DISEÑO Y ELABORACION DE CONSTRUCCIONES CON LOS GENES crtW y Lcy-b PARA LA TRANSFORMACION GENETICA DE

CEMPAXUCHIL (Tagetes erecta)

INFORME TECNICO FINAL Avance reportado 100 %

PROYECTO DIRIGIDO POR: Dra. Alma Angélica del Villar Martínez.

PARTICIPANTES ARACELI SOLANO NAVARRO PABLO EMILIO VANEGAS ESPINOZA

Diciembre-2007.

CeProBi

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

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RESUMEN

Los carotenoides son necesarios en nuestra dieta ya que son precursores de la

vitamina A y se ha reportado que tienen funciones importantes en la salud;

actualmente son considerados como compuestos nutraceuticos. Los vertebrados

no sintetizan carotenoides, por lo que es necesario adquirirlos de los alimentos

para la producción de retinoides; éstos, son compuestos que se derivan del beta

caroteno. Se han clonado y caracterizado los genes que codifican para las enzimas

que participan en esta ruta de diferentes fuentes; con lo cual se ha logrado la

obtención de las herramientas necesarias para llevar acabo la manipulación

genética de los sistemas en donde se producen y acumulan los carotenoides. Se ha

reportado la información de la susceptibilidad de la ruta para su manipulación

genética; con lo cual se demuestra que las plantas pueden ser utilizadas como una

fuente para la obtención de nuevos carotenoides como es la astaxantina; en este

sentido el cempaxúchil representa una opción interesante debido a que de manera

natural se acumulan una cantidad importante de carotenoides en sus flores,

aunque el principal carotenoide en este sistema es la luteína; hemos realizado el

análisis de la expresión de los genes de la ruta de biosíntesis en cempaxúchil; y los

resultados apuntan hacia la regulación transcripcional. También, los puntos clave

en la ruta se ubican en el sitio en donde ocurre la ciclación del licopeno. En este

proyecto se plantea el diseño de construcciones con los genes Lcy-b de

cempaxúchil mediante el análisis de las secuencias de nucleótidos de los genes

mencionados anteriormente.

INTRODUCCIÓN

El cempaxúchil (Tagetes erecta) es una fuente importante de luteína, el extracto

de estas flores se ha utilizado como aditivo en algunos productos alimenticios. El

cempaxúchil no tiene la capacidad de sintetizar algunos carotenoides rojos, debido

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a que carece de la enzima β-caroteno cetolasa. La posibilidad de modificar la ruta

de biosíntesis de los carotenoides en esta planta por técnicas de ingeniería

genética conducirá a incrementar su eficiencia como material pigmentante y lograr

que sobre-produzca carotenoides con alto valor agregado. En este proyecto se

pretende elaborar construcciones con los genes que codifican para las enzimas

beta caroteno ciclasa y una cetolasa; con el fin de utilizar estas construccione

spara sobreexpresar el gen que codifica para la enzima beta caroteno ciclasa y

transferir el gen bacteriano denominado crtW al genoma de la planta de

cempaxúchil; con esto, se plantea la posibilidad de que la planta sintetice y

acumule los pigmentos rojos, el mejoramiento en la producción de carotenoides y

la modificación de la ruta de biosíntesis de estos pigmentos en flores de

cempaxúchil (Tagetes erecta).

I. INTRODUCCIÓN

El color en los alimentos es una de las características más importantes en lo que a

la evaluación de la calidad se refiere, seguida por el sabor y la textura (Delgado-

Vargas, 1997; Granado y col., 1997). Se ha demostrado que el color en un

alimento es capaz de reemplazar al azúcar y mantener la sensación de dulzura de

ciertos alimentos (Clydesdale, 1993). La preferencia por la utilización de los

pigmentos naturales se debe a las grandes críticas que han recibido los colorantes

sintéticos ya que se les ha relacionado directamente con la aparición de

enfermedades en los consumidores de productos que utilizaron estos colorantes

sintéticos como materia prima, además de un sentimiento generalizado que se ha

desarrollado en la sociedad de volver hacia los productos naturales (Delgado-

Vargas, 1997). Por lo mismo, el mercado de los pigmentos naturales está en

constante incremento, basta decir que para 1994, el consumo de los pigmentos

fue de alrededor de 265 millones de dólares de los cuales un 65% representó a los

pigmentos de origen natural; para 1998, el consumo de pigmentos naturales se

estimó en unos 939 millones de dólares y la tendencia continúa en forma

ascendente (Pszczola, 1998).

