido, así como el flavonoide apigenina. Se ha demostrado la actividad

biológica de esos compuestos, como anti-inflamatoria, antioxidante y citotóxica, que

pueden estar relacionadas con los usos tradicionales de esta planta. Se desarrolló

una metodología de separación por cromatografía líquida de alta resolución en fase

reversa (CLAR-FR) para analizar FG e IG. Se determinó su concentración en

diferentes tejidos de plantas silvestres. El verbascósido se acumuló principalmente

en raíces e inflorescencias (9.23 y 7.88 mg g-1 de biomasa seca (BS),

respectivamente), mientras que el isoverbascósido se acumuló principalmente en las

raíces (7.13 mg g-1 BS). Se estableció el cultivo de raíces adventicias in vitro, en el

que las raíces se cultivaron en medio B5 con 10 M de ácido indol 3-acético (AIA) ó

10 M de ácido α-naftalenacético (ANA). El mayor rendimiento de biomasa seca fue

con la auxina AIA a los 30 días (30 g L-1), éste valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto

(P <0,05) que lo obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento

(control), respectivamente. Los mayores rendimientos específicos de FG también se

obtuvieron utilizando esta auxina; el máximo nivel de verbascósido fue 14.62 mg g-1

BS (438.6 mg L-1) a los 30 días de la cinética y el máximo rendimiento de

isoverbascósido fue de 37.32 mg g-1 de BS (522.48 mg L-1) a 23 días de la cinética.

El cultivo de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora es un sistema prometedor

para que en futuros estudios se amplíe el conocimiento sobre la biosíntesis de los

feniletanoides glicosilados.

vii

ABSTRACT

In this study, we identified for the first time verbascoside and isoverbascoside as the

major phenylethanoid glycosides (PhGs) in wild plants of C. tenuiflora. These

compounds have proven biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant,

and cytotoxic activities, which may be related to the traditional uses of this plant. We

developed a reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)

procedure to analyze PhGs, and determined their concentrations in various different

tissues of wild plants. Verbascoside accumulated mainly in roots and inflorescences

(9.23 and 7.88 mg g-1 dry biomass, respectively), while isoverbascoside accumulated

mainly in the roots (7.13 mg g-1 dry biomass). To provide an alternative source of

material for production of bioactive compounds, we established in vitro adventitious

root cultures in which roots were grown in B5 medium containing either 10 M indole

3-acetic acid (IAA) or 10 M -naphthaleneacetic acid (NAA). The greatest dry

biomass yield (30 g L-1) was achieved at 30 days after transfer of roots into IAA-

containing medium. The highest specific yields of PhGs were also obtained using this

auxin; the maximum level of verbascoside was 14.62 mg g-1 dry root biomass (438.6

mg L-1) at 30 days after root transfer, and the maximum yield of isoverbascoside was

37.32 mg g-1 dry root biomass (522.48 mg L-1) at 23 days after root transfer.

Adventitious root cultures of C. tenuiflora are a promising system for further studies

on scale-up and phenylethanoid glycosides biosynthesis.

1

1. INTRODUCCIÓN

Castilleja tenuiflora Benth. (Oronbachaceae antes Scrophulariaceae) es una especie

de importancia en la medicina tradicional Mexicana. Se ha descrito su uso para tratar

síntomas asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos

gastrointestinales. En la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica

como diurético y sialagogo (sustancia que estimula la saliva).

El primer estudio químico de plantas silvestres de C. tenuiflora fue realizado por

Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en el extracto butanólico de la parte aérea

los iridoides glucosilados: bartsiósido, aucubina, shanzhisida, ácido geniposídico y el

ácido mussaenosídico. En una investigación reciente, Rosas (2007) demostró que

tanto en la parte aérea como en la raíz hay presencia de iridoides. Entre los cuales

solo identificó aucubina y bartsiósido.

En el género Castilleja, el verbascósido fue identificado por primera vez en Castilleja

integra en 1987 y en 1990 el isoverbascósido sólo se había identificado en Castilleja

linariaefolia. Los iridoides glucosilados (IG) del tipo de la aucubina, así como los

feniletanoides glicosilados (FG) del tipo de verbascósido son compuestos

considerados marcadores taxonómicos y su presencia se encuentra restringida a los

ordenes Lamiales, Scrophulariales, Hippuridales y Oleales. La presencia de estos

compuestos en la planta parece deberse a su interacción con microorganismos y el

ambiente.

La investigación sobre la biología de la raíz se había visto obstaculizada por la

naturaleza de las raíces y la falta de sistemas experimentales adecuados para

estudiar la interacción entre raíz-raíz y raíz-microorganismo. Sin embargo, los

avances recientes en las raíces que crecen de forma aislada de otros elementos de

la rizósfera han facilitado enormemente su estudio, específicamente del metabolismo,

fisiología y genética, contribuyendo a la comprensión de este órgano, así como el

2

potencial de los metabolitos derivados de la raíz en términos de su actividad biológica

y la manipulación humana.

Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y

organización celular pueden sintetizar y/o acumular estos metabolitos secundarios,

representando una alternativa a la extracción directa de la planta. Previamente, en

cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora se acumularon iridoides (biomasa y medio

de cultivo), aunque no se elucidaron las estructuras, sólo se identificó aucubina en el

sobrenadante.

En el presente trabajo de investigación, se realizó el estudio químico de las raíces y

tallos de C. tenuiflora con lo que se logró el aislamiento y elucidación estructural de

dos FG: verbascósido e isoverbascósido, los IG: aucubina y bartsiósido y el

flavonoide: apigenina. Adicionalmente, se desarrolló la metodología cromatográfica

para la cuantificación de estos metabolitos secundarios. Se demostró que las

mayores concentraciones de verbascósido e isoverbascósido están en la raíz. Se

estableció el cultivo in vitro de raíces adventicias y se analizó la capacidad de

producir éstos compuestos.

3

2. ANTECEDENTES

2.1. Castilleja tenuiflora y su importancia en la medicina tradicional

Mexicana

El género Castilleja comprende más de 220 especies, son herbáceas anuales o

perennes, que se distribuyen principalmente en el continente Americano. En México,

considerado centro de dispersión del género, crecen alrededor de 43 especies

(Holmgren, 1976). Éste género ha sido recientemente reclasificado de la familia

Scrophulariaceae hacia la Orobanchaceae, en base a los análisis filogenéticos

moleculares y por sus características hemiparásitas (Thorne, 2000; Wesselingh y van

Groenendael, 2005; Egger, 2008; Tank et al., 2009). Éste género ha sido muy

estudiado desde el punto de vista ecológico (Roby y Stermitz, 1984b; Mead et al.,

1992; Mead et al., 1993; Spasojevic y Suding, 2011) pero poco en el uso medicinal

(Moreno-Escobar et al., 2011).

Castilleja tenuiflora se conoce como calzón de indio, cola de borrego, castilleja,

coneja, copete de grulla, culano, flor de hielo, garañona, garayona, hierba del cáncer,

hierba del golpe, mirto, plumero, saca miel, tetlatlatzo, yerba de la epístola (Argueta

et al., 1994; Mondragón y Vibrans, 2005) en dialecto náhuatl "Atzoyatl” (Béjar et al.,

2000), en tarahumara “Rosábochi” (Olivas, 1999) y en inglés como "Indian

paintbrush". Las sinonimias son Castilleja canescens (se conoce como garañona) y

Castilleja angustifolia (Nesom, 1992).

Se distribuye en las zonas montañosas del sur de Estados Unidos y en México,

donde se ha registrado principalmente en la zona centro y sur (Nesom, 1992). C.

tenuiflora tiene crecimiento herbáceo o subarbustivo, crece abundantemente arriba

de los 2000 metros de altitud; en el valle de México se encuentra hasta los 3300

m.s.n.m. Su hábitat son bordes de cultivo y orillas de caminos, junto a coníferas y

árboles de encino, en matorrales y pastizales (Figura 1-A).

4

La planta crece de 30 cm hasta 1 m aprox. de alto. El tallo es erecto, muy ramificado,

con pelos largos y tiesos o rígidos, que llegan a ser blancos a blanco-grisáceo. Las

hojas son sésiles y al menos levemente auriculadas (con forma de oreja) en la base,

son lineares-lanceoladas, de 1 a 4.5 cm de largo, el ápice es agudo u obtuso, con

tricomas suaves ó tiesos y largos, algunas veces glanduloso-pubescentes. La

inflorescencia es racemosa, con numerosas flores, pedicelos de 3 a 5 mm de largo,

las brácteas son lanceoladas de 1.2 a 4 cm de largo, con ápice agudo, en ocasiones

teñido de rojo. Las flores tienen forma de corola de 3 a 4.5 cm de largo, de color

anaranjado, ocasionalmente amarilla, gálea verdosa, con pelos simples y muy cortos,

de 1.5 a 2 cm de largo; las anteras son de 2 a 3 mm de largo; el estilo es de 3 a 4 cm

de largo, estigma bilobulado; cáliz de 2 a 3 cm de largo, lóbulos dentados con pelos

largos y tiesos, con el ápice teñido de rojo (Figura 1-B). Los frutos son cápsulas

ovoides de 9 a 14 mm de largo (Figura 1-C) y las semillas son elipsoides de 1.8 mm

aprox. de largo y de color café (Nesom, 1992). Actualmente no hay reportes sobre la

morfología de las raíces de esta especie. En la figura 1-D, se muestra una fotografía

de las raíces de C. tenuiflora recolectadas en el estado de Amecameca.

Figura 1. Castilleja tenuiflora. A. Hábitat de C. tenuiflora (flecha señalando plantas en estado

de floración). Amecameca, Estado de México. 3500 m.s.n.m. B. Inflorescencia. C. Corte

transversal del fruto. D. Raíces. Fotografías (A, B y D) tomadas en Noviembre de 2008 por

Gómez-Aguirre, Y. A. y (C) tomada en un estereomicroscopio por Sánchez, J. A.

D

A B C

5

En el siglo XVI, el médico y naturalista español Francisco Hernández (1517?-1587)

investigó sobre las plantas medicinales en México. Una de las especies que describió

fue C. tenuiflora y relató los siguientes usos: antiespasmódico, diurético (sustancia

que al ser ingerida provoca eliminación de agua y sodio), enfermedades del

estómago, eupéptico (sustancia que facilita la digestión), purifica la sangre y

sialagogo (Béjar et al., 2000). En el siglo XX, otros autores también registraron sus

usos en la herbolaria mexicana para curar cólicos hepáticos (Martínez, 1969), tratar

la anemia, cálculos de la vesícula, colecistitis (inflamación de la pared de la vesícula

biliar) y dispepsia (alteración funcional asociada al aparato digestivo) (Cabrera,

1958). También se recomienda para curar tumores (Graham et al., 2000), tratar la

esterilidad, problemas gastrointestinales y la cirrosis (Béjar et al., 2000). La Sociedad

Farmacéutica de México la indica como diurético y sialagogo (Morales, 1952). En el

cuadro 1, se resumen los usos de C. tenuiflora, así como su forma de preparación.

Cuadro 1. Usos y forma de preparación de C. tenuiflora en la medicina tradicional.

Uso medicinal Parte Vía de administración Preparación

Fertilidad y purificación de

la sangre

N.I. Oral Cocción

Lavados vaginales Hojas Local Cocción

Lavado de heridas Planta Local Cocción

Heridas internas Planta Oral Cocción

Tos Inflorescencia y hojas Oral Cocción

Disentería

Nervios

Vómitos

Hojas con

flores de nochebuena

(Euphorbia pulcherrima),

hojas de altísima

(Tanacetum parthenium)

y Chocolate pinolillo

Oral Cocción

Retraso ó adelanto

menstrual

Esterilidad femenina

Flores Oral Cocción

Afecciones del hígado

Problemas del riñón

Ramas Oral Cocción

Caída del cabello Ramas Local Cocción

N.I.: No identificado.

Referencia: (http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%

B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964).

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%25%20B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%25%20B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964

6

2.2. Estudios de fitoquímica y actividades biológicas del género Castilleja

El género Castilleja ha sido objeto de diversos estudios químicos con los que se ha

logrado el aislamiento y elucidación estructural de iridoides glucosilados (IG) y el

feniletanoide glicoslidado (FG) verbascósido, principalmente. Por ejemplo, en C.

integra se han identificado IG como catalpol y macfadienósido (5-hidroxicatalpol)

(Mead et al., 1993) y el FG verbascósido (Gardner et al., 1987). Mientras que en C.

miniata aff. rhexifolia se detectó aucubina, catalpol y bartsiósido, principalmente. En

C. linariaefolia se identificaron verbascósido e isoverbascósido (Gardner et al., 1987;

Pettit et al., 1990). Hasta el momento sólo se ha identificado el ácido fenólico

salidrósido en C. chromosa (Stermitz et al., 1991). Otros compuestos aislados de

diversas especies del género Castilleja son presentados en los cuadro 2 y 3.

Las investigaciones sobre C. tenuiflora son pocas; abarcan aspectos fitoquímicos,

farmacológicos y biotecnológicos. Uno de los primeros estudios químicos fue

realizado por Jiménez et al. (1995), quienes identificaron en un extracto n-butanólico

de las partes aéreas, los siguientes iridoides poliacetilados: bartsiósido penta-

acetilado, aucubina hexa-acetilada, éster metílico del ácido geniposídico penta-

acetilado, éster metílico del ácido mussaenosídico tetra-acetilado y éster metílico de

la shanzhisida penta-acetilada (Cuadro 2). Posteriormente, Rosas (2007), demostró

mediante cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución (CLAR)

y resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C e 1H, que en extractos de acetato de

etilo de la parte aérea se acumulan iridoides glucosilados, de los cuales sólo se

identificó la aucubina y el bartsiósido.

7

Cuadro 2. Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.

Especie Iridoides glucosilados Referencia

C. rhexifolia

O

HO

HO Oglc

Aucubina

O

HO

HO Oglc

O

Catalpol

O

HO

Oglc

COOMe

Dihidrocornina

O

HO

Oglc

COOMe

Penstemonósido

Roby y Stermitz (1984a)

C. miniata

O

HO

HO Oglc

Aucubina

O

HO Oglc

Bartsiósido

O

HO

HO Oglc

O

Catalpol

O

HO Oglc

O

6- deoxicatalpol

O

AcO

Oglc

HO

COOMe

Shanzhisidato de metilo

O

Oglc

COOMe

HO

Gardósidato de metilo

O

Oglc

COOMe

HO

8-epi loganina

O

Oglc

HO

COOMe

Mussaenósido

Arslanian et al. (1985)

C. integra

O

Oglc

COOOH

Shanzhisida

O

AcO

Oglc

HO

COOMe


O

HO

HO Oglc

O

Catalpol

O

Oglc

COOMe

HO

HO

6-- Hidroxiadoxósido

O

HO Oglc

COOMe

Adoxósido

O

HO Oglc

COOH

Ácido adoxosídico

O

HO

HO Oglc

O

OH

Macfadienósido

O

Oglc

COOOH

HO

Ácido 8-epi-logánico

Gardner et al. (1987)

8

Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.


C. linariifolia

O

Oglc

COOOH

Shanzhisida

O

HO

HO Oglc

O

Catalpol

O

HO Oglc

COOMe

Adoxósido

O

HO Oglc

COOH

Ácido adoxosídico

Gardner et al. (1987)

C. wightii

O

HO

O Oglc

O

Oglc

10-O-trans-

cinnamoilmelitósido

O

HO Oglc

Bartsiósido

O

Oglc

HO

COOMe

Mussaenósido

Belofsky y Stermitz (1988)

C. sessiliflora

O

MeOCO

HO Oglc

Oglc

6-O-Acetilmelitósido

O

HO

HO Oglc

Oglc

Melitósido

O

HO Oglc

COOMe

Adoxósido

O

Oglc

HO

COOMe

Mussaenósido

Stermitz et al. (1991)

C. foliolosa

O

HO

HO Oglc

Aucubina

O

HO

HO Oglc

Oglc

Melitósido

O

Oglc

COOMeH

HHO

Genipósido

O

HO Oglc

COOH

Ácido geniposídico

C. exilis

C. minor O

AcO

Oglc

HO

COOMe


O

Oglc

COOMe

HO

8-epi-loganina

O

Oglc

HO

COOMe

Mussaenósido

9

Cuadro 2 (continuación). Iridoides glucosilados identificados en el género Castilleja.


C. purpurea

O

MeOCO

HO Oglc

Oglc

6-O-Acetilmelitósido

O

AcO

Oglc

HO

COOMe


Stermitz y Pomeroy (1992)

C. indivisa

O

HO

HO Oglc

Oglc

Melitósido

C. tenuiflora

O

HO

HO Oglc

Aucubina

O

HO Oglc

Bartsiósido

O

HO Oglc

COOH

Ácido

geniposídico

O

Oglc

HO

COOMe

Ácido

mussaenosídico

O

AcO

Oglc

HO

COOMe

Shanzhisidato de

metilo

Jimenez et al. (1995)

10

Cuadro 3. Feniletanoides glicosilados y ácidos fenólicos identificados en el género Castilleja.

