<,TULO

INPORI~F: FINAL SOBRE EL PROYECPO AYUDANTI TIA EN LA DOCEK

C I A DEL CURSO DE MBORATORIO DE BIOLOGIA JKWXLAR’QUE PL RA CUMPLIR CON EL SERVICIO SOCIAL PRESENTA EL PASANTE DE -

I/ INGENIERIA BIOQUIRIICA INDUSTRIAL, MIGUEL BUENDIA JIMENEZ - Caacsru

CON NUHERO DE CUENTA 77328046, EL CUAL TUVO UNA DURACION DE

CUATRO TIZIMESTRES;2RINCIPIAIVDO EN EL MES DE SEFI!IEHEF¿E DE- i980 y FINALIZANDO EN DICIEMBRE DE L981.

A SISTENTE :

I / MIGUEL BUENDLA JIMENEZ

J ASESOR y

GONZALJZZ CEREZO.

C O N T E N I D O .

pag Int ro duoc $4n

Antecedentes - . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Problemas y soluciones aplicadas . . . . . . . . . . . 10

Bugeremias aplicables a l curso . . . . . . . . . . . 14

Metodología para l a evaluaci4n del alumno y tiempo

empleado en actividades propias de l cum0 . . . . . . 17

Conclueiones. .................... 22

I N T R O D U C C I O N .

E l presen t e reporte tiene por objeto informar sobre las ac-

tividades desarPolladas durante e l tiempo destinado a l a rea - i izacidn de mi servicio socia l , el cual se l levo acabo en

los laboratorios de CBS, de l a Universidad Autdnoma Metropo-

l i tana , desempeñando l a funci6n de profesor asistente del - curso de laboratorio de Biología Molecular, bajo l a aaesoria

del m. en Phil . Héctor ~ o m t á ~ e a Cere50. profesor titular de

l a U . E . A.

~l desarrollo de éste S.S. tuvo uaa duración de cuatro tri - mestres en los cuales tuve la oportunidad de hacer una ser ie

de observaciones acerca de a l m s de las deficiencias que

se presentan en éste tipo de actividades, como es e l caso de

l a deficiencia en matekiales y reactivos para la plena reali

aacidn de un experimento, entrie otras cosas.

Por l o tanto e l informe consta inicialmente de una descrip - cidn global amnera de c r í t i ca , acerca de las deficiencias

que se encuentran amenudo en éste tipo de curaos; asi como

l a metodología aplicada en cada uno de l o a experimentos

consta 6ste.

En seguida ae plantean algunos de los problemas encontrados

en e l curso y slgunas de las modificaciones efectuadas almis

mo, as r como sum comecuencias.

Posteriormente se anotan algunas sugerencias que a mi crite-

r i o , ser ian de mucha util idad, para cubrir de mejor manera

los objetivos del curso antes mencionado.

Acontinuaci6n se proporciona Una pequeña informacidn acerca

de l a metodología empleada en la evaiuacidn del alumno asi

corn un aesglosamiento general del tiempo empleado en caüa

una de las actividades que involucra el desarmlo del S. s.3

-

que

- -

L.

. _"

a e i como e l tota l de alumnos a m i cargo.

Por atimo, en anexos está contenida l a metodología de los

exprimentoe que se augieren aplicables alcurso de laboratoa

r i o de Bio log ía b i e cu i a r .

1

ARTECEDENPES I

E l curso pr6ctico constaba de prácticas ya aprobaaas por l o s

órganos colegiados de l a U A M y eon l a s siguientesi

- Preparación de material e s t é r i l y nmdios de cult ivo - Obtención de h i d o desoxirribonucleico y ribonucleico bac-

- Analisis de l a composicih en bases de los.doidos nucleico

- Mutagenesis

Este grupo de prácticas requería para su real ización equipo

y materiales t a l e s como:

- Balanzas

- Incubadoras

teriano,

- Estufas

- REfrigerador

- Potenciometros

- Centrifugas

- Camaras de cronmtograffa

- Vidriería en general

- Nutrientes

- Soluciones

E l grupo constaba siempre de unos 40 6 d a alumnos divididos

en 2 subgrupos una vez por semana.

Por l o anterior se tubier6n que implementar prácticas que

cubr iedn l o s siguientes requisitos minimos, s i n sa l i r se de l

patron exigido para este cwso. Estos requisitos son: Conocimiento, manejo, extraccidm y caracterieacidn de moro-

miecuiae informacionales CDNA,RNA) y i a u t i l i zac ión a0 agen - t e s f ísicos(1uz UV.) en l a producción e ident i f icacidn de mu - tantes. Con ese propdeito se introdujerón algunas enmiendas como son

2

. .-

I

I-

. -

.-

A) . Desde e l punto de v i s ta p d c t i c o se citan: 1. Uso de papel indicador en vez de pHmetro

2. Uso do balanza granatarla d a que l a e lectr ica

3. Vso casi exclusivo de centrifuga c l in ica no refrigerada

4. Ausencia t o t a l de uao de espectmfotdmetro

Se encuentra muchas def iciencias para implementar estas prdc - t i cas par ejemplo:

E l equipo caro(centrifugas, pHmetro), son inaccesibles a l

estudiante por tanto tuvo que ser sustituido por equipo m- nos sofisticado.

Los reactivos y equipos especif icos en l a mayoria de los casos tienden a escsearse debido a que varios grupos de l a

misma materia los uaan simultaznamente por Ejem. Lisosima

y camaras de cromatografía

No se cuenta siempre con un Stocgde cepas n i hay forma de

mantenerlas por tiempos largos debido a l mi. estado de los

refrigeradores o bien porque se u t i l i z an para otros grupos Loa alumnos carecen en este momento de entrenamiento adeca - ado en e l manejo de equipo y reactivos ya que no han cursa - do aspectos practicos de instrumentacibn, n i en Bioquimica

@is Desde e l punto de v is ta de l a s rriacromlecuias , se h i c i e - ron otros ajustes.

