INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGÍA

TESIS

Presentada para obtener el grado de

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

por

I.Q.I. Mariana Margarita Alonzo Durán

TRATAMIENTO DE UN SUELO CONTAMINADO CON PLAGUICIDAS POR

LAVADO ASISTIDO CON SURFACTANTES NATURALES

Y TRATAMIENTO BIOLÓGICO DE LAS AGUAS GENERADAS

Dirigida por:

Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos

Dra. Elvia Inés García Peña

Marzo, 2015.

ii

iii

iv

v

RESUMEN

La contaminación del suelo se debe a que diversos tipos de sustancias que se depositan en él,

ocasionando un deterioro de las funciones del suelo. El uso de grandes cantidades de

plaguicidas en la agricultura constituye un riesgo potencial para la contaminación del suelo ya

que son de las sustancias de mayor uso a nivel mundial. Por ello es de suma importancia el

desarrollo de tecnologías para la remediación de los suelos que incluyan métodos prácticos y

viables para lograr la remoción exitosa de los contaminantes presentes. El lavado de suelo es

una técnica de tratamiento versátil que puede ser utilizada para remover los contaminantes

utilizando una solución acuosa para la remoción de los contaminantes. En este trabajo se

desarrolló de un sistema para la remoción de plaguicidas organoclorados por medio del Lavado

de Suelos Asistido por Surfactantes (LSAS) acoplado con un tratamiento para el agua residual

generada por medio de un Biofiltro Aerobio Sumergible (BAS); de igual forma, se llevaron a

cabo estudios acerca de las poblaciones microbianas involucradas durante el proceso. En las

muestras de suelo obtenidas del Ejido de la Finca, Estado de México, se detectaron tres

plaguicidas organoclorados: DDT, DDE y DDD. Para el proceso de LSAS el biopilomero que se

utilizó fue HPTAC-guar a una dosis del 0.05% ya que obtuvo los mejores resultados. En el BAS

Las velocidades de degradación de DDT alcanzadas estuvieron entre 6.5 y 22.5 mg DDT/Ld para

los tratamientos con concentraciones iniciales de 500 ppm y 100 ppm respectivamente.

Adicionalmente se realizó la pirosecuenciación del soporte de tezontle del BAS y se corroboro la

presencia de bacterias como Pseudomona fluorecens, Klebsiela pneumonia, Comamonas

aquatica entre otras. Así se comprueba que el acoplamiento del LSAS con un BAS inoculado con

los microorganismos del suelo contaminado es un proceso eficiente para lograr la remoción de

DDT de un suelo contaminado.

vi

ABSTRACT

Soil contamination is caused because various types of substances deposited on it, causing a

deterioration of the soil functions. Using large amounts of pesticides in agriculture is a potential

risk to soil contamination because they are the substances most commonly used worldwide.

For this reason is therefore important to develop technologies for the remediation of soils that

include practical and viable methods for successful removal of contaminants. Soil washing is a

versatile processing technique that can be used to remove contaminants using an aqueous

solution to remove contaminants. In this work we developed a system for the removal of

organochlorine pesticides through Surfactant Enhanced Soil Washing (SESW) coupled with a

biological treatment for wastewater generated by an Aerobic Biofilter; likewise, were carried

out studies on microbial populations involved in the process. In soil samples obtained from

Ejido Finca, State of Mexico, three organochlorine pesticides were detected: DDT, DDE and

DDD. For the SESW process the gum used was HPTAC-guar at a concentration of 0.05% since it

obtained the best results. The Aerobic Bioilter in DDT degradation rates were achieved are

between 6.5 and 22.5 mg DDT/Ld in treatments for initial concentrations of 500 ppm and 100

ppm respectively. Additionally pyrosequencing from tezontle was performed and the presence

of bacteria such as Pseudomonas fluorescens, Klebsiela pneumonia, Comamonas aquatica and

others were corroborated. Thus it is found that the coupling of a SESW with an Aerobic Biofilter

inoculated with microorganisms of contaminated soil is to achieve an efficient removal of

contaminated soil DDT process.

vii

PRODUCTOS DERIVADOS DE ESTA TESIS

Carteles en congresos u otras reuniones científicas.

Alonzo-Durán, M. M.; Rodríguez, R.; Torres, L.; (2013) Remediación de un suelo

contaminado con plaguicidas por lavado asistido con surfactantes naturales y

tratamiento biológico de las aguas generadas. III Foro de Biotecnología UPIBI, IPN.

Alonzo-Durán, M. M.; Rodríguez, R.; Torres, L.; (2014) Remediación de un suelo

contaminado con plaguicidas por lavado asistido con surfactantes naturales y

tratamiento biológico de las aguas generadas. II Semana de la Ciencia UPIBI, IPN.

Exposiciones en Congresos u otras reuniones científicas con resumen publicado in extenso.

Alonzo-Durán, M. M.; Villanueva, R.; Torres, L.; (2013) Ponencia: Caracterización en el

contenido de plaguicidas organoclorados y organofosforados de un suelo agrícola

localizado al sur del Estado de México. III Simposio Nacional de Plaguicidas: Impactos y

Perspectivas.

Alonzo-Durán, M. M.; Rodríguez, R.; Torres, L. (2014) Presentación: Remediación de un

suelo contaminado con plaguicidas por lavado asistido con surfactantes naturales y

tratamiento biológico de las aguas generadas. XXXV Encuentro Nacional de la AMIDIQ.

Alonzo-Durán, M. M.; Rodríguez, R.; Torres, L. (2014) Resumen in extenso: Remediación

de un suelo contaminado con plaguicidas por lavado asistido con surfactantes

naturales y tratamiento biológico de las aguas generadas. Memorias del XXXV

Encuentro Nacional de la AMIDIQ. ISBN 978-607-95593-2-8. pp. 571-575.

viii

Agradecimientos

A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología y al Instituto Politécnico Nacional.

Al apoyo financiero brindado por el Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)

dentro del marco de Becas Nacionales de Posgrado, así como al Programa de Formación de

Investigadores (PIFI).

Al Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos por el apoyo, confianza y amistad que me ha brindado.

A la Dra. Elvia Inés García Peña por todos los consejos, enseñanzas y tiempo dedicado.

Para los que ayudaron directamente en la realización de este proyecto: a la Dra. Refugio

Rodríguez, Alejandro Islas y Natalia Tapia del CINVESTAV por permitirme trabajar en sus

instalaciones y por la capacitación técnica recibida.

A la maestra Sandra García por sus explicaciones detalladas acerca de los métodos

cromatográficos y apoyo técnico para la realización de este trabajo.

A la alumna y amiga Andrea Sánchez por ayudarme de forma invaluable en la parte molecular

de este proyecto y por permitirme aprender de ella.

A los miembros del comité tutorial, profesores y el personal administrativo de la maestría que

ayudaron a mi formación. A los compañeros del Laboratorio de Bioprocesos y mis compañeros

de maestría que hicieron mis días de clases y experimentación más divertidos y llevaderos.

A Ehus Sanguino y Fausto Alfaro por aguantar largas y tediosas conversaciones (de mucho y

nada al mismo tiempo), por sus consejos, su ayuda incondicional y, sobre todo, el valioso

tiempo que dedicaron a la crítica de este trabajo.

A los Ciudadanos Comprometidos y mis amigos PUMAS por apoyar la causa, por estar siempre a

disposición de salvar el planeta con acciones y convicción, demostrándome que poco a poco se

logran grandes diferencias, darme ánimos para seguir adelante; también por darme otra

perspectiva al respecto de este trabajo.

A Laura Carrillo y Rosa Vázquez por aguantar las buenas, malas y peores de una compañera y

amiga tan complicada como yo.

A los que de alguna forma me ayudaron en la realización de este proyecto sin tener ninguna

obligación en ello: MUCHAS GRACIAS.

ix

Dedicatoria

Dedico esta tesis a todos aquellos amigos, compañeros y maestros que han sido parte

importante de mi vida y han sido ejemplo a seguir.

A la Dra. Carmen Ponce y Dr. German Giacoman por todas sus enseñanzas

invaluables, su amistad, su apoyo incondicional y la confianza que depositaron en

mí durante mi estancia en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental de FIUADY.

A ni nana Imelda y a mis padrinos Jorge y Jovita por estar junto a nosotras,

aconsejarnos, cuidarnos y apoyarnos incondicionalmente en todo momento. La

lealtad nos hace familia.

A mi hermana Julia por ser solo como ella sabe ser, por las conversaciones

interesantes y por su exceso de confianza. Gracias por entenderme.

A mi hermana Lucy por estar siempre pendiente de su hermana, extrañarme y ser la

hermana mayor cuando no estoy. Gracias por quererme.

A mi mamá por luchar siempre por nosotras y por nuestro bienestar, por ser lo mejor

que tengo. Gracias por todo lo que significas en mi vida.

A mi papá a quien siempre extraño y extrañaré. Gracias por haber sido mi papá.

“Hermoso es lo que vemos. Más hermoso es lo que sabemos.

Pero mucho más hermoso es lo que no conocemos”

Niels Steensen

x

Contenido

Índice de figuras ......................................................................................................................................... xii

Índice de Tablas ..........................................................................................................................................xiii

1. Introducción .......................................................................................................................................... 1

2. Antecedentes ........................................................................................................................................ 2

2.1 El Suelo y su importancia .............................................................................................................. 2

2.2 Contaminación del suelo ............................................................................................................... 3

2.3 Plaguicidas ..................................................................................................................................... 4

2.3.1 DDT y sus metabolitos........................................................................................................... 7

2.4 Contaminación del suelo por plaguicidas ..................................................................................... 8

2.5 Tecnologías desarrolladas para la remoción de contaminantes del suelo ................................. 11

2.5.1 Tratamientos Fisicoquímicos .............................................................................................. 12

2.5.2 Tratamientos Biológicos ...................................................................................................... 13

2.5.3 Acoplamiento de sistemas de tratamiento ......................................................................... 13

2.6 Lavado de Suelo Asistido con Surfactantes (LSAS)...................................................................... 14

2.6.1 Surfactantes ........................................................................................................................ 15

2.7 Tratamiento de efluentes por Biofiltro Aerobio Sumergido (BAS) ............................................. 17

3. Justificación ......................................................................................................................................... 22

4. Hipótesis.............................................................................................................................................. 23

5. Objetivos ............................................................................................................................................. 24

5.1 Objetivo general ................................................................................................................................ 24

5.2 Objetivos específicos......................................................................................................................... 24

6. Metodología ........................................................................................................................................ 25

6.1 Etapa 1: Selección y caracterización de un suelo contaminado con plaguicidas........................ 25

6.2 Etapa 2: Identificación del surfactante y dosis óptimas a utilizar en el lavado de suelo ............ 25

6.3 Etapa 3: Lavado de suelo a escala 10 L y caracterización del agua residual generada durante el

lavado de suelo. ...................................................................................................................................... 26

6.4 Etapa 4: Inoculación, operación y caracterización microbiológica del BAS ................................ 27

7 Resultados y discusión ........................................................................................................................ 30

7.1 Etapa 1: Selección y caracterización de un suelo contaminado con plaguicidas........................ 30

xi

7.2 Etapa 2: Identificación del surfactante y dosis óptimas a utilizar en el lavado de suelo ............ 34

7.3 Etapa 3: Caracterización del agua residual generada durante el lavado de suelo ..................... 38

7.4 Etapa 4: Inoculación, operación y caracterización microbiológica del biofiltro ......................... 39

8 Conclusiones. ...................................................................................................................................... 53

9 Bibliografía ............................................................................................................................................. 55

10 Anexos ............................................................................................................................................. 59

ANEXO A .................................................................................................................................................. 59

ANEXO B .................................................................................................................................................. 60

ANEXO C .................................................................................................................................................. 61

ANEXO D .................................................................................................................................................. 62

ANEXO E .................................................................................................................................................. 65

xii

Índice de figuras

Figura 1: Complejidad del suelo (Valencia, et al., 2001). .............................................................................. 2

Figura 2: Clasificación de Plaguicidas (Calva y Torres, 2008). ....................................................................... 5

Figura 3: Estructura del DDT; •Carbono, ○Hidrógeno, • Cloro (Elaboración propia) ................................... 7

Figura 4: DDT y sus metabolitos principales (Ryan, 1995) ............................................................................ 8

Figura 5: Dinámica de los plaguicidas presentes en el suelo (Readaptación de Andreu y colaboradores

(2004) y Towhid (2014); elaboración propia). .............................................................................................. 9

Figura 6: Diversas cargas en los surfactantes (Riojas et al., 2011). ............................................................ 15

Figura 7: Estructuras moleculares de las gomas utilizadas comúnmente en el LSAS, ................................ 17