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II. ANTECEDENTES

El cempaxúchil (Tagetes erecta) es una planta perteneciente a la clase

Magnoliopsidae (Angiospermae), la subclase Dicotiledoneae, al orden Asterales y a

la familia Asteraceae (Compositae). Es una planta anual, erecta, de hasta 1.8 m

de altura, muy aromática al estrujarse. Sus tallos estriados, que pueden ser

glabros o pubescentes; sus hojas llegan a medir 20 cm de longitud, son pinnadas y

tienen de 11 a 17 foliolos, lanceolados o linear-lanceolados, alcanzando hasta 5 cm

de largo por 1.5 cm de ancho. Sus inflorescencias son cabezuelas que se pueden

presentar solitarias o agrupadas, sobre pedúnculos de hasta 15 cm de largo,

provisto de brácteas; el invólucro es campanulado, de 13 a 20 mm de alto por 9 a

25 mm de ancho (Penagos-López y Díaz-orozco, 1995). Las inflorescencias por lo

general son numerosas y su coloración se debe a la presencia de carotenoides de

los cuales el principal es la luteína (Delgado-Vargas y Paredes López, 1996).

La especie Tagetes erecta es originaria de México y se cultiva principalmente en

los estados de Veracruz, México, Tabasco, Chiapas, Hidalgo, Guanajuato y Sinaloa

(Mendieta y Del Amo, 1981). Esta especie se cultiva desde tiempos ancestrales,

principalmente con fines ornamentales ya que es utilizada tradicionalmente en

ceremonias religiosas relacionadas con los muertos, por lo que se le conoce

también con el nombre de "flor de muerto". También son conocidas sus cualidades

en la farmacopea tradicional por lo que se le usa como antiparasítico,

antiespasmódico, en el combate de enfermedades del estómago, bazo e hígado

(Delgado-Vargas y Paredes-López, 1997a; Guzmán-Maldonado y Paredes-López,

1998). Además de lo anterior, el pigmento de la flor de cempaxúchil ha sido

utilizado en la pigmentación de mantequillas y quesos. En la actualidad está

permitido su uso en los Estados Unidos y México como complemento alimenticio en

la producción de aves de corral, ya que este producto incrementa la pigmentación

en la piel de las aves y la yema de los huevos, características muy importantes

para su aceptación por el consumidor (Fletcher y Halloran, 1983; Fletcher y col.,

1986; Tyczkowski y Hamilton, 1986; Henken, 1992; Delgado-Vargas y Paredes-

López, 1997 b,c).

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El sistema de producción en el cultivo de la flor de cempaxúchil es mediante

transplante. Las plántulas se desarrollan en almácigos para ser transplantadas al

campo cuando alcanzan alrededor de 10 cm de altura (20 a 45 días). Los

rendimientos son muy variables dependiendo del manejo del cultivo, obteniéndose

desde 12 hasta 30 ton de flor/Ha en un máximo de 7 cortes (Mendieta y Del Amo,

1981; Penagos-López y Díaz-orozco, 1995).

Los carotenoides son pigmentos liposolubles que presentan coloraciones roja,

anaranjada y amarilla, contribuyen aportando coloración a flores y frutos en

diferentes etapas de desarrollo de las plantas (Bartley y Scolnik, 1995). Estos

compuestos se componene básicamente de una cadena hidrocarbonada de 40

átomos de carbono que se forman por la condensación de ocho unidades de

isopreno (Goodwin, 1980) y pueden ser lineales o bien, pueden contener ciclos en

su estructura química. Las etapas finales en la biosíntesis de carotenoides;

después de llevarse a cabo la ciclación del licopeno, involucran la introducción de

moléculas de oxígeno y por lo tanto la formación de xantofilas, compuestos que

contienen grupos funcionales oxigenados. Estas etapas finales son diferentes entre

organismos y da como resultado la amplia gama de carotenoides presentes en la

naturaleza. (Goodwin, 1980).

Los carotenoides son necesarios en nuestra dieta ya que son precursores de la

vitamina A y se ha reportado que tienen funciones importantes en la salud

(Palozza y Krinski, 1992); actualmente son considerados como compuestos

“nutraceuticos”. Los vertebrados no sintetizan carotenoides, por lo que es

necesario adquirirlos de los alimentos para la producción de retinoides; éstos, son

compuestos que se derivan del β-caroteno, el cual es capaz de aportar dos anillos

β-ionona para su formación.