1. Uti l isacibn de bazo de perm en ves de Bacillus Subtilis

y/o E. aiIi 2. ~eterminación cualitat iva de &croorganismos Gram (+) y

G r a m (-) como práctica de relleno.

E l desarrollo de estas actividades produjo los siguientes be - nef ic ios :

. .. C).

. .-

..-

. .-

._ e )

.--

. ..

,.

*-

I

.._.

3 A l a UAM l a utilieclbi$a alternativa de SUB recuraos f i - sicos y humanoa.

e l planteamiento de nuevas alternativas ut i l ieablea -- f rente a grupos mayores.

A l interesado l a presentación, direccidn y c r i t i c a de

un experimento f r e d e a un grupo.

io anterior ae reiaciopr con l a formacibn de un nuevo

recurso docente.

La apiicaci6n de I r o w ~ o a de Ciencia bdsica, microbiolo - gis, Bactierkologia, Química ,e iastrumentacidn, todaa

e l l o s parte de la formacidn d e l 1%. Bioquímico y d i r i -

gidas en éste caso a alumnos de n i v e l introductorio.

Acontinuacidn se describe en forma general l a metodología de

l a s prácticas antes measionadas:

PRACTICA 1.

Preparación de nater ia l e a t é r i l y medios de cultivo.

E l metodo empleado en esta práctica ea relativamente senc i l lo

y consiste en:lavar adecuadamente e l i3lateriaL de v idr io que-

se desea ut i l i za r ( cajas pe*ri, pipetas, tubos de ensaye,etc

Se preparan los componentes de loa medios de cult ivo y se a

ajustan a pH 7, atendiendo a l a f o r ~ a c i b n .

Se prepstran tapones de gasa y algoaon y se tapa e l material

que a s í l o requiera( incluyendo matraces con medio de cult i -

vo). Las cajas petri se envuelven en papel de estraea y l as pipe-

tas se introducen en un pipetero.

Una vez hecho l o anterior, se COlOC8. e l material en horno 6 autoclave segun convenga para su eateri i ieación.

Después de l a es te r i i i eac ión y de 18 a 24 Hra. antes de l a - siguiente práctica, ae inoculan l o s medioe de cult ivo con Bs

c i l l u s Subti l is gB- 19 y s e incuba por e l tiempo mencionado. -

.

4

P R A C T I C A 2 .

OBTENCION DE ACID0 DESOXIRRUBONWCLEICO Y RIBONIJCLEICO.

La metodo log í a se describe en e1 siguiente cuadro:

CEPA DE BASXLLUS $ W T I L I S SB-19

i 0 -

1 INCUBAR 180s 24 HIlbl. a 37 Q C/AGI'EACIOFI

CENTRIFUGAR a 5000rpm/20 ' _ I " ^ - _ I I_I.._--_.__

SOBRENADARE I (dese charlo) .c PRECIPITADO (PP.)

LAS CBLULAS EA

SOL. DE mci 0.14 m. RIEPE-

T I R LA OPERACION 2 VECES.

.1

i i

RESUSPENDER LAS CELULaS EN SOL. SALINA-CITRATO( idl. ) HOiiiOGEPíEIZAR.

AD I C I WAR LISO XMA (10 mg.) E INCUBA^ a,5Ooc /io0

ADICIONAR LAURIL SULFATO DE SODIO A L 259 (5gotas)

I

ADICIONAR SOL. SALINA-CITRATO (10 a.) HOMOGENEIZAR SUAVEM.

I

G SOBRENADANBE 21 toomervar a 4 a )

ADIüIOñAR SOL. DE N a c l 2 H.

I

AGITAR MABñBTICAIIIEWí'E a 4'8 /30'

\1 CENTQfFUoAR a 3000 rpm/30'

a 1 I

SOBRENADANTE I11 r-

(PF. 1

REUNIR CON SOBRENADANTE I1

CEM!RIFUGÁR a3000 rpm/jO ' I

4 I

SOBRENADANTE IV 4

(PP. )

J. ADZBIOIIAR 2 VOUIMEaFJBS DE

ETAWOL FRIO ESTRATIFICAl m.

-1 FASE EN SOLUCICN ( FRACC. '*Bee )

I----- COIZCPAR EL (pp.) CON UNA VARILLA DE VIDRIO ( FRACC. I'A")

DISOLVERID EN SOL. 2 Y DE rUaCl(5 d.)

6

r: *I .1

/I

DESPROTEINIZAR CON SOL. DE CLQROFORRIO - ISOPROPANOL (Srl) UN VOLUMEN, AGITAR SUAVJIXENPE / 20'

CENTRIFUGAR a 3000 rpm/)O'

J. (PP.)

JI FASE ACUOSA O

SOBRENADANTE V

.1 ADICIONAR 10 mg. de RNAsa

I

4 INCUBAR A 37Oc / 1 Hr.

!

4 BICIWWPEINIZAR 2 VEWS MAS

J AGREGAR 2 VOLUMENES DE

ETANOL FRIC ESTRATIFICANDO I

I (pp.) ,SS DNA SOLUCION

REDISOLVEHM EN SCL.

ESTEEIL DE NCi 0.14 iü.

( CONSERVAR a 4Oc

a

FRACCIüN "Bn

CEmRIFUGAR A 3000 rpm / 30'

7 1 - . . ___.__

SOBRENADANTE V I 5.- --

(PP. 1 I

J. ADICIONAR 10%. de DNAsa

I

J. INCUBAR a 37'0 / 1 m.

BESPROTEIN~ZAR CON SOL. CMROFQRMO - ISOPROPANGL AGITANDO SUAVEMBRTE/20 '

l BENIERIBUGIAR a 3000 rpm / 30'

I

( PP. ES RNA I JI

REDISOLVERLO EN SOLUCIOIB

ESTERIL 0.14 M. de RaCl

n 5 mi.*' (comemar a 4'c)

JI SOBRENADA NTE

. ..

8

P R A C T I C A 3.