N.I.: No identificado

Sobre la actividad biológica de C. tenuiflora se han realizado investigaciones acerca

de la actividad citotóxica y actividad antioxidante. En el primer caso, los extractos

metanólicos obtenidos de plantas colectadas en Ocuitlán (Estado de México),

presentaron actividad citotóxica en las líneas de cáncer cérvico-uterino (CaSki) y de

mama (MCF7) (Moreno-Escobar et al., 2011). En este estudio no se asoció la

actividad biológica con algún compuesto químico en específico. Por otro lado, los

extractos metanólicos de las plantas silvestres y órganos cultivados in vitro contienen

compuestos con actividad antioxidante, lo cual se demostró mediante modelos in

vitro de actividad antirradical (ABTS y DPPH) y de poder reductor (fosfomolibdeno).

Especie Feniletanoides glicosilados Ácidos fenólicos Referencia

C. integra

O

O

O

OHO

O

OH

OHHO

HOH3C

OHO

HO

OH

OH

Verbascósido

N.I. Gardner et al. (1987)

C. linariaefolia Verbascósido (Acteósido)

O

O

O

OHO

HO

O

OHHO

HO

OH

OHOHO

HO

Isoacteósido

N.I. Pettit et al. (1990)

C. sessiliflora Verbascósido N.I. Stermitz et al. (1991)

C. foliolosa Verbascósido N.I.

C. exilis Verbascósido N.I.

C. minor Verbascósido N.I.

C. chromosa Verbascósido

Salidrósido

11

La actividad antioxidante, ha sido asociada con el contenido de compuestos fenólicos

y flavonoides (López-Laredo et al., 2010; Trejo-Tapia et al., 2011). La concentración

de estos compuestos depende de la parte de la planta, así como de las condiciones

de crecimiento y desarrollo.

2.3. Iridoides glucosilados

Los monoterpenos son productos biosintéticos derivados de dos unidades de

isopreno y están distribuidos en una gran variedad de sistemas vivos: plantas,

microorganismos e insectos; algunos tienen función específica en el individuo

productor y varios presentan actividades biológicas de distinta naturaleza, por

ejemplo, atraen polinizadores, son agentes alelopáticos o sustancias de defensa

contra depredadores y parásitos (Marcano y Hasegawa, 2002).

Los iridoides son compuestos monoterpénicos de origen vegetal, aunque el primero

de ellos: la Iridomirmecina (Figura 2-A), se aisló de la hormiga carnívora australiana

Iridomyrmex detectus, de donde toman su nombre. En algunos casos se consideran

como marcadores quimiotaxonómicos de algunas familias y se les han encontrado

diversas actividades farmacológicas. Algunos iridoides glicosilados producen efectos

analgésicos, antiinflamatorios, protectivos, diuréticos, antidiarreicos, sedantes y

citotóxicos (Gálvez et al., 2005; Bi et al., 2008; Jeong et al., 2011; Kirmizibekmez et

al., 2011; Liu y Wang, 2011). Por otro lado, tienen un papel relevante el mecanismo

de defensa en insectos (L'Empereur y Stermitz, 1990a, b).

Los iridoides estructuralmente se caracterizan por tener unidades de isopreno (2-

metil-1,3-butadieno), son compuestos que tienen el esqueleto ciclopentanopirano, el

cual se forma por un anillo básico de dihidropirano fusionado a un ciclopentano

(McMurry, 2004) (Figura 2-B). En función de sus características estructurales, los

iridoides se pueden clasificar en: iridoides glicosilados, iridoides simples o no

glicosilados, secoiridoides (con el anillo ciclopentano abierto) y bis iridoides. Los

glicosilados se encuentran fusionados con un azúcar en el hidroxilo del C-1

12

preferentemente. Los iridoides simples tienen un esqueleto iridano con un metil en C-

8 y otro carbono doble en C-4 (Figura 2-B). La división del enlace 7-8 del anillo

ciclopentano forma secoiridoides, mientras que los bis iridoides resultan de la

dimerización de los iridoides y secoridoides (McMurry, 2004).

La introducción de carbonos, grupos funcionales y dobles enlaces en el esqueleto

iridano origina diversas estructuras de iridoides. Algunas variaciones estructurales

son la oxidación de los carbonos C-6, C-7, C-8 y C-10, epoxidación del anillo

ciclopentano, la introducción de grupos acetoxi y carboxilos, y a veces puede faltar el

enlace 7-8 formando parte de otros metabolitos como en el caso de los esqueletos de

alcaloides indólicos (seco-iridoides) (McMurry, 2004).

2.3.1. Biosíntesis de los iridoides glucosilados

La biosíntesis de iridoides del tipo de la aucubina ha sido poco estudiada. La mayor

parte de las investigaciones se han centrado en la biosíntesis del iridoide

secologanina, por su importancia como intermediario de la síntesis de los alcaloides

indolterpénicos. De tal forma que la mayoría de las reacciones para la síntesis de los

iridoides de este tipo aún no están claramente elucidadas (Oudin et al., 2007).

En las plantas, el isopreno se sintetiza a partir de dos vías diferentes del metabolismo

primario, la vía del acetato/ácido mevalónico (MVA), y la vía del 2-C-metil-D-eritrol-4-

fosfato (MEP), éstas ocurren en compartimientos diferentes: citosol y plastidio,

respectivamente (Lichtenthaler et al., 1997). En experimentos in vivo, donde se han

usado marcadores isotópicos para establecer los pasos de la ruta biosintética de los

Figura 2. Iridoides. A. Primer iridiode aislado: iridomirmecina. B. Sistema de numeración:

R= H ó glucosa. (Tomado de Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).

A B

13

iridoides, han establecido como precursor al geraniol pirofosfato. La ciclización del

aldehído en un anillo ciclopentano da origen al iridodial y oxidaciones posteriores

forman un iridotrial. La forma hemiacetal produce el ácido deoxilogánico (Villaseñor,

2007).

Sampaio-Santos y Kaplan (2001), realizaron una revisión sobre la ruta de biosíntesis

de los iridoides del tipo de la aucubina, en distintas familias de plantas, encontrando

que dependiendo de la familia e incluso de la especie, la secuencia de los pasos

puede cambiar. Adicionalmente, hicieron un experimento marcando con deuterio, el

8-epi-iridodial, 8-epi-iridotrial y el glucósido 8-epi-iridotrial (boschnalosido), los cuales

dieron lugar al harpagido y aucubina, también mencionan que el 8-epi-ácido es

precursor del antirrhinosido en Antirrhinum majus. Con base en los estudios

realizados por éstos autores en especies de Scrophulariaceae: A. majus,

Scrophularia umbrosa, Buddleya albiflora y Scrophularia racemosa se propone la ruta

de biosíntesis que se presenta en la figura 3.

14

Figura 3. Propuesta de ruta de biosíntesis de iridoides glucosilados para Scrophularia

umbrosa (a), Buddleya albiflora (b), Antirhinum majus (c) y Scrophularia racemosa (d)

(Sampaio-Santos y Kaplan, 2001).

15

En cuanto a factores que regulan la biosíntesis de este tipo de iridoides, también

existe poca información. Al parecer la biosíntesis de iridoides ocurre en las hojas. Sin

embargo, en la raíz de varias especies se ha observado su acumulación y varios

reportes apuntan a que es diferencial en los diversos tejidos y órganos de la planta.

Por ejemplo, en la raíz de S. ningpoensis (Nguyen et al., 2005) y S. lepidota se

identificaron varios iridoides, entre ellos derivados de la aucubina y del catalpol

(Tasdemir et al., 2005). En la raíz de plantas silvestres de Scrophularia nodosa, el

harpagósido representa el doble (1.6%, base seca) de lo presente en hojas. De

manera inversa, la aucubina representa 1.5% (base seca) en hojas y sólo se

encuentra en 0.5% en raíz (Sesterhenn et al., 2007).

También se han observado diferencias en la acumulación en plantas in vivo e in vitro.

En plantas de A. majus desarrolladas en hidroponía, el iridoide antirrinósido estuvo

presente en todos los órganos incluyendo la raíz pero la mayor concentración fue en

tallos, yemas y flores. En contraste, el iridoide antirrínido se encontró solo en hojas.

Conforme las plantas crecen, el nivel de antirrinósido disminuyó y el del antirrínido

aumentó. Los resultados con 14C-antirrinósido sugieren que se trata de un compuesto

móvil a través del floema (Beninger et al., 2008). La concentración de harpagósido en

la parte aérea y la raíz de plantas micropropagadas de S. yoshimurae fue cinco

veces mayor que en la raíz de planta silvestre (Sagare et al., 2001).

En especies de otro género como Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se han

realizado estudios más amplios, que muestran que el contenido de iridoides está bajo

control genético (Adler et al., 1995), puede variar en función de la edad de la hoja y

de la planta (Bowers et al., 1993; Darrow y Bowers, 1999), así como de factores

abióticos como la luz o del nivel de nutrimentos ó pueden ser inducidos por daño de

herbívoros o patógenos (Wurst et al., 2004; Wurst et al., 2010).

16

2.3.2. Actividad biológica de los iridoides glucosilados

Desde el punto de vista ecológico, la aucubina y el catalpol, son de los más

estudiados. El catalpol sirve como atrayente alimenticio y estimulante de larvas de

mariposa a las que protege de pájaros insectívoros debido al sabor amargo que les

confiere, por esto los iridoides han sido motivo de estudios ya que en las larvas y

mariposas son usados como defensa contra depredadores (Stermitz et al., 1986;

Baden et al., 2011; Dobler et al., 2011).

Para interés humano, los iridoides presentan actividades biológicas diversas:

antimicrobiana, antitumoral (Wysokinska y Skrzypek, 1992; Gálvez et al., 2005), anti-

inflamatoria (Chen et al., 2009; Liu y Wang, 2011), antinociceptivo ó analgésico (Li et

al., 2010), neuroprotectora (Jeong et al., 2011), citotóxica (Nguyen et al., 2005) e

inmunoestimulante (Mathad et al., 1998).

Los iridoides glicosilados harpágido de 8-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 8-O-

Z-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-E-p-metoxicinamoilo, harpágido de 6`-O-Z-

p-metoxicinamoilo, E-harpagósido, Z-harpagósido y harpágido, aislados de raíces de

S. buergeriana, disminuyeron el daño neuronal que fue inducido por glutamato en un

cultivo de células corticales de ratas en un intervalo de concentración de 10 M y 100

M. Estos resultados indican un efecto protector ante la neurodegeneración inducida

por glutamato en un cultivo primario de células corticales de rata (Kim et al., 2002).

Ahmed et al. (2003) demostraron la actividad anti-diabética y anti-inflamatoria de los

IG: escropoliósido-D y el harpagósido-B, respectivamente. Éstos fueron aislados de

la parte aérea de Scrophularia deserti (Scrophulariacea). El escropoliósido-D

disminuyó en 31.47% los niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos,

después de una hora del tratamiento con respecto al nivel inicial. En cuanto a la

actividad anti inflamatoria, la evaluación se hizo en ratones, a los cuales se les indujo

17

el edema en la pata derecha. El harpagósido-B disminuyó la inflamación en 30% a

una dosis de 10 mg/kg después de 3 horas.

En específico, los IG identificados en C. tenuiflora presentan actividades biológicas

comprobadas, por ejemplo la aucubina posee propiedades como antioxidante y

control de la hiperglicemia (Jin et al., 2008), fotoprotección, prevención del

fotoenvejecimiento (Ho et al., 2005a; Ho et al., 2005b), citotóxica (Nguyen et al.,

2005), antitumoral (Gálvez et al., 2005; Hung et al., 2008) e inmunoestimulante

(Mathad et al., 1998). La aucubina y genipósido presentan actividad citotóxica en las

líneas celulares cancerígenas TK-10 (adenocarcinoma renal), MCF-7

(adenocarcinoma de seno) y UACC-62 (Melanoma) (Gálvez et al., 2005).

2.4. Feniletanoides glicosilados

Los FG son fenilpropanoides que también se conocen como glicósidos fenetilalcohol

(Inagaki et al., 1991). Son productos naturales solubles en agua que se caracterizan

por contener un dihidroxifenetil β-D-glucopiranósido, un ácido fenilpropenóico como

un éster (ácido cinámico, ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico) y residuos

de monosacáridos (apiosa, ramnosa, glucosa y xilosa, entre otros) (Kawada et al.,

2002; Sinaphet et al., 2006) (Figura 4). Estos compuestos se encuentran distribuidos

entre plantas del orden Lamiales, que incluye las familias Scrophulariaceae y

Orobanchaceae (Scogin, 1992).

Se han identificado alrededor de 150 feniletanoides glicosilados que son producidos

por las plantas en respuesta al ataque de insectos y se ha demostrado que hay

diferencias en el contenido de estos compuestos en la misma planta y entre

poblaciones de la misma especie debido a la variación genética. Por ejemplo, en

clones de la especie Plantago lanceolata (Plantaginaceae) se demostró que hay

variación genética en la planta y entre poblaciones en cuanto a la producción de

verbascósido (feniletanoide glicosilado) (Adler et al., 1995).

18

El verbascósido también se conoce como acteósido, kusaginina y orobanchina

mientras que su isómero, el isoverbascósido como isoacteósido (Scogin, 1992;

Saimaru y Orihara, 2009). Son glicósidos pertenecientes a los fenilpropanoides y

constituyen una familia de compuestos orgánicos sintetizados a partir de la

fenilalanina. El verbascósido contiene un disacárido constituido por una unidad de

glucosa unido a una ramnosa en el C3; la glucosa está esterificada con el ácido

cafeico en el C4 y se une a través de un enlace de tipo éter con la unidad de 3,4-

dihidroxifenil etanol en el C1 (Figura 4).

Verbascósido

R1=H

R2=ramnosa

Figura 4. Estructura general de los feniletanoides. R1=H y R2= Ramnosa, glucosa, apiosa ó

xilosa.

El verbascósido fue aislado por primera vez de Verbascum sinuatum y la estructura

completa fue elucidada en Orobanche rapum-genistae, encontrándose que coincidía

con la reportada para el acteósido (Andary et al., 1982). Algunas de las plantas en las

que está presente el verbascósido son la Hierba Luisa (Aloysia triphylla,

Verbenaceae), el gordolobo (V. densiflorum, Scrophulariaceae), el tepozán (Buddleja

scordioides y B. cordata, Buddlejaceae), el llantén (Plantago major, Plantaginaceae)

ó el cistanche (Cistanche phelipea, Orobanchaceae).

2.4.1. Biosíntesis de los feniletanoides glicosilados

La biosíntesis de FG no ha sido estudiada extensamente. Actualmente existen pocos

reportes sobre la ruta de biosíntesis. Aún hay muchas incógnitas por resolver en los

pasos individuales de las secuencias biogénicas y se ha detectado más de un

camino para llegar a un mismo producto fenólico y ello depende del medio biológico

que lo sintetiza.

19

Saimaru y Orihara (2009) reportaron la ruta de biosíntesis del acteósido y aislaron

cuatro feniletanoides glicosilados (acteósido, isoacteósido, -oxoacteósido, -hidroxi-

acteósido) y uno de los precursores (salidrósido) en células en suspensión de Olea

europea (Oleaceae). La unidad de hidroxitirosol del acteósido (verbascósido) es

sintetizado de la tirosina a través de la dopamina, mientras que la unidad de cafeoil

del acteósido es sintetizado de fenilalanina a través del cinamato. La dopamina es

incorporada al acteósido a través de la oxidación del correspondiente aldehído,

reducción al alcohol y por último una -glicosilación (Figura 5).

20

Figura 5. Propuesta de ruta de biosíntesis de los feniletanoides glicosilados en Olea europea

(Oleaceae) (a) y Cistanche deserticola (Orobanchaceae) (b) (Saimaru y Orihara, 2009; Hu et

al., 2011). Pasos desconocidos (- - -).

a

21

2.4.2. Actividades biológicas de los feniletanoides glicosilados

Los FG son compuestos naturales, absorbibles por las células intestinales (Cardinali

et al., 2010; Cardinali et al., 2011) y tienen un amplio espectro de actividades

biológicas (in vitro e in vivo) (Dembitsky, 2005). Por ejemplo, el verbascósido elimina

efectivamente los radicales libres e inhibe la colinesterasa (Shindo et al., 2008; Martin

et al., 2009; Kahraman et al., 2010; Georgiev et al., 2011a). Es un potente agente

anti-inflamatorio, ya que inhibe la acumulación de moléculas pro-inflamatorias tales

como el óxido nítrico y citocinas, junto con la expresión de las ciclo-oxigenasas

(COX-1 y COX-2) (Gyurkovska et al., 2011).

El verbascósido también presenta efectos vasodilatadores en la aorta torácica

aislada de rata (Yoshikawa et al., 2006); actividad antibacteriana frente a

Staphylococcus aureus, al afectar la síntesis de proteínas (Avila et al., 1999) y

presenta actividad anti-hiperalgésica (Isacchi et al., 2011). El isoverbascósido

presenta una fuerte actividad sobre los radicales libres (Kim et al., 2009; Martin et al.,

2009; Arthur et al., 2011), inhibe la proliferación celular maligna y revierte las

características fenotípicas de la línea celular de cáncer gástrico MGC803 (Chen et

al., 2002).