Por otra parte, se tienen reportes de la capacidad antioxidante de los carotenoides;

y se ha planteado que esta característica se debe a la estructura de la molécula.

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Específicamente hablando de la astaxantina se sabe que aporta la característica de

color al salmón, trucha y camarón; con relación a los efectos benéficos se ha

reportado que ayuda al buen funcionamiento del sistema inmune en humanos

(Jyonouchi, 1995), reduce la carcinogenesis oral en ratas (Tanaka, 1995) e inhibe

el crecimiento de tumores de mama en ratones (Chew, 1999); de la misma

manera se ha señalado que estas propiedades se deben a su poderosa capacidad

antioxidante.

Se han clonado y caracterizado los genes que codifican para las enzimas que

participan en esta ruta de diferentes fuentes; con lo cual se ha logrado la

obtención de las herramientas necesarias para llevar acabo la manipulación

genética de los sistemas en donde se producen y acumulan los carotenoides

(Cunningham y Gantt, 1998).

En estudios previos se ha logrado la expresión de crtI (fitoeno desaturasa) en

Nicotiana tabacumm para conferir resistencia a un herbicida; en este intento,

además se provocó un cambio cuantitativo en los carotenoides producidos en las

xantofilas de hojas (Misawa y col.,1993). Fray y col., (1995), reportaron la

expresión de psy (fitoeno sintasa) de jitomate; en las plantas transformadas se

observó enanismo en las plantas, debido a la redirección de la ruta con una

disminución en la síntesis de giberelinas. Se ha logrado elevar los niveles de β-

caroteno por la expresión constitutiva de crtI (fitoeno desaturasa de Erwinia

uredovora) y crtL (licopeno ciclasa de Arabidopsis thaliana) en los frutos de

jitomate (Roemer y col., 2000; Rosati y col., 2000). Recientemente se logró el

incremento de licopeno en los frutos del jitomate como resultado de la

manipulación de la ruta de biosíntesis de carotenoides mediante la expresión

tejido-específica de crtB (fitoeno sintasa) de Ewinia uredovora. Con estos trabajos

se tiene la información de la susceptibilidad de la ruta para su manipulación

genética.

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La ingeniería metabólica de los carotenoides se ha logrado recientemente en

algunas plantas como es el caso de las semillas de arroz y canola en donde se

logró el incremento de β-caroteno (Ye y col., 2000; Shewmaker, y col., 1999). En

el caso de arroz, se observó que psy y crtI fueron suficientes para lograr la síntesis

de licopeno, β-caroteno y zeaxantina, esto significa que tanto la β-ciclasa como la

hidroxilasa están presentes en el endospermo, lo cual simplifica la transformación.

En este trabajo se logró la formación de 200 µg de β-caroteno por cada 100 g de

arroz; este trabajo es un logro de alto impacto para los países en donde se tienen

graves problemas por deficiencia de vitamina A.

Con relación al trabajo realizado en canola se sabe que la expresión del gen crtB

fusionado a un péptido de transito plastídico, bajo el control de un promotor

específico de semilla fue suficiente para obtener β-caroteno en cantidades

similares a las encontradas en el aceite de palma (Shewmaker, y col., 1999).

En las flores de tabaco, se ha logrado la producción de carotenoides que no son

comunes en plantas (Mann y col., 2000). En este trabajo se observó que los

cromoplastos del néctar de las plantas transgénicas acumularon astaxantina y

otros cetocaroteniodes debido a la expresión de β-caroteno cetolasa de

Haematococcus pluvialis en los cromoplastos de néctar, en donde se sintetizan β-

caroteno y xantofilas. Cosecuentemente, se logró el cambio en la coloración del

néctar de amarillo a rojo (Mann y col., 2000). Con esto se demuestra que las

plantas pueden ser utilizadas como una fuente para la obtención de nuevos

carotenoides como es la astaxantina; en este sentido el cempaxúchil representa

una opción interesante debido a que de manera natural se acumulan una cantidad

importante de carotenoides en las flores de las plantas, aunque el principal

carotenoide en este sistema es la luteína; el análisis de la expresión de los genes

de la ruta de biosíntesis apunta hacia regulación transcripcional y los puntos clave

en la ruta se ubican en el sitio en donde ocurre la ciclación del licopeno (Del Villar

y col., 2003; Moehs y col., 2001).