ANALISIS DE LA CCMFQSICIC>N DE BASES DE LOS ACIWS NUCUICOS

Ia metodologia se resume a continuación :

Se colocan 0.5 ml de solución de DNA en una ampolleta y 0.1

ml. de HC1 bN, entonces se s i e r ra a l a fiama, esto mismo se

hace a l RNA solamente que se t omn 0.4 m l en ves ae 0.5 m i - y se agregan 0.2 m i pero de Na OH 3 N en ves de HCL.

Después se izrtrodujerón en e l autoclave durante 3 Hrs. para

hiürol isar loa dcidos.

Se corta e l papel whatmrrn de l No. 1 de 23 por 57 cm. se l e - hicierón 7 divisiones para cada nucleotido y para DNh yRN,..

Se colocaron 150 microl itros de RNA, DNA y de cada una de - l a s muestras p t rón .

Los cromatogramas asi obtenidos se colocaron en l a camara - aaturada con l a mezcla isopropanpl - HC1 2 N.

mspuea de 3/4 partes ae corrimiento de l eluente en e l papel

se sacaron asecar - l o s cromstogramas durante 12 Hrs. Una ves secos l o s cromatogramas se procedio a l revelado con

luz u l t rav io le ta , sacandose entonces l o s R f y Rv.

De esta manera se concluye l a práctica.

I-

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I .-

.-

."

.-

.-

P R A C T I C A 4. WUTAGENESIS.

Se crece E. Coli K L 16 en caldo Luria por un periódo de -- tiempo de 18 Hrs.

Se tomarón 5 mi del cu l t ivo anterior, se centrifugarón a3000

rpm durante 15 min. , se desecho e l sobrenadante y a l paque6

t e aelular se l e resuepenaio en 5 ml de NaCl 0.14 M.

Se homogenbizó l a solución anter i o r por agitación

Se tom6 1 mi de l a sudpeen606a.&~-eotor y se colocó en una ca - j a petri e s t é r i l ( s i n medio)

9

Se l l e v o a diferentes tiempos de raaiaci6n ( 10, 30, 60, 90,

y 120 seg.), esto es 1 ml para cada tiempo de radiacibn.

Se hicieron diluciones (lo-', de las

c4lulas para cada tiempo de radiacidn, tomandose 0.1 ml c/u

de las muestras.

Después se sembraron en cajas pe t r i 0.lml de laa células en

suspensión de cada una de l a s diluciones, por e l método de

vaciado en placa. Estas cajas contenian agar ylc Conkey e l - cual es un medio di ferencial .

Se l levardn a incubar a 37Oc durante 18 a 24 Hrs.

Una vez tranicurrido e l tiempo de incubacidn, se prodedio a l

conteo de colonias no fermentadoras de lactoaa (mutadas) que

se obtubierdn en cada caja etiquetada con una diluci6n y un

determinado tiempo de radiacibn.

10 PROBLEMAS Y SOLUCIONES APLICADAS.

coiso en cualquier actividad siempre trae inherente alguna

deficiencia, nuestro laboratorio de B i o l o g h Molecular y

loa otros laboratorios adolesen de material, reactivos ~r

equipo necesario para l l e va r aoabo los objetivos propues-

tos en cada experimento, s in dificultad; por 10 que en e e

ta parte del reporte expongo alguaos de los problemas con

l o s que me encontre durante e l tiempo en que estuve al-

frente de este laboratosio.

Uno de l o s problema a los que me enfrente en l a primera

práctica fue l a falta de autoclaves en funcioaamiento ya

que en un trimestre solo habia funcionendo una pequeña l a

cual fue inauficiente para todo e l grupo, esto ocaciono - que l a práctica se real izara con lentitud.

Otro problema que pude observar es que l a myor ia de los

alumnos l legan a l 20 Trimestre ain conocimintos n i expe-

r iencia en l a manipulación de material y aobre todo de - microorganisms, por ejemplo cuando se e f e c t d l a inocula-

cción de microorganisms, estos pipitean con e l dedo pul - gar , absorben burbujas de a i r e y toman pocas precaucionea

tanto para evitar contaminación de l a cepa pipeteada, co - mo para evitar ingerir loa microorganisms mientras pipe - tean, entre otros cosas.

Ante t a l situacion era nesesario introducir una sesión pa-

ra que adquieran un minim de habilidad para e l manejo de

microorganisms para l a mejor realizaccidn de experimen6os

posteriores. Pero dadas l a s limitaciones de tiempo no se - podia implementrr esta parte y no es sino hasta despues - de l 20 CUFSO que d i , enque muchos otros problemas se fue- ron acentuando y que provocar6n una peque-

ccidn en e l curso de laboratorio. Problems restructura - como la f a l t a

...

. .-

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-... .- r-

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de centrifugas en buen estado y de a l t a velocidard; por l q - que se tenla que recurr ir a s o l i c i t a r este equipo en labora6 tor ioe de inveetigacibn, particularmente para centrifugar a

5000 rpn que es e l caso para l a extracción de ácidos nuclei-

COS, t a l equipo fue negado en alguna ocación por loa profe - sores encargados argumentando que cada profeaor debería con- t a r con sus propios tubos de centrifuga, de esto derivo una

fuerte presidn de los alumnos, por i o que se ópto cambiar e l d t o d o de extracción de ácidos nucleicos de microorganisnos,

por l a extracción apart ir de bazo de perro 6 de cerdo ( e l d t o d o aplicado se describe en l a parte de anexoe)i éste d- todo contribuyo a que se cubriera e l curso norm1 ya que se

puede hacer uso de los recursos que se tienen como es e l u80

de centrifuga c l in i ca particularmente a h cuando se recomien - da que l a centrifugacidn se efectÚe con centrifuga de a l t a v velocidad, pero para loa f ines que se persiguen, se obtienen

resultados bastante aceptables y sobre todo en un p r i 6do de

tiempo menor en la real ización de este experimento; acortan-

dose 4 a 2 sesiones de laboratorio d s tiempo extra.