Figura 8: Biopelícula a) Características (elaboración propia), .................................................................... 18

Figura 9: Ruta propuesta para la degradación de DDT por bacterias (Rochkind et al., 1987) ................... 20

Figura 10: Ruta de degradación de DDT propuesta para Pseudomonas spp .............................................. 20

Figura 11: Ruta de degradción de DDT que sigue Alcaligenes spp (Adaptado de Latha, 2012). ................ 21

Figura 12: Cultivos de fresa del sitio de estudio. ........................................................................................ 30

Figura 13: Puntos de muestro del sitio de estudio. .................................................................................... 31

Figura 14: Remociones de plaguicida para M001 con los distintos surfactantes utilizados....................... 34

Figura 15: remociones de plaguicida para M003 con los distintos surfactantes utilizados ....................... 35

Figura 16: Dosis de surfactante a utilizar. ................................................................................................... 36

Figura 17: Medición de las tensiones superficiales. ................................................................................... 37

Figura 18: Remoción con respecto a la Tensión Superficial Final ............................................................... 38

Figura 19: DQO/DQO0 vs tiempo del proceso. ............................................................................................ 40

Figura 20: % de remoción de DQO de las diferentes condiciones de agua generada. ............................... 40

Figura 21: DDT/DDT0 vs tiempo del proceso............................................................................................... 41

Figura 22: % de remoción de DDT de las diferentes condiciones de agua generada. ................................ 42

Figura 23: Gráfico de velocidad de degradación de DDT vs Concentración inicial de DDT ........................ 43

xiii

Índice de Tablas

Tabla 1: Características generales de plaguicidas ......................................................................................... 6

Tabla 2: Límites máximos de plaguicidas presentes en suelo (mg/kg) ....................................................... 11

Tabla 3: Medidas para la remediación de suelos (Meuser, 2013) .............................................................. 12

Tabla 4: Tipos de contaminantes factibles de remover por LSAS. .............................................................. 14

Tabla 5: Plaguicidas encontrados en los diversos puntos de muestreo ..................................................... 31

Tabla 6: Caracterización Fisicoquímica del Suelo ....................................................................................... 33

Tabla 7: Cuadro de comparación con otro estudios realizados .................................................................. 33

Tabla 8: Caracterización del Agua Residual generada ................................................................................ 39

Tabla 9: Porcentajes y velocidades de degradación (* Calculados a 5 días). ............................................. 42

1

1. Introducción

Desde el desarrollo de la agricultura se ha utilizado el suelo como un recurso natural invaluable

como proveedor de alimentos, así como de asentamientos de ciudades. Sin embargo, el

desarrollo industrial y el aumento de la población han ocasionado un incremento en las

emisiones de los diversos contaminantes hacia el medio ambiente, afectado de manera

significativa pero sin parecer impactar al suelo.

La contaminación del suelo, ya sea rural o urbano, puede darse por múltiples factores; un

ejemplo de esta situación en los suelos urbanos es que, como resultado del aumento de

construcciones, diversos tipos de partículas que se dispersan y, eventualmente, se depositan

nuevamente en él, así como la infraestructura de diversas industrias e instalaciones de tuberías.

En el caso de los suelos rurales que se usan para la agricultura (Lal, 2009), los factores que

tienen mayor impacto ambiental son la aplicación de fertilizantes, plaguicidas y lodos

provenientes de procesos de tratamientos de aguas. También es posible encontrar suelos

rurales contaminados debido a la presencia de minas y canteras de extracción (Meuser, 2010).

Es por esta razón que actualmente resulta de mucha importancia el desarrollo de tecnologías

para la remediación de los suelos que incluyan diversos métodos para lograr la remoción y

tratamiento exitoso de los contaminantes presentes. Es importante destacar que el tratamiento

que se utilice dependerá del tipo de suelo, tipo de contaminante y los costos implicados en el

proceso para aplicar el proceso de remediación.

En este trabajo se presenta el desarrollo de un sistema para la remoción de plaguicidas

organoclorados (DDT y sus metabolitos DDE y DDD) por medio del Lavado de Suelos Asistido

por Surfactantes (LSAS), con la finalidad de extraer el contaminante del suelo. Así como el

tratamiento del agua residual generada durante este proceso por medio de un tratamiento

biológico por un Biofiltro Aerobio Sumergible (BAS), esto para promover la degradación del

contaminante de una manera satisfactoria. Adicionalmente se llevaron a cabo estudios acerca

de las poblaciones microbianas involucradas durante el proceso, con el objetivo de conocer a

los microrganismos responsables de la degradación de los contaminantes.

2

2. Antecedentes

2.1 El Suelo y su importancia El suelo es uno de los recursos naturales más valiosos del mundo. Es esencial para todas las

formas de vida en este planeta ya que provee una matriz física, entorno químico, biológico y

posee la capacidad de proporcionar y ajustar las cantidades de agua, de nutrientes, aire y de

intercambio de calor para los organismos (Rosewell, 1999). Éste se puede definir como un

cuerpo natural formado por la alteración de las rocas presentes en la superficie terrestre,

sometidas a la actividad física, química y de los organismos vivos en un periodo prolongado de

tiempo (Ortiz et al., 2007). Estas características hacen del suelo un sistema altamente complejo,

como se muestra en la Figura 1, donde se puede observar que existen diversos materiales que

lo componen además de los espacios porosos, así como gases y líquidos, así se forman

interfaces sólido-líquido y líquido-gas donde, en general, se encuentran los microorganismos.

FIGURA 1: COMPLEJIDAD DEL SUELO (VALENCIA, ET AL., 2001).

El suelo es un recurso fundamental para la humanidad ya que suministra prácticamente todos

los alimentos que sostienen la población y proporciona el ecosistema de apoyo a la vida ya que

en él influyen los procesos hidrológicos y biogeoquímicos; regulan el intercambio de material,

energía, agua y gas en el sistema litosfera-hidrosfera y la biosfera-atmósfera (Anderson, 2010).

También es un recurso clave en el progreso humano ya que cuenta con la capacidad para

3

desarrollar una serie de funciones esenciales en la naturaleza de carácter medioambiental,

ecológico, económico y social (Ortiz et al., 2007).

Aproximadamente el 96% de la alimentación humana se obtiene a partir del suelo (Pimentel et

al., 1989). En este contexto se ha de tener en cuenta que no todos los suelos agrícolas son

fértiles y productivos. Lal (2009) estimó que, para que una población sea capaz de mantener un

nivel aceptable de sustento, se requieren de alrededor de 0,5 hectáreas de cultivo per cápita,

situación que, en la mayor parte de los países, no es posible de cubrir. La mala gestión y el mal

uso han degradado ya mayor parte del suelo productivo alrededor de todo el mundo.

Como recurso natural es clasificado como no renovable en comparación con el tiempo de la

vida humana (Lal, 2009) y, por tanto, es susceptible a que se desequilibre o deteriore por

diversos factores como los ciclos naturales terrestres o la contaminación.

La degradación del suelo es un proceso que disminuye su capacidad potencial para producir,

cuantitativa y cualitativamente, bienes y servicios, teniendo un desequilibrio de sus funciones

biogeoquímicas. Forma parte imprescindible en el desarrollo económico en países que son

grandes productores de alimentos. El uso de diversos agroquímicos, entre los que destacan en

cantidad los plaguicidas, constituye un riesgo potencial para su contaminación y la pérdida de

sus funciones fundamentales. Oldeman et al., (1991) sugieren que alrededor del 17% de la

superficie terrestre del planeta está degradada por la intervención humana. Las consecuencias

de la degradación de la tierra no sólo afectan el rendimiento de la tierra para la alimentación y

la producción de recursos, sino que también tienen graves consecuencias para el medio

ambiente.

2.2 Contaminación del suelo

La contaminación del suelo puede ser definida como la acumulación de una sustancia, ya sea

nativa o introducida, a un nivel perjudicial para el crecimiento y salud de los organismos

presentes en él, desde microorganismos hasta plantas y animales. Las sustancias consideradas

como contaminantes que se pueden encontrar son diversas y, en general, dependerán de la

actividad productiva a la que se encuentra sometido el suelo. La acumulación del contaminante

ocurre generalmente como consecuencia de actividades humanas (Towhid, 2014).

4

El suelo ejerce una función de protección natural de regulación de la contaminación ya que las

propiedades fisicoquímicas y biológicas controlan en gran medida los ciclos biogeoquímicos

superficiales, actuando como un reactor complejo que sirve de elemento protector de otros

medios más sensibles frente a los contaminantes (Meuser, 2013). Esto se realiza a través de

reacciones de complejación, reacciones de adsorción y desorción, reacciones de precipitación y

disolución, reacciones de óxido-reducción, reacciones ácido-base y reacciones derivadas de

procesos metabólicos. Todas estas reacciones están estrechamente controladas por

propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo como su textura, estructura, porosidad,

capacidad de intercambio catiónico, pH y la actividad microbiológica. Cuando esta capacidad se

supera, el suelo deja de ser eficaz como contención de la contaminación, pudiéndose dar el

caso de invertirse el proceso y a convertirse en una fuente de contaminación para los

organismos del suelo y para el medio que le rodea (Ortiz et al., 2007).

Es importante aclarar que distintos tipos de suelo van a reaccionar de forma diferente ante la

presencia de un mismo contaminante aun siendo la misma cantidad. Esta reacción estará

condicionada por factores que representen el grado de sensibilidad del suelo frente a la

agresión del o de los contaminantes y que está muy relacionada con autorregulación del suelo.

Así, la vulnerabilidad de diversos tipos de suelo frente a la contaminación depende no solo de la

intensidad de la contaminación, sino también de la velocidad con que se producen los cambios

negativos en las propiedades del mismo en respuesta a esa contaminación (Volke et al., 2002).

También es necesario considerar la biodisponibilidad del contaminante o su posible asimilación

por los organismos presentes en del suelo, la movilidad y la persistencia. Los agentes

potencialmente contaminantes del suelo están fundamentalmente asociados a residuos

derivados de actividades industriales, mineras, agrícolas y ganaderas (Ortiz et al., 2007). Las

categorías de mayor importancia en los contaminantes del suelo son: Compuestos orgánicos

persistentes, metales pesados e hidrocarburos.

2.3 Plaguicidas

Una plaga es un organismo vivo que se degrada la salud, el valor, utilidad o condición de otro

organismo, una estructura o un lugar (Towhid, 2014). Pueden ser plantas, hongos, algas,

5

animales vertebrados, invertebrados o microorganismos tales como bacterias, mohos, lodos, y

hongos, para su control se utilizan en consecuencia los plaguicidas. De acuerdo a la

Organización Mundial de la Salud (OMS), los plaguicidas son definidos como compuestos

químicos que se utilizan para matar las plagas, incluidos insectos, roedores, hongos y plantas no

deseadas. Ellos pueden ser naturales o productos químicos sintéticos, mezclas de éstos, o los

mismos organismos vivos que actúan como agentes de control biológico.

Los plaguicidas pueden ser clasificados de diversas formas, siendo una de las más aceptadas la

que se muestra en la Figura 2. En agricultura los plaguicidas se conocen mayormente de

acuerdo a su organismo que controla. El uso de plaguicidas en la agricultura ha ido en constante

aumento durante las últimas décadas.

Los plaguicidas ofrecen una variedad de beneficios a la sociedad en el sector agrícola, como son

el incremento de la producción de los cultivos y el combate de las infestaciones de insectos

(Tennefy, 2008), y en el sector salud para el control de algunas enfermedades causadas por

vectores, como la malaria y el paludismo; es por esto que su uso ha ido aumentando en las

últimas décadas.

México es el mayor consumidor de plaguicidas para el sector agrícola en Latinoamérica. La

aplicación intensiva de plaguicidas sintéticos se inició en el país en 1948, con la introducción de

Organismo que controla

•Insecticida

•Bactericida

•Fungicida

•Antibiotico

•Herbicida

•Rodenticida

Modo de acción

•Por contacto

•sistémico

•fumigante

•repelente

Composición química

•Organicos•Organoclorados

•Carbamatos

•Organofosforados

•Inorganicos

•Biológicos

FIGURA 2: CLASIFICACIÓN DE PLAGUICIDAS (CALVA Y TORRES, 2008).

6

diclorodifeniltriclorometano (DDT) y, posteriormente, con la aparición de otros plaguicidas

organoclorados (Albert, 2005). Desde entonces se han incrementado los usos y diversidad de

plaguicidas comerciales. La cantidad real de plaguicidas que se aplican a los cultivos no se

conocen con certeza, pero algunas estimaciones realizadas indican que se consume un

aproximado de 50,000 toneladas anuales. De acuerdo a Albert (2006), el 70% del DDT usado en

México se concentran en las los estados de Colima, Puebla, Sinaloa y Veracruz.