El verbascósido e isoverbascósido presentaron actividad in vitro contra el virus

respiratorio sincitial, que provoca infecciones en los pulmones y en las vías

respiratorias y es la principal causa de enfermedades respiratorias en los niños

pequeños (Kernan et al., 1998) y contra el virus del herpes simplex HSV-1 y HSV-2,

que es una enfermedad infecciosa inflamatoria de tipo vírico, que se caracteriza por

la aparición de lesiones cutáneas formadas por pequeñas vesículas agrupadas en

racimo y rodeadas de un halo rojo (Martins et al., 2009). También éstos FG

mostraron un efecto hepatoprotector en un modelo in vivo (Morikawa et al., 2010) y

son citotóxicos porque inhiben la proliferación de las células HL-60 de leucemia

promielocítica (Pettit et al., 1990) y el melanoma murino B16F10 (Nagao et al., 2001).

22

Este tipo de compuestos poli activos, tales como los FG están siendo intensamente

buscados para el tratamiento de procesos patológicos como la inflamación o las

enfermedades crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide y la enfermedad de

Alzheimer) (Georgiev et al., 2011a; Gyurkovska et al., 2011) siendo atractivos para la

industria de los alimentos y farmacéutica (Georgiev et al., 2010; Cardinali et al., 2011;

Stancheva et al., 2011).

2.5. Cultivos in vitro de raíces

La raíz constituye un órgano vegetativo importante de las plantas vasculares, situada

normalmente por debajo del suelo que desempeña varias funciones, como

proporcionar agua, nutrimentos, anclaje y soporte a la parte aérea de la planta. Sin

embargo, también se ha observado que cumple un papel muy importante en la

biosíntesis y acumulación de diversos metabolitos secundarios (Bais et al., 2001).

Los cultivos de tejidos vegetales in vitro, por su grado de especialización y

organización celular pueden sintetizar y/o acumular metabolitos secundarios de

interés farmacológico, representando una alternativa a la extracción directa de la

planta (Matkowski, 2008; Lubbe y Verpoorte, 2011).

En cultivo in vitro, el desarrollo del cultivo de raíces resulta tanto de la formación de

raíz laterales como de su elongación. Las raíces laterales se originan del primordio

de la raíz, luego hay crecimiento del primordium y emergencia. El crecimiento de la

punta es lineal y puede ser medido en unidades de longitud por tiempo. En el cultivo

de raíces el incremento en biomasa exponencial resulta de la formación de la raíz

lateral y un consecuente incremento exponencial en el número de puntas alargadas

(Dodds y Roberts, 1985).

Existen dos tipos principales de cultivos de raíces. El primero, son los cultivos de

raíces “no transformadas”, éstas son obtenidas de forma tradicional con o sin

regulador de crecimiento (auxina). Las auxinas que se usan son: ácido indolbutírico

23

(IBA) y ácido 3-indolacético (AIA). La respuesta a las auxinas es el efecto en la

elongación, la estimulación de la formación de las raíces laterales y la liberación del

etileno estimulada por la auxina (Fukaki et al., 2007; Ivanchenko et al., 2008). El

segundo tipo de cultivos de raíces son las “transformadas” ó “raíces peludas”, las

cuales resultan de la infección y la posterior transformación genética de tejidos

vegetales por el patógeno bacteriano del suelo: Agrobacterium rhizogenes. La

transformación ofrece células que proliferan hacia el crecimiento de raíz. En

cualquiera de los dos tipos de cultivo, las raíces se obtienen por la inoculación de las

puntas en medio líquido, éstas pueden obtenerse de las raíces de las plántulas

germinadas in vitro ó de raíces inducidas de otro tejido de la planta, callos ó

agregados celulares (Dodds y Roberts, 1985).

2.6. Cultivos de órganos in vitro como fuente de iridoides glucosilados y

feniletanoides glicosilados

Los cultivos de órganos y células vegetales son una fuente alternativa para la

producción de compuestos químicos, tales como FG (Georgiev et al., 2011b;

Stancheva et al., 2011) e IG (Sesterhenn et al., 2007; Grabkowska et al., 2010; Trejo-

Tapia et al., 2011). Éstas técnicas son útiles para la propagación y conservación de

germoplasma y por lo tanto representan una forma de proteger la biodiversidad de

las plantas (Lubbe y Verpoorte, 2011; Sarasan et al., 2011).

Los reportes de cultivo in vitro en las familias Scrophulariaceae u Orobanchaceae

son escasos (Cuadro 4). Por ejemplo, el cultivo de raíces peludas de Verbascum

xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) acumuló 12.82 g L-1 del FG verbascósido

(Georgiev et al., 2011c), ésta concentración fue mayor a la reportada para el cultivo

de raíces peludas de Paulownia tomentosa (1 g L-1) (Scrophulariaceae) (Wysokinska

y Rozga, 1998). En callos y suspensiones de Penstemon serrulatus (Plantaginaceae,

antes Scrophulariaceae) la producción de los FG penstémido y serrulatolósido fue

mayor (2-4% base seca) que en hojas (3 y 1.4% en base seca, respectivamente). Por

otro lado, en cultivos de raíces adventicias de Cormus capitata (Corniaceae) se

24

identificaron los IG ácido 6--dihidrocórmico y ácido 6--dihidrocórmico (Tanaka et

al., 2001). En otra familia como Pediacelaea, las raíces transformadas de

Harpagophytum procumbes producen IG (Grabkowska et al., 2010).

La producción de FG en general, ha sido de interés en las últimas 3 décadas. En

particular, el verbascósido por las actividades biológicas que se han demostrado. La

producción de verbascósido en cultivos tejidos y células en suspensión es una

alternativa a la explotación de las especies silvestres. En el cuadro 4, se muestra la

producción del verbascósido mediante técnicas biotecnológicas.

Cuadro 4. Cultivos de raíces peludas y células en suspensión que producen verbascósido.

.

Familia/especie Sistema Verbascósido Referencia

Scrophulariaceae

Verbascum xanthophoeniceum

Raíces peludas 12.82 g L-1

Georgiev et al. (2011c)

Pedialaceae

Harpagophytum procumbens

Células en suspensión


Raíces peludas

445.44 mg L-1

517. 3 mg L-1

56.84 mg L-1

Georgiev et al. (2011b)

Stancheva et al. (2011)

Grabkowska et al.

(2010)

Buddlejaceae

Buddleja cordata

Células en suspensión 116 mg g-1

Estrada-Zúñiga et al.

(2009)

Verbenaceae

Gmelina arborea

Raíces peludas 3.64 mg g-1

Dhakulkar et al. (2005)

Orobanchaceae

Cistanche deserticola


Callos

9 mg g-1

BS

10.7% (w/w)

1.65 g g-1

BS

Ouyang et al. (2003)

Lu y Mei (2003)

Acanthaceae

Aphelandra sp.


15.1 % Nezbedová et al. (1999)

Plantaginaceae

(antes Scrophulariaceae)

Penstemon serrulatus

Células en suspensión cis y trans

6.1 g L-1

Skrzypek y Wysokinska

(1999)

Scrophulariacea

Paulownia tomentosa

Raíces peludas 1 g L-1

Wysokinska y Rozga

(1998)

25

2.7. Antecedentes sobre el cultivo in vitro de raíces de C. tenuiflora

Además de ser una fuente alternativa de compuestos bioactivos en los cultivos in

vitro de C. tenuiflora, también puede ser útil para la investigación sobre la bioquímica

de esta especie. Como parte de la investigación sobre la conservación y manejo

sostenible de especies de plantas medicinales, en el CeProBi se han estado

realizando trabajos sobre varios aspectos de biotecnología en C. tenuiflora,

incluyendo el establecimiento de cultivos in vitro y análisis de su composición química

y actividad biológica (Salcedo-Morales et al., 2009; Martínez-Bonfil et al., 2011; Trejo-

Tapia et al., 2011).

Rosas (2007) estableció cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora a partir de raíces

adventicias formadas de manera indirecta (vía callo) en explantes de hojas de

plantas silvestres. La inducción de los callos rizogénicos ocurrió en medio de cultivo

Murashige & Skoog (1962) con 10 µM de la auxina ácido -naftalenacético (ANA). El

cultivo de raíces se estableció cuando las raíces de los callos rizogénicos se

transfirieron a medio MS líquido sin reguladores de crecimiento. Bajo las condiciones

de cultivo evaluadas, en el día 28 se alcanzó la concentración de biomasa máxima

(25.141 g L-1) con un td de 19 días. El análisis fitoquímico mostró que los cultivos de

raíces acumularon aucubina y otros iridoides no identificados aún (Rosas, 2007). Por

lo tanto, el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa potencial para

la producción principios activos para uso medicinal.

26

3. JUSTIFICACIÓN

Castilleja tenuiflora Benth. (Orobanchaceae antes Scrophulariaceae) es una especie

de importancia en la medicina tradicional Mexicana, se ha usado para tratar síntomas

asociados con el cáncer, enfermedades respiratorias y trastornos gastrointestinales;

en la actualidad, la Sociedad Farmacéutica de México la indica como diurético y

sialagogo. Se desconoce cuáles son los compuestos mayoritarios en las plantas

silvestres de ésta especie, por lo que es importante desarrollar una metodología para

aislarlos. Por otro lado, la limitada disponibilidad de fuentes naturales, hace que los

métodos biotecnológicos utilizados para la producción de metabolitos secundarios de

plantas, se hayan establecido firmemente por el alto valor económico. Por lo tanto, el

cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora es una alternativa sustentable para la

producción de iridoides y feniletanoides glicosilados, los cuales son compuestos con

un potencial uso como principios activos para uso farmacéutico.

27

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas silvestres de

Castilleja tenuiflora Benth. y evaluar su acumulación en cultivos de raíces in vitro.

4.2. Objetivos específicos

Aislar e identificar estructuralmente los compuestos mayoritarios en plantas

silvestres de C. tenuiflora.

Evaluar el efecto de auxinas para la producción de raíces in vitro de C.

tenuiflora y caracterizar su comportamiento cinético.

Determinar la concentración de los compuestos mayoritarios en plantas

silvestres y en las raíces in vitro de C. tenuiflora.

28

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Material vegetal silvestre

La colecta de plantas completas de C. tenuiflora en estado de floración, se realizó en

Noviembre de 2008. Se tomaron 49 plantas de una población silvestre en

Amecameca, Estado de México, México (coordenadas: N 19º 04’ 18.1”, W 98º 42’

01.9”; altitud: 3500 m.s.n.m.). Se tomó un ejemplar de la población para identificar la

especie y depositarlo en el herbario (registro HUMO13234) de la Universidad

Autónoma del Estado de Morelos (UAEM), México.

Las plantas se separaron en inflorescencias, raíces y tallos con hojas;

inmediatamente se registró el peso de la biomasa en fresco. El proceso de secado

fue a temperatura ambiente bajo sombra por 2 semanas, una vez secas las hojas, se

separaron de los tallos, para así obtener el peso de la biomasa de cada órgano

(Cuadro 5) y después se trituró en un molino granulador de cuchillas con un tamiz de

4 mm (PulvexMR Plastic, modelo 95). Las condiciones de almacenamiento fueron a

temperatura ambiente y en oscuridad.

Cuadro 5. Peso fresco y peso seco de cada órgano de la planta silvestre de C. tenuiflora.

Órgano Antes de la molienda Después de la molienda

Peso fresco (g) Peso seco (g) Peso seco (g)

Inflorescencia 160.30 31.28 30

Hojas - - 597

Tallos - - 1319

Raíces 889.24 358 350.09

29

5.2. Evaluación de protocolos de extracción

Se evaluaron tres métodos de extracción, en todos los casos se utilizaron 2 g del

material vegetal seco de C. tenuiflora. En el primero, se maceraron raíces e

inflorescencia (por separado) con 250 mL de metanol por 24 h a temperatura

ambiente. En el segundo, se preparó una infusión, la cual se realizó de la siguiente

manera: se calentaron 250 mL de agua a 60ºC, posteriormente se agregó el material

seco, ya sea raíces ó inflorescencias y se dejó reposar por una hora. En el tercero,

se realizó una maceración del material vegetal seco (raíces, hojas, tallos e

inflorescencias) con 40 mL de metanol por 30 min a 60oC en baño María. Terminados

los tiempos de extracción, se filtró para eliminar residuos sólidos. En el caso de los

extractos metanólicos, el disolvente se eliminó mediante un proceso de destilación a

presión reducida en un rota-evaporador (Büchi®-490; Büchi, Suiza) a 50ºC. Con el

propósito de conocer el perfil de los compuestos presentes en la infusión y los

extractos, se realizó una cromatografía en capa fina y se compararon con aucubina

(iridoide).

El rendimiento de los extractos metanólicos se obtuvo por la diferencia de pesos

entre matraz vacío y matraz con extracto seco; 10 mL del extracto acuoso, se

congelaron a -70 ºC y se liofilizaron (Liofilizadora LABCONCO, freeze dryer 18). Se

utilizó el proceso de diferencia de peso entre el matraz con el producto liofilizado y el

matraz sin extracto y se calculó el rendimiento. Todos los extractos se almacenaron a

-18ºC en oscuridad hasta su análisis.

5.3. Cromatografía de capa fina (CCF)

La CCF fue el método de elección para llevar a cabo el análisis de rutina de los

extractos, fracciones, compuestos puros y para optimizar la fase móvil de la

cromatografía en columna abierta.

30

Se utilizaron placas de cromatofolios de aluminio recubiertas de silica gel 60 F254

(Fase normal, 1.05554.001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas

isocráticas de cloroformo (CHCl3)/Metanol (MeOH) (95:5, 90:10, 85:15 ó 70:30 v/v,

según la muestra a tratar) según la polaridad de las muestras analizadas. También

se utilizaron cromatofolios de aluminio recubiertos de silica gel 60 RP-18 F254S (Fase

reversa, 1.05559.0001, Merck®) y como fase móvil una serie de mezclas isocráticas

de agua/acetonitrilo. Las placas se analizaron con una lámpara de luz ultravioleta

(UVGL-58, UVP, Cambridge, UK) a 254 y 365 nm antes y después del tratamiento

con reveladores químicos.

Para la detección de iridoides y feniletanoides se utilizó como agente cromogénico la

solución denominada HS. La cual contiene 0.5 mg de 4-hidroxibenzaldehido

(Merck®), 90 mL de etanol y 10 mL de ácido sulfúrico. La coloración azul

Copenhague y café indicó la presencia de iridoides y, el magenta y amarillo ocre

indicó feniletanoides. Con esta mezcla también se detectan componentes de aceites

esenciales y saponinas al obtener colores lavanda, rosa y púrpura (Wagner et al.,

1996). En cuanto a flavonoides, se utilizó como agente cromogénico la solución

denominada NP/PEG, que contenía 5 mL de difenilboriloxietilamina, 200 mg de

polietilenglicol y 35 mL de etanol (Wagner et al., 1996). Después de aplicar el

revelador, las placas se colocaron en una parrilla a 90ºC durante 5 s y se observaron

en una cámara de luz ultravioleta (UV) a 365 nm. Finalmente, para cada compuesto

se determinaron los factores de retención (Rf) mediante la ecuación 1.

Rf = (1)

La aucubina (Sigma-Aldrich, ≥99.0% HPLC) y la apigenina (Sigma-Aldrich, ≥95.0%

HPLC) se utilizaron como estándares de referencia.

Distancia recorrida por el soluto____

Distancia recorrida por el disolvente

31

5.4. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de tallo de C. tenuiflora.

Para realizar el aislamiento e identificación de los compuestos mayoritarios, se

maceración en metanol de 1300 g de tallos secos y molidos de C. tenuiflora.

Después de concentrar el extracto metanólico por destilación a presión reducida, se

obtuvieron 21.9 g de un extracto color marrón. Se tomaron 17 g de éste extracto al

que se adicionaron 200 mL de acetato de etilo y se puso en baño María a 50ºC

durante una hora. La parte soluble en el acetato de etilo se filtró y concentró por

destilación a presión reducida (F1). La parte insoluble (precipitado color marrón) fue

nuevamente re-suspendida en una solución de mayor polaridad (acetato de

etilo/metanol 7:3). La suspensión se mezcló en un baño ultrasónico (Bransonic®

1510, Branson), se filtró y concentró a sequedad mediante rota-evaporador y

posteriormente se liofilizó. Con este proceso se obtuvieron 13 g (F2).

En la figura 6 se muestra el resumen del aislamiento de aucubina y bartsiosido, a

partir de la fracción de acetato de etilo del tallo (F2), ésta fracción se purificó

mediante un proceso de cromatografía en columna abierta (40 cm de altura x 4 cm

de diámetro interno). La columna fue empacada con 90 g de silica gel 60 (Merck) y la

fase móvil consistió en una mezcla de cloroformo, acetona y metanol en el siguiente

orden y proporciones: Cloroformo 100%, cloroformo/acetona 95:15, 90:10, 85:15,

cloroformo/acetona/metanol 85:15:5 y metanol 100% (cuadro 6). De esta manera, la

fracción F2 se separó en 92 fracciones y con los resultados de los factores de

retención obtenidos en la CCF se agruparon en 30 fracciones que contenían

compuestos químicos de polaridad semejante.

Se analizó la fracción T9, ya que la CCF indicó la presencia de un compuesto

mayoritario. De la misma manera se analizaron las fracciones T19 y T22 y se realizó

un proceso de purificación descrito en el siguiente inciso.

32

Figura 6. Obtención de la fracción de acetato de etilo de tallo (F2) y aislamiento de

flavonoide (T9) e iridoides glucosilados (T19b y T22a).