Por otra parte e l que se extrageran con mayor prontitud los ácidos nucleicos di6 opsi6n a que se introdujera despds de

la práctica de es te r i l i zac ión * una sesión teor ico - prácti - c8 sobre los distintos d todos de sembrado de microorganis-

nos, aa i como BU ident i f icación cualitat iva mediante l a t i n - ción de @ram; ya que de eata manera pueden corroborar s i un

cult ivo de microorganiemoe está puro para que en caso contra - ria poder a i s l a r l o ya sea usando medios se lect ivos o de algu - na otra form.

Los t ipos de sembrado que se realizardn son:

a). Estria en placa y tubo inclinado (cerrada, abierta,(itrop

b). Picadura en tubo de e m # * , en éste con objeto de obser - var microorganisnos asrobios, microaerofi l icos, anaero-

12

bios y £acultativos.

Otro problema fuerte fue en t r e s de l o s cuatro cursos a m i - cargo, l a d i f i cu l tad para conseguir reactivde como Uuril - suifato de sódio, DNxsa y Rusa entre otros, puesto que em-- pleando metodos químicos para sust i tu i r a las enzima8 ep&

tardado y se emplean condiciones d e drásticas de tempera -- tura.

Ctro problema son l a impreeicidn de las balanzas analit icas,

ademas l a carencia de camaras de cromatograffa (e610 2 para

5 grupos, 4 de l turno matutino y uno de l turno vespertino) y

l a s dos que hay, carecen de cubetas o recipientes para e l - eluente. Por estas y otras raaones poces equipos obtubierdn

resultados eatisfactorioa en cuanto a l a iden t i f i c a c i ón de

bases de boa ácido6 nuckeicos, como l o s que se presentan l a tabla siguiente:

en

BASES VALORES ENCONTRADOS . DE LA BIBLICGRAFIA Ef Rv R f

Adenina 0.97 0.39 0.40

Guanina 0.96 0.31 0.29

Citocina m.oi (#I 0.54 0.51

Timina 0.99 0.84 0.85

- - 0.75 Uraci l o - - (#) valor erroneo

Otrc de l os objetos que no se encotraba con frecuencia cuan-

do se requeria era l a lámpara de luz ultravio leta por l o que

se iienia que recurr ir a los laboratorio8 de investigaci6n a

s o l i c i t a r l a para poder l l e va r acabo e l experimento, con res- pecto a este , se l e implemento pidiendo a l alumno l a curva

de l e ta l idad en l a que se gra f ica e l tiempo de radiación con

t r a e l % de sobrevivencia, con objeto de que e l alumno apre-

c i e como varia l a población microbiana con respecto a l a do-

-

1 3

sis de radiación y con l a diiuci6n.

También se introdujo e l empleo de NI? i o menos un prOdiUct0 - químico como ester i l i zante que fué fenoi a i 5s para e s t e r i i L

zar un medio de cultivo oue contenga microorganismos no bene - f i c o s , en vez de usar e l autoclave, e l cual también es e f i c í

caz.

Por otra parte ademas de l a introducción teor ica que se l a - daba a l alumno , se l e daba a l alumno, se aplicaban exámenes

cortos por prdctioa, se entablaban discusiones a manera de

mesa redonda ; esto combinandolo en e l laboratorio, da bue:i

nos resultados ya que en m i opinión las discusiones de los - fundamentos de un experimento genera interes entre los alum- nos y de esta manera se ev i ta que l a reai izacidn de un expe-

rimento se concrete a l a apiicacibn de una receta.

En esta parte se plantean algunos puntos que su aplicacidn - ser ía benefica a l curso, y son l o s siguientes:

Que se tome en cuenta las carenoias de l laboratorio cuan-

do se diseña un experimento.

Que a l alumno se instruya en l a mnipulación de msterial

básico asi como de microorganismos, es decir, que de6p~éS

de i a práctica de ester i l i zación, se practiquen los dist-

t in tos t ipos de sembrado, a s i como l a caracterización ge-

neral de los microorganismos mediante l a t inción de Dram. Que se compruebe que l a es te r i l i zac ión efectuada es acep-

table , mediante l a incubación de cajas pe t r i canteniendo

medio de cul%ivo s i n inoculaci6n previa.

Que se practique l a ester i l i zac ión con productss qdmicos

como es e l caso del fono1 6 bien como en e l caso de g6r - micidas para para es t e r i l i aa r materiales sencibles a l ca-

l o r como suturas no hervibles donde se usa fortwldehido y

alcohol, para l o cual se introducen l a s suturas en esta - soiucidn por 3 ñrs. de esta manera se l legan a destruir

virus y bacterias incluyendo los t ipos esporagenos.

Puesto que t a l e s germicidas son toxicos, deüen efectuarse

enjuagues con alcohol isopropil ico y agua ea t e r i l antes c

de emplear e l material. Para comprobar su ester i l idad se

puede hacer como se d i j o anteriormente.

Bomo podemos obserbar en e l ejenplo antes descrito, se 1

l l evar fa mucho tiempo y vaCios rect ivos para su real iza+

ción por l o que se deben buscar otros &todos d s adecua

doe ya sea usando otros reactivos como e l oxido de e t i l e

no u otro.

- -

Que se adopte l a extraccfdn de ácidos nucleicos apart i r d

15

de bazo de perro d de cerdo - Que se oganicen discusiones acerca de los principios con

los que funciona un &todo, para e v i t a r un poco l a nono - tonga de l a apiicacidn de una receta.

Un ejemplo de l o anterior es: en l a extracción de 6cidos

nuoleicos en este, es de interes para el alumno saber que

e l c i t ra to de sddio se usa porque se necesita inactivar l a

DNAsa yRi?Asa y este funciona cono un ligando de l o s cofac-

tores de t a l e s emimas, ademas de que también se tonian en

cuenta l a s propiedades fisicoquimicas de l a s macromolecu - l a s paca su extraccidn como es e l hecho de que son m y solu-

en agua y en soluciones de a l t a concentración ionica e iriii

solubles en soluciones de baja concentraci6n; por l o que

con esto se j t i e t i f i ca el empleo de soluciones de N a C 1 a d i - ferentes concentraciones.