TABLA 1: CARACTERÍSTICAS GENERALES DE PLAGUICIDAS

Tipos de plaguicida Características Ejemplos

Organoclorados

Solubles en lípidos se acumulan en los tejidos

grasos de los animales, son transferidos a través

de la cadena alimentaria, tóxicos para gran

variedad de animales; persistentes a largo plazo.

DDT, aldrín, lindano

mirex.

Organofosforados

Solubles en agua, se infiltran hasta alcanzar las

aguas subterráneas; menos persistentes que los

organoclorados; son absorbidos por las plantas.

Malatión, paratión.

Carbamatos

Derivados de los ácidos carbamáticos, matan a un

espectro limitado de insectos pero son altamente

tóxicos en vertebrados, su persistencia es

relativamente baja.

Servin, carbaril.

En la cuestión de salud, datos de la OMS (2012) revelan que la toxicidad relacionada con el

manejo y aplicación de plaguicidas se ve relacionado con aproximadamente 37,000 casos de

cáncer anuales en el mundo. En México, los efectos a la salud de tipo agudo son, de manera

general, los más considerados en comparación con los de exposición prolongada. Sin embargo,

en las últimas dos décadas han tomado importancia los efectos crónicos debidos a la exposición

de plaguicidas y por ello se ha prohibido su uso desde el año 2002 (Fernandez et al., 2004).

El Instituto de Medicina Forense del Estado de Veracruz ha realizado diversos estudios

relacionados con los efectos de los plaguicidas en la salud y ha llevado a cabo un monitoreo

permanente de los niveles de plaguicidas en los habitantes de diversas zonas cercanas. Estos

7

investigadores encontraron que la población mostró niveles altos de plaguicidas en sangre y

tejido adiposo, en comparación con los habitantes que no se encuentran cercanos a la zona

(Waliszewski et al., 1995). Otros estudios han revelado la presencia de plaguicidas en mujeres

con carcinoma mamario, encontrando una clara correlación entre los niveles de plaguicidas

presentes en sangre y tejido adiposo contra la enfermedad desarrollada (Waliszenwski et al.,

2003).

2.3.1 DDT y sus metabolitos

Los plaguicidas organoclorados son considerados altamente persistentes porque son

estructuralmente estables en el medio ambiente y pueden resistir a la degradación. Esta

capacidad de los plaguicidas organoclorados les confiere la cualidad de ser eficaces y, como

consecuencia, ampliamente utilizados.

El DDT, representado en la Figura 3, es un plaguicida organoclorado, considerado como

insecticida, que fue utilizado de forma exhaustiva para actividades agrícolas y el control de

vectores a partir de la década de los 40. Estructuralmente es altamente estable por la presencia

de los anillos aromáticos además de su alto contenido de cloros, haciendo de esta molécula un

FIGURA 3: ESTRUCTURA DEL DDT; •CARBONO, ○HIDRÓGENO, • CLORO (ELABORACIÓN PROPIA)

8

compuesto muy persistente, teniendo hasta periodos entre 10 y 20 años para su

mineralización, ya que sus metabolitos son igualmente persistentes (Wijeyaratne, 1993). Es por

esto que la exposición a estos puede llegar a ser crónica.

El DDT y sus metabolitos han llegado a identificarse en todas los compartimientos ambientales

(agua, aire, suelo, sedimentos) y en todas las regiones; son compuestos que se biomagnifican y

bioacumulan una vez que ha entrado dentro de la cadena trófica (Calou, 1993). La degradación

inicial del DDT ocurre generalmente por las 3 rutas distintas (Figura 4), donde se involucra un

ataque directo a la porción alifática del compuesto. Los metabolitos mayoritarios son el DDD

para la vía anaerobia, DDE para la vía aerobia, y dicofol.

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

ClCl

Cl Cl

ClCl

Cl Cl

OH

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

DDD

DDE

Dicofol

Deshidrodecloración

Oxidación

Decloración

reductiva

FIGURA 4: DDT Y SUS METABOLITOS PRINCIPALES (RYAN, 1995)

2.4 Contaminación del suelo por plaguicidas

La contaminación generada por el uso indiscriminado de plaguicidas ha demostrado ser un

problema no únicamente de salud, sino también medioambiental, ya que en su mayor

proporción son contaminantes altamente persistentes en el ambiente. La Organización de

Naciones Unidas (ONU) ha estimado que sólo el 1% de los componentes activos presentes en

9

los plaguicidas usados en la agricultura, realizan la función de control de plagas, mientras que el

resto se dispersa por diversas vías en el ambiente.

Debido a sus características químicas, son un tipo de contaminante que ha demostrado tener

resistencia variable a la degradación fotoquímica, química o biológica con tendencia a persistir

en diversos compartimientos ambientales (Albert, 1998). En ese sentido, el suelo es

gravemente afectado teniendo en consecuencia el deterioro, la disminución de su actividad,

fertilidad y es el puente de contaminación hacia los cultivos. Por estas razones, es necesario

contar con métodos y tecnologías de tratamiento efectivos para remover y degradar los

plaguicidas presentes en suelos contaminados.

Dinámica de

plaguicidas

Absorción por

plantas

Degradación

fotoquímicaAcumulación en el suelo

Depositación

atmosférica

Volatilización

BiodegradaciónLixiviación

Asimilación

microbiana

Movilidad de cultivos y

plagas

Difusión

Erosión e

infiltración

FIGURA 5: DINÁMICA DE LOS PLAGUICIDAS PRESENTES EN EL SUELO (READAPTACIÓN DE ANDREU Y

COLABORADORES (2004) Y TOWHID (2014); ELABORACIÓN PROPIA).

En la Figura 5 se presenta la dinámica general de los plaguicidas una vez que se han dispuesto

en el suelo. Las formas más importantes de propagación de los plaguicidas en el ambiente son

la erosión o infiltración y la volatilización por la acción del viento. La dispersión por infiltración

contamina el suelo debajo del lugar de almacenamiento y eventualmente puede también

contaminar las aguas subterráneas y superficiales. Por su parte, la volatilización por la acción

10

del viento contamina la superficie de la zona circundante (FAO, 2012). Los residuos de

plaguicida en el aire pueden existir en forma gaseosa o ser enlazados o atrapados por las

partículas en suspensión (Jantunen et al., 2000).

Adicionalmente, se ha reportado que el cambio climático contribuye en cierta medida la

movilidad de los plaguicidas, ya que la plagas tienden a extender o moverse de su entorno

natural, ocasionando que en una zona determinada, se tenga que usar otro tipo de plaguicidas

para su control (Chen et al., 2001). Los cultivos agrícolas también participan en el movimiento

de aquellos plaguicidas que son aplicados para su protección, ya que las plantas son

susceptibles de retenerlos en diversas partes de su estructura (tallo, hojas y frutos) (Bro-

Ramunsen, 1996).

En México se ha demostrado la existencia de contaminación ambiental por residuos de

plaguicidas organoclorados y organofosforados (Waliszewski et al., 2003; Wong et al., 2008;

Cantú et al., 2011). Los plaguicidas presentes en el aire son absorbidos por las plantas mientras

que los que se encuentran en el suelo se movilizan mediante el transporte activo interno,

permitiendo su acumulación especifica en las semillas (Waliszenwski et al., 2003).

Se han desarrollado diversas normatividades en varias partes del mundo, pero existe muy poca

información con respecto a las cantidades y distribuciones que existen en diversos países; a

pesar de ello, se conocen algunos límites máximos permisibles de diversos plaguicidas, en

particular en las algunas regiones y ciudades de Estados Unidos, España, Canadá y Chile (Tabla

2). Se puede observar que pertenecen a diversos tipos de suelos (clasificados en Residencial,

Urbano, Industrial y Agrícola) y es importante recalcar entre los diferentes tipos de plaguicidas

considerados en ellos así como la diferencia de valores considerados como los máximos, esto se

observa claramente al comparar los suelos industriales, donde Canadá tiene un límite máximo

de 12 mg/kg, mientras que el de España es de 219 mg/kg y Estados Unidos de 7004 mg/kg.

Chile tiene la restricción más fuerte en sus suelos agrícolas con un máximo de 0.56 mg/kg.

11

TABLA 2: LÍMITES MÁXIMOS DE PLAGUICIDAS PRESENTES EN SUELO (mg/kg)

Compuesto

USA España Canadá Chile

Regiones 3,6 y 9 New York

Residencial Industrial NR Urbano Industrial Residencial Industrial Agrícola

HCB 0.3 1.1 0.1 1

α-HCH 0.077 0.27 0.11 0.1 1

β-HCH 0.27 0.96 0.2 0.1 1

Lindano 0.52 2.1 0.06 0.1 1

Clordano 0.54 0.1 1

Heptacloro 0.11 0.38 0.1

Aldrin 0.029 0.1 0.041 0.1 1 0.02

Endrin 18 180 0.1 0.1 1

Dieldrin 0.003 0.11 0.044 0.1 1 0.02

DDT (Total) 0.1 1 0.7 12 0.5

p,p DDT 1.7 7 2.1

p.p DDD 2 7.2 2.9 2 20

p,p DDE 1.4 5.1 2.1 7 70 0.02

Endosulfan (Total) 370 3700 6 60

Endosulfan I 0.9 6 60

Endosulfan II 0.9

Endosulfan sultato 1

Metoxicloro 310 3100

Mirex 0.027 0.096

Totales 704.436 7004.416 11.095 21.9 219 0.7 12 0.56

La ausencia de legislación acerca de la contaminación por plaguicidas en suelos es evidente en

diversos países en vías de desarrollo. En México no existe una normatividad ambiental que

regule la concentración de los plaguicidas presentes en suelo. Sin embargo, se pueden

encontrar diversos informes con la finalidad de llegar a una propuesta para su legislación, así

como para el complimiento del Convenio de Estocolmo, como el Plan Nacional de

Implementación presentada en el año 2006 (Albert, 2006).

2.5 Tecnologías desarrolladas para la remoción de contaminantes del suelo

La presencia de diversos contaminantes en el suelo, incluyendo los plaguicidas, es una

preocupación creciente, y por ello se han desarrollado diferentes tratamientos para su

remoción.

12

La rehabilitación de suelos contaminados comprende un conjunto de procedimientos que,

mediante la contención, retirada o destrucción de las sustancias contaminantes, permite la

recuperación total o parcial de las funciones del suelo. El gran número de técnicas existentes

puede agruparse en función de sus características de operación o finalidad: Tratamientos

fisicoquímicos o biológicos (Volke et al., 2002). Los tratamientos que persiguen la eliminación

del riesgo mediante la transformación de los contaminantes del suelo en productos no

peligrosos emplean procesos complementarios para lograr su finalidad.

TABLA 3: MEDIDAS PARA LA REMEDIACIÓN DE SUELOS (MEUSER, 2013)

+ APLICACIÓN USUAL, (+) APLICACIÓN EXTRAORDINARIA, - NO APLICA.

Tratamiento in situ on site off site

Excavación y disposición de tierra o reciclado - - +

Cubierta superficial (Geotextil y bentonita) + - -

Sellado + - -

Instalación de barreras laterales + - -

Solidificación (base de cemento) + + (+)

Asfaltado - + (+)

Vitrificación + (+) (+)

Estabilización + - -

Lavado de suelos (+) + +

Biorremediación + + +

Fitorremediación + - -

Tratamiento térmico (+) - +

Electro-remediación + - (+)

De acuerdo con la ubicación del suelo durante su tratamiento (Tabla 3) existen dos tipos de

técnicas, las que se aplican sobre el suelo contaminado en su posición de origen, in situ, y las

que se emplean con posterioridad a la excavación del terreno, ex situ. Además, los tratamientos

ex situ pueden llevarse a cabo sobre el propio terreno (on site) o en otro lugar (off site).

2.5.1 Tratamientos Fisicoquímicos

Se utilizan generalmente cuando las propiedades fisicoquímicas de los contaminantes y las

características del suelo son apropiadas para la separación de estos. Son altamente efectivas y

con la ventaja que suelen efectuarse en periodos de tiempo muy cortos; aunque los costos

pueden incrementar dependiendo del tipo de tratamiento que requiera el contaminante a

13

separar (Volke et al., 2002; Towhid, 2014). Entre las tecnologías más destacadas se encuentran

la electro-remediación, el lavado de suelos y la estabilización.