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OBJETIVO

Manipular el material genético y obtener las construcciones necesarias para llevar

a cabo la transformación genética del cempaxúchil

MATERIALES Y MÉTODOS

Mantenimiento de cepas: Para el mantenimiento de las cepas de E. coli es

necesario llevar a cabo la preparación del medio LB adicionado con el antibiótico

de selección específico para cada plásmido. El vector que contiene el cDNA que

codifica para la beta ciclasa posee además, un gen que le confiere a la bacteria,

resistencia a la ampicilina. El medio de cultivo adicionado con ampicilina es el

adecuado para mantener a la bacteria y de esta manera conservar el material

genético que nos interesa.

Minipreparación de ADN plasmídico; método de lisis alcalina: La extracción de DNA

plasídico, es necesaria para tener el control del material genético clonado, de

manera que en cada resiembra es necesario llevar a cabo el monitoreo del DNA

de cada cepa. El procedimiento se maneja de la manera siguiente:

1.- Obtener el cultivo de colonias de bacterias.

2.- Usar un palillo estéril, picar solo una colonia y colocarla en un tubo estéril que

contenga 2.5 ml de medio de cultivo adicionado con el antibiótico de selección

adecuado.

2.- Incubar el tubo en agitación constante a 37ºC durante 12 a 16 h o toda la

noche.

3.- Para conservar una muestra de la minipreparación se mezclan 200 µl del cultivo

con 200 µl de una solución de glicerol al 30 % (v/v), congelar en nitrógeno líquido

y almacenar los tubos a –70 ºC.

4.- Transferir el cultivo restante a tubos eppendorf y centrifugar durante un min a

temperatura ambiente.

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5.- Desechar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 100 µl de la solución I,

aplicar vórtex e incubar durante 5 min. A temperatura ambiente.

6.- Adicional 200 µl de la solución II, mezclar por inversión e incubar en hielo

durante 5 min.

7.- Adicionar 150 µl de la solución III, mezclar por inversión y centrifugar durante

30 min

8.- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar la pastilla

9.- Adicionar 1000 µl de etanol, mezclar bien y centrifugar durante 15 min.

10.- Lavar la pastilla con etanol al 70 % y eliminar todo el etanol.

11.- Resuspender la pastilla en 50 µl de agua destilada estéril o buffer TE.

Electroforesis de DNA: Para visualizar el material genético extraído, se realizó la

electroforesis en gel de agarosa al 1%, la corrida se llevó a cabo a 70 V durante

40mmin.

Ensayos de restricción: Se realizaron ensayos con enzimas de restricción para

monitorear la presencia del DNA en las cepas bacterianas.

preparacion de particulas de oro: Las partículas se deben prepararon un día antes

del bombardeo. Se pesaron 60 mg de partículas de oro en un tubo eppendorf se

agrego 1 ml de etanol absoluto y se aplico vortex durante 3 minutos se

centrifugo de 2 a 5 minutos a 13000 rpm y descartamos el sobrenadante se

agrego 1ml de etanol al 70% aplicándole vortex durante 2 minutos , se incubo la

muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifugo a 13000

rpm durante 3 minutos y eliminamos el sobrenandante se agrego 1 ml de agua

destilada estéril dándole vortex durante 1 minuto se dejaron reposar las

partículas durante 1 minuto a temperatura ambiente y se centrifugo a velocidad

máxima durante 2 minutos, se realizaron nuevamente los lavados se agrego 50%

(v/v) de glicerol y se almacenaron a -20º C.

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particulas + dna : A las microparticulas se les dio vórtex durante 1 minuto y

posteriormente se sonicaron, se aagregaron 50 µl de la suspensión de partículas

(6 mg/ml) y se agrego 12 µl de DNA

(1 g por ml) se adicionaron 50 µl de cloruro de calcio 2 M y se aplico vórtex, se

adicionaron 20 µl de espermidina (5M) se aplico vórtex y se agito suavemente

durante 15 minutos vortex en el cuarto frio, posteriormente se ccentrífugo a

1000rpm durante 20 segundos, eliminamos el sobrenadante y lavamos con 50

microlitos de etanol al 70 por ciento, sonicamos durante 1 minuto Centrifugar a

10K durante 20 segundos y se elimina el sobrenadante Resuspender en 50µl de

etanol absoluto y se transfierio a hielo Agregamos 75 µl de a suspensión al filtro

para bombardear. Un tubo rinde 5 disparos

preparacion de muestras a bombardear: Se prepara medio MS-15 % maltosa y se

colocaron las muestras de callo y hoja en este medio durante un periodo de cuatro