33

Cuadro 6. Fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de tallos

silvestres de C. tenuiflora.

SISTEMA DE ELUCIÓN FRACCIONES

COLECTADAS

FRACCIONES

REUNIDAS

CLAVE

Cloroformo 100% 1-21 1-4 T1

5-7 T2

8-12 T3

13-17 T4

18-19 T5

Cloroformo-Acetona 95:15 22-31 20-23 T6

24-26 T7

27-30 T8

Cloroformo-Acetona 90:10 32-38 31-33 T9

34-35 T10

36-37 T11

Cloroformo-Acetona 85-15 39-57 38-39 T12

40-42 T13

43-49 T14

50-53 T15

54-55 T16

56-58 T17

Cloroformo- Acetona- Metanol 85:15:5 58-89 59-60 T18

61-62 T19

63-65 T20

66-67 T21

68-69 T22

70 T23

71 T24

72-74 T25

75 T26

76-77 T27

78 T28

79-89 T29

Metanol 100% 90-92 90-92 T30

5.4.1. Purificación de la fracciones T19 y T22

La fracción T19 (505 mg) se suspendió en cloroformo, se concentró y se obtuvo una

fracción sólida a la cual se le agregó cloroformo/metanol (80:20). Este procedimiento

se realizó dos veces con la fracción sólida, como se indica en la figura 6. En este

proceso, la sub-fracción soluble T19b (26 mg) se concentró y posteriormente se

separó el compuesto por cromatografía preparativa (Cromatoplacas HPTLC, 5 x 5

cm, Silica gel 60 F254, precortado de 10 x 10 cm, Merck, Alemania).

34

La fracción T22 (649 mg) se suspendió en cloroformo y se obtuvo una fracción sólida

que se re-suspendió con cloroformo/metanol (80:20; 70:30 y metanol 100%) y al final

del proceso se obtuvo la fracción T22a (265 mg), como se muestra en la figura 6. Los

compuestos aislados en estas fracciones se identificaron por RMN de 1H (400 MHz).

5.5. Análisis cromatográfico del extracto metanólico de raíces de C.

tenuiflora

5.5.1. Obtención de la fracción acetónica de raíces

Se realizó una extracción metanólica de raíz silvestre (160 g) a 60ºC en baño María

por 30 min, se filtró y el disolvente fue eliminado mediante un proceso de destilación

a presión reducida en un rota-evaporador a 50ºC. El peso del extracto fue de 7.2 g, al

que se le adicionó cloroformo (600 mL) para obtener la fracción menos polar (F1, 1 g,

13.88%); se filtró y al precipitado (F2, 6.2 g, 86.12%) se le adicionó 600 mL de

acetona. Esta suspensión fue depositada durante un minuto en un baño ultrasónico a

temperatura ambiente para incrementar la solubilidad. Después de haber filtrado la

fracción soluble en acetona, ésta fue concentrada por destilación a presión reducida

obteniendo 1.6 g (F3, 22.2%). El precipitado fue secado a alto vacío (F4, 4.6 g,

63.88%) (Figura 7).

5.5.2. Fraccionamiento de la fracción acetónica (F3) de raíces

Se realizó un fraccionamiento de F3 (1.6 g) mediante una cromatografía en columna

abierta (40 cm de alto y 4 cm de diámetro) previamente empacada con silica gel 60

(40 g). Se eluyó con disolventes de polaridad creciente (Cloroformo 100%,

cloroformo/acetona 97:33, 90:10, 85:15, cloroformo/metanol 95:50, 80:20, 70:30 y

metanol 100%), se recolectaron 50 mL de cada fracción. En la cuadro 7, se muestra

la cantidad de fracciones recolectadas en cada sistema de elución y la agrupación de

éstas se realizó en base a la similitud de los compuestos observados en la CCF con

35

su respectiva clave. Se identificó por RMN de 1H y 13C del compuesto aislado de la

fracción R19’. Se obtuvo un precipitado blanco (soluble en cloroformo).

En la figura 7, se resume la purificación que se explica en los siguientes incisos.

Figura 7. Resumen del proceso de purificación del extracto metanólico de raíces de

C. tenuiflora.

36

Cuadro 7. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción acetónica del extracto

metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.


COLECTADAS

FRACCIONES REUNIDAS CLAVE

Cloroformo 100% 1-23 1 R1

2 R2

3-4 R3

5-7 R4

8-9 R5

10 R6

1 R7

12 R8

13-15 R9

Cloroformo-Acetona 97:33 24-35 16-22 R10



Cloroformo- Metanol 95:5 74-86 72-81 R13

Cloroformo-Metanol 8:2 87-117 82-90 R14

91 R15

R15’

92-93 R16

94 R17

Cloroformo-Metanol 7:3 118-121 95-118 R18

119 R19

R19’

120-122 R20

Metanol 100% 122-132 123-132 R21

5.5.2.1. Purificación de las fracciones C1 obtenidas de la fracción acetónica del

extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora

Las fracciones R4, R7 y R10 (263 mg) se reunieron y se denominaron C1, fueron

purificadas en una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando un sistema de

elución: agua (5% de ácido trifluoracético, TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas

fueron 52, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas

en la cromatografía en capa fina, obteniendo así 7 fracciones, como se indica en el

cuadro 8.

37

Cuadro 8. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C1 obtenidas de la fracción

acetónica del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.


COLECTADAS


Agua (TFA)-Acetonitrilo 80:20 1-27 1 C1R1

Agua (TFA)-Acetonitrilo 7:3 28-44 2-3 C1R2

Metanol 100% 45-52 4-27 C1R3

28-29 C1R4

30-33 C1R5

34-46 C1R6

46-52 C1R7

5.5.2.2. Purificación de las fracciones C2 de la fracción acetónica del extracto


La fracción R14 (419 mg) denominada C2, se suspendió en metanol formando una

fase soluble y otra sólida (que se disolvió con cloroformo-metanol) con la cual se hizo

el fraccionamiento mediante una columna abierta de fase reversa (RP18), utilizando

un sistema de elución: agua (TFA)-acetonitrilo. Las fracciones obtenidas fueron 41,

las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas en la

cromatografía en capa fina, obteniendo así 15 fracciones, como se indica en el

cuadro 9. Las fracciones 5 a 7 son de color amarillo, las demás no presentaron color

en el momento de recolectar las fracciones.

38

Cuadro 9. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C2 de la fracción acetónica

del extracto metanólico de raíces silvestre de C. tenuiflora.


COLECTADAS




Metanol 100% 41 7-9 C2R3

10-12 C2R4

13 C2R5

14-15 C2R6

16 C2R7

17-19 C2R8

20-21 C2R9

22 C2R10

23-25 C2R11

26 C2R12

27-28 C2R13

29-40 C2R14

41 C2R15

5.5.2.3. Purificación de la fracción C3 de la fracción acetónica del extracto


La fracción R16 (0.26 g) denominada C3, se disolvió en metanol. Se realizó una

CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 8:2. Posteriormente

fue gradualmente incrementándose la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones

obtenidas fueron 51, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas

reveladas en CCF, obteniendo así 12 fracciones (Cuadro 10). La fracción C3R3 (95

mg) se analizó por cromatografía líquida de alta resolución y se identificaron por

comparación de espectros de RMN de muestras de referencia y/o con datos de RMN

consultado en la literatura. Los espectros de RMN 1H y 13C fueron obtenidos en un

equipo Varian Innova de 400 MHz, se utilizó cloroformo deuterado (CDCl3) y metanol

deuterado (DMSO) como disolventes y tetrametilsilano como referencia interna. Esta

técnica espectroscópica nos permitió determinar el contenido total de hidrógenos y

carbonos que constituyen a las moléculas que se elucidaron. Los valores de

desplazamiento químico (δ) expresados en partes por millón (ppm), así como las

39

intensidades de las señales permitieron descifrar el tipo de grupos funcionales a los

que se encuentra unido cada Carbono o Hidrógeno. Para esto se analizaron los

experimentos: COSY que es la correlación de núcleos de la misma especie protón-

protón, NOESY es la correlación de núcleos a través del espacio, HMQC es la

correlación de núcleos heteronucleares por su desplazamiento químico a un enlace

de distancia, HSQC es la correlación heteronuclear a un enlace de distancia y HMBC

es la correlación heteronuclear a dos y tres enlaces de distancia.

Cuadro 10. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C3 de la fracción



COLECTADAS




Metanol 100% 45-51 8 C3R3

9 C3R4

10 C3R5

11 C3R6

12-15 C3R7

16-23 C3R8

24 C3R9

25 C3R10

26 C3R11

27-51 C3R12

5.5.2.4. Purificación de la fracción C4 de la fracción acetónica del extracto


La fracción R18 (0.23 g) denominada C4, se disolvió en metanol. Se realizó una

CCF-FR, en un sistema de elución con agua (TFA)-acetonitrilo 80:20 y

posteriormente se incrementó la cantidad de acetonitrilo. Las fracciones obtenidas

fueron 27, las cuales se reunieron de acuerdo a la similitud de las bandas reveladas

en CCF, obteniendo así 8 fracciones (Cuadro 11). Las fracciones C4R2 (21 mg) y

C4R4 (12.8 mg) se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución y RMN 1H.

40

Cuadro 11. Fraccionamiento cromatográfico de la fracción C4 de la fracción



COLECTADAS




Metanol 100% 26-27 8-9 C4R3

10-12 C4R4

13-14 C4R5

15 C4R6

16-17 C4R7

19-27 C4R8

5.6. Cuantificación de aucubina

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) se utilizó para analizar los

extractos y las fracciones, guiar la separación de compuestos en los procesos de

aislamiento, optimizar las condiciones para los procesos de cromatografía de

mediana presión y verificar la pureza de los productos aislados.

La cuantificación de aucubina en los extractos metanólicos de cada órgano de

plantas silvestres (inflorescencias, hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos

de raíces adventicias in vitro, se llevó acabo mediante la ecuación y=7575.9x +

248079 (R2=99958), la cual se obtuvo de una curva de regresión linear de áreas

obtenidas de las concentraciones (900, 450, 225 y 112 μg mL-1) del estándar

analítico, en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep.

4000), provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de

diodos. Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck)

empacada con material de fase reversa. La elución se llevó a cabo utilizando agua-

acetonitrilo 97:3 (A) y acetonitrilo (D) (Cuadro 12), aplicando un flujo constante de 1

mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 32 min con

una longitud de onda de 205 nm.

41

Cuadro 12. Sistema de elución utilizado en la separación de iridoides glucosilados

por HPLC.

Tiempo (min) A (%) D (%)

0 100 0

8 100 0

9 80 20

10 80 20

11 70 30

15 70 30

16 40 60

23 20 80

25 20 80

26 0 100

28 0 100

29 100 0

32 100 0

5.7. Cuantificación de verbascósido e isoverbascósido

La cuantificación de los feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido

en extractos metanólicos de cada órgano de plantas silvestres (inflorescencias,

hojas, tallos y raíces) de C. tenuilfora y los cultivos de raíces adventicias in vitro, se

llevó acabo mediante la ecuación y=22144x - 1614443 (R2=99965), la cual se obtuvo

de una curva de regresión linear de áreas obtenidas de las concentraciones (500,

250, 125 y 62.5 μg mL-1) del verbascósido aislado en el presente trabajo (≥94.0%

HPLC), en un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000),

provisto con un detector de índice de refracción y un detector de arreglo de diodos.

Se utilizó una columna Lichrosphere RP-18 (250 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada

con material de fase reversa. La elución se llevo a cabo utilizando agua-acetonitrilo

97:3 (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 13), aplicando un flujo constante de 1 mL min-1. El

volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de corrida de 17 min con una longitud

de onda de 330 nm.

42

Cuadro 13. Sistema de elución utilizado en la separación de feniletanoides

glicosilados por HPLC.

Tiempo (min) A (%) B (%)

0 100 0

2 77 23

3 77 23

11 70 30

13 70 30

14 0 100

15 0 100

16 100 0

17 100 0

5.8. Cuantificación de apigenina

La cuantificación de apigenina (flavona) en extractos metanólicos de cada órgano de

plantas silvestres (inflorescencia, Hoja, tallos y raíces) de C. tenuilfora, se realizó con

la ecuación y=70832x + 785112 (R2=99941), la cual se obtuvo de una curva de

regresión linear de las áreas obtenidas de las diferentes concentraciones (400, 200,

100, 50 y 25 μg mL-1) del estándar de apigenina, en un cromatógrafo de líquidos de

alta resolución (Waters, Delta Prep. 4000), provisto con un detector de índice de

refracción y un detector de arreglo de diodos. Se utilizó una columna LiChroCART®

RP-18e (125 x 4 mm, 5 μm, Merck) empacada con material de fase reversa. La

elución se llevo a cabo utilizando agua (A) y acetonitrilo (B) (Cuadro 14), aplicando

un flujo constante de 1 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 μL y el tiempo de

corrida de 28 min con una longitud de onda de 365 nm.

43

Cuadro 14. Sistema de elución utilizado en la separación de apigenina por HPLC.

Tiempo (min) A (%) D (%)

0 100 0

2 100 0

3 90 10

5 90 10

8 80 20

9 70 30

11 70 30

12 60 40

16 60 40

17 30 70

19 30 70

20 10 90

21 10 90

22 0 100

24 0 100

26 100 0

28 100 0

5.9. Inducción de raíces adventicias y cultivo in vitro de C. tenuiflora

Se utilizaron brotes in vitro de C. tenuiflora de 14 días de edad como fuente de

explantes (Salcedo-Morales et al., 2009). Los cultivos in vitro de raíces se iniciaron a

partir de los explantes de hojas en medio de cultivo B5 (Gamborg et al., 1968)

semisólido suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 10 M de ácido α-naftalenacético

(ANA) y 8 g L-1 de agar (Trejo-Tapia et al., 2011). El pH del medio se ajustó a 5.8

antes de la esterilización. Después de la inducción, las raíces fueron transferidas a

matraces Erlenmeyer de 50 mL con 10 mL de medio líquido B5 libre de auxina y las

raíces se subcultivaron cada 8 días durante 6 meses. Los cultivos se incubaron en la

oscuridad en un agitador rotatorio (120 rpm) a 25 ± 2°C.

Para los experimentos, se transfirieron segmentos de punta de raíces (1 cm de

longitud) a matraces Erlenmeyer de 50 ml con 10 mL de medio líquido B5

44

suplementado con 10 M de ácido indol-3-acético (AIA), 10 M ANA, 10 M de indol-

3-butírico (IBA) ó sin auxina (control). Cada semana se recolectaron raíces a partir de

tres matraces Erlenmeyer individuales, hasta los 37 días de cultivo. Para determinar

la biomasa, las raíces obtenidas en cada matraz Erlenmeyer, se liofilizaron y se

pesaron para obtener la biomasa seca (BS). Para el análisis químico, las raíces

liofilizadas se molieron hasta un polvo fino y se procesaron como se describe en la

sección 5.2. Se realizaron observaciones microscópicas en un microscopio

estereoscópico (modelo SMZ1500, Nikon Instruments Inc., Japón) con zoom de 0.75.

Las imágenes digitales se capturaron con una cámara de 3 CCD RealView (Dage-

MTI, Michigan, EE.UU.).

5.10. Determinación de parámetros cinéticos

A partir de los resultados de la cinética de crecimiento, se calcularon la velocidad

específica de crecimiento (μ, días-1), el tiempo de duplicación (td, días) y el índice de

crecimiento (IC) de acuerdo con las siguientes ecuaciones:

μ = ln (XF/X0) / t (2)

td = ln 2 / μ (3)

Donde X0 y XF son las cantidades de biomasa de raíces al inicio y al final del intervalo

de período del cultivo (g L-1), respectivamente; t es el intervalo de tiempo de cultivo

(días), td es el tiempo de duplicación (días) y μ es la tasa de crecimiento específico

(día -1).

El índice de crecimiento se calculó de la siguiente manera:

IG = (XF-X0) / X0 (4)

donde XF y X0 son la biomasa de raíces final e inicial, respectivamente.

45

5.11. Análisis estadístico

Los datos se analizaron por ANOVA de una sola vía, y la prueba de Holm-Sidak se

utilizó para las comparaciones múltiples entre las medias. El nivel de significancia

para todas las pruebas estadísticas fue de 5%. Los análisis estadísticos se realizaron

con SigmaPlot para Windows versión 11.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA,

EE.UU.).

46

6. RESULTADOS

6.1. Evaluación de protocolos de extracción

La figura 8 muestra la CCF de los extractos metanólicos de inflorescencias y raíces

en comparación con la aucubina (estándar analítico) revelada con el HS. Las bandas

de color café indicaron la presencia de aucubina, demostrandose que este tipo de

compuesto puede ser extraído con los tres procesos de extracción evaluados. En la

infusión se obtuvieron rendimientos de 15.75% en raíces y 47.7% en inflorescencias.

Con metanol por 24 h los rendimientos fueron 11.17% para raíces y 33.85% para

inflorescencias.

A B C D E

Figura 8. Cromatografia en capa fina de extractos metanólicos (por 24 h) e infusiones de C.

tenuiflora. A. Infusión de raíces; B. Extracto metanólico de raíces; C. Aucubina; D. Infusión

de inflorescencias; E. Extracto metanólico de inflorescencias. Revelador HS. CCF fase

normal. Fase móvil: CHCl3/MeOH/H2O 7:2.5:0.5.