2.5.2 Tratamientos Biológicos

En general, los tratamientos biológicos son preferidos para la remediación de la contaminación

en suelos porque son tratamientos tecnológicos de bajo costo, pueden degradar los

contaminantes de forma efectiva (Torres et al., 2012) y por tener una baja afectación a la flora y

fauna nativa de los sitios (Liu et al., 2007). En México se han realizado estudios asociados a las

características fisicoquímicas, microbiológicas, de micronutrientes y otro tipo de indicadores de

suelos para determinar si se pueden llevar a cabo los procesos de biorremediación

determinando si existen los niveles necesarios de nutrientes en la matriz de suelos (Escobar et

al., 2012).

2.5.3 Acoplamiento de sistemas de tratamiento

Si bien los tratamientos fisicoquímicos y biológicos pueden ser aplicados de forma individual y

dar resultados exitosos, en algunos casos es necesario acoplar diversos tratamientos para una

mejora en la eficiencia de remoción o ya sea porque se requiere un tiempo definido breve para

llevar a cabo el tratamiento y otras razones, en particular, la económica. Se conocen varios

casos de trenes de tratamiento que son efectivos para el tratamiento de efluentes

contaminantes, los más conocidos son los de aguas residuales.

En este sentido y de igual forma que para el tratamiento de aguas, existen diversos

tratamientos utilizados para suelos contaminados con diversos componentes como

hidrocarburos, metales pesados y plaguicidas que han comprobaron ser exitosos (Volke et al.,

2002; Torres, 2012).

Se ha demostrado que el acoplamiento de diversos sistemas pueden mejorar las remociones de

los contaminantes a comparación de sus usos individuales, como lo son los tratamientos de

lavados de suelo con surfactantes usando técnicas de oxidación avanzadas (Bandala et al.,

2007; Bandala et al., 2012), o acoplados a algún sistema biológico para el tratamiento (Zacarias

et al., 2013)

14

De estas técnicas se destaca primordialmente el lavado de suelos porque provee una

alternativa proactiva para la extracción de diversos contaminantes, como los plaguicidas, a un

costo considerable y en un corto periodo de tiempo.

En este trabajo se propuso el uso de un sistema acoplado de Lavado de Suelo Asistido con

Surfactantes (LSAS) naturales y un subsecuente tratamiento de las aguas residuales que se

generaron en este proceso por medio de un Biofiltro Aerobio Sumergible (BAS).

2.6 Lavado de Suelo Asistido con Surfactantes (LSAS)

El lavado de suelo es una técnica de tratamiento que puede ser utilizada para remover los

contaminantes en el mismo mediante una extracción utilizando una solución acuosa; con esto

se logra que la solución acuosa (agua de lavado) arrastre los contaminantes, quedando el suelo

limpio. El agua contaminada generada (agua generada) se separa entonces para un tratamiento

posterior. Se han realizado diversos estudios para suelos con diferentes tipos de contaminantes

como hidrocarburos del petróleo, metales y plaguicidas, a escalas laboratorio, piloto y en escala

real, teniendo resultados alentadores (Torres et al., 2012). En la Tabla 4 se pueden encontrar

los tipos de contaminantes que son susceptibles a ser removidos por medio de esta técnica.

TABLA 4: TIPOS DE CONTAMINANTES FACTIBLES DE REMOVER POR LSAS.

Tipo de contaminante Ejemplos

Solventes clorados

Tetracloroetileno, tricloroetileno, 1,1,1-tricloroetano, etc.

Solventes aromáticos

Benceno, tolueno, xileno, etilbenceno.

Hidrocarburos volátiles o semivolátiles

Gasolina, diésel, turbosina, queroseno, etc.

Constituyentes semivolátiles SVOCs

Bifenilos policlorados, policíclicos aromáticos, crudo, etc.

Metales

Arsénico, cromo, níquel, plomo, etc.

Radionucleótidos

Uranio, cesio, torio, radio, etc.

Plaguicidas

Metilparatión, linurón, 2,4-D, etc.

15

La eficiencia de la remoción del contaminante dependerá y por limitación de la baja solubilidad

de los compuestos orgánicos hidrofóbicos. Se ha demostrado que el uso de surfactantes

aumenta considerablemente la disponibilidad del contaminante a ser degradado por los

microrganismos (Torres et al., 2007). En este método el contaminante pasa del suelo al agua,

por lo cual se han encontrado diversas ventajas en su tratamiento por medios biológicos, esto

porque el contaminante se encuentra más biodisponible en la matriz acuosa.

2.6.1 Surfactantes

Los surfactantes son moléculas o iones anfifilicos, por lo que una parte de su estructura es

hidrofóbica y otra hidrofílica. La parte que corresponde a la región hidrofóbica, también

llamada cola, es generalmente una cadena de hidrocarburo (mayores a 12 átomos de carbono)

y la región hidrofóbica o cabeza es la región iónica o polar (Riojas et al., 2011).

Los surfactantes son sustancias muy versátiles siendo su principal característica alterar las

propiedades de una solución, ya que poseen actividad superficial o interfacial, siendo la

propiedad más importante de estos la capacidad de adsorberse en interfases: líquido-gas,

líquido-líquido y líquido-sólido, cambiando sustancialmente las energías de interacción entre las

fases de dichos sistemas, por eso también son denominados tensoactivos. Como se muestra en

la Figura 6 pueden clasificarse como aniónicos, catiónicos, no iónicos (Torres, 2012).

FIGURA 6: DIVERSAS CARGAS EN LOS SURFACTANTES (RIOJAS ET AL., 2011).

16

El uso de surfactantes en un proceso de lavado tiene como objetivo trasladar el contaminante

de una fase sólida a un medio acuoso. Presentan un comportamiento químico especial al

ponerse en contacto con la matriz de suelo y por ello es que pueden utilizarse en el lavado de

suelo contaminado. El tipo o mezcla de surfactantes utilizados, así como su dosis, empleado en

un proceso de remediación, debe determinarse por medio de procedimientos experimentales,

ya que los suelos de distintas regiones pueden presentar características diferentes. En este

sentido deben identificarse las propiedades del suelo contaminado para ajustar el tratamiento,

luego a los aspectos teóricos y prácticos que las rigen (Riojas et al., 2001).

Actualmente la tendencia internacional del LSAS recurre al uso de surfactantes naturales, los

cuales pueden ser de dos tipos: a) producidos por microorganismos y b) productos naturales y

derivados (Figura 7). Las características deseables en un surfactante incluyen biodegradabilidad,

baja o nula toxicidad, solubilidad a bajas temperaturas, baja adsorción en el suelo y el uso de

concentraciones efectivas en concentraciones por debajo del 3% (Hernández et al., 2013).

Diversos surfactantes de origen natural cumplen con estas características y no afectan de

manera riesgosa al entorno. Se han realizado estudios que demuestran que los surfactantes

naturales como la goma guar, la goma de algarrobo y la goma de mezquite presentan

excelentes resultados de remoción con respecto a los surfactantes sintéticos (Torres et al.,

2012).

17

FIGURA 7: ESTRUCTURAS MOLECULARES DE LAS GOMAS UTILIZADAS COMÚNMENTE EN EL LSAS, A) MEZQUITE, B) GUAR Y C) HPTAC-GUAR, TAMBIÉN CONOCIDA COMO COSMEDIA.

2.7 Tratamiento de efluentes por Biofiltro Aerobio Sumergido (BAS)

El lavado de suelos genera un agua residual particular, de la cual se conoce el tipo de

contaminante que se ha de remover para poder disponer el agua de manera adecuada. En este

contexto, la biofiltración es un proceso considerado medioambientalmente amigable, consiste

en un proceso en el cual se remueven cantidades considerables de contaminantes que

subsecuentemente son metabolizados por los microorganismos presentes en el sistema

(Zacarías et al., 2013). Esto sucede durante el proceso de filtración, los microorganismos de

diversos tipos se desarrollan en una superficie inerte del filtro y forman una biopelícula (Singh

et al., 2003).

Existen entonces tres procesos biológicos que pueden ocurrir en un biofiltro:

la fijación de microorganismos,

el crecimiento del microorganismo y

la descomposición y desprendimiento de los microorganismos.

18

El éxito de un biofiltro depende del crecimiento de la biopelícula y su mantenimiento en la

superficie del material inerte (Singh et al., 2003). Este sistema tiene la particularidad de que

están presentes las 4 fases: La sólida o medio de soporte, el líquido o efluente a tratar, el medio

gaseoso que promueve la aerobiosis y, la parte fundamental, la biológica. Esto hace que este

sistema sea altamente complejo.

La formación de la biopelícula es la etapa fundamental del proceso. La arquitectura de las

biopelículas es el resultado de mezclas de varios microorganismos con diferentes hábitos de

crecimiento que habitan en condiciones similares, entre ellas las que son capaces de segregar

exopolisacarido, un biopolímero al cual son capaces de adherirse otros microorganismos que no

tiene esta capacidad (Figura 8), así podemos distinguir claramente dos capas: la anaerobia que

se encuentra unida al soporte y en la cual ya no se difunde el oxígeno, y la aerobia que se

encuentra en contacto directo con el fluido a tratar.

FIGURA 8: BIOPELÍCULA A) CARACTERÍSTICAS (ELABORACIÓN PROPIA), B) MICROGRAFÍA DE UNA BIOPELÍCULA (BARRAGÁN ET AL., 2007)

19

Existe una relación fundamental entre su estructura, organización y función. La diversidad

estructural refleja la adaptación de los microorganismos a un rango diverso de circunstancias

físicas y químicas a las que se somete la superficie (Caldwell et al., 1995), también se ha

determinado que la resistencia de la biopelícula surge de la heterogeneidad: los microbios más

próximos al líquido que la rodea tienen un mayor acceso a los nutrientes y el oxígeno en

comparación con aquellos en el centro del material inerte (Ceri et al., 2005).

La destrucción biológica de compuestos xenobióticos es contribución de metabolismo

microbiano que los convierten a CO2 u otros compuestos orgánicos. Los microorganismos

desempeñan un papel esencial en la bioconversión y la ruptura total de plaguicidas (Latha,

2012). La capacidad de los microrganismos para degradar plaguicidas es controlada por la

biodisponibilidad del contaminante y por la capacidad del microrganismo de utilizar el

contaminante como sustrato o co-sustrato (Rama et al., 2011). En ecología microbiana, la

nutrición es el principio de selección natural en los ambientes contaminados; cuando los

microrganismos indígenas se enriquecen por adición de algún contaminante, en este caso un

xenobióticos, o un inóculo es adicionado al suelo, la supervivencia de estos dependerá de la

capacidad de los microorganismos de utilizar este recurso (Ryan, 1995). La inoculación del suelo

con los mismos microorganismos es altamente recomendable ya que provienen de la misma

microflora indígena del sitio, los microrganismos provenientes del suelo de forma nativa no son

capaces de metabolizar los contaminantes a los que se ha visto sometido ya que son

potenciales fuente de energía, entonces es posible que la dinámica ambiental a la que se

pueden ver sometidos pueda ser exitosa, desde la perspectiva que la competencia por el

recurso no exista.

20

FIGURA 9: RUTA PROPUESTA PARA LA DEGRADACIÓN DE DDT POR BACTERIAS (ROCHKIND ET AL., 1987)

Se ha reportado la las rutas para la biodegradación de DDT por medio de bacterias y hongos de

donde se destacan Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiela

pneumonia, entre otras. (Aislabie et al., 2010). En la Figura 9 puede observarse una ruta general

para la decloración de la parte alifática del compuesto llevado a cabo en condiciones

anaerobias; en el caso aerobio se tiene que tomar en cuenta la vía de DDT hacia DDE, que se

considera como uno de los pasos terminantes de la reacción. Algunas bacterias de coliformes

intestinales de mamíferos tienen la capacidad de llevar a cabo esta reacción como E. coli y E.

aerogenes.

Cl

Cl

Cl

Cl Cl Cl

O

Cl Cl

O O

OH

Cl

C

+ +OH2 CO2

DDT DBP Dicofol4CPAA

FIGURA 10: RUTA DE DEGRADACIÓN DE DDT PROPUESTA PARA PSEUDOMONAS SPP (ADAPTADO DE LATHA, 2012).

21

En la Figura 10 se puede observar una ruta de degradación que siguen algunas especies de

Pseudomonas spp que consiguen incorporar un oxígeno a la porción alifática, logrando de esta

forma aumentar la solubilidad en agua de la sustancia.

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

OH

OH

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

OH

OH

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

O

OH

OH

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

C

Cl

CO OH

Ácido 4-clorobenzóico

DDT

FIGURA 11: RUTA DE DEGRADCIÓN DE DDT QUE SIGUE ALCALIGENES SPP (ADAPTADO DE LATHA, 2012).