- Que s e introdusca l a cromatografía en capa f ina ya que ti-

ene l a s siguientes ventajas :

a ) reeoiucidn del soiuto de buena a exelente

b) l a mayoria de l a s preparaciones se logra de 5 a 6 Hrs.con

l o cual no habria problemas de uso de niaterial por otros

grupos.

c) se pueden separar cas i todo t i po de compuestos.

d) no hay l im i te en e l t i po de d t o d o de detección. - O bien se puede cambiar e l &todo de determinacidn de DNA

y RNA por m6todos colorimetricos ( l a metodología esta con

tenida en l a parte de anexos). Que en el reporte se l e pida a l alumno tanto Rf corn Rv, cal-

culados y reportados en l a b ib l iogra f ía , con objeto de que se de cuenta de l 46 de error obtenido. - En cuanto a mutagdnesis propongo l a elaboración de curvas

de l e ta l idad donde se graf ioa e l 9 de sobrevivencia contra

16

._ C U R V A - . D E L E T A L i D A D

T . $ de

'- Sobrevi- .- vencia I

Cuma

Cbn dilución

\ \

\ 3 \

4 '. \ /I

1 8' / \

i \

\ \

-3 / i

Con dilución 10 ,

so

. I 4 (curva mas aceptable)

25 ',

tiempo de radiacidn con objeto de quer e l alumno aprecie

l a varriacidn de l a poblacidn microbiana segun l a dosis de

radiacidn y l a dilucibn. (ver gráfica anterior) .EIbdJce que &e adopten e s t e s propuestma, algunae de l a s cuales se

apliaaron ya obteniendose buenos resultados.

17

METODOLOGIA APLICADA QARA LA EVALUACICN DFL ALWNO Y TIEMPO

ENIPLEADO EN AC2IVIDADES PROPIAS DEL CURSG.

En cuanto a l a evaluaoion d e l alumno en cbda curso, esta se

rea l i zó tomando en cuenta a spe t o s como: 1. Iaelaboraci6n por parte de l alumno de un reporte indiv i , -

dual de cada una de l a s prácticas reaiicadas en e l curso.

a s i como una pequeña investigación respeoto de l tema u ob - j e t i v o en cueetión.

2. ñ3rticipación del alumno tanto práctica cam teor ica en

cuanto a discusiones a manera de mesa redonda de algunos

aspectos importantee de l a práctica.

3 . Aplicación de exámenes cortos (10-15 min.) antes de em-

zar con un eperimento. 4. ia aplicación de dos exámenes parciales.

Con l o cual se obtiene un promedio de cada actividad, e L f h nal, dandose un pocentaje a cada una para obtener l a c a l i f i - cación f rna l , desde luego no siempre se aplicaban todas sino

d s bien una combinacidn e l l a s durante el curso, d e aún ee

apl ico o tra actividad en alguna ocacidn como Sue la de que&& - introducci6n teorico-práctica l a d i e d e l alumno pero a mi j

j u i c i o ésto no fuciona por i o que s6io se agikic- las ante - r i o res y l a introducción s iguió a cargo de mi persona.

La aplicación de los conceptos enunciados anteriormete, como base para l a evaluacibn del alumno obedece a:

- En cuanto a l primer punto , considero que esto l e s i r v e

a l alumno como base para l a elaboración de investigaciones posteriores.

- Con respecto a l punto eiguiente, pienso que es muy impor - tante puesto que de esta manera e l alumno puede asimilar

m j o r un conocimienta sobre l o s principios basicos que ri- gen un experimento. - En tanto que l a aplicacidn de edmenes cortos c o ~ i ~ ~ ~ . -

18

que tiene como objeto e l que el alumno laegue a l laboratorio

con l oa conceptos & elementales para l a reaiiaación del er_ perimento en turno.

Antes de ver el tiempo to ta l empleado en ita6 actividades de@ sempefladas en e l laboratorio de Biología Molecular, combiene

aclarar un c0ncepS.o que en las secciones anteriores se ha ve - nido mencionando con frecuenciay - es l a pslabra%iempo extra"

por l o que WiBn vale l a pena aclarar que se ha denombzmdo 4

a s í , a i tiempo empleado en l a preparación de medios de cult&

vo , inoculaciones, conteo de colonias y revelado de cromto

grams principalmente.

Acontinuacidn se presenta un ouadro de l a relaoióm de alum - ma a mi cargo por curso y e l grupo, durante e l desarrollo

de m i S.S.

Tr im . Gpo. # Alumms

80-0 BB-51 20

81-1 BB-$1 25

81-P BB-51 50

81-0 BB-51 20 ?i3=

Por tanto se revisaron y corrigierdn un promedio de 350 re - portes, se cal i f icaron un promdio de 370 e - 8 (entre -- edmenea cortos, parciales y f inales ) , de esta manera tenemo

que se emplearon un promedio da 360 m. en la oorrección de

reportes y exámenes; a s i mismo empleando un promedio de 146

Hrs. en clase y un promedio de 96 Hre. dedicadas a la prepa-

ración de clase, de material yreactivos entre otros io cual

hace un to ta l ae 60.2 Hra. dedioadas a la docencia en cuatro

cursoá de laboratorio de Biología Pblecular. Esto es toimndo

en cuenta s610 l o s abpectos d r importantes, ya que de esta

iaanera el S.S. se puede cubrir en a610 t r e trimestres.

19

..