Debido a que la maceración con metanol nos permitió obtener el mismo perfil de

iridoides que una infusión pero sin la extracción exhaustiva de productos del

metabolismo primario, se decidió utilizar metanol para el análisis químico en todos los

órganos colectados de la planta, así como la extracción en baño María, porque ésta

se realiza en corto tiempo (30 min).

47

En la figura 9, se muestran CCF de los extractos metanólicos de inflorescencia,

hojas, tallos y raíces obtenidos en baño María a 60ºC por 30 min. Al comparar los

perfiles de los compuestos entre órganos, podemos observar una banda que produce

fluorescencia de color azul en todos los extractos cuando la placa fue expuesta a luz

UV (365 nm) (Figura 9-A). Éstos compuestos se aislaron e identificaron por RMN 1H

y 13C, por lo cual esta fluorescencia azul indicó la presencia de feniletanoides

glicosilados. Al revelar la placa con HS se observó una banda amarillo ocre en todos

los organos de la planta (Rf 0.3) la cual coincide con el Rf de la aucubina (Auc)

(Figura 9-B); ésta banda se observó mas intensa en las inflorescencias y raíces. Se

obtuvieron bandas de color azul Copenhague en todos los extractos, lo cual indicó la

presencia de otros iridoides menos polares que la aucubina (Rf 0.6). En la figura 9-C,

se observa la CCF revelada con el reactivo difenilboriloxietilamina en polietilenglicol

(NP/PEG); las bandas de color amarillo indican la presencia de flavonoides,

principalmente en inflorescencia, hojas y raíces. En base a esta información, se

procedió a fraccionar el extracto metanólico de tallos porque está constituido

principalmente por iridoides y el extracto metanólico de raíces para aislar los

feniletanoides glicosilados.

Figura 9. Cromatografía en capa fina de extractos metanólicos de plantas silvestres de C.

tenuiflora. Maceración con metanol a 60oC en baño María por 30 min. A. CCF en luz UV 365

nm. B. CCF revelada con HS. C. CCF revelada con NP/PEG. I: Inflorescencia, H: Hojas, Auc:

Aucubina, T: Tallos, R: Raíces. CCF de fase normal. Fase móvil: CHCl3 – MeOH–H2O

7:2.5:0.5.

A

B

Rf 0.6

C

I H Auc T R I H Auc T R I H Auc T R

48

6.2. Identificación de apigenina en tallos silvestres de C. tenuiflora

En la figura 10, se comprueba la presencia de apigenina aislada en la fracción T9 (16

mg). La cual se obtuvo a partir de la fracción de acetato de etilo de tallos (Figura 7).

Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (Anexo 7) y se comparó con el

estándar analítico de apigenina, la cual tuvo un tiempo de retención de 15.23 min (λ=

225, 267.5 y 338,6 nm).

A B C

Figura 10. Cromatografía en capa fina de compuestos aislados del tallo (Luz UV 365

nm). A. Fracción FT9; B. Mezcla apigenina/fracción FT9. C. Apigenina. CCF de fase

normal. Revelada con NP/PEG. Fase móvil: CHCl3/MeOH 8:2.

6.3. Identificación de aucubina y bartsiósido en tallos silvestres de C.

tenuiflora

Se obtuvieron las fracciones T19b y T22a a partir de la purificación de la fracción de

acetato de etilo de tallos de C. tenuiflora. En los cuadros 15 y 16 se muestran los

desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento obtenidas mediante el

análisis de los datos espectroscópicos de RMN de 1H (400 MHz) de las fracciones

T19b y T22a, respectivamente. Estos resultados se compararon con datos

previamente reportados para iridoides (Boros y Stermitz, 1990) lo que permitió

confirmar que corresponden al bartsiósido y aucubina, respectivamente. La diferencia

principal entre éstos iridoides glucosilados corresponde al hidroxilo ubicado en la

posición 6 (Figura 11).

49

Figura 11. Estructura química de aucubina y bartsiósido aislados de tallos silvestres

de C. tenuiflora.

Cuadro 15. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de aucubinaa

(CD3OD).

aDatos en

1H (400 MHz)

b Ver Fig. 11 para la numeración

Entre paréntesis está la multiplicidad y constante de acoplamiento (J, valores en Hz)

Posición del

carbonob Aucubina

1H (J) teórico

(ACD/HNMR)

1H (J) experimental

1 5.24

2

3 6.16 6.30 (dd 1.6, 6.4)

4 5.04 5.08 (dd 3.6, 6.4)

5 2.85 2.88 (6.8)

6 4.50 4.43 (dd 2, 3.2)

7 6.04 5.7 ( d 2)

8

9 3.11

10 4.25 4.32 (d 15.6)

Glucosa 1 4.70 4.67 (d 7.6)

2 3.44 3.42 (8.8)

3 3.53 3.61 (2)

4 3.03

5 3.60

6 3.69

3.85

3.66 (d 5.2)

3.87 (d 2.4)

50

Cuadro 16. Valores de desplazamiento químico del protón (δ, ppm) de bartsiósidoa

(CD3OD).

Posición del

carbonob Bartsiósido

1H (J) teórico

(ACD/HNMR)

1H (J) experimental

1 5.24 5.14 (d 6.4)

2

3 6.29 6.26 (dd 2,1.6)

4 4.93 4.68 (d 5.2)

5 3.75 3.69 (d 7.2)

6 2.1 2.08 (dd 1.6)

7 5.7 5.7 (d 1.2)

8

9 2.55 2.62 (dd 16.4,16.4)

10 4.23

4.28

4.16 (d 14.4)

4.27 (d 14)

Glucosa 1 4.7 4.66 (d 4.8)

2 3.44 3.43 (3.2)

3 3.52 3.48

4 3.09 2.9

5 3.6 3.6

6 3.7

3.85

3.8

3.8 a Datos en

1H (400 MHz)

b Ver Fig. 11 para la numeración


6.4. Identificación de feniletanoides glicosilados en raíces silvestres de C.

tenuiflora

A partir de la purificación de la fracción acetónica de las raíces, se obtuvo la fracción

C3R3. En el cuadro 15 se muestran los desplazamientos químicos y las constantes

de acoplamiento de la fracción C3R3 obtenidas por RMN de 1H (500 and 300 MHz,

respectivamente) y 13C (125 and 75 MHz, respectivamente), además se analizaron

los espectros de 1H–1H COSY (Figura 13-17), 1H–1H NOESY, 1H–13C HSQC (Anexo

4 y 5) y 1H–13C HMBC (Figura 19), con los cuales se asignaron los protones y

carbonos de la molécula estudiada. Estos resultados también fueron comparados con

51

datos previamente descritos (Andary et al., 1982; Li et al., 2005) y se confirmó la

presencia del verbascósido aislado de las raíces silvestres de C. tenuiflora.

Del primer fraccionamiento de la fracción acetónica de las raíces se aisló de la

fracción R19’ un precipitado blanco (soluble en cloroformo), el cual se analizó por

RMN de 1H y 13C y se identificó como isoverbascósido. La diferencia principal entre el

verbascósido y el isoverbascósido es la ubicación del ácido cafeico en la molécula de

glucosa (resaltado en negritas en el cuadro 17).

Figura 12. Estructuras químicas de los feniletanoides glicosilados: verbascósido e

isoverbascósido aislados de raíces silvestres de C. tenuiflora.

52

Cuadro 17. Valores de desplazamiento químico del protón y carbón (δ, ppm) de

verbascósidoa e isoverbascósidob (CD3OD).

Posición

del carbonoc

Verbascósido Isoverbascósido

1H (J) 13C 1H (J) 13C

Aglicona 1 131.5 131.4

2 6.69 (d,2) 117.1 6.68 (d,2.1) 117.1

3 146.1 146.1

4 144.6 144.7

5 6.66 (d,8) 116.3 6.66 (d,7.5) 116.3

6 6.55 (dd,2,8) 121.2 6.55 (dd,2.4,7.8) 121.2

7 2.76 (ddd,3.5,7,14), 36.5 2.78 (m), 36.6

2.80 (ddd,3,7,14) 2.78 (m)

8 3.71 (ddd,6.5,7,8), 72.2 3.68 (m), 72.2

4.04 (ddd,3,6.5,8) 3.72 (m)

Glucosa 1 4.36 (d,8) 104.2 4.36 (d,8.1) 104.3

2 3.38 (dd,9.5,7.5) 76.2 3.35 (m) 76.3

3 3.81 (t,9.3) 81.6 3.81 (t,10.5,3) 78.1

4 4.91 (t,9.5) 70.6 3.4-3.5 (m) 70.4

5 3.52 (m) 76.0 3.60 (m) 76.0

6 3.54 (m), 62.3 4.46 (m), 65.1

3.60 (d,10) 4.28 (m)

Ácido cafeico 1’ 127.6 127.6

2’ 7.04 (d,2) 115.2 7.04 (d,2.1) 115.2

3’ 146.8 146.8

4’ 149.7 149.8

5’ 6.77 (d,8) 116.5 6.76 (d,8.1) 116.5

6’ 6.95 (dd,2,8) 123.1 6.96 (dd,2.7,8.1) 123.2

7’ 7.58 (d,16) 148.0 7.59 (d,16.2) 148.0

8’ 6.26 (d,16) 114.7 6.26 (d,15.9) 114.7

9’ 168.2 167.9

Ramnosa 1 5.18 (d,2) 103.0 5.173 (s) 102.2

2 3.91 (dd,2,3) 72.3 3.90 (m) 72.3

3 3.56 (dd,3,9.5) 70.4 3.567 (m) 70.4

4 3.28 (t,9.5) 73.8 3.5-3.8 (m) 73.8

5 3.55 (m) 72.0 4.00 (m) 72.0

6 1.08 (d,6) 18.4 1.17 (d,6) 18.0 a Datos en

1H (500 MHz) y

13C (125 MHz)

b Datos en

1H (300 MHz) y

13C (75 MHz)

c Ver Fig. 12 para la numeración


53

Figura 13. Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido aislado del

extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las zonas

indicadas junto con la estructura. Azúl: protones del ácido cafeico y la aglicona;

Amarillo: protón de la ramnosa.

54

Figura 13 (continuación). Espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD) del verbascósido

aislado del extracto metanólico de raíces silvestres de C. tenuiflora. Ampliación de las

zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protones de la aglicona; Amarillo:

protones de glucosa y ramnosa.

55



zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo:

protones de glucosa y ramnosa.

56



zonas indicadas junto con la estructura. Azúl: protón de la aglicona; Amarillo: protón

de la ramnosa.

57

Se utilizó el experimento 1H-1H COSY para identificar el tipo y orientación espacial de

los azúcares presentes en el compuesto aislado (fracción C3R3). Se identificó el

protón anomérico (H-1) desplazado a 4.36 ppm con una constante de acoplamiento

J= 8.0 Hz que correlaciona con una señal desplazada a 3.38 ppm (J= 9.5, 7.5 Hz)

identificada como el H-2. La correlación de este protón con la señal presente en 3.81

ppm (J= 9.3) nos mostró la ubicación del H-3 de este azúcar. Los protones H-4, H-5,

H6a y H6b de este azúcar fueron ubicados mediante el mismo tipo de correlaciones

mostradas en la figura 14. Tanto los desplazamientos químicos como las constantes

de acoplamiento de este azúcar corresponden a una molécula de β-D-glucopiranosa.

Figura 14. Expansión del espectro COSY del verbascósido mostrando la secuencia

de espines de la glucosa.

58

La molécula de α-L-ramnopiranosa fue determinada mediante el mismo tipo de

correlación entre el acoplamiento vecinal del protón anomérico ubicado en 5.18 ppm

(J= 2.0 Hz) con la señal presente en 3.91 ppm (J=2, 3Hz) que correlaciona a su vez

con la señal dd ubicada en 3.3 ppm (J=3, 9.5). Las señales correspondientes a H-4,

H-5 y el metilo de la α-L-ramnopiranosa fueron ubicadas en 3.28 (J= 9.5 Hz), 3.55

(m) y 1.08 (J=6.0 Hz) ppm respectivamente (Figura 15).

Figura 15. Expansión del espectro COSY junto a la estructura del verbascósido

mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.

59

Figura 15 (continuación). Expansión del espectro COSY junto a la estructura del

verbascósido mostrando la secuencia de espines de la ramnosa.

La molécula de la aglicona se determinó mediante el experimento 1H-1H COSY

(Figura 16 y 17). Se identificó la correlación entre el acoplamiento vecinal del

hidrógeno H-8a (3.71 ppm, J= 6.5, 7, 8) y H-8b (4.04 ppm, J= 3, 6.5, 8) con el H-7

desplazado a 2.8 ppm (J= 3, 7, 14). Los protones H-2, H-5, H6 de los anillos benceno

de la aglicona y el ácido cafeico se ubicaron mediante el mismo tipo de correlaciones

mostradas en la figura 16.

60


de espines de la aglicona.

61


de espines del anillo benceno éstos compuestos fenólicos.

Los espectros de 13C RMN (Figura 18) del compuesto aislado en la fracción C3R3

indicaron la presencia de 29 señales, de las cuales seis carbonos corresponden para

la β-D-glucopiranosa, seis para la α-L-ramnopiranosa, ocho para el feniletanoide y

nueve del ácido cafeico, de los cuales uno corresponde a un carbonilo C-9’ (δ 168.2).

La unión entre el ácido cafeico y la glucosa se determinó mediante el espectro de

HMBC (Figura 18) al observar que el H-4 de la glucosa (J = 9.5 Hz) presenta una

correlación con el C-9’ (δ 168.2) a dos ligaduras. De la misma manera se determinó

la union entre el hidrógeno H-8 (J = 6.5, 7, 8 Hz) del feniletanoide y el carbon C-1 (δ

104.2) de la glucosa.

62

La unión interglicosídica se determinó mediante el espectro HMBC (Figura 19) al

observar que el hidrógeno H-3 (J= 9.3) de la glucosa presenta correlación con el

carbono C-1 (δ 103.0) de la ramnosa.

Figura 18. Espectro del 13C y expansión del espectro HMBC junto a la estructura del

verbascósido mostrando la unión del carbono C-9 del ácido cafeico con el hidrogeno H-4 de

glucosa.

63

Figura 19. Expansión del espectro HMBC del verbascósido mostrando la unión del carbono

e hidrogeno de glucosa y ramnosa

Las fracciones 30 hasta 35, que se denominó C4, obtenidas de la fracción acetónica

de las raíces, al analizarse por CCF revelaron compuestos menos polares que el

verbascósido (una banda es de color amarillo ocre). Se analizaron por RMN 1H la

fracción C4R2 y C4R4 (Anexo 5 y 6). Los espectros demostraron la posible presencia

de otro feniletanoide glicosilado mezclado con otros compuestos, que no permitieron

la identificación.

6.5. Cuantificación de aucubina, verbascósido, isoverbascósido y apigenina

en plantas silvestres

El establecimiento de una metodología de análisis cuantitativo por HPLC utilizando

los productos comerciales (aucubina y apigenina), así como los productos aislados

64

verbascósido e isoverbascósido como estándares permitieron obtener curvas de

calibración adecuadas R2=0.99, 0.99, 0.99 y 0.99, respectivamente. En el cuadro 18

se presenta la concentración de aucubina, verbascósido, isoverbascosido y

apigenina en diferentes órganos de las plantas silvestres. La concentración de

aucubina varió entre 0.81 ± 0 (hojas) y 22.69 ± 1.29 (raíces) mg g-1 BS. El

verbascósido se acumuló principalmente en las raíces e inflorescencias (9.23 ± 0.07

y 7.88 ± 0.01 mg g-1 BS, respectivamente) y el isoverbascósido fue abundante en las

raíces (7.13 ± 0.07 mg g-1 BS). Las hojas y tallos acumularon bajas concentraciones

de éstos dos FG. La apigenina se acumuló principalmente en las hojas y no se

detectó en las raíces. Como la raíz fue el principal órgano de acumulación de la

acubina y los FG, se estableció el cultivo de raíces in vitro de C. tenuiflora y se

determinó su capacidad de sintetizar dichos compuestos.

Cuadro 18. Concentración de aucubina, feniletanoides y apigenina en los diferentes

órganos de plantas silvestres de C. tenuiflora.

Órgano de la planta Aucubina Verbascósido Isoverbascósido Apigenina

Raíces 22.69 ± 1.29 9.23 ± 0.07 7.13 ± 0.07 N.D.

Tallos 1.59 ± 0.08 0.39 ± 0.07 0.35 ± 0.01 0.05 ± 0.04

Hojas 0.81 ± 0 0.54 ± 0.01 0.42 ± 0.01 1.60 ± 0.004

Inflorescencias 14.01 ± 0.25 7.88 ± 0.01 0.52 ± 0.01 0.02 ± 0.001

La concentración de los compuestos químicos se reporta en mg g-1 biomasa seca. Los

valores son la media ± error estándar de tres determinaciones.