En el caso de las aguas generadas contaminadas con plaguicidas, se ha comprobado

ampliamente la biodegradación de estos por microrganismos como: Pseudomona fluorecens,

Pseudomona aeroginosa, Bacillus sp, Chrysteubacterium joostei, Klebsiela pneumonia (Bandala

et al., 2006; Rama et al., 2011).

22

3. Justificación

El uso de agentes agroquímicos para asegurar la producción de los cultivos con fines

alimenticios ha tenido como consecuencia una sobrexposición de plaguicidas a diversos

compartimientos ambientales, entre los cuales destaca el suelo.

Los problemas medioambiental y de salud que surgen por la persistencia de algunos

plaguicidas, en específico el DDT y sus metabolitos, continúan agravando conforme aumente su

uso incontrolado que implica la disminución de la capacidad productora del suelo y una

exposición crónica de los plaguicidas en la población. Una de las posibles soluciones requiere

del desarrollo de tecnologías adecuadas y eficientes para el tratamiento y la rehabilitación del

suelo.

El LSAS naturales es un método prometedor por su versatilidad de aplicación para diversos

contaminantes, la rapidez y el costo accesible. El acoplamiento del lavado a un sistema de

tratamiento biológico, como lo es un BAS, complementa de manera adecuada el sistema para

lograr la degradación eficiente de los compuestos contaminantes, para ello la alternativa más

adecuada es la utilización de un consorcio proveniente del sitio contaminado a tratar.

23

4. Hipótesis

El acoplamiento del LSAS naturales y un BAS, permitirá una eficiente remediación de un suelo

contaminado con plaguicidas y el tratamiento de las aguas residuales generadas en el proceso.

24

5. Objetivos

5.1 Objetivo general

Evaluar el desempeño de un sistema de LSAS de un suelo contaminado con plaguicidas (DDT y

sus metabolitos) empleando surfactantes naturales acoplado a un BAS para tratar las aguas

generadas en el proceso de lavado previo.

5.2 Objetivos específicos

Realizar la caracterización microbiológica y fisicoquímica de un suelo contaminado

con plaguicidas (DDT).

Determinar el tipo de surfactante natural (Mezquite, guanábana, chirimoya, guar,

HPTAC-guar, flamboyán natural, flamboyán derivado) y la dosis (0.005%, 0.01%,

0.5%, 0.1%, 0.25%) de surfactante para el lavado de suelo a una escala de 10 L.

Tratar las aguas generadas en el lavado por medio de un biofiltro aerobio sumergido

empacado con tezontle a una velocidad de flujo de 0.015 L/min.

Determinar la evolución microbiana del BAS antes y después del tratamiento de las

aguas por medio de pirosecuenciación.

25

6. Metodología

La metodología se dividió en 4 etapas para alcanzarlos objetivos específicos antes descritos.

6.1 Etapa 1: Selección y caracterización de un suelo contaminado con plaguicidas

Se colectaron diversas muestras de suelo agrícola, susceptibles a estar contaminadas, de

diversas unidades agrícolas pertenecientes al Ejido de la Finca, Estado de México; las muestras

se tomaron a una profundidad aproximada de 5 a 10 cm (Wong et al., 2008; Ortiz et al., 2010).

Las características determinadas del suelo fueron: densidad real, pH y humedad (Torres et al.,

2012). La determinación de la concentración de plaguicidas fue por medio de los métodos de

cromatografía de gases EPA 8081A-1996 para plaguicidas organoclorados presentes en suelo y

EPA 8141A-1996 para plaguicidas organofosforados presentes en suelos (Laboratorios ABC).

La caracterización microbiológica proximal se realizó por métodos tradicionales de

microbiología (morfología y tinción de gram) y cuenta viable en placa; los microorganismos

encontrados se cultivaron en caldo nutritivo (120 rpm, 28°C, 48h) para su crecimiento con la

finalidad de preparar un inóculo semilla para el BAS que se utilizó el tratamiento de las aguas

generadas en el proceso de lavado.

6.2 Etapa 2: Identificación del surfactante y dosis óptimas a utilizar en el lavado de suelo

El efecto y tipo de surfactante adecuado para el suelo estudiado se determinó a partir de

sistemas cerrados y en microcosmos (Figura 10), donde muestras de 6 g de suelo contaminado

del sitio se pusieron en contacto con 20 mL de solución de surfactante/agua a una

concentración de 0.1%.

26

FIGURA 10: PRUEBAS EN MICROCOSMO DE LAVADO.

Para la identificación del tipo de surfactante a utilizar, se probaron 7 surfactantes de origen

natural y derivados: mezquite, chirimoya, guanábana, flamboyán nativo, flamboyán derivado,

guar y HPTAC-guar. Los microcosmos se sometieron a agitación constante a una velocidad de

100 rpm por 24 horas a una temperatura de 28ºC (Torres et al., 2012).

Una vez identificado el surfactante a utilizar, se procedió a la determinación de la dosis óptima

de surfactantes, que fueron 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 y 0.25%, esto porque se ha demostrado que

en concentraciones más altas, las viscosidades causan problemas durante el proceso de lavado

(Torres et al., 2007). En ambos procesos se utilizó como blanco de lavado agua destilada.

6.3 Etapa 3: Lavado de suelo a escala 10 L y caracterización del agua residual generada durante el lavado de suelo.

Determinados tanto surfactante a utilizar como dosis óptima del mismo, se llevó a cabo el

lavado de 10 L, donde aproximadamente 5 kg suelo del sitio de estudio (M003) previamente

cernido en malla americana 10 (< 2mm), se enriqueció con 100 ppm DDT dejándolo alcanzar el

equilibrio por 20 días agitándose diariamente por un tiempo de 3 minutos. El agua de lavado se

preparó utilizando la dosis óptima calculada experimentalmente en la etapa anterior. El lavado

se llevó a cabo en frascos de 5 litros, utilizando 2 periodos de lavado de 90 minutos cada uno, a

la velocidad de 100 rpm y temperatura de 28°C (Zacarias et al., 2013).

27

El agua generada por el lavado de suelos se caracterizó por medio de las pruebas básicas de

aguas residuales Demanda Química de Oxígeno (DQO), Demanda Bioquímica de Oxígeno

(DBO5), sólidos totales (ST), pH, conductividad y turbidez de acuerdo a la metodología AWWA,

APHA y WPCE (1989).

La extracción de plaguicidas presentes en el suelo se llevó a cabo antes del lavado y al final del

mismo por los métodos de extracción con solventes orgánicos EPA 8081A-1996 para plaguicidas

organoclorados presentes en suelos y el EPA 3350C para el caso de aguas. La determinación de

la concentración de plaguicidas presentes llevó a cabo por medio de los métodos de

cromatografía de gases EPA 8081A-1996 para plaguicidas organoclorados.

El agua de lavado generada se dividió en 5 porciones y se enriquecieron con diversas cantidades

de DDT (100, 200, 300 y 500 ppm) y en uno de los casos se agregó la concentración de 0.5% de

surfactante adicional. Se obtuvieron de esta forma 5 diferentes aguas generadas con diferentes

concentraciones de DDT.

6.4 Etapa 4: Inoculación, operación y caracterización microbiológica del BAS

Se utilizaron dos columnas (A y B) empacadas con soporte de tezontle (piedra volcánica de alta

porosidad) que ha demostrado tener las características adecuadas para el crecimiento de

biopelículas (Torres et al., 2012). La Figura 11 describe las dimensiones y características de

ambas columnas; cada columna se empacó con 270 gr de tezontle blanco que de forma previa

se pulverizó y cernió en una malla americana número 10 (< 2mm). El volumen de operación del

BAS se determinó a 300 mL. Para el tratamiento del agua generada del lavado, la columna se

trabajó a temperatura ambiente y velocidad de flujo ascendente de 0.015 L min-1.

28

FIGURA 11: MEDIDAS DEL BAS

La inoculación de las columnas se realizó con los microrganismos preadaptados del sitio; el

inóculo semilla cultivado previamente en caldo nutritivo (Etapa 1) se llevó hasta 5 L. La

inoculación de la columna se realizó haciendo pasar el inóculo por un periodo de 5 días hasta

alcanzar una biomasa suficiente y visible en las paredes del tezontle; posteriormente se realizó

la etapa de selección haciendo circular por ambas columnas el agua de lavado a 100 ppm de

DDT por un periodo de 10 días antes del inicio de la operación (Bandala et al., 2005).

El tratamiento de las aguas de lavado se realizó posterior al proceso de inoculación. Las

diferentes aguas generadas fueron tratadas de forma subsecuente y en paralelo en ambos

biofiltros, con diversas concentraciones de DDT (100, 200, 300 y 500 ppm) y una de 100 ppm

DDT con 0.5% de surfactante. Ambas columnas (denominadas A y B) se alimentaron en lote

durante un periodo de 10 días para cada agua de lavado generada (Bandala et al, 2007).

29

En la columna A se trataron las aguas de 100 ppm DDT, 100 ppm y 0.5% de surfactante y un

blanco de adsorción; en la columna B se trataron las aguas de 200 ppm, 300 ppm y 500 ppm

DDT.

El monitoreo realizado incluyó la medición diaria de los parámetros: DQO, pH, conductividad,

turbidez y color. Las mediciones de plaguicidas y UFC·g-1 se realizaron los días 0, 3, 5, 7 y 10 de

cada tratamiento.

La caracterización microbiológica del biofiltro durante su operación se realizó por

pirosecuenciación y DGGE.

FIGURA 12: DETALLE DE UNA COLUMNA UTILIZADA PARA BAS.

30

7 Resultados y discusión

7.1 Etapa 1: Selección y caracterización de un suelo contaminado con plaguicidas

La localidad de Ejido de la Finca está situada en el municipio de Villa Guerrero, estado de

México. Consta de una población de 1042 habitantes (INEGI, 2010). La población

económicamente activa es del 29.17% y el sector agrícola es la principal ocupación, lo que

constituye un 87.04% de la actividad productiva. Se tiene conocimiento de que en este sitio los

principales cultivos corresponden a los de la flor de gladiola y fresas en sus variedades de

Camino Real y de Festival (Figura 14). Adicionalmente se sabe que se han utilizado diversos

tipos de plaguicidas para el control y mitigación de plagas durante un extenso periodo de

tiempo.

FIGURA 12: CULTIVOS DE FRESA DEL SITIO DE ESTUDIO.

En la Figura 15 se puede observar la localización de los sitios muestreados. Se tomaron un total

de 11 muestras, todas de diversas unidades y con características de cultivo distintas. Los

señalados por B1 y B2 corresponden a sitios que de acuerdo a sus condiciones históricas de uso,

no están expuestos a la aplicación de plaguicidas; los otros puntos se utilizan para agricultura,

siendo el cultivo de fresa (M003, M004, M005 y M006) y gladiola (M001) los más comunes de la

zona. En el ANEXO A se puede consultar los puntos georreferenciados y las observaciones que

se realizaron.

31

FIGURA 13: PUNTOS DE MUESTRO DEL SITIO DE ESTUDIO.

Los análisis de plaguicidas realizados al suelo fueron para organofosforados y organoclorados.

En el caso de los plaguicidas organofosforados no se logró la detección de ningún plaguicida,

esto puede ser debido a que los plaguicidas organofosforados son poco persistentes, aunque

altamente tóxicos. Para el caso de los organoclorados de los 22 plaguicidas analizados en el

suelo, únicamente se lograron cuantificar 3: DDT y sus derivados DDD y DDE. En el ANEXO B se

pueden consultar a detalle los resultados de los análisis de plaguicidas realizados. En la Tabla 5

se resumen los resultados más relevantes de los plaguicidas encontrados en el sitio.

TABLA 5: PLAGUICIDAS ENCONTRADOS EN LOS DIVERSOS PUNTOS DE MUESTREO

Plaguicida M001 M003 M004 M005 M006

DDD g/kg 4.897 4.786 0 0 0

DDE g/kg 20.254 18.972 2.261 4.843 3.784

DDT g/kg 21.968 13.628 2.219 6.302 4.975

DDT (g/kg) 47.119 37.386 4.48 11.145 8.759

Indicador 1 1.084 0.718 0.981 1.301 1.315

Indicador 2 1.145 1.743 1.018 0.768 0.761

DDT=DDE+DDD+DDT, Indicador 1=DDT/DDE, Indicador 2=(DDE+DDD)/DDT

32

El punto M001 corresponde a los cultivos de gladiolas de la zona donde se tiene conocimiento

de haber realizado una aplicación de insecticida un mes antes del muestreo de suelo. El punto

M003 corresponde al cultivo de fresa, donde se tiene información de la aplicación de un

plaguicida durante 15 días anteriores a la toma de muestras. En las muestras M004, M005 y

M006 se observa la presencia de DDT y DDE, es posible que el DDD se encuentre presente pero

no en cantidad necesaria para poder ser detectado, estos últimos puntos corresponden a

cultivos de fresa tal como se observa en la Tabla 5.