I-

A N E X O S :

A). METODO DB BXTRACCION DE ACIDOS BnCL3ICoS. En l a aplicacidm de éste d t o d o se hace uso de :

1. Solución Buffer de DNA. NacU. (@.I# S. ) - Citmto de Na(O.01 S . ) , pR 72 - 74 p e l

pH se ajusta con HCL 6 mOOH (0.1 M.)segun e l caso

2. Soiucidn de NECL 2.6W.

3.. Se preparan de 10 - 15 g. ds bazo congelado ( de preferen - c i a te j ido fresco). Eeta se sumerge inmedistrmnte en ñu-

f f e r DNA.

Depués de 30 min. se rebans en cuadritoe y se congela. A l

usarse se deja descongelar parcialmente y se quita l a cág

. ..

.-

. .-

sula de te j ido conectivo.

4. stanoi a i 9596 (500d.) 5. Oentrifuga c l inica . S i es posible ,ut i l lsar centrifuga de

alta velocidad,

6. Matraces Erlen Meyer

7. Agitador de v idr io

8. Balanea Gramtáría

9. Licuadora

Nota: las soluciones, a l igual que la preparacídn de baao

deben mantenerse a bada temperatura, y s i por razones de

tiempo se desea descontinuar e l experimento 1 eato s e pue - de hacer en el paso No. 8, rotulando y dejando en e l con-

gelador hasta reanudar el experimento.

ratoao.

1). @rte e l tejxdo en cubos y p r e p r e como se indico ante - riormente.

2). Homogeneiear e l te j ido en una licuadora con un v o l d n a

apmximiado de 150 nil de solucidn Buffer DNA( agregue po-

co a poco el te j ido)

.

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20

3). Centrifugar a 5000 rpm / 15 * '

4). Se descarta e l sobrenadante (RNA$' aeucams, proteinas,

1ipiLioa 1 5). Resuspender e l paecipitado en Buffer DM, y centrifugue

como en e l p s o No. 3 . 6). Descartar e l sobrenadante y resus9ender e l precicipitado

(pp.) en soluci6n 2.6 E¶. de Ii iaCl, Hasta un v o l d n apro-

ximado de 200 - 225ml.

7). mzc la r l a sol. en l a licuadora / 1' 8). Con ima v a r i l l a de vidrio ag i tar l a Sol. /lo' 9). mntrifugar nuevamente como se indica en e l paso b. 3 10) .Poner e& sobrenadante en un vaso de pp. Gde. Lentamente

y por las paredes del va60 , agregar a volumenes de eta-

no1 f r i o , estratif icando

il).Fa l a interfase se forms un pp. blanco y denso , con una

v a r i l l a de v idr io se ag i ta suavemente con objeto de en - r r o l l a r l a l a s hebras de DWen l a v a r i l l a . Esto se ha - ce hasta que ya no hay pp.

12). A l precipitatio a s i obtenido, se l e coloca en un recipi-

ente y se l e agregan 200nil. de agua destilada.

13). Seagita con una v a r i l l a de v idr io hasta di ioluci6n del

pp.Si l a disolucibn es muy lenta , se coloca de 2 - 3 segundos en l a licuadora y se conserva congelado hasta

nuevo empleo de Bate.

"PA: todo e l proceso de Bate &todo se debe hacer en condic

ciones de baja temperatura(use hielo) .

B).WODO ESPECTROFUi'O1IIETRICC DE D!A'ERMiNACcION DE DNA Y RNA

1. Determinaci6n de DNA;.por l a reacción de DIFENILAMIHB.

Fleactivos : - &estra patron de DNA y RNA comerciales(l0 mg.)

- Soiuci6n de DNA de bazo oongelado 6de cualquiera otro, co-

i

i

2 1

mo Eacllus Subt i l i s o'germen de t r i go .

- Amortiguador sal ino (NBCl0.15 M.-Citrato de iW 0.015 X.)

pH 7 . -Reactivo de d i f en i l amina(10g. de WA/ 1Lt. de Ac. Acético

g lac ia l , s e disuelven; se agregan 25 mi. de H2S04 Oonc.) ;:

Freparece a bajg . tempartttura.

- BsiIo de agua hirbiendo.

XBtodo :

1). Disuelva 10 mg. de Ac. nucleico en 50 mi de amrtiguedor

sa l in0

2). A2 ml de l a Sol. anterior agregarle 4ml. de reactivo de

d i f enilamina

3). Caliente l a muestra en un b a o ae agua hirviendo / 10'

4) . Enfrie y l e a la extincidn a 595 m. 5). Trate de la misma forma l a solucidn de ácidos nucleicoa

de bazo congelado.

1

2. ~eterminación de Rltll por l a reacción de ORCINOL. - REBctiw de orcillpl(disue1va un gramo de cloruro f e r r i co

(PeC13.6H20), en un l i t r o de H U concentradoy agregae 35ml I

de orc inol en aicohol 696 p/v. 4 I

@todo: I

1). B z c l e 2ml de Sol. de Ac. Nucleic0 con 3ml. de ñeactim, I

de Orcinol.

2). Caliente en un b a o de agua hirviendo/20'

3 ) . Enfrie y l ea l a muestra patron y l a de loa Ac. nucleicos

preparados de bazo congelado con un blanco de orcinol a

665nm, una vez f r i a l a Sol. I

22

CONCLUSIONES :

Sra base alo anterior podemos concluir que l o s cursos de la -

boratorio de Biología Molecular, a s i como sua similares,

que se imparten en nuestra instituai6n; estan provistos de

ciertas deficiencias, algume derivadas de l o numeroso delao - grupos, en cuanto a l a deficiencia de materiales, equipos y

reactivos necesarios; a s i corn de algunas técnicas de exper&

inentos, que para su apiicacidn requieren de un poco d a de

experiencia por parte de l alumno para su mejor realieacidn

a s i como de un tiempo mas 6 mnos largo. Esto aunado a l a hsa

inexperiencia por parte mía, en los primeros meses, dificul+

t o mi labor pero pienso que CQn e l deseo inherente de supera - ción se puede s a l i r adelante; por i o que puedo concluir en

forma general que en los cuatro curso8 que estube a cargodel - laboratorio de Biología &lectalar , a h con todas la6 agra.rr

viantes, cumpli con los objetivos propuestos de l a mejor ma-

nera posible, por t a l motivo me siento satisfeoho de mi l a - bor realizada.