6.6. Inducción de raíces adventicias y cultivos in vitro de C. tenuiflora

La rizogénesis indirecta se observó sobre la superficie de los explantes de hoja

después de una semana de cultivo, en el medio B5 suplementado con 10 M de

ANA. A los 21 días, las raíces adventicias se desarrollaron completamente (Figura

20-A). Las raíces adventicias se transfirieron a medio líquido B5 sin regulador de

crecimiento (SRC), donde se observó crecimiento y desarrollo de raíces laterales

(Figura 20-B); para el mantenimiento del cultivo se renovó el medio de cultivo cada 8

65

días. En medio con IBA (24.6 μM) a los 30 días de cultivo, los explantes de raíz se

oxidaron y el medio se tornó café (Figura 20-C). En el medio SRC se formaron brotes

(Figura 20-D).

Figura 20. Inducción de raíces adventicias in vitro de C. tenuiflora. A. Formación de raíces

adventicias en explantes de hoja después de 21 días de estar en contacto con medio de

cultivo B5 suplementado con 10 μM de ANA. B. Raíces adventicias subcultivadas cada 8

días en medio líquido B5, sin regulador de crecimiento. C. Raíces en medio B5 con IBA (24.6

μM) a los 30 días. D. Formación de brotes en raíces crecidas durante 30 días en medio B5

sin regulador de crecimiento. Barras=1 cm.

En la figura 21, se observa la morfología de las raíces laterales obtenidas en medios

que contienen AIA, ANA y sin regulador de crecimiento. El AIA promovió

hinchamiento y callogénesis en los explante y posteriormente la formación de raíces

laterales de color amarillo pálido (Figura 21-A), éstas raíces se alargaron a través del

tiempo (Figura 21-B). Por el contrario, en el medio con ANA, las raíces fueron

inicialmente verdes y desarrollaron pocas raíces laterales (Figura 21-B), pero a los 30

días también se observó un desarrollo de raíces laterales, además de alargarse,

éstas a su vez generaron nuevas raíces laterales (Figura 21-C). En un medio libre de

C D

66

auxinas, hubo elongación en lugar de desarrollo de las raíces laterales y el grado de

desarrollo de raíces fue menor que el observado en el medio que contiene auxina

(Figura 21-D y 21-E). Al final del período de cultivo en el medio SRC, se formaron

brotes y en las raíces se desarrollaron protuberancias (Figura 21-F). Estos resultados

indican que las auxinas afectan la morfología de las raíces de C. tenuiflora cultivadas

in vitro.

Figura 21. Morfología de las raíces adventicias de C. tenuiflora cultivadas in vitro. A – C – E.

A los 9 días, inducción de raíces en medio liquido B5; A. 10 μM AIA, C. 10 μM ANA y E. sin

regulador de crecimiento. B – D – F. A los 30 días, crecimiento y desarrollo de raíces

laterales en medio liquido B5; B. 10 μM AIA, D. 10 μM ANA y F. sin regulador de crecimiento.

Las flechas señalan las “protuberancias” en las raíces que crecieron en medio liquido B5 sin

regulador de crecimiento. Barras=1 cm.

67

En la figura 22, se muestra el comportamiento cinético de cultivos in vitro de raíces

de C. tenuiflora. En la primera semana del cultivo, la biomasa seca de las raíces fue

similar entre todos los tratamientos. Entre los 9 y 30 días, hubo un aumento

exponencial de la biomasa en el medio con AIA ó ANA. La velocidad específica de

crecimento (μ) en el medio con AIA fue de 0.92 días-1, mientras que en el medio con

ANA fue de 1.01 días-1. El mayor rendimiento de biomasa seca fue con la auxina AIA

a los 30 días (30 g L-1). Este valor fue de 1.5 y 2.3 veces más alto (P <0,05) que lo

obtenido en un medio con ANA o sin regulador de crecimiento (control),

respectivamente. Al final del periodo del cultivo (37 días), las raíces cultivadas en el

medio de cultivo con AIA mostraron el índice de crecimiento más alto (74). En el

medio sin regulador de crecimiento, se formaron brotes a los 30 días. Al final del

período de cultivo, la biomasa de raíces secas en el medio SRC fue similar a la de

las raíces en el medio que contenía ANA (16 g L-1).

Figura 22. Cinética del cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora en medio líquido B5

suplementado con 10 M de AIA ó ANA ó sin regulador de crecimiento (control), según sea

el tratamiento. Los valores son la media error estándar de tres determinaciones.

68

6.7. Cuantificación de aucubina, verbascósido e isoverbascósido en

cultivos in vitro de raíces adventicias de C. tenuiflora

El análisis por HPLC confirmó que los cultivos de raíces C. tenuiflora acumularon

verbascósido e isoverbascósido (Figura 23-A), los cuales son los principales FG que

se identificaron en las raíces de plantas silvestres C. tenuiflora (Fig. 23-B). El perfil de

HPLC sugirió que el isoverbascósido es el FG mayoritario en cultivos de raíces in

vitro, mientras que el verbascósido se acumuló principalmente en las raíces

silvestres.

En los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora, las raíces que crecieron en medio

suplementado con AIA contenía la mayor concentración específica de FG (Figura

24). La concentración máxima de verbascósido fue 14.62 mg g-1 biomasa seca

(438.6 mg L-1) y se obtuvo a los 30 días del cultivo (Figura 24-A). Esto fueron dos

veces mayor (P <0,05) que la concentración máxima en el control (7.13 mg g-1, que

corresponde a 92.69 mg L-1 a los 23 días). En el medio que contenía ANA, las raíces

acumularon bajos niveles de verbascósido (1,09 mg g-1 biomasa seca). Las raíces

cultivadas en un medio que contenía AIA mostraron el mayor rendimiento específico

de isoverbascósido (Figura 24-B) con una concentración máxima de 37.32 mg g-1 a

los 23 días (522.48 mg L-1). Este valor fue cinco veces mayor (P <0,05) que el

máximo en el control (7.27 mg g-1 correspondiente a 91 mg L-1) y seis veces mayor (P

<0,05) que en medio con ANA (6.61 mg g-1 correspondientes a 132.2 mg L-1). Los

niveles de trazas de verbascósido e isoverbascósido también fueron detectados en el

medio de cultivo, pero la concentración fue inferior a la mínima detectada por el

método HPLC (datos no mostrados). Así como verbascósido e isoverbascósido, las

raíces de C. tenuiflora también acumularon otros feniletanoides glicosilados que

podrían ser identificados en futuras investigaciones.

69

Figura 23. Cromatogramas de CLAR (detección a los 330 nm) de extractos metanólicos de

C. tenuiflora. A. Extractos de raíces adventicias cultivadas in vitro en medio líquido B5

suplementado con AIA, después de 30 días. B. Extractos de raíces silvestres. Picos: (1)

Verbascósido. (2) Isoverbascósido. Cuadro insertado: espectro de absorción UV de 1 y 2.

70

Figura 24. Producción de feniletanoides glicosilados en raíces adventicias de C. tenuiflora

cultivadas en medio líquido B5 suplementado con AIA, ANA ó SRC. A. Verbascósido. B.

Isoverbascósido. Los valores son la media error estándar de tres determinaciones.

B

A

71

7. DISCUSIÓN

Este trabajo de investigación se realizó el estudio químico de las raíces y tallos de

material vegetal silvestre de C. tenuiflora. La elucidación estructural de los

compuestos mayoritarios (iridoides en los tallos y feniletanoides en las raíces) nos

permitió utilizarlos como referencia para el desarrollo de metodologías de análisis

cualitativo y cuantitativo por CCF y CLAR, respectivamente. Estos procesos

cromatográficos fueron indispensables para realizar el estudio comparativo de

constitución química entre el material vegetal silvestre y el material obtenido por

cultivo in vitro. El fraccionamiento cromatográfico del extracto metanólico de las

raíces y la posterior purificación de algunas fracciones de este proceso generó el

aislamiento de dos compuestos que al ser analizados por RMN de 1H y 13C fueron

identificados como los feniletanoides glicosilados: verbascósido e isoverbascósido. El

mismo tipo de procesos cromatográficos y espectroscópicos realizados sobre el

extracto metanólico de los tallos de esta especie vegetal (material vegetal silvestre) y

sus componentes mayoritarios generó el aislamiento y elucidación estructural de los

iridoides acubina y batsiósido así como del flavonoide apigenina. Estos compuestos

se distribuyen de forma desigual entre los diferentes órganos de la planta. En las

raíces se acumula principalmente aucubina y feniletanoides glicosilados, siendo la

aucubina mayoritaria. En la hoja se encuentra la mayor concentración de apigenina.

La tecnología in vitro ofrece varias ventajas, entre las cuales está la de extraer y

purificar de manera simple, compuestos químicos con calidad estándar a partir de

materia vegetal que crece con independencia de los factores climáticos, libre de

microorganismos y con menor variabilidad comparada con las plantas silvestres

(Lubbe y Verpoorte, 2011). Por lo tanto, se estableció el cultivo de raíces adventicias

de C. tenuiflora utilizando diferentes auxinas (ANA y AIA) y se cuantificaron los IG y

FG. Los cultivos de raíces adventicias producen niveles más altos de FG que las

72

plantas silvestres pero concentraciones menores de aucubina. Las raíces cultivadas

en medio que contiene AIA, acumularon las mayores concentraciones de FG.

Los feniletanoides glucosilados son marcadores taxonómicos de las plantas en el

orden Lamiales, que incluye la familia Orobanchaceae (Scogin, 1992). La presencia

de éstos compuestos puede estar restringida debido a que el alcohol 3,4-

dihidroxifenetil (hidroxitirosol) de los FG es raro entre los metabolitos secundarios

(Saimaru y Orihara, 2009). En el género Castilleja, el verbascósido ha sido reportado

en Castilleja integra (Gardner et al., 1987), mientras que el verbascósido e

isoverbascósido fueron reportados en Castilleja linariaefolia (Pettit et al., 1990). En

las plantas silvestres de C. tenuiflora, la mayor concentración de verbascósido se

encontró en la raíz, seguido de las inflorescencias, mientras que isoverbascósido se

encuentra casi exclusivamente en la raíz.

La distribución espacial del verbascósido y del isoverbascósido en los órganos de C.

tenuiflora puede ser el resultado de la regulación genética, como se observa para los

compuestos fenólicos en las especies relacionadas. En Cistanche deserticola

(Orobanchaceae), la expresión del gen CdPAL1 se correlacionó con la acumulación

de compuestos fenólicos totales en las flores, tallos y raíces (Hu et al., 2011). La

expresión de CdPAL1 fue mayor en las flores que en la raíz, y el nivel de expresión

mayor en las flores se asoció con su alto contenido de compuestos fenólicos. Se han

realizado estudios sobre la biosíntesis de FG en C. deserticola donde se demostró

que la fracción cafeoil es biosintetizada a partir de la fenilalanina a través de la vía de

cinamato y el alcohol 3,4-dihidroxifenetil es biosintetizado de la tirosina (Ouyang et

al., 2005; Hu et al., 2011), otro estudio realizado en Olea europaea (Oleaceae)

concuerda con esta propuesta de ruta de biosíntesis (Saimaru y Orihara, 2009). Por

lo tanto, la PAL puede ser una enzima clave en la biosíntesis de los FG en Castilleja.

Actualmente no hay reportes sobre la biosíntesis de éstos compuestos en Castilleja.

En la Biblioteca Digital de Medicina Tradicional Mexicana (2009), mencionan que las

inflorescencias y ramas de C. tenuiflora se usan como infusión. La identificación de

73

verbascósido en las inflorescencias de C. tenuiflora puede estar asociada con su uso

en los remedios tradicionales para el tratamiento de enfermedades respiratorias (tos,

por ejemplo), inflamación del intestino y dolencias gástricas (por ejemplo, colitis y

cólicos hepáticos) (Béjar et al., 2000; Nazemiyeh et al., 2008; Mazzon et al., 2009;

Esposito et al., 2010; Singh et al., 2010).

Las auxinas exógenas fueron necesarias para la inducción de raíces en el cultivo in

vitro de C. tenuiflora, también es el caso de otras especies estrechamente

relacionadas, tales como Ocimum sactum L. (Lamiaceae) (Shilpa et al., 2010) y

Lavandula pedunculata (Lamiaceae) (Zuzarte et al., 2010). La necesidad de auxinas

exógenas para la inducción de raíces pudo ser debida a la ausencia de primordios en

aquellas raíces que crecieron en medio de cultivo libre de auxinas por una síntesis

insuficiente de hormonas endógenas (Kim et al., 2003). Aunque el AIA y ANA

indujeron la formación de raíces laterales y un aumento en la biomasa de raíces, la

mejor respuesta de C. tenuiflora se logró con la auxina AIA. Como se reportó en otros

trabajos, los efectos de las auxinas exógenas sobre la morfología y el crecimiento de

los cultivos de raíces dependen de factores como el genotipo, la fuente de explante,

el medio de cultivo, entre otros (Sorin et al., 2005; Aloni et al., 2006; Fukaki et al.,

2007). Por ejemplo, ANA inhibió el desarrollo de las raíces laterales en el cultivo de

raíces de Hypericum perforatum (Hyperiaceae) (Cui et al., 2010). En Cichorium

litybus (Asteraceae), la mayor velocidad de enraizamiento se obtuvo mediante una

combinación de ANA e IBA (Nandagopal y Ranjitha-Kumari, 2007), en lugar de las

auxinas solas. En los cultivos de raíces transformadas de Rehmannia glutinosa

(Scrophulariaceae), AIA fue más efectivo que el ANA ó IBA para promover el

crecimiento (Hwang, 2005).

Las protuberancias que se observaron en las raíces de C. tenuiflora que crecieron en

medio libre de auxinas, podría suponerse que son haustorios, órganos que están

especializados para la fijación y la penetración de las raíces hospederas, que han

sido reportados en cultivos in vitro de raíces en especies estrechamente

74

relacionadas, tales como la hemiparásita Triphysaria versicolor (Orobanchaceae)

(Tomilov et al., 2005).

Los cultivos de raíces adventicias de C. tenuiflora acumularon verbascósido e

isoverbascósido en medio libre de auxina y en medio con AIA, mientras que ANA

parece afectar adversamente el metabolismo relacionado con la producción de FG.

Sin embargo, la concentración de aucubina fue menor a 0.1 mg g-1 BS. Este es uno

de los pocos reportes en donde los cultivos de tejidos in vitro producen mayores

cantidades de verbascósido e isoverbascósido que sus contrapartes, las plantas

silvestres (Wysokinska y Rozga, 1998; Estrada-Zúñiga et al., 2009; Stancheva et al.,

2011). El ANA influye negativamente en la acumulación de algunos metabolitos

secundarios, incluyendo compuestos fenólicos en los cultivos de raíces de H.

perforatum (Cui et al., 2010), las naftoquinonas en Impatiens balsamina

(Balsaminaceae) (Sakunphueak y Panichayupakaranant, 2010) y saponinas de

Panax ginseng (Araliaceae) (Kim et al., 2003). En otros estudios, el ANA influyó

positivamente en la acumulación de plumbagina (naftoquinona) en cultivos de raíces

peludas de Plumbago indica (Plumbaginaceae) (Gangopadhyay et al., 2011). Del

mismo modo, el AIA afectó positivamente la acumulación de la rutina (flavonoide) en

las raíces adventicias de Morus alba (Lee et al., 2011). Los diferentes efectos de las

auxinas en el metabolismo secundario en los cultivos de raíces también se asocian

con cambios en la especialización y la morfología celular (Kim et al., 2003; Cui et al.,

2010).

La acumulación de feniletanoides glicosilados en cultivos de raíces adventicias de C.

tenuiflora está asociado con el crecimiento. Esto también se reportó en los cultivos de

células en suspensión de Buddleja cordata (Estrada-Zúñiga et al., 2009) y

Harpagophytum procumbens (Georgiev et al., 2011b; Stancheva et al., 2011). El

rendimiento volumétrico del verbascosido (438.6 mg L-1) a partir de cultivos de raíces

adventicias de C. tenuiflora fueron mayores a los reportados para los cultivos de

raíces transformadas de Gmelina arborea (Verbenaceae) [3.64 mg L-1] (Dhakulkar et

al., 2005), H. procumbens (Pedaliaceae) [56.84 mg L-1] (Grabkowska et al., 2010) y

75

Verbascum xanthophoeniceum (Scrophulariaceae) [298.83 mg L-1] (Georgiev et al.,

2011c) e inferior a lo reportado en Paulownia tomentosa (Scrophulariaceae) [1 g L-1]

(Wysokinska y Rozga, 1998).

La concentración de verbascósido fue mayor en las plantas silvestres, mientras que

el isoverbascósido fue el principal compuesto en el cultivo de raíces adventicias.

Estas diferencias entre plantas silvestres y cultivos in vitro se han observado también

en otros sistemas, por ejemplo, el clon de HP-3 de las raíces peludas de H.

procumbens (Pedaliaceae) (Grabkowska et al., 2010) y las raíces peludas de V.

xanthophoeniceum (Georgiev et al., 2011c). Los cultivos de raíces adventicias de C.

tenuiflora ofrecen buenas perspectivas para ampliar aún más la capacidad de

obtener grandes cantidades de biomasa de raíces de C. tenuiflora en medio que

contiene AIA, los tiempos de duplicación cortos y altos rendimientos de FG. Este

sistema también podría utilizarse para identificar otros feniletanoides glicosilados y se

podrían utilizarse en otras aplicaciones de la biotecnología, tales como la

transformación genética de las raíces para mejorar los rendimientos de los FG.

76

8. CONCLUSIONES

Los feniletanoides mayoritarios se aislaron e identificaron estructuralmente como

verbascósido e isoverbascósido en el extracto metanólico de raíces silvestres de C.

tenuiflora.