De los plaguicidas encontrados en los sitios se observa que las concentraciones se encuentran

en g/kg, las cuales, en el caso de la familia del DDT, pueden ser consideradas como

concentraciones históricas presentes en el suelo agrícola en cuestión.

En la Tabla 5 también se incluyen dos indicadores, el Indicador 1 se usa para estimar las

aplicaciones recientes de DDT y, en general una razón de 0.33 o menor es considerada como

una mezcla envejecida presente en el suelo y degradada. Mientras que una razón mayor

representa una aplicación reciente (Bhupander et al., 2011). En este caso particular se observa

que todas las muestras analizadas se encontraron por arriba de 0.33 y el rango se encuentra de

0.76 a 1.743 lo que implica el uso reciente de DDT en el área. El Indicador 2 se utiliza de igual

forma para indicar el tiempo de residencia de DDT en el ambiente, en este indicador un valor

>1.0 refiere que la aplicación fue realizada en el pasado y valores <1.0 indican una aplicación

relativamente reciente (Cheng et al., 2008). Para los suelos denominados como M005 y M006

las razones obtenidas fueron de 0.768 y 0.761 sugiriendo nuevamente una aplicación reciente

de este tipo de plaguicidas en el área. Dados los resultados de este análisis, es posible que la

aplicación de DDT no se esté llevando a cabo en forma regular, si no que en pequeñas

cantidades o como parte de una mezcla de varias sustancias que se vierten al suelo.

Adicionalmente se llevó a cabo la caracterización fisicoquímica de suelo impactado. En la Tabla

6 se muestra la caracterización que fue realizada en una muestra compuesta de los suelos

muestreados, a excepción de los blancos. En general, se puede observar que el suelo es de tipo

limoso-arcilloso, con un pH cercano al neutro. Es importante destacar que la cuenta viable en

placa resultó baja en comparación con otros estudios, así como la capacidad de campo del

33

suelo fue menor a la esperada (Boivin, et al., 2005; Torres, et al., 2012). La caracterización

microbiológica proximal puede consultarse a detalle en el Anexo C.

TABLA 6: CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DEL SUELO

Se tiene conocimiento que el DDT y sus metabolitos se han encontrado a diversas

concentraciones y en diversos países, porque lo que resulta compleja una comparación, ya que

su presencia depende en gran medida del tipo y frecuencia de uso, restricciones, características

y tipo de suelo, entre otros. Sin embargo, en la Tabla 7 se puede observar que los rangos

encontrados en este estudio se encuentran por debajo de otros rangos encontrados, a

excepción de Serbia, en el caso de otros estudios realizados en México se puede observar que

se encuentran dentro de los rangos reportados con anterioridad.

TABLA 7: CUADRO DE COMPARACIÓN CON OTRO ESTUDIOS REALIZADOS

Lugar Tipo de suelo Concentración µg/kg

Referencia Menor Mayor

Serbia Agrícola 12.8 185.8 Marković et al., 2009

Egipto Agrícola 173 239 Ghabbour et al., 2012

México Agrícola 62.3 102.2 Escobar et al., 2002

Parámetro Resultado

Textura

Arena 20.80%

Limo 44%

Arcilla 35.20%

pH 6.46

Humedad 13.60%

Densidad real 2.08 g/cm3

Capacidad de campo 8.05%

Conteo placa 1.1E6 UFC

34

Chile Varios 120 704.6 Henriquez et al., 2006

Tanzania Agrícola 125.3 240.7 Kihampa et al., 2010

México Agrícola 0.08 11.1 Walszewsky et al., 2011

México Agrícola 4.48 47.119 Este estudio

7.2 Etapa 2: Identificación del surfactante y dosis óptimas a utilizar en el lavado de suelo

De las muestras de suelo contaminadas, únicamente se utilizaron las de mayor concentración

de plaguicida presente en la muestra, en este caso tanto la M001, como la M003. Para ambas

muestras se probaron 7 diferentes tipos de surfactantes naturales y derivados: guanábana,

chirimoya, mezquite, flamboyán natural, flamboyán derivado, guar, HPTAC-guar a una

concentración de 0.1% y agua como blanco de lavado Los resultados obtenidos de los

porcentajes de remoción correspondientes a los cultivos de gladiolas (M001) se presentan a

continuación en la Figura 14:

FIGURA 14: REMOCIONES DE PLAGUICIDA PARA M001 CON LOS DISTINTOS SURFACTANTES UTILIZADOS

0

20

40

60

80

100

120

Po

rce

nta

je d

e r

em

oci

ón

de

pla

guic

idas

(su

ma

de

to

tale

s)

Surfactante

35

En la figura se pueden observar los resultados obtenidos de las remociones en el suelo M001,

para este suelo se obtuvo que el mayor porcentaje de remoción se encontró para la goma guar

(91.9% de remoción); las gomas que obtuvieron menores remociones a las del agua (22.5%)

fueron las de mezquite, chirimoya y flamboyán derivado.

FIGURA 15: REMOCIONES DE PLAGUICIDA PARA M003 CON LOS DISTINTOS SURFACTANTES UTILIZADOS

Los resultados correspondientes a la remoción de plaguicidas en el suelo M003 (cultivos de

fresa) se presentan en la Figura 15, donde se puede observar que, a excepción de flamboyán

derivado, todas las gomas presentaron remociones mayores al del agua (46.8%). Las

remociones superiores a las del agua se encontraron entre 67.4% (flamboyán nativo) y 84.7%

(HPTAC-guar).

Para la prueba de dosis óptima de surfactante se utilizó el suelo M003 y con la goma de HPTAC-

guar, usando agua como control. En la Figura 16 se muestran el porcentaje de DDT,

determinado por CG-CE, obtenidos posterior a la extracción orgánica. Se puede observar que la

máxima remoción de DDT se obtuvo al utilizar una dosis de 0.05% de surfactante. Considerando

que en la prueba anterior (Figura 15) la remoción del agua fue de 46%, se podría esperar que,

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Po

rce

nta

je d

e r

em

oci

ón

de

pla

guic

idas

(s

um

a d

e t

ota

les)

Surfactante

36

en concentraciones superiores, las remociones fueran superiores. Sin embargo, se observa que

las concentraciones que más favorecen la remoción del contaminante son la 0.05% y de 0.1%,

siendo

FIGURA 16: DOSIS DE SURFACTANTE A UTILIZAR.

Posteriormente se realizaron las mediciones de tensión superficial con la finalidad de conocer el

comportamiento de las soluciones utilizadas antes y después del proceso de lavado; esto se

realizó por medio de un tensiómetro, utilizando el método del anillo de platino. Las mediciones

que se llevaron a cabo fueron de las aguas generadas en 3 diferentes tipos de suelo: M001,

M003 y un suelo enriquecido con 100 ppm de DDT, así como en la solución de lavado a

utilizarse con las diferentes concentraciones de la goma de HPTAC-guar. Los resultados se

presentan en la Figura 19.

0

20

40

60

80

100

120

Agua 0.01 0.05 0.1 0.25

% d

e r

emo

ció

n

% de surfactante

Dosis a utilizar

37

FIGURA 17: MEDICIÓN DE LAS TENSIONES SUPERFICIALES.

Se puede observar que en el caso de los lavados realizados con agua la tensión permanece

cercana al valor reportado de 72 mN/m. En los otros casos se observa la acción de la goma de

HPTAC-guar reduciendo el valor de la tensión de la solución que va desde 56.6 mN/m para

0.01% hasta 66 mN/m para 0.005%. Es importante señalar que el valor de la tensión superficial

no disminuye de manera inversamente proporcional con respecto al porcentaje de goma

utilizada, este comportamiento se ha reportado en otro estudio realizado por Torres et al.,

(2005). Después de los lavados las tensiones aumentaron hasta valores por arriba de 70 mN/m

en todos los casos excepto para el lavado del suelo enriquecido que, por el contrario, disminuyó

el valor de la tensión superficial hasta 57.3 mN/m.

En otro estudio reportado por Torres et al., (2005) se ha tratado de relacionar tanto la

diferencia entre las tensiones (finales e iniciales) y las tensiones finales con el porcentaje de

remoción de los contaminantes; para este estudio se realizaron las mediciones y los resultados

se observan en la Figura 20.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Agua 0.005 0.01 0.05 0.1 0.25

Ten

sió

n s

up

erf

icia

l (m

N/m

)

% de goma

Solución de lavado

M001

M003

Enriquecido

38

FIGURA 18: REMOCIÓN CON RESPECTO A LA TENSIÓN SUPERFICIAL FINAL

Al realizar los cálculos correspondientes, no se encontró una correlación entre el porcentaje de

remoción y la diferencia entre las tensiones; sin embargo, de manera general, el

comportamiento es el mismo: las tensiones superficiales suelen incrementarse durante el

proceso de lavado en comparación con el agua. En la Figura 18, se aprecia una correlación

entre la tensión superficial final y el porcentaje de remoción de DDT, se puede apreciar de

forma clara que para porcentajes de remoción mayores de DDT hay una disminución en la

tensión superficial en la solución de lavado utilizada.

7.3 Etapa 3: Caracterización del agua residual generada durante el lavado de suelo

Los lavados realizados dependieron de la cantidad de suelo contaminado a tratar. Para 5 kg de

suelo previamente enriquecido con 100 ppm DDT se realizaron lavados de suelos empleando

1.5 kg con 4.5 L de solución de lavado. El agua de lavado generada fue caracterizada y los

resultados se muestran en la Tabla 8.

y = 2.4902x - 2.5198R² = 0.7915

0

10

20

30

40

50

60

70

80

10 15 20 25 30 35

% r

em

oci

ón

DD

T

Tensión superficial final

39

TABLA 8: CARACTERIZACIÓN DEL AGUA RESIDUAL GENERADA

Parámetro Resultado

DQO 174.6 ppm

DBO5 2.14 ppm

pH 6.84

Conductividad 415.75 S

Color 170.25 uPt-Co

Sólidos suspendidos 24.25 mg/L

Es importante señalar que estos valores dependen, entre otras cosas, del tipo de contaminante

que se encuentre en el suelo a tratar. No existen reportes de aguas residuales generadas de

este tipo, pero es claro que los parámetros encontrados dependerán del tipo de contaminante

presente y del surfactante utilizado en el proceso. Ejemplos de la caracterización de estas aguas

generadas con un proceso similar es aquel donde se retiró hidrocarburos totales del petróleo,

obteniéndose una DQO de 19440 mg/L (Bandala et al., 2013) así como de 1329 mg/L (Zacarías

et al., 2013), en este caso no se encontraron estudios con la caracterización del agua generada

de suelos contaminados con plaguicidas organoclorados.

7.4 Etapa 4: Inoculación, operación y caracterización microbiológica del biofiltro

Una vez que se llevó a cabo el proceso de inoculación y selección de los microorganismos en los

BAS se inició el tratamiento subsecuente de las aguas generadas. En la Figura 19 se pueden

observar el comportamiento de la remoción de materia organica medidas a través de DQO para

6 pruebas realizadas en el BAS. Se observa una disminución de la DQO en todos los casos;

aunque la mejor remoción se logró para el agua que contenía una cantidad de 300 ppm de DDT.

Los parámetros medidos adicionalmente pueden consultarse en el Anexo D.

40

FIGURA 19: DQO/DQO0 VS TIEMPO DEL PROCESO.

También se realizó la comparación de las remociones con un blanco de adsorción del filtro

(Figura 20), donde se puede observar que el material retiene el 36.7% de la DQO inicial,

mientras que el porcentaje de remoción para los otros tratamientos se encuentran entre el

53.45% (200 ppm DDT) y 87.35% (300 ppm DDT).

FIGURA 20: % DE REMOCIÓN DE DQO DE LAS DIFERENTES CONDICIONES DE AGUA GENERADA.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250

DQ

O/D

QO

0

Tiempo (h)

100 ppm

100 ppm, 50mg/L HPTAC-guar

200 ppm DDT

300 ppm DDT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Blanco 100 ppm DDT 100 ppm DDT,50 mg/L deHTPC-Guar

200 ppm DDT 300 ppm DDT 500 ppm DDT

% d

e r

em

oció

n D

QO

41

De igual forma se realizaron las determinaciones de las cantidades de DDT degradadas. En la

Figura 21 se muestran los comportamientos de las diferentes aguas tratadas. Si bien en todos

los casos se observa una disminución en las cantidades de DDT iniciales, las concentraciones

que mostraron una mayor velocidad de remoción de DDT fueron los sistemas con una

concentración inicial de 100 y 200 ppm DDT, alcanzando la mínima concentración de

aproximadamente 250 h de cultivo.