horas antes de comenzar el bombardeo

uso de la pistola de bombardeo: Se limpió con alcohol la pistola y todo el

equipo, se sumergieron en alcohol absoluto los materiales (macro, micro carrier,

holders, mallas) se dejaron secar en cajas petri, se abrió el gas de helio verificando

que el manómetro de la derecha estuviera a 2000 y el de la izquierda a 1600, se

conecto y encendió la pistola, se encendió la bomba de vació verificamos que

entre el vació, se coloco la macro en el holder, y se coloco el DNA, se colocaron las

piezas y base de plastico a una distancia de 11 y se coloco la muestra a

bombardear, se cerro la pistola, se coloca vació (verificando que suba arriba de 20

hg) se dio el disparo, se ingreso aire se abrió la pistola, sacamos la muestra, para

apagar el equipo se ingreso vació para apagar la bomba de vació y cerrar la

bomba de helio y se dio un disparo para purgar

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RESULTADOS:

Mantenimiento de cepas: Se tienen en el CEPROBI-IPN las cepas que contienen los

plásmidos que portan los genes que codifican para las enzimas beta cilasa, épsilon

cilasa y crtW. Las cepas se han conservado y mantenido mediante resiembras

periódicas y se está trabajando en el análisis de las secuencias y los posibles

vectores para iniciar los ensayos de transformación en el CINVESTAV-IPN Unidad

Irapuato..

Las secuencias de cDNA que codifica para beta ciclasas y crtW se han analizado.

Con ellas se han realizado la extracción y purificación de los plásmidos y se ha

trabajado con los análisis de restricción.

Construcciones para la transferencia genética:

A continuación se presentan las construcciones que se tienen hasta el momento.

Ambas se han utilizado para llevar a cabo el establecimiento de las condiciones

para la introducción del material genético al genoma de cempaxúchil.

La construcción denominada pHKB, está diseñada para expresarse en cloroplasto,

de manera que al insertarse, la expresión se verá reflejada en el sitio de síntesis y

acumulación de los carotenoides. Adicionalmente se han realizado observaciones a

nivel ultraestructural de callo de cempaxúchil y hemos observado la presencia de

plastidos en diferentes etapas de desarrollo, lo cual, indica la posibilidad de éxito al

β-licopeno ciclasa Prrn TrbcL

pHKB

Rps12/

aadA

Xba I Xba I

Región homóloga

Región homóloga

trnV

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transformar callo con ésta construcción. Los resultados de estos estudios se

encuentran en etapa de análisis.

La construcción denominada pCB35S, está diseñada para lograr su expresión

constitutiva, es decir, a todos los niveles en una planta.

Además de estas construcciones se realizaron ensayos de transformación con el

plásmido pBI426, para validar la eficiencia de las condiciones de transformación.

Es importante señalar que en este proyecto no está comprometida la

transformación genética y se han realizado los experimentos que contribuyen

sustancialmente a lograr la introducción del gen en un sistema de células

desdiferenciadas.

MANTENIMIENTO DE CALLOS DE CEMPAXÚCHIL.

Los callos de cempaxúchil (fig 1), se mantuvieron en medio MS (Murashige y

Skoog, 1962), adicionado con BA (bencil aminopurina) y 2,4-D (ácido 2,4

diclorofenoxiacético) con una concentración de 2 mg/L, hasta su utilización en el

tratamiento de bombardeo.

ß-licopeno ciclasa 35S NOS

pCß35S

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Figura 1: Callo de cempaxúchil desarrollado en medio MS adicionado con

reguladores de crecimiento, a partir de explantes de hoja de

cempaxúchil.

Ensayos de transformación transitoria en callos de cempaxúchil.

En el caso de la transformación por biobalística, se uso el sistema de

bombardeo de alta presión (Finer y col., 1992). Para una recuperación máxima de

transformantes estables es necesario disminuir el daño al tejido para tener una

mayor viabilidad celular. Un precultivo en medio con altas concentraciones de algún

compuesto osmótico puede incrementar la supervivencia celular al reducir la presión

de turgencia, lo que permite disminuír el daño celular al evitar fugas del citoplasma

(Birch 1997; Christou 1996, Hunold et al, 1994). El número de foci después del

tratamiento del tejido con manitol a una concentración 0.2 M rindió solo el 50% del

número de foci obtenidos por bombardeo, después del tratamiento con sorbitol a una

concentración 0.2M. El medio con manitol y sorbitol dio como resultado sólo el 30%

del tratamiento con sorbitol. A partir de estos ensayos se determinó que el

tratamiento con sorbitol 0.2M era el más recomendado para la expresión en tejido

inducido de hojas (Figura 2).