Los iridoides mayoritarios se aislaron e identificaron como aucubina y bartsiósido en

el extracto metanólico de tallos silvestres de C. tenuiflora.

Se desarrollaron metodologías de análisis cuantitativo para iridoides y feniletanoides

glicosilados.

Se desarrolló un sistema de cultivo de raíces adventicias de C. tenuiflora. El AIA fue

el regulador de crecimiento que indujo mayor desarrollo y crecimiento de raíces

adventicias y en esta condición se obtuvo la mayor acumulación de verbascósido e

isoverbascósido.

Los cultivos de raíces in vitro de C. tenuiflora acumulan principalmente los

feniletanoides glicosilados verbascósido e isoverbascósido en mayor cantidad que

las raíces silvestres. Sin embargo, los cultivos in vitro acumulan aucubina en menor

cantidad que la planta silvestre.

En la planta silvestre, el verbascósido y la aucubina se acumularon principalmente en

raíces e inflorescencias, mientras que el isoverbascósido en las raíces y la apigenina

en las hojas.

Los cultivos in vitro de raíces de C. tenuiflora representan una fuente alternativa para

la producción de compuestos bioactivos como aucubina, verbascósido e

isoverbascósido.

77

9. PERSPECTIVAS

Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que los cultivos de raíces in

vitro de C. tenuiflora son fuente de verbascósido e isoverbascósido. Se propone,

continuar con el estudio químico de esta especie y realizar pruebas farmacológicas

de las fracciones aisladas y de los extractos completos, así como también iniciar con

estudios para elucidar la ruta de biosíntesis y la función de los fenieltanoides en C.

tenuiflora.

78

10. LITERATURA CITADA

Adler, L.S., Schmitt, J., Bowers, M.D. 1995. Genetic variation in defensive chemistry in Plantago lanceolata (Plantaginaceae) and its effect on the specialist herbivore Junonia coenia (Nymphalidae). Oecologia. 101, 75-85.

Ahmed, B., Al-Rehaily, A.J., Al-Howiriny, T.A., El-Sayed, K.A., Ahmad, M.S. 2003. Scropolioside-D2 and harpagoside-B: two new iridoid glycosides from Scrophularia deserti and their antidiabetic and antiinflammatory activity. Biol. Pharm. Bull. 26, 462-467.

Aloni, R., Aloni, E., Langhans, M., Ullrich, C.I. 2006. Role of cytokinin and auxin in shaping root architecture: regulating vascular differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Ann. Bot. 97, 883-893.

Andary, C., Wyldea, R., Laffitea, C., Privat, G., Winternitz, F. 1982. Structures of verbascoside and orobanchoside, caffeic acid sugar esters from Orobanche rapum-genistae. Phytochemistry. 21, 1123-1127.

Argueta, A., Cano, L., Rodarte, M.E. 1994. Atlas de las plantas de la medicina tradicional. Instituto Nacional Indigenista, México.

Arslanian, R.L., Harris, G.H., Stermitz, F.R. 1985. Some iridoid glucosides, including the new 6-deoxycatapol, from Indian Paintbrush species realted to Castilleja miniata. J. Nat. Prod. 48, 957-961.

Arthur, H., Joubert, E., De Beer, D., Malherbe, C.J., Witthuhn, R.C. 2011. Phenylethanoid glycosides as major antioxidants in Lippia multiflora herbal infusion and their stability during steam pasteurisation of plant material. Food Chem. 127, 581-588.

Avila, J.G., de Liverant, J.G., Martínez, A., Martínez, G., Muñoz, J.L., Arciniegas, A., Romo de Vivar, A. 1999. Mode of action of Buddleja cordata verbascoside against Staphylococcus aureus. Journal of Ethnopharmacology. 66, 75-78.

Baden, C.U., Thomas, G., Franke, S., Dobler, S. 2011. Sequestered iridoid glycosides – Highly effective deterrents against ant predators?. Biochem. Syst. Ecol. 39, 897-901.

Bais, H., Loyola-Vargas, V., Flores, H., Vivanco, J. 2001. Root-specific metabolism: the biology and biochemistry of underground organs. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant. 37, 730-741.

Béjar, E., Reyes-Chilpa, R., Jiménez-Estrada, M. 2000. Bioactive compounds from selected plants used in the XVI century mexican traditional medicine. Stud. Nat. Prod. Chem. 24, 799-844.

Belofsky, G.N., Stermitz, F.R. 1988. 10-trans-cinnamoylmelittoside and other iridoids from castilleja wightii. J. Nat. Prod. 51, 614-616.

79

Beninger, C.W., Cloutier, R.R., Grodzinski, B. 2008. The iridoid glucoside, antirrhinoside, from Antirrhinum majus has differential effects on two generalist insect herbivores. J. Chem. Ecol. 34, 591-600.

Bi, J., Jiang, B., Liu, J.H., Lei, C., Zhang, X.L., An, L.-J. 2008. Protective effects of catalpol against H2O2-induced oxidative stress in astrocytes primary cultures. Neurosci. Lett. 442, 224-227.

Boros, C.A., Stermitz, F.R. 1990. Iridoids an updated review. Part I. J. Nat. Prod. 53, 1055-1147.

Bowers, D.M., Boockvar, K., Collinge, S.K. 1993. Iridoid glycosides of Chelone glabra (Scrophulariacea) and their sequestrion by larvae of a sawfly Tenthredo grandis (Tenthredinidae). J. Chem. Ecol. 19, 815-823.

Cabrera, L.L. 1958. Plantas curativas de México. Cicerón.

Cardinali, A., Cicco, N., Linsalata, V., Minervini, F., Pati, S., Pieralice, M., Tursi, N., Lattanzio, V. 2010. Biological activity of high molecular weight phenolics from olive mill wastewater. J. Agric. Food Chem. 58, 8585-8590.

Cardinali, A., Linsalata, V., Lattanzio, V., Ferruzzi, M.G. 2011. Verbascosides from olive mill waste water: assessment of their bioaccessibility and intestinal uptake using an in vitro digestion/Caco-2 model system. J. Food Sci. 76, H48-H54.

Chen, C.Q., Zhang, W.Y., Youn, U., Kim, H., Lee, I., Jung, H.-J. 2009. Iridoid glycosides from Gardeniae Fructus for treatment of ankle sprain. Phytochemistry. 70, 779-784.

Chen, R.C., Su, J.H., Yang, S.M., Li, J., Wang, T.J., Zhou, H. 2002. Effect of isoverbascoside, a phenylpropanoid glycoside antioxidant, on proliferation and differentiation of human gastric cancer cell. Acta Pharmacol. Sin. 23, 997-1001.

Cui, X.H., Chakrabarty, D., Lee, E.J., Paek, K.Y. 2010. Production of adventitious roots and secondary metabolites by Hypericum perforatum L. in a bioreactor. Bioresour. Technol. 101, 4708-4716.

Darrow, K., Bowers, M.D. 1999. Effects of herbivore damage and nutrient level on induction of iridoid glycosides in Plantago lanceolata. J. Chem. Ecol. 25, 1427-1440.

Dembitsky, V.M. 2005. Astonishing diversity of natural surfactants: 5. Biologically active glycosides of aromatic metabolites. Lipids. 40, 869-900.

Dhakulkar, S., Ganapathi, T.R., Bhargava, S., Bapat, V.A. 2005. Induction of hairy roots in Gmelina arborea Roxb. and production of verbascoside in hairy roots. Plant Sci. 169, 812-818.

80

Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. 2011. Coping with toxic plant compounds – The insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604.

Dodds, J.H., Roberts, L.W. 1985. Experiments in plant tissue culture. Cambridge university press, Cambridge. pp. 232.

Egger, J.M. 2008. Nomenclatural changes and selected lectotypifications in Castilleja (Oronbanchaceae). Phytologia. 90, 63-82.

Esposito, E., Mazzon, E., Paterniti, I., Dal Toso, R., Pressi, G., Caminiti, R., Cuzzocrea, S. 2010. PPAR-alpha contributes to the anti-Inflammatory activity of verbascoside in a model of inflammatory bowel disease in mice. PPAR Res. 2010, 917312.

Estrada-Zúñiga, M.E., Cruz-Sosa, F., Rodríguez-Monroy, M., Verde-Calvo, J.R., Vernon-Carter, E.J. 2009. Phenylpropanoid production in callus and cell suspension cultures of Buddleja cordata Kunth. Plant Cell Tissue Organ Cult. 97, 39-47.

Fukaki, H., Okushima, Y., Tasaka, M. 2007. Auxin-mediated lateral root formation in higher plants. Int. Rev. Cytol. 256, 111-137.

Gálvez, M., Martín-Cordero, C., Houghton, P.J., Ayuso, M.J. 2005. Antioxidant activity of methanol extracts obtained from Plantago species. J. Agr. Food Chem. 53, 1927-1933.

Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50, 151-158.

Gangopadhyay, M., Dewanjee, S., Chakraborty, D., Bhattacharya, S. 2011. Role of exogenous phytohormones on growth and plumbagin accumulation in Plumbago indica hairy roots and conservation of elite root clones via synthetic seeds. Ind. Crop. Prod. 33, 445-450.

Gardner, D.R., Narum, J., Zook, D., Stermitz, F.R. 1987. New iridoid glucosides from Castilleja and Besseya: 6 hydroxyadoxoside and 6 isovanillylcatapol. J. Nat. Prod. 50, 485-489.

Georgiev, M., Alipieva, K., Orhan, I., Abrashev, R., Denev, P., Angelova, M. 2011a. Antioxidant and cholinesterases inhibitory activities of Verbascum xanthophoeniceum Griseb. and its phenylethanoid glycosides. Food Chem. 128, 100-105.

Georgiev, M., Alipieva, K., Pashova, S., Denev, P., Angelova, M., Kerns, G., Bley, T. 2010. Antioxidant activity of devil’s claw cell biomass and its active constituents. Food Chem. 121, 967-972.

Georgiev, M., Ludwig-Müller, J., Weber, J., Stancheva, N., Bley, T. 2011b. Bioactive metabolite production and stress-related hormones in Devil's claw cell suspension cultures grown in bioreactors. Appl Microbiol Biotechnol. 89, 1683-1691.

81

Georgiev, M.I., Ludwig-Müller, J., Alipieva, K., Lippert, A. 2011c. Sonication-assisted Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Verbascum xanthophoeniceum Griseb. for bioactive metabolite accumulation. Plant Cell Rep. 30, 859-866.

Grabkowska, R., Królicka, A., Mielicki, W., Wielanek, M., Wysokinska, H. 2010. Genetic transformation of Harpagophytum procumbens by Agrobacterium rhizogenes: iridoid and phenylethanoid glycoside accumulation in hairy root cultures. Acta Physiol. Plant. 32, 665-673.

Graham, J.G., Quinn, M.L., Fabricant, D.S., Farnsworth, N.R. 2000. Plants used against cancer - an extension of the work of Jonathan Hartwell. Journal of Ethnopharmacology. 73, 347-377.

Gyurkovska, V., Alipieva, K., Maciuk, A., Dimitrova, P., Ivanovska, N., Haas, C., Bley, T., Georgiev, M. 2011. Anti-inflammatory activity of Devil’s claw in vitro systems and their active constituents. Food Chem. 125, 171-178.

Ho, J.N., Lee, Y.H., Lee, Y.D., un, W.J., Kim, H.K., Hong, B.S., Shin, D.H., Cho, H.Y. 2005a. Inhibitory effect of aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced matrix metalloproteinase-1 production in human skin fibroblasts. Biosci. Biotechnol. Bioch. 69, 2227-2231.

Ho, J.N., Lee, Y.H., Park, J.S., Jun, W.J., Kim, H.K., Hong, B.S., Shin, D.H., Cho, H.Y. 2005b. Protective effects of aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced oxidative stress in human skin fibroblasts. Biol. Pharm. Bull. 28, 1244-1248.

Holmgren, N.H. 1976. Four new species of mexican Castilleja (subgenus Castilleja, Scrophulariaceae) and their relatives. Brittonia. 28, 195-208.

Hu, G.S., Hur, Y.J., Jia, J.M., Lee, J.H., Chung, Y.S., Yi, Y.B., Yun, D.J., Park, S.K., Kim, D.H. 2011. Effects of 2-aminoindan-2-phosphonic acid treatment on the accumulation of salidroside and four phenylethanoid glycosides in suspension cell culture of Cistanche deserticola. Plant Cell Rep. 30, 665-674.

Hung, J.Y., Yang, C.J., Tsai, Y.M., Huang, H.W., Huang, M.S. 2008. Antiproliferative activity of aucubin is through cell cycle arrest and apoptosis in human non-small cell lung cancer A549 cells. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 35, 995-1001.

Hwang, S.J. 2005. Growth characteristics and catalpol production in chinese foxglove (Rehmannia glutinosa Liboschitz) hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes ATCC15834. J. Plant Biol. 48, 380-386.

Inagaki, N., Nishimura, H., Okada, M., Mitsuhashi, H. 1991. Verbascoside production by plant cell cultures. Plant Cell Rep. 9, 484-487.

82

Isacchi, B., Iacopi, R., Bergonzi, M.C., Ghelardini, C., Galeotti, N., Norcini, M., Vivoli, E., Vincieri, F.F., Bilia, A.R. 2011. Antihyperalgesic activity of verbascoside in two models of neuropathic pain. J. Pharm. Pharmacol. 63, 594-601.

Ivanchenko, M.G., Muday, G.K., Dubrovsky, J.G. 2008. Ethylene-auxin interactions regulate lateral root initiation and emergence in Arabidopsis thaliana. Plant J. 55, 335-347.

Jeong, E.J., Kima, T.B., Yang, H., Kang, S.Y., Kim, S.Y., Sung, S.H., Kim, Y.C. 2011. Neuroprotective iridoid glycosides from Cornus officinalis fruits against glutamate-induced toxicity in HT22 hippocampal cells. Phytomedicine. doi:10.1016/j.phymed.2011.08.068.

Jimenez, M., Padilla, M.E., Reyes-Chilpa, R., Espinosa, L.M., Melendez, E., Lira-Rocha, A. 1995. Iridoid glycoside constituents of Castilleja tenuiflora. Biochem. Syst. Ecol. 23, 455-456.

Jin, L., Xue, H.Y., Jin, L.J., Li, S.Y., Xu, Y.P. 2008. Antioxidant and pancreas-protective effect of aucubin on rats with streptozotocin-induced diabetes. Eur J Pharmacol. 582, 162-167.

Kahraman, C., Tatli, II, Orhan, I.E., Akdemir, Z.S. 2010. Cholinesterase inhibitory and antioxidant properties of Verbascum mucronatum Lam. and its secondary metabolites. Z. Naturforsch. C. 65, 667-674.

Kawada, T., Asano, R., Makino, K., Sakuno, T. 2002. Synthesis of isoacteside, a dihydroxyphenylethyl gycoside. J. Wood Sci. 48, 512-515.

Kernan, M.R., Amarquaye, A., Chen, J.L., Chan, J., Sesin, D.F., Parkinson, N., Ye, Z.-J., Barrett, M., Bales, C., Stoddart, C.A., Sloan, B., Blanc, P., Limbach, C., Mrisho, S., Rozhon, E.J. 1998. Antiviral phenylpropanoid glycosides from the medicinal plant Markhamia lutea. J. Nat. Prod. 61, 564-570.

Kim, K.H., Kim, S., Jung, M.Y., Ham, I.H., Whang, W.K. 2009. Anti-inflammatory phenylpropanoid glycosides from Clerodendron trichotomum leaves. Arch. Pharm. Res. 32, 7-13.

Kim, S.R., Lee, K.Y., Koo, K.A., Sung, S.H., Lee, N.G., Kim, J., Kim, Y.C. 2002. Four new neuroprotective iridoid glycosides from Scrophularia buergeriana roots. J. Nat. Prod. 65, 1696-1699.

Kim, Y.-S., Hahn, E.-J., Yeung, E.C., Paek, K.-Y. 2003. Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C.A. Meyer. In Vitro Cell. Dev. Plant. 39, 245-249.

Kirmizibekmez, H., Ariburnu, E., Masullo, M., Festa, M., Capasso, A., Yesilada, E., Piacente, S. 2011. Iridoid, phenylethanoid and flavonoid glycosides from Sideritis trojana. Fitoterapia. doi: 10.1016/j.fitote.2011.10.003.

83

L'Empereur, K.M., Stermitz, F.R. 1990a. Iridoid glycoside content of Euphydryas anicia (Lepidoptera: Nymphalidae) and its major hostplant, Besseya plantaginea (Scrophulatiaceae), at a high plains colorado site. J. Chem. Ecol. 16, 187-197.

L'Empereur, K.M., Stermitz, F.R. 1990b. Iridoid glycoside metabolism and sequestration by Poladryas minuta (Lepidoptera: Nymphalidae) feeding on Penstemon virgatus (Scrophulareaceae). J. Chem. Ecol. 16, 1495-1506.

Lee, Y., Lee, D.-E., Lee, H.-S., Kim, S.-K., Lee, W.S., Kim, S.-H., Kim, M.-W. 2011. Influence of auxins, cytokinins, and nitrogen on production of rutin from callus and adventitious roots of the white mulberry tree (Morus alba L.). Plant Cell Tissue Organ Cult. 105, 9-19.