FIGURA 21: DDT/DDT0 VS TIEMPO DEL PROCESO.

En el caso de las remociones de DDT en los distintos tipos de tratamiento, presentados en la

Figura 22 se puede observar que la mayor remoción de DDT se da para el agua que se

encontraba inicialmente con 100 ppm DDT de 86.5% y la menor a 500 ppm DDT a 25.7%. Este

porcentaje únicamente se evaluó hasta el día 5 de operación del BAS, por lo que es posible que

la remoción que se alcanza posteriormente fuese mayor, en este sentido es posible que las

remociones de todos los tratamientos estuviesen por arriba del 27.3 % que presentó el blanco

de adsorción.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 50 100 150 200 250

DD

T/ D

DT 0

Tiempo (h)

100 ppm DDT

100 ppm DDT, 50mg/L HPTAC-guar

200 ppm DDT

300 ppm DDT

500 ppm DDT

42

FIGURA 22: % DE REMOCIÓN DE DDT DE LAS DIFERENTES CONDICIONES DE AGUA GENERADA.

TABLA 9: PORCENTAJES Y VELOCIDADES DE DEGRADACIÓN (* CALCULADOS A 5 DÍAS).

C0 DDT Velocidad de degradación

DQO (mg/L·d)

% degradación DQO

Velocidad de degradación DDT

(mg/L·d) % degradación DDT

100 ppm DDT 85 72.86 6.5 86.5

100 ppm DDT, 50 mg/L de HPTAC-

guar

31.5 63.64 1.72 59.4

200 ppm DDT 83.2 53.54 13.5 76.8

300 ppm DDT 192.3 87.35 5.4 37.3

500 ppm DDT 154.5 82.62 22.5* 25.7*

Con estos datos se calcularon las velocidades de degradación de los diferentes tratamientos,

presentados en la Tabla 9. Se pueden observar que las velocidades de degradación con el

mayor porcentaje de degradación para DQO se observaron para el casó de 300 ppm DDT con

una velocidad de 192.3 mgL-1d-1. Con ayuda de estos datos se obtuvo la gráfica de las

velocidades de degradación de DDT contra la concentración inicial de DDT en la Figura 23.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Blanco 100 ppm DDT 100 ppm DDT,50 mg/L deHTPC-Guar

200 ppm DDT 300 ppm DDT 500 ppm DDT

% r

em

oci

ón

DD

T

43

FIGURA 23: GRÁFICO DE VELOCIDAD DE DEGRADACIÓN DE DDT VS CONCENTRACIÓN INICIAL DE DDT

De igual manera se realizó la determinación de la evolución microbiológica del BAS realizándose

extracciones de ADN genómico. De las muestras iniciales y finales se realizaron las extracciones

de ADN; del suelo se hizo la extracción empleando el método de extracción con 0.5 g de suelo

agrícola con 20 ppm de DDT. Para el inóculo se tomó una alícuota de medio fresco

aproximadamente 5 mL. Luego de encontrar las condiciones óptimas para la amplificación del

DNA por PCR con los iniciadores 341F y 907R se amplificaron las dos regiones hipervariables

del gen 16S rRNA. Para evidenciar la presencia del DNA extraído y la amplificación de las

regiones del gen 16S se realizó una electroforesis en gel de agarosa. El ADN extraído fue

analizado por espectrofotometría para determinar la concentración y la pureza de este, las

figuras de los geles obtenidos pueden observarse a detalle en el Anexo E.

Para la concentración del agente desnaturalizante se realizó un gel vertical de 0 a 100% de

concentración de desnaturalizante (Figura 24), en el que se cargaron diferentes muestras que

se obtuvieron al final de los tratamientos. Esto fue para observar el intervalo de concentración

de desnaturalizante en el que se localizan la mayor cantidad de bandas. Al realizar un par de

pruebas preliminares en gradientes más cerrados de desnaturalizante se observó que las

0

5

10

15

20

25

30

10 110 210 310 410 510

Vel

oci

dad

de

deg

rad

ació

n D

DT

(mg/

Ld)

DDT0 (mg/L)

44

muestras se desnaturalizan por completo debido a que el tiempo de corrimiento que se utilizó

(6 h) es demasiado prolongado.

FIGURA 24: DGGE DE 0 A 100% DE CONCENTRACIÓN DESNATURALIZANTE

Como se observa en la Figura 23, la mayor parte de bandas se encuentran en un intervalo de

desnaturalizante de 30-60%. Con base en esto, se realizaron diferentes pruebas en geles

verticales, donde en cada pozo se cargaron cada una de las muestras previamente descritas. Se

obtuvo el resultado presentado en la Figura 24:

45

FIGURA 24: DGGE DE 30% A 60% DE CONCENTRACIÓN DESNATURALIZANTE

En la figura anterior se observan las bandas de las diferentes muestras de DNA, mismas que se

pueden considerar como un microorganismo diferente. En el conteo de bandas que se realizó

se encontró que los tratamientos con mayor número de microorganismos fueron los de 100

ppm DDT + 0.5% HPTAC-guar y el de 300 ppm DDT ambas con 13 bandas, y la de menor número

de microorganismos se encontró en el suelo con 4 bandas. La baja diversidad microbiana

encontrada en el suelo pudo deberse a que este se encontraba impactado con plaguicidas, lo

cuales fueron aplicados un poco antes de la toma de muestra de suelo. Mientras que las

46

muestras que contienen una diversidad microbiana mayor fueron sometidas a un proceso de

enriquecimiento, inicialmente en un medio rico en nutrientes y posteriormente con el

contaminante. La etapa de enriquecimiento es necesaria para tener una alta concentración de

microrganismos adaptados que sean capaces de degradar el contaminante en el sistema de

biofiltración. Esta etapa favoreció el crecimiento de distintos microorganismos cuya

identificación se discutirá posteriormente. De manera adicional, se podría hipotetizar que la

goma también pued3e constituir un sustrato de crecimiento para los microorganismos

presentes en el BAS.

Es importante recalcar que en todos los tratamientos se observa una banda que se conserva

(marcado con una flecha). Esta banda no se encuentra presente ni en el inóculo, ni el suelo,

esto puede deberse a que la población microbiana se fue adaptando mejor al contaminante a lo

largo de la operación del BAS. Una especie predomino y se mantuvo siendo capaz de llevar a

cabo la degradación del mismo. La presencia de esta población microbiana podría deberse a las

condiciones de operación del BAS que fueron favorables para su crecimiento y permanencia

dentro del sistema. Pudo provenir del inoculo donde no se observaba por estar en

concentraciones pequeñas que no se pueden detectar en el gel.

Con la finalidad de realizar una comparación de la similitud o discrepancia de las poblaciones

microbianas presentes a lo largo de todo el tiempo de operación del BAS B (Figura 25), se

realizó un conteo de las bandas y se comparó su permanencia en las diferentes etapas , con

estos datos se calcularon los índices de Jacard y de Sörensen-Dice que son ampliamente

utilizadas para determinar la similitud entre las poblaciones.

Es importante señalar que en el BAS las muestras de agua con concentraciones crecientes de

DDT (200 ppm DDT, 300 ppm DDT y 500 ppm DDT) se trataron de forma subsecuente. Cada

concentración evaluada fue alimentada al BAS para observar la evolución del proceso de

biodegradación del contaminante durante 10 días como se observa en la gráfica. De esta forma,

cada flecha indica el día en el que se tomó cada una de las muestras procesadas para llevar a

cabo el análisis de DGGE y calcular los índices, así mismo esto corresponde también a un

cambio en la concentración del contaminante. Los índices de similitud mayores se encontraron

en los días 21 y 32 de operación del BAS con un índice de 0.5 y 0.66 de Jackard y Sörencen-Dice

47

respectivamente, esto podría implicar que las poblaciones microbianas son similares una vez

que se desarrollaron y predominaron los microorganismos capaces de degradar DDT. La menor

similitud se presentó entre el inóculo y el día 21 de operación con 0.125 y 0.22 de los mismos

índices, esto sugiere que las poblaciones predominantes capaces de eliminar el contaminante

se desarrollaron durante la etapa de adaptación al contaminante.

Es importante conocer de las comunidades que están presentes en un suelo contaminado, en

este caso DDT ya que el tipo de microorganismos inoculado determinará el éxito del proceso.

Establecer qué microrganismos se adaptan mejor bajo las distintas concentraciones de DDT

evaluadas permitirá entender y explicar mejor el proceso de degradación de los contaminantes

y desarrollar procesos más eficientes con las poblaciones predominantes después de una etapa

de adaptación, debido a lo se utilizó la pirosecuenciación realizada por los laboratorios de

Research and Testing Laboratory (Lubbock, Texas) para determinar el género y la especie de las

poblaciones microbianas presentes en las muestras del suelo, el inóculo, para el final de los

tratamientos de 100 ppm DDT y 500 ppm DDT y también determinar la evolución de la

comunidad microbiana del BAS. Los datos obtenidos de la pirosecuenciación se analizaron y

únicamente se contabilizaron aquellos microorganismos con una concentración mayor al 1%

presente en la muestra.

48

FIGURA 25: MEDICIONES HISTÓRICAS DE DQO DEL TRATAMIENTO BIOLÓGICO, CON LOS ÍNDICES DE SIMILITUD DE JACKARD (SJ) Y SÖRENSEN-DICE (SD).

49

En la Figura 26 se observan los resultados del análisis de pirosecuenciación obtenido en el suelo

del sitio. Se observa la predominancia de Klebsiella oxytoca, a nivel de identificación de especie

en el suelo con un porcentaje de 21 %. El segundo microorganismo más abundante fue Bacillus

sp con un porcentaje de predominancia del 16%. El resto de la población microbiana (63%)

corresponde a algunos microorganismos pertenecientes al género de enterobacterias, tales

como Enterobacter asburiae(16%) y Enterobactec aerogenes (7%). También se pudieron

identificar microorganismos cuya presencia es común en un suelo agrícola, como Achromobacte

sp. La presencia de enterobacterias sugiere que parte del riego utilizado para este sitio provino

de aguas negras. Se sabe por bibliografía que Bacillus sp, algunas enterobacterias y Klebsiella

sp, son microorganismos previamente identificados e involucrados en la biodegradación de

plaguicidas (Bandala et al., 2006; Rama et al., 2011)

FIGURA 26: RESULTADO DE LA PIROSECUENCIACIÓN REALIZADA EN EL SUELO DEL SITIO.

La Figura 27 presenta los resultados de la pirosecuenciación del inóculo; donde se encontró en

mayor proporción a Pseudomonas fluorescens representando casi un 50 % seguido por un 40%

de Morganella morganii que pertenece a la familia de las enterobacterias. Comamonas

aquatica en un porcentaje mínimo de 1%. Pseudomonas se ha encontrado en diversos tipos de

cultivos, particularmente en el de fresas, aunque también se ha encontrado su capacidad para

degradar plaguicidas (Bandala et al., 2006; Torres et al., 2012). Morganella morganii es un

K. oxytoca21%

Bacillus sp17%

E. asburiae16%

B. cereus10%

Enterobacter sp9%

E. aerogenes7%

Achromobacter sp6%

B. oceanisediminis3% Otras

11%

50

microorganismo comúnmente encontrado en las plantas de tratamientos de aguas residuales;

sin embargo se ha demostrado su capacidad para la biodegradación de colorantes azoicos

(Pedraza et al., 2004).

FIGURA 27: RESULTADO DE LA PIROSECUENCIACIÓN REALIZADA EN EL INÓCULO.

La Figura 28 presenta los resultados del tratamiento a 100 ppm DDT. Se observa que

Comamonas aquatica constituye el 73% de los microorganismos presentes en el biofiltro

seguido de Stenotrophomonas maltophila con un 9% de presencia; se observa que

Pseudomonas fluorescens disminuye su porcentaje hasta 8%, pero permanece presente en el

proceso a pesar del aumento de concentración de plaguicida. Comamonas aquatica no se ha

relacionado directamente con la degradación de DDT o alguno de sus metabolitos (DDD y DDE)

pero se tiene reportes de su presencia en ambientes contaminados con clorofenoles y ha

demostrado su capacidad de biodegradación para PAHs (Liu et al., 2007; León et al., 2009).

P. fluorescens48%

M. morganii40%

C. aquatica1%

otras 11%

51

FIGURA 28: RESULTADO DE LA PIROSECUENCIACIÓN REALIZADA AL BIOFILTRO DESPUES DEL TRATAMIENTO DEL

AGUA CONTAMINADA CON 100 PPM DDT.

Finalmente en la Figura 29 se presentan los resultados que se obtuvieron para la concentración

de 500 ppm DDT. Comamonas aquatica representa un 29% de los microorganismos presentes

en el soporte, seguido de Leucobacter komagatae con un 16% de presencia. De estos,

Leucobarter kogamatae se ha encontrado en biopelículas de Celdas de Combustibles

Microbianos (CCM) para la producción de energía y en biopelículas utilizadas para degradación

de tolueno y contaminando tanques de combustible aéreo (Di Lorenzo et al., 2005). De igual

manera se vuelve a observar que Psudomonas fluorescens está presente en el BAS, es posible

que se trate la banda que se observa de forma constante en el DGGE de la Figura 24.

C. aquatica73%

S. maltophilia

9%

P. fluorescens8%

Otras10%

52

FIGURA 29: RESULTADO DE LA PIROSECUENCIACIÓN REALIZADA AL BIOFILTRO DESPUES DEL TRATAMIENTO DEL

AGUA CONTAMINADA CON 500 PPM DDT.

Era de esperarse que en este análisis la variedad de microorganismos presentes en el BAS

disminuyera; sin embargo, se observa una diversidad superior de microorganismos que

probablemente están relacionados de forma indirecta con la degradación del plaguicida ya que

existen diversas rutas de degradación reportadas (Ryan, 1995; Aislabie et al., 2010; Latha, 2012)

donde se producen diversos metabolitos. Se podría esperar de igual manera que la degradación

de mayores concentraciones de DDT se deba a una actividad sintrófica de las distintas

poblaciones en el sistema de biofiltración. Ha de precisarse que, dado que los BAS son sistemas

biológicamente abiertos a lo largo de un tiempo de operación prolongado, pueden ingresar

nuevas especies microbianas al sistema. Estos pudieron irse desarrollando a partir de un

número de intermediarios metabólicos acumulados en el sistema y producidos durante la

degradación del contaminante principal.

C. aquatica29%

L. komagatae16%

P. alcaligenes9%

Acinetobacter sp8%

A. faecalis8%

B. diminuta7%

P. fluorescens7%

Otras16%

53

8 Conclusiones.

El acoplamiento del LSAS utilizando surfactantes naturales con un BAS inoculado con los

microorganismos del suelo contaminado es eficiente en la remoción de contaminante, en este

caso, de los suelos contaminados con DDT.

En las muestras de suelo obtenidas del Ejido de la Finca no se detectó ningún plaguicida de tipo

organofosforado; de los organoclorados se detectaron el DDT, DDE y DDD. Estas cantidades que

fueron encontradas son consideradas como concentraciones históricas. Sin embargo, se

encontró evidencia de recientes aplicaciones al suelo de este plaguicida.

Al lavar el suelo proveniente del Ejido de la Finca, Estado de México, la muestra denominada

M003, el biopilomero más eficiente fue HPTAC-guar a una dosis del 0.05%, con una remoción

del 84.7%.

La goma HPTAC-guar presentó un comportamiento en las mediciones de tensión superficial

realizadas: para un porcentaje de remoción mayor de DDT hay una disminución en la tensión

superficial en la solución de lavado utilizada.

En el tratamiento de las aguas de lavado:

DDT: Las velocidades de degradación alcanzadas estuvieron entre 6.5 y 22.5 mgL-1d-1 Las

remociones de DDT alcanzadas en el BAS fueron en el rango de 25.7 y 87.5% para una

concentración de 500 ppm y 100 ppm respectivamente.

DQO: Las degradaciones estuvieron entre 53.5 y 87.36%, para 200 ppm DDT y 500 ppm

DDT respectivamente; estas representan velocidades de degradación entre 31.5 y 192.3

mgL-1d-1

Se caracterizó la población microbiana presente en el BAS responsable de la biodegradación de

DDT en suelo y en diferentes etapas durante la operación del sistema, mediante técnicas

moleculares como PCR, DGGE y Pirosecuenciación.

54

Mediante la pirosecuenciación de las muestras se corroboró la presencia de bacterias tales

como Pseudomona fluorecens, Pseudomona aeroginosa, Bacillus sp, Klebsiela pneumonia entre

otras previamente reportadas como bacterias que intervienen en la degradación de plaguicidas.

Con los datos de pirosecuenciación Comamonas aquatica está presente de forma significativa al

inicio y al final de la operación del biofiltro, lo cual puede indicar su relación con la

biodegradación de DDT.

De los microorganismos encontrados en el suelo, al ser transferidos, inoculados y seleccionados

por la concentración de DDT, se encontró Pseudomonas fluorescens (48%), Morganella morgani

(40%).

Se encontraron diversos grupos de microrganismos para los experimentos con concentraciones

de DDT diferentes. En el caso de 100 ppm DDT, dominó Comamonas aquatica (73%). Es posible

que en el caso de 500 ppm DDT se encuentre una mayor diversidad debido a la acumulación de

otros metabolitos del DDT.

55

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59

10 Anexos

ANEXO A

Tabla general de observaciones de la toma de muestras de suelo realizada.

Punto Observaciones ˚N ˚W

1 Bulbos de Gladiola, siembra reciente, aplicado aprox 1 mes.

18.8262331 -99.6690443

2 Ranchillo, no aplicado. 18.8678823 -99.6238434

3 Junto a la represa, no aplicado. 18.8678823 -99.6238434

4 Suelo recién preparado para siembra. 18.88225 -99.6219106

5 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.88231916 -99.62283119

6 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.8678823 -99.6238434

7 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.88259954 -99.62366842

8 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.88238588 -99.62432088

9 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.8678823 -99.6238434

10 Cultivo de fresa Camino Real, recién aplicado aprox 15 días, neomectin.

18.8678823 -99.6238434

11 Junto a canal de riego, no aplicado. 18.8678823 -99.6238434

60

ANEXO B Plaguicidas encontrados en el sitio de estudio.

Identificación B1 B2 M001 M002 M003 M004 M005 M006

Parámetro (Unidades) Resultado Resultado Resultado Resultado Resultado Resultado Resultado Resultado

HUMEDAD % 12.0293 13.7707 14.3637 12.5331 27.2833 17.9008 15.3177 18.8424

ALDRIN mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

BHC (ALFA, BETA Y DELTA) mg/kg

ND ND ND ND ND ND ND ND

CLORDANO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

DDD mg/kg ND ND 0.004897 ND 0.004786 ND ND ND

DDE mg/kg ND ND 0.020254 ND 0.018972 0.002261 0.004843 0.003784

DDT mg/kg ND ND 0.021968 ND 0.013628 0.002219 0.006302 0.004975

DIELDRIN mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDOSULFAN (ALFA Y BETA) mg/kg

ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDRIN mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

GAMA-BCH (LINDANO) mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

HEPTACLORO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

HEPTACLORO EPOXIDO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

HEXACLOROBENCENO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

METOXICLORO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

TOXAFENO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

DELTA-BHC mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDRIN ALDEHIDO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDOSULFAN SULFATO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

TOXAFENO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

DELTA-BHC mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDRIN ALDEHIDO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

ENDOSULFAN SULFATO mg/kg ND ND ND ND ND ND ND ND

61

ANEXO C

Detalle del estudio microbiológico proximal de suelo.

Se realizaron aislamientos de los microrganismos presentes en el suelo encontrándose tanto

bacterias como hongos; en el caso de las bacterias, que fueron cultivadas en agar nutritivo, se

encontraron 5 con diferente morfología, en este caso fueron 4 bacilos: 3 gram positivos y 1

gram negativo y únicamente una cepa de diplococos.

Clave A B C F G

COLOR Blanco Blanco Blanco Blanco Blanco

FORMA redondo redondo Puntlloso Redondo Redondo

BORDE Entero Rizoide Entero (ND) Rizoide Irregular

ELEVACIÓN Concava Elevada Elevado Umbonada Elevada

CONSISTENCIA Butirosa Cremosa Cremoso Butirosa Cremosa

LT/LR +/+ -/+ +/+ +/- +/+

TAMAÑO 5 mm 5 mm ND 7 mm 3 mm

GRAM + + - + +

TIPO Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos Diplococos

OBSERVACIONES En forma de arroz, largos

En cadenas, largos Invasivo Forma de "levadura", estriado

En el caso de los hongos los microcultivos realizados en agar extracto de malta y agar de agua

se identificaron por macromorfología de esporas encontrándose 2 del genero Aspergillus, 1 del

género Fusarium y 2 no generadores de esporas (NGE).

Clave Género

A Aspergillus

B Aspergillus

D NGE

E Fusarium

H NGE

62

ANEXO D

Parámetros medidos en el tratamiento biológico

100 ppm DDT

Tiempo (horas)

Color (u Pt-Co)

Turbidez DO

(600nm) pH

Conductividad

(S)

0 437 1.541 0.178 7.95 1438

24 370 0.457 0.151 8.78 833

48 341 1.213 0.129 8.49 1250

72 339 1.519 0.176 8.62 1672

96 415 1.886 0.119 8.59 392

120 322 1.494 0.163 8.66 248

144 452 2.348 0.124 8.31 1533

168 470 0.642 0.173 8.28 1802

192 413 1.637 0.174 8.34 1803

216 384 1.596 0.151 8.07 1202

240 347 1.098 0.121 7.96 1715

100 ppm + 50 mg/L HPTAC-guar

Tiempo (horas)

Color (u Pt-Co)

Turbidez DO

(600nm) pH

Conductividad

(S)

0 272 0 0.165 6.73 966

24 394 0.743 0.154 6.49 907

48 421 1.433 0.15 7.88 526

72 377 2.925 0.172 8.04 959

96 331 2.508 0.112 6.91 535

120 369 1.668 0.139 8.02 1019

144 411 1.198 0.141 6.75 532

168 470 1.522 0.144 6.74 1070

216 394 1.202 0.143 8.08 1146

240 496 1.231 0.208 8.12 1053

63

200 ppm DDT

Tiempo (horas)

Color (u Pt-Co)

Turbidez DO

(600nm) pH

Conductividad

(S)

0 398 0.202 0.406 8.55 233

24 354 0.184 0.244 8.42 1019

48 360 1.368 0.118 8.69 459

72 441 0.981 0.152 8.7 962

96 384 1.756 0.132 8.71 1311

120 442 1.704 0.154 8.5 1253

144 394 1.491 0.139 8.69 1523

168 478 1.774 0.185 8.31 1263

192 497 2.029 0.181 8.21 1270

216 494 1.874 0.174 8.37 1727

240 483 2.398 0.17 8.19 1271

300 ppm DDT

Tiempo (horas)

Color (u Pt-Co)

Turbidez DO

(600nm) pH

Conductividad

(S)

0 1084 1.094 0.069 6.98 387

24 1541 0.924 0.692 6.83 904

48 1566 0.678 0.669 6.96 921

72 1579 0.786 0.571 6.01 984

96 1654 1.232 0.571 7.39 988

120 1987 2.316 0.304 7.72 1003

144 1875 1.978 0.286 7.75 1051

168 1635 1.702 0.303 7.66 1061

216 1981 2.013 0.273 8 1183

240 1786 2.145 0.222 7.83 1193

64

500 ppm DDT

Tiempo (horas)

Color (u Pt-Co)

Turbidez DO

(600nm) pH

Conductividad

(S)

0 1077 0 0.149 6.55 261

24 1325 0.98 0.71 7.78 1231

48 1456 0.496 0.5 7.65 1080

72 1963 0.106 0.448 7.42 1123

96 2031 0.83 0.34 7.67 1088

120 1852 0.464 0.571 7.04 1132

144 1784 0.256 0.643 7.23 1325

168 1963 0.436 0.404 7.73 1140

192 1852 0.852 0.643 7.68 1161

216 1957 0.752 0.556 7.02 922

240 1984 0.842 0.475 7.12 1273

65

ANEXO E

Geles de agarosa.

Cada muestra se midió en una relación de absorbancias de OD260/OD280. Este valor debe estar

entre 1.8 (60% proteínas y 40% ácidos nucleicos, aproximadamente) y 2.0 (0% de proteínas y

100% de ácidos nucleicos). En el gel se pueden observar las diferentes bandas del DNA

genómico, si bien el marcador de peso molecular indica que el DNA tiene aproximadamente

más de 12,000 pb, por bibliografía se sabe que el DNA de las bacterias es aproximadamente de

15,000 pb. Lo cual se observa claramente que el ADN extraído está por arriba de la banda del

marcado de peso molecular de 12,000 pb.

FIGURA A: AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 16S RRNA

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FIGURA B: AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 16S RRNA