23

BIBLIWRAFiA :

1. Amorican Inet itute O f Biological Sciences, Develomnts i n

Induetrial Microbilogy, Washington D.C. 1968, Vol. 739.

2. J.R. Norria-D.W. Ribbow, Methods in ricrobiology, Acade-

mic Pres9 , &don I 1971 , Vol. 5B.

3. Mal B. Groaian - Welnia C. Chambera,Bseic iaboratorg Tec - niques for microbiology a Self- I n E t r U C t i O M ,

4. D.A.Shapton - 0oul;dG. W. , Isolation Yethods for ñíicrobio - log ists , Academic Press, 1969.

5. -vid T. Plumarr, Introduccion a l a Bioqdmica M c t i c a ,

Mc. G m w - H i l l Iatinoaisericana, 1981

.

Proyecto sobre l a ayudantia e n l a docenciadel curso de labora-

t o r i o de B i o l o g í a Molecular, que para cumplir con e l s e r v i c i o so-

c i a l , presenta e l pasante de I n g e n i e r í a Bioquímica I n d u s t r i a l , M i -

guel Buendía Jimgnez. Cubriendo un promedio de 14 Hrs. semanarias,

con f e c h a de i n i c i o , e l 1 7 de septiembre de 1980, para f i n a l i z a r -

e l 4 de diciembre de 1981, haciendo un t o t a l de cuatro t r i m e s t r e s .

d l e z Cerezo.

. . <

, - I . '

Ayudante e n l a docencia de l a b o r a t o r i o de B i o l o g í a

Mole cular . ia r e a i i z a c c i ó n d e l presente proyecto de Serv ic io -

S o c i a l , t i e n e por o b j e t o auxiliar en l a docencia de - cuatro cursos de l a b o r a t o r i o h B.iOlo& f fo lecuiar , a

cargo d e l Dr. Héctor González Cerezo.

U s a c t i v i d a d e s e s p e c i f i c a s a d e s a r r o l l a r e n e s t e -

t i p o de cursos , c o n s i s t e e n dar a los alumnos d e l se-

gundo t r i m e s t r e de l a D.C.B.S, una in t roducc ión teo--

r i c o - p r á c t i c o , p r e v i a a cada s e s i ó n de l a b o r a t o r i o ; -

a s e s o r a r l o s dentro y f u e r a de las horas de c l a s e , asi

como l a enseñanza de t é c n i c a s de manipuleo en labora-

t o r i o ; y e l manejo de algunos aparatos t a l e s como cen-

trifugas, a u t o c l a v e s , balanzas analiticas, e t c . ; Tam-

b i e n incluye l a r e v i s i ó n y c o r r e c c i ó n de repor tes in-

d iv iduales (semanales); preveen que las s u s t a n c i a s , - s o l u c i o n e s , r e a c t i v o s , equipo de l a b o r a t o r i o e n ge--

n e r a l , e t c . s e h a l l e n dispaP&bles para l a s e s i ó n y -- correspondiente o b i e n e l acondiccionamiento o modifi-

cac ión ( e n úitima i n s t a n c i a ) de algunos a s p e c t o s de - l a pdct i ca para que e s t a s e pueda l l e v a r acabo.

Tambien s e deben p r e p a r a r e i n p a r t i r exámenes par-

c i a l e s y f i n a l e s con e l o b j e t o da contar con una pano-

ramica más amplia para la evaluación d e l alumno. Estas son a grandes r a s g o s , las a c t i v i d a d e s a desem-

peñar durante e l d e s a r r o l l o d e l S e r v i c i o S o c i a l .

Las practicas que generalmente s e l l e v a n acabo en-

e s t e t i p o de cursos son las s iguentes :

1.- Preparación de m a t e r i a l e s t e r í i y medios de c u l t i v o

2.- obtención de ac ido Desoxirr ibonucle ico y acido Ri--

bonucl e i c o Ba c t e r i a n o s.

3.- Análisis de l a composición en bases de l o s ácidos desoxi-

rr ibonucle ico y ác ido r ibonucle ico.

4.- Mutagériesis.

Práct ica 1.

En cuanto a l o que s e r e f i e r e a técnicas de esteri l iza---

ción, se proponen l o s siguentes métodos:

Es t e r i l i z a c i ón por incineración de materia orgánica o "ca-

l o r rojo". En és t e , se emplea un mechero para l a e s t e r i l i z a -

c i ón de asas de p lat ino que se usan en l a inoculación.

Es t e r i l i z a c i ón por "ca lor secol'. Aqui se emplea e l horno

para l a e s t e r i l i z a c i ó n de mt t e r i a l de v i d r i o en general. No-

a s i para sustancias. que puedan s u f r i r a l terac iones no desea-

das.

Es t e r i l i z a c i ón con va-pc o "calor humedo". Es uno de l o s

más ampliamente usados en l a e s t e r i l i z a c i ó n de medios de cul-

t ivo y o t ros mater ia les, empleandose para e l l o e l autoclave.

E s t e r i l i z a c i ón por f i l t r a c i ó n . es ta se l l e v a acabo empie-

andose membranas mi l iporo o bikn nagel whatman de poro peque-

ño, para l a e s t e r i l i z a c i ó n de i i qu idos viscosos.

E s t e r i l i z a c i ón por vtebui18ici6n'~. Este método consiste en

l l e v a r e l Znaterial que se desea e s t e r i l i z a r z baños de agua

en ebul l i c ión.

Es t e r i l i z a c i ón por radiaciones. Este método se emplea en

l a e s t e r i l i z a c i ó n de habitaciones y se l l e v a acabo con lam-

paras de ~ U Z , u l t r a v i o l e t a o rayo2 t!X".