Li, L., Tsao, R., Liu, Z., Liu, S., Yang, R., Young, J.C., Zhu, H., Deng, Z., Xie, M., Fu, Z. 2005. Isolation and purification of acteoside and isoacteoside from Plantago psyllium L. by high-speed counter-current chromatography. J. Chromatogr. A. 1063, 161-169.

Li, M., Shang, X., Zhang, R., Jia, Z., Fan, P. 2010. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of iridoid glycosides extract of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo. Fitoterapia. 81, 167-172.

Lichtenthaler, H.K., Rohmer, M., Schwender, J. 1997. Two independent biochemical pathways for isopentenyl diphosphate and isoprenoid biosynthesis in higher plants. Physiol. Plantarum. 101, 643-652.

Liu, X., Wang, J. 2011. Anti-inflammatory effects of iridoid glycosides fraction of Folium syringae leaves on TNBS-induced colitis in rats. Journal of Ethnopharmacology. 133, 780-787.

López-Laredo, A.R., Sepúlveda-Jiménez, G., Trejo-Tapia, G. 2010. Evaluacion del potencial de cultivos in vitro de Castilleja tenuiflora para producir compuestos antioxidantes. XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica. VI Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica. VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular, México.

Lu, C.-T., Mei, X.-G. 2003. Improvement of phenylethanoid glycosides production by a fungal elicitor in cell suspension culture of Cistanche deserticola. Biotechnol. lett. 25, 1437-1439.

Lubbe, A., Verpoorte, R. 2011. Cultivation of medicinal and aromatic plants for specialty industrial materials. Ind. Crop. Prod. 34, 785-801.

Marcano, D., Hasegawa, M. 2002. Fitoquímica orgánica. Consejo de Desarrolo Científico y Humanístico. Universidad Central de Venezuela, Caracas. pp. 440.

Martin, F., Hay, A.-E., Quinteros, V.R., Cressend, D., Reist, M., Gupta, M.P., Carrupt, P.A., Hostettmann, K. 2009. Antioxidant phenylethanoid glycosides and a neolignan from Jacaranda caucana. J. Nat. Prod. 72, 852-856.

84

Martínez, M. 1969. Las plantas medicinales de México. Botas, México.

Martínez-Bonfil, B.P., Salcedo-Morales, G., López-Laredo, A.R., Ventura-Zapata, E., Evangelista-Lozano, S., Trejo-Tapia, G. 2011. Shoot regeneration and determination of iridoid levels in the medicinal plant Castilleja tenuiflora Benth. Plant Cell Tissue Organ Cult. 107, 195-203.

Martins, F.O., Esteves, P.F., Mendes, G.S., Barbi, N.S., Menezes, F.S., Romanos, M.T. 2009. Verbascoside isolated from Lepechinia speciosa has inhibitory activity against HSV-1 and HSV-2 in vitro. Nat. Prod. Commun. 4, 1693-1696.

Mathad, V.T., Raj, K., Bhaduri, A.P., Sahai, R., Puri, A., Tripathi, L.M., Srivastava, V.M.L. 1998. Studies on the profile of immunostimulant activities of modified iridoid glycosides. Bioorg. Med. Chem. 6, 605-611.

Matkowski, A. 2008. Plant in vitro culture for the production of antioxidants — A review. Biotechnol Adv. 26, 548-560.

Mazzon, E., Esposito, E., Di Paola, R., Riccardi, L., Caminiti, R., Dal Toso, R., Pressi, G., Cuzzocrea, S. 2009. Effects of verbascoside biotechnologically produced by Syringa vulgaris plant cell cultures in a rodent model of colitis. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 380, 79-94.

McMurry, J. 2004. Química orgánica. 6ª edición. International Thomson Editores, S. A. de C. V., México. pp. 197.

Mead, E.W., Foderaro, T.A., Gardner, D.R., Stermitz, F.R. 1993. Iridoid glycoside sequestration by Thessalia leanira (Lepidoptera: Nymphalidae) feeding on Castilleja integra (Scrophulariacea). J. Chem. Ecol. 19, 1155-1166.

Mead, E.W., Looker, M., Gardner, D.R., Stermitz, F.R. 1992. Pyrrolizidine alkaloids of Liatris punctata and its root parasite, Castilleja integra. Phytochemistry. 31, 3255-3257.

Mondragón, J., Vibrans, H. Malezas de México [en línea]. Dirección URL: <http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/scrophulariaceae/castillejatenuiflora/fichas/pagina1.htm>. [consulta: Noviembre de 2011].

Morales, A. 1952. Nueva farmacopea mexicana, México.

Moreno-Escobar, J.A., Bazaldúa, S., Villarreal, M.L., Bonilla-Barbosa, J.R., Mendoza, S., Rodríguez-López, V. 2011. Cytotoxic and antioxidant activities of selected Lamiales species from Mexico. Pharm. Biol. 49, 1243-1248.

Morikawa, T., Pan, Y., Ninomiya, K., Imura, K., Matsuda, H., Yoshikawa, M., Yuan, D., Muraoka, O. 2010. Acylated phenylethanoid oligoglycosides with hepatoprotective activity from the desert plant Cistanche tubulosa. Bioorg. Med. Chem. 18, 1882-1890.

85

Nagao, T., Abe, F., Okabe, H. 2001. Antiproliferative constituents in the plants 7. Leaves of Clerodendron bungei and leaves and bark of C. trichotomum. Biol. Pharm. Bull. 24, 1338-1341.

Nandagopal, S., Ranjitha-Kumari, B.D. 2007. Effectiveness of auxin induced in vitro root culture in chicory. J. Cent. Eur. Agric. 8, 73-80.

Nazemiyeh, H., Rahman, M.M., Gibbons, S., Nahar, L., Delazar, A., Ghahramani, M.-A., Talebpour, A.-H., Sarker, S.D. 2008. Assessment of the antibacterial activity of phenylethanoid glycosides from Phlomis lanceolata againts multiple-drug-resistant strains of Staphylococcus aureus. J. Nat. Med. 62, 91-95.

Nesom, G.L. 1992. Taxonomy of the Castilleja tenuiflora group (Scrophulariaceae) in México, with an overview of sect. Castilleja. Phytologia. 73, 389.

Nezbedová, L., Hesse, M., Dušek, J., Werner, C. 1999. Chemical potential of Aphelandra sp. cell cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 58, 133-140.

Nguyen, A.-T., Fontaine, J., Malonne, H., Claeys, M., Luhmer, M., Duez, P. 2005. A sugar ester and an iridoid glycoside from Scrophularia ningpoensis. Phytochemistry. 66, 1186-1191.

Olivas, M.P. 1999. Plantas medicinales del estado de Chihuahua. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez.

Oudin, A., Courtois, M., Rideau, M., Clastre, M. 2007. The iridoid pathway in Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis. Phytochem. Rev. 6, 259-276.

Ouyang, J., Wang, X., Zhao, B., Wang, Y. 2005. Enhanced production of phenylethanoid glycosides by precursor feeding to cell culture of Cistanche deserticola. Process Biochem. 40, 3480-3484.

Ouyang, J., Wang, X.D., Zhao, B., Wang, Y.C. 2003. Formation of phenylethanoid glycosides by Cistanche deserticola callus grown on solid media. Biotechnol. Lett. 25, 223-225.

Pettit, G.R., Numata, A., Takemura, T., Ode, R.H., Narula, A.S., Schmidt, J.M., Cragg, G.M., Pase, C.P. 1990. Antineoplastic agents, 107. Isolation of acteoside and isoacteoside from Castilleja linariaefolia. J. Nat. Prod. 53, 456-458.

Roby, M.R., Stermitz, F.R. 1984a. Penstemonoside and other iridoids from castilleja rhexifolia. Conversion of penstemonoside to the pyridine monoterpene alkaloid rhexifoline. J. Nat. Prod. 47, 854-857.

Roby, M.R., Stermitz, F.R. 1984b. Pyrrolizidine and pyridine monoterpene alkaloids from two castilleja plant host of the plume moth, platyptilia pica. J. Nat. Prod. 47, 846-853.

86

Rosas, G. 2007. Establecimiento del cultivo in vitro de Castilleja tenuiflora Benth. Maestría, Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, Yautepec.

Sagare, A.P., Kuo, C.-L., Chueh, F.-S., Tsay, H.-S. 2001. De novo regeneration of Scrophularia yoshimurae YAMAZAKI (Scrophulariaceae) and quantitative analysis of harpagoside, an iridoid glucoside, formed in aerial and underground parts of in vitro propagated and wild plants by HPLC. Biol. Pharm. Bull. 24, 1311-1315.

Saimaru, H., Orihara, Y. 2009. Biosynthesis of acteoside in cultured cells of Olea europaea. J. Nat. Med. 64, 139-145.

Sakunphueak, A., Panichayupakaranant, P. 2010. Effects of donor plants and plant growth regulators on naphthoquinone production in root cultures of Impatiens balsamina. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 102, 9-15.

Salcedo-Morales, G., Rosas-Romero, G., Nabor-Correa, N., Bermúdez-Torres, K., López-Laredo, A.R., Trejo-Tapia, G. 2009. Propagation and conservation of Castilleja tenuiflora Benth. ("Hierba del cancer") through in vitro culture. Polibotánica. 28, 119-137.

Sampaio-Santos, M.I., Kaplan, M.A. 2001. Biosynthesis significance of iridoids in chemosystematics. J. Braz. Chem. Soc. 12, 144-153.

Sarasan, V., Kite, G.C., Sileshi, G.W., Stevenson, P.C. 2011. Applications of phytochemical and in vitro techniques for reducing over-harvesting of medicinal and pesticidal plants and generating income for the rural poor. Plant Cell Rep. 30, 1163-1172.

Scogin, R. 1992. The distribution of acteoside among angiosperms. Biochem. Syst. Ecol. 20, 477-480.

Sesterhenn, K., Distl, M., Wink, M. 2007. Occurrence of iridoid glycosides in vitro cultures and intact plants of scrophularia nodosa L. Plant Cell Rep. 26, 365-371.

Shilpa, K., Selvakkumar, C., Senthil, A.K., Lakshmi, B.S. 2010. In vitro root culture of Ocimum sanctum L. and evaluation of its free radical scavenging activity. Plant Cell Tissue Organ Cult. 101, 105-109.

Shindo, K., Saito, E., Sekiya, M., Matsui, T., Koike, Y. 2008. Antioxidative activity of the flower of Torenia fournieri. J. Nat. Med. 62, 247-248.

Sinaphet, B., Noiarsa, P., Rujirawat, S., Otsuka, H., Kanchanapoom, T. 2006. Dolichandroside, a new phenolic triglycoside from Dolichandrone serrulata (DC.) Seem. J. Nat. Med. 60, 251-254.

87

Singh, N., Shukla, N., Singh, P., Sharma, R., Rajendran, S.M., Maurya, R., Palit, G. 2010. Verbascoside isolated from Tectona grandis mediates gastric protection in rats via inhibiting proton pump activity. Fitoterapia. 81, 755-761.

Skrzypek, Z., Wysokinska, H. 1999. Accumulation of phenylethanoids in suspension cultures of Penstemon serrulatus Menz. Biotechnol. lett. 21, 691-693.

Sorin, C., Bussell, J.D., Camus, I., Ljung, K., Kowalczyk, M., Geiss, G., McKhann, H., Garcion, C., Vaucheret, H., Sandberg, G., Bellini, C. 2005. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17, 1343-1359.

Spasojevic, M.J., Suding, K.N. 2011. Contrasting effects of hemiparasites on ecosystem processes: can positive litter effects offset the negative effects of parasitism?. Oecologia. 165, 193-200.

Stancheva, N., Weber, J., Schulze, J., Alipieva, K., Ludwig-Müller, J., Haas, C., Georgiev, V., Bley, T., Georgiev, M. 2011. Phytochemical and flow cytometric analyses of Devil’s claw cell cultures. Plant Cell Tissue Organ Cult. 105, 79-84.

Stermitz, F.R., Gardner, D.R., Odendaal, F.J., Ehrlich, P.R. 1986. Euphydryas anicia (Lepidoptera: Nymphalidae) utilization of iridoid glycosides from Castilleja and Besseya (Scrophulariaceae) host plants. J. Chem. Ecol. 12, 1459-1468.

Stermitz, F.R., Ianiro, T.T., Robinson, R.D., Gardner, D.R. 1991. 6-O-Acetylmelittoside and other iridoids from Castilleja species. J. Nat. Prod. 54, 626-628.

Stermitz, F.R., Pomeroy, M. 1992. Iridoid Glycosides from Castilleja purpurea and C. indivisa, and Quinolizidine Alkaloid Transfer from Lupinus texensis to C. indivisa via Root Parasitism. Biochem. Syst. Ecol. 20, 473-475.

Tanaka, N., Tanaka, T., Fujioka, T., Fujii, H., Mihashi, K., Shimomura, K., Ishimaru, K. 2001. An ellagic compound and iridoids from Cornus capitata root cultures. Phytochemistry. 57, 1287-1291.

Tank, D.C., Egger, J.M., Olmstead, R.G. 2009. Phylogenetic classification of subtribe Castillejinae (Orobanchaceae). Syst. Bot. 34, 182-197.

Tasdemir, D., Guner, N., Perozzo, R., Brun, R., Donmez, A., Calis, I., Ruedi, P. 2005. Anti-protozoal and plasmodial FabI enzyme inhibiting metabolites of roots. Phytochemistry. 66, 355-362.

Thorne, R.F. 2000. The classification and geography of the flowering plants: dicotyledons of the class angiospermae (subclasses Magnoliidae, Ranunculidae, Caryophyllidae, Dilleniidae, Rosidae, Asteridae, and Lamiidae). Bot. Rev. 66, 441-647.

88

Tomilov, A.A., Tomilova, N.B., Abdallah, I., Yoder, J.I. 2005. Localized hormone fluxes and early haustorium development in the hemiparasitic plant Triphysaria versicolor. Plant Physiol. 138, 1469-1480.

Trejo-Tapia, G., Rosas-Romero, G., López-Laredo, A.R., Bermúdez-Torres, K., Zamilpa, A. 2011. In vitro organ cultures of the cancer herb Castilleja tenuiflora Benth. as potential sources of iridoids and antioxidant compounds. In: Orhan, I. (Ed.), Biotechnological Production of Plant Secondary Metabolites. Bentham Science Publishers Ltd, pp. 1-21.

Villaseñor, I.M. 2007. Bioactivities of Iridoids. Anti-Inflamm Anti-Allergy Agents. 6, 307-314.

Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M. 1996. Plant drug analysis. A thin layer chromatography atlas. Springer-Verlag, Germany. pp. 384.

Wesselingh, R.A., van Groenendael, J.M. 2005. The biology of non-weedy hemiparasitic Orobanchaceae: synthesis and perspectives. Folia Geobot. 40, 311-318.

Wurst, S., Dugassa-Gobena, D., Scheu, S. 2004. Earthworms and litter distribution affect plant-defensive chemistry. J. Chem. Ecol. 30, 691-701.

Wurst, S., Wagenaar, R., Biere, A., van der Putten, W. 2010. Microorganisms and nematodes increase levels of secondary metabolites in roots and root exudates of Plantago lanceolata. Plant Soil. 329, 117-126.

Wysokinska, H., Rozga, M. 1998. Establishment of transformed root cultures of Paulownia tomentosa for verbascoside production. J. Plant Physiol. 152, 78-83.

Wysokinska, H., Skrzypek, Z. 1992. Studies on iridoids of tissue cultures of Penstemon serrulatus: isolation and their antiproliferative properties. J. Nat. Prod. 55, 58-63.

Yoshikawa, M., Matsuda, H., Morikawa, T., Xie, H., Nakamura, S., Muraoka, O. 2006. Phenylethanoid oligoglycosides and acylated oligosugars with vasorelaxant activity from Cistanche tubulosa. Bioorg. Med. Chem. 14, 7468-7475.

Zuzarte, M.R., Dinis, A.M., Cavaleiro, C., Salgueiro, L.R., Canhoto, J.M. 2010. Trichomes, essential oils and in vitro propagation of Lavandula pedunculata (Lamiaceae). Ind. Crop. Prod. 32, 580-587. Biblioteca digital de la medicina tradicional Mexicana [en línea]. 2009. Atlas de las plantas de la medicina tradicional Mexicana. Dirección URL: <http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964>. [consulta: Junio de 2011]

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Gara%C3%B1ona_o_cola_de_borrego&id=7964

89

ANEXO 1. Espectro de RMN 1H (400 Hz) del bartsiósido (T19b)

90

ANEXO 2. Espectro de RMN 1H (400 Hz) de la aucubina (fracción T22a)

91

ANEXO 3. Espectro de 1H–1H NOESY (400 Hz) del verbascósido

92

ANEXO 4. Espectro de 1H–13C HSQC (400 Hz) del verbascósido

93

ANEXO 5. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuestos aislados de la fracción

C4R2 (posible feniletanoide glicosilado)

94

ANEXO 6. Espectro de RMN 1H (300 Hz) de compuesto aislado de la fracción

C4R4 (posible feniletanoide glicosilado)

95

ANEXO 7. Cromatograma de HPLC del extracto metanolico del tallo de C.

tenuiflora

Apigenina

96

ANEXO 8. Artículo publicado con los resultados de la presente tesis

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