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Expresión del gen

uidA Expresión del gen

uidA

Fig 2: Muestra de callo de cempaxúchil expuesta en medio osmótico

previo a los ensayos de biobalística.

En la Figura 3 se observan algunos de los resultados obtenidos tras los análisis de β-

glucuronidasa en tejido inducido. En las fotografías se resaltan los puntos azules

producto de la reacción química del gen gus A (B y C), que contrastan con la

ausencia de estas señales en el control negativo (A).

Figura 12 . Imagen de callos bombardeados en la cual se observa que en la combinación de 6201 Kpa y distancia de 9 cm (a) se obtuvo el mejor nivel de

expresión del gen uidA, en tanto que en la combinación de 6201 Kpa y distancia de 11 cm se mostró muy poco nivel de expresión

a b

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Los otros parámetros seleccionados fueron la presión utilizada para la aceleración de

partículas y la distancia entre el acelerador de partículas y el tejido blanco. Las

condiciones iniciales fueron 60, 80, 100 y 120 PSI (libras por pulgada cuadrada) de

presión y 7.5, 10.5, 13.5 y 16.5 cm de distancia. En la gráfica 2 se reportan los datos

del efecto de la presión de helio para la aceleración de las partículas de tungsteno-

DNA y la distancia al tejido blanco.

La expresión transitoria del gene GUS incrementa de una presión de 60 PSI a 80 PSI

y disminuye cuando la presión aumenta a 100 y 120 PSI. La combinación con

distancia nos indica que la mejor respuesta se logró con una distancia de 10.5 cm y

una presión de 80 PSI. Este resultado representa el equivalente a una y dos veces el

número de foci a 60 PSI y 13.5 cm y 120 PSI con 13.5 cm respectivamente. A una

mayor presión el número de foci disminuye. De esta forma se seleccionó una presión

de 80 PSI y 10.5 cm de distancia para los siguientes experimentos de bombardeo.

En reportes previos ya se han estudiado diferentes factores para la optimización del

bombardeo de partículas en diferentes especies vegetales, entre estos factores se

han estudiado la conformación y concentración de DNA, el tipo de partícula, así como

el tejido seleccionado para el bombardeo, entre otros (Cabrera-Ponce et al, 1995;

Finer et al, 1992; Hunold et al, 1994; Nandeva et al, 1999). El objetivo principal en

estos estudios fue establecer las condiciones en que se lograba una mayor expresión

de los genes marcadores con el mínimo de daño del tejido. En estos ensayos sólo

una pequeña proporción de las células del tejido blanco reciben las partículas de DNA

y sólo una porción de estas células sobrevive el tratamiento e integra el DNA de

manera estable (Birch 1997).

De los experimentos de expresión transitoria podemos desprender que las tres

variables probadas influyeron en el resultado registrado como número de foci en el

tejido. Finer y col.,(1992) y Hunold (1994) reportaron el efecto de la presión en la

expresión transitoria de células embriogénicas de maíz y hojas de tabaco utilizando la

pistola de baja presión. En estos reportes el número máximo de foci fue alcanzado

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con menos de 100 PSI. En el presente reporte el número máximo de foci se logró

con 80 PSI, cuya razón sea posiblemente el tipo de tejido; que es un factor también

a considerar cuando se establecen las condiciones de expresión transitoria. La

distancia al sitio blanco también mostró un efecto notorio en la expresión de gus,

donde la combinación, resultando la combinación de 10.5 cm con 80 PSI la mejor

opción.

La exposición a diferentes tratamientos osmóticos tuvo efecto en el rendimiento

reportado en número de foci. En otros sistemas se ha encontrado repetidas veces un

incremento en la expresión transitoria por efecto del efecto osmótico (Nandadeva et

al.,1999). Es notorio el efecto del tratamiento osmótico sobre la expresión

transitoria; la falta de este tratamiento se refeleja en una disminución cercana a cero

en la expresión transitoria (dato no mostrado). Se asume que la exposición del tejido

blanco al tratamiento osmótico aumentó las posibilidades de sobrevivir al bombardeo

a este tejido (Christou, 1996). De esta forma se optimizaron los parámetros para la

transformación genética estable.