También se proponen e r t e r i l i s an t e s químicos pero so l o se

l l e v a a l a práct ica l a e s t e r i l i z a c i ó n por métodos f í s i c o s .

En tanto que para l a preparacidn de medios de cu l t i v o se

suguieren los siguentes:

1). Medio r i c o (caldo l u r i a )

2). Medio minim

3). Medio d i f e r enc ia l (para cepas fermentadoras de lactosa).

Ia b ib l i og ra f f a sugerida wr;: ésta nrr 'ct icl e s l a s iguien - t e :

Col l ins C. H. , M6todos microbioldgicos, Ed. Aeribia, 1969,

Zaragoza España.

Pelczar, M. H., M$crobiology, ea. Ed., Mc G r a w H i l l , New York

USA.

Piatkin,K., Microbiología,Ed. M i r , 1968, Moscú, Rusia.

&vis, B. 13. y hrlbecco, R., Microbiology, 2a. Ed., Harper

and Row, 1973, New York, USA.

YrBctica 2.

En l o que se r e f i e r e a l a obtencidn de ácido desoxirribo-

nucleic0 y ácido ribonucleic0 bacterinos, se pretende a i s l a r

e l DNA yRNA de Bac i l lus Sub t i l i s SB-19, l o m8s puro posibñe,

para i o que se requiere de l a preparación de diversas soiuci-

ones.

E l método empleado consiste a grandes razgos en: rompimi-

ento de l a pared ce lu la r del. microorganismo mediante enzimas

y detergentes, as i como fentri fugaciones suoeeivas, para que

posteriormente que s e t ienen l o s los ácidos nucleicos l i b r e s

inso l ab i l i sa r l o s en etanol f r i o .

Una vez obtenidos éstos ácidos, se l l e v an a una desprotei - nizacidn con una mezcla cloroformo-isopropanol, de t a l forma que quedan l i s tos para un aridlisis cromatografico de bases.

La metodologia se encuentra detal lada en l a b i b l i w f í a

s iguiente:

Marmur, J., A procedure f o r the i s o l a t i on o f DNA from Micro-

organism, Journal Mol. Bio l . 3 :208-218, 1961.

.

Práct ica 3. Con respecto a e l a d l i s i s de l a composición en bases de

l o s ácidos desoxirribonucleico y r ibonucleico, se pretende + corroborar que los productos obtenidos en l a práct ica ante - r i o r corresponden a l o esperado, mediante un aná l i s i s croma-

t o g d f i c o comparativo para l o cual se emplea un patron de ba - sea.

ia metodología a seguir , a grandes razgos es l a s iguiente

Se somete a h i d r ó l i s i s ácida o alcal ina(segun convenga), tan - t o l a muestra problema como l a patrón (ácidos nucleicos sin-

t e t i c o s ) , en ampoiilatas a una temperatura de aproximadamente

120 e, por un c i e r t o tiempo, para después cor re r un cromato-

gramade éstas en papel y su pos te r io r revelado con luz u l t r a

v i o l e t a , de ésta manera podemos medir sus*'Iif** y comparar con

l os '*Rf*' reportados en l a b ib l i o g ra f í a , con es to se concluye

e l a d l i s i s de l DNA y e l RNA.

O

- -

La b i b l i o g r a f í a correspon.diente es l a s iguiente:

Watson, J. D. , Bio log ía Molecular d e l Gen, Fondo educativo

interamericano,Mdxico, 1978. Rendina, G. 'Eécnicas de Bioqgímica Aplicada, Ed. Interameri t

cana, México, 1974.

'Práctica 4.

En cuanto a rnutagénesis; a ru i se pretende obtener cé lulas

mutantes de E. Co l i K L 16 rio fermentadoras de lactosa, medi

ante l a obtenci6n de l a ui lución y tiempo de i r rad iacc ió i d 6

rieos para a s i , encontrar l a cantidad 6ptima de células muta+ das.

-

una ves que se t i enen l a s cé lulas crecidas, se someten a

centri fugaci6n y después, a l paquete de restos ce lulares se

l e resuspende en soiucidn f i s i o l ó g i c a ; de és ta suspensión

se r ea l i san di luciones desdel 10 hasta posteriomente. -1

se i i w a a irradiacit ín un voiumén determinado de todas y ca-

cia una de l a s di luciones a d i ferentes tiempos. Daspués se - siembran las céiuias irradiesias y un patrón ( céiuias no mu-

tadas), en un medio a i f e r enc ia i ( agar Mc Conkey) y se incu-

ban por 18 Hrs. de ésta manera se óbservarán, l a s células

fermentadoras y no fermentadoras de láctosa, ya que e l agar

Mc Conkey , posee un indicador de pH, sencible a l ácido lác-

t i c o .

Las células fer4rLentadoras de láctosa se manifestarán por

l a formación de un halo ambar o amari l lo asu alrededor.

La metodologia en de ta l l e se encuentra en :

%vis, B. D., ET. All. , Microbimlogy, Ed. Harper and Row,

New York, USA, 1973.

Watson, J.U. , Bio log ía Molecular del Gén, Ed. F. E. I. S. A

México, 1978.

E l programa de act iv idades a desempeiiar, se describe a conti-

nuación:

E l horar io de labora tor io para B io l og í a Molecular , como t o - dos l o s dent&, fué f i j a d o por l o s coordinadores encargados de - t a l ac t i v idad , poi- i o que se imparte los mi6rcoies apar t i r . dE - l a s 18 Hrs.

E l tiempo dedicado a l s e r v i c i o s o c i a l , por cada uno de los - t r imestres , proyectados a irnpartirse por semana es e l s i gu iente :

2. Hrs. preparación tenrico-práctica

2 Hrs. ~ r e p a r a c i 6 n de soluciones y sustancias a emplearse,

a s í como ve r i f i . ca r que tant;o react ivos como equipo

que se usen se encuentre en condiciones.

4 H r s . E f ec t i vas de cl.ase por seción.

6 Hrs. Tiempo dedicado a l a r e v i c i ón de exámenes y