IMPACTO: La generación de tecnologías que conduzcan a la transformación y

regeneración de cempaxúchil (Tagetes erecta), así como a la producción de

carotenoides altamente pigmentantes en cempaxúchil transgénico puede llegar a

producir grandes beneficios a las industrias de los alimentos, forrajes y

farmacéutica. Los mercados mundiales para la cantaxantina y la astaxantina se

estimaron en alrededor de 250 millones de dólares en 1996. Las flores de

cempaxúchil poseen ya de por si altos contenidos de luteína. Como resultado de la

introducción de genes determinantes en dicha planta, la ruta de carotenogénesis

será redirigida hacia la síntesis de cantaxantina y astaxantina, con lo cual se puede

esperar una alta sobreproducción de ambos carotenoides en cempaxúchil. Los

nuevos pigmentos obtenidos tendrían un fuerte impacto en la industria alimentaria

tanto para consumo humano como animal.

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VIII. BILIOGRAFIA

Altuschul,S.F.; Madden T.L.; Schaffer A.; Zheng Zhang J.; Miller W. and Lipman. D.1997. Gapped Blast and Psi Blast and Psi-blast: generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Al-Babili, S., Hobeika, E. and Beyer, P. 1996. A cDNA Encoding Lycopene Cyclase from Narcissus pseudonarcissus L. Plant Physiology. 112:1398-1398. Alvarez, J.C. 1994. Los carotenoides: pintan bien. Tecno-Industria. Agosto-Septiembre. pp. 24-27. Bradley, D.; Ratcliffe O., Vincent C., Carpenter R and Coen R. 1997. Inflorescence commitment and architecture in Arabidopsis. Science. 275: 80-83. Birch, R.G., 1997. Plant Transformation: problems and strategies for practical application. Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 48:297-326. Cabrera-Ponce, J.L., Vegas-Garcia A. and Herrera-Estrella L., 1995. Herbicide resistant transgenic papaya plants produced by an efficient particle bombardment transformation method. Plant Cell Rep. 15: 1-7. Christou, P.,1996. Particle Bombardment for genetic engineering of plants. Academic Press. New York. USA. 199 pp. Coupland, G. 1995. Leafy blooms in aspen. Nature. 377.482-483. Cunningham, F.X. Jr., Pogson, B., Sun, Z., McDonald, K.A., DellaPenna, D. and Gantt, E. 1996. Functional analysis of the beta and epsilon lycopene cyclase enzymes of Arabidopsis reveals a mechanism for control of cyclic carotenoid formation. Plant Cell. 8:1613-1626. Cunningham, F.X. Jr. and Gantt, E. 1998. Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 49: 557-583. Clydesdale, F. M. 1993. Color as a factor in food choice. Cri. Rew. Food Sci. Nut. 33. 83-101. Dalta, R.S., Hammerlindl J.K., Pelcher L.E., Crosby W.L. and Selvaraj G., 1991. A bifunctional fusion between B-glucuronidase and neomycin phosphotransferase: a broad spectrum marker enzyme for plants. Gene. 101:239-246. Delgado-Vargas, F. and Paredes-Lòpez, O. 1996. Correlation of HPLC and AOAC methods to assess the all-trans-lutein content in marigold flowers, J. Sci. Food Agr. 72:283-290.

19

Delgado-Vargas, F. and Paredes-Lòpez, O. 1997a. Enzymatic treatment to enhance carotenoid content in dehydrated marigold flower meal. Plant Foods Hum. Nut. 50:163-169. Delgado-Vargas, F and Paredes-Lòpez, O. 1997b. Effects of enzymatic treatments of marigold flowers on lutein isoformeric profiles, J. Agr. Food Chem. 45:1097-1102. Delgado-Vargas, F. and Paredes-López O. 1997c. Effects of enzymatic treatments on carotenoid extraction from marigold flowers (Tagetes erecta). Food Chem. 58: 255-258. Del Villar-Martínez A. A., Ma R. and Paredes-López O. 1999. Molecular characterization of cDNAs encoding 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in marigold (Tagetes erecta). J. Plant Physiol. 155: 205-211. Finer, J.J., Vain P., Jones M. W. and McMullen M.D., Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant. Cell. Rep. 11:323-328. Fletcher, D. and Hallloran, H.R. 1983. Egg yolk pigmenting properties of a marigold extract and paprika oleoresin in a practical type diet. Poultry Sci. 62: 1205-1210. Fletcher, D. Papa C. M. and Tirado F. 1986. The effect of saponification on the broiler coloring capability of marigold extracts. Poultry Sci. 65: 1708-1714 Granado, F. Olmedilla B., Blanco I., Gil-Martínez E. and Rojas-Hidalgo E. 1997. Variability in the intercomparison of food carotenoid content data: a user´s point of view. Cri. Rew. Food Sci. Nut. 37: 621-633. Guzmán-Maldonado, H. and O. Paredes-López. 1998.Functional products of plants indigenous to latin america: amaranth, quinoa, common beans and botanicals. En: Functional foods. Biochemical and processing aspects. G. mazza8Ed.) tech nomic Publishing Co. Inc USA. Hempel, F., Zambryski P. and Feldman L .1998. Photoinduction of flower identity in vegetatively biased primordia. Plant Cell. 10: 1663-1675. Henken, H. 1992. Chemical and physiological behavior of feed carotenoids and their effects on pigmentation Poultry Sci. 71: 711-717. Hunold, R., Bronner R. and Hahne G., 1994. Early events in microprojectile bombardment: cell viability and particle location. Plant. J. 5: 593-604.

20

Jefferson, R.A., Kavangh T.A. and Bevan M. W., 1987. GUS fusions: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907. Klein, T.M., Fromm M., Weissinger A., Tomes D., Schaaf S., Sletten M. and Sanford J.C., 1989.Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity projectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 4305-4309. Mandel A., Gustafson-Brown C., Savidge B. and Yanofsky M.F. 1992. Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA 1. Nature. 360: 273-277. MendietaR. M. y Del Amo S.M. 1981. Plantas medicinales del estado de yucatán 1ª. Edición, Instituto Nacional sobre Recursos Bióticos. CECSA México. Nandadeva, Y.L., Lupi C.G., Meyer C.S., Devi P. S., Potrikus I. and Bilang R., 1999. Microprojectile-mediated transient and integrative transformation of rice embryogenic suspension cells: Effects of osmotic cell conditioning and of the physical configuration of plasmid DNA. Plant Cell. Rep. 18: 500-504. Mandel A., Gustafson-Brown C., Savidge B. and Yanofsky M.F. 1992. Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA 1. Nature. 360: 273-277. Nuñez-Elisea, R.and Davenport T. 1995. Effect of leaf age, duration of cold temperature treatment and photoperiod on bud dormancyrelease and floral initiation in mango. Sci. Hort. 62: 63-73. Page, T.; Macknight R., Yang C and Dean C. 1999. Genetic interactions of the Arabidopsis flowering time gene FCA, with genes regulating floral initiation. Plant. J. 17:231-239. Pecker, I., Gabbay, R., Cunningham JR, F.X. and Hirschberg, J. 1998. Cloning and characterization of the lycopene cyclase gene from tomato. Unpublished No Acceso X86452.

Pena, L.; Martín-Trillo M., Juárez J.A., Navarro L. and Martínez-Zapater J.M. 2001. Constitutive expresión of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their regeneration time. Nat. Biotechnol. 19: 263-267. Penagos-López, E. y Díaz-Orozco, D. 1995. El cempaxúchil. Agricultura. 8-9. Pszczola, D.E. 1998. Natural colors: pigments of imagination . Food. Tech. 52: 72-82.

21

Ronen, G., Carmel-Goren, L., Zamir, D. and Hirschberg, J. 2000. An alternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of Beta and old-gold color mutations in tomato. Proc, Nat.. Acad Sci. U.S.A. 97:11102-11107. Ronen, G., Cohen, M., Zamir, D. and Hirshberg, J.1998. Regulation of expression of the gene for lycopene epsilon cyclase during fruit ripening of tomato. Unpublished No Acceso Y14387. Sambrook, J.; Fritsch E.F. and Maniatis T.1987. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor. Laboratory Press. New York. USA. Sandman, G., Albercht, M., Schnurr, G., Knörzer, O. and Böger, P.1999. The biotechnological potential and design of novel carotenoids by gene combination in Escherichia coli. TIBtech. 17: 233-237. Schuler, M. and Zielinski R. 1989. Methods in plant molecular biology. Academic press. New York, USA. Pp 89-96. Tyczkowski and Hamilton P.B.1986. Absortion, transport and deposition in chickens of lutein diester, a carotenoid extracted from marigold (Tagetes erecta) petals. Poultry Sci. 65: 1526-1531.

Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.R. and Meyerowitz E. 1992. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. Cell. 69: 843-859.

Weiggel D. and Nilson O.1995. A developmental switch sufficcient for flower initiaton in diverse plants. Nature.377: 495-500.

Zhang, D.; Armitage A.M., affolder, J.M. and Dirr M.A. (1996). Environmental control of flowering and growth of Achillea millefolium L. “summer pastels”. HortSci. 31: 364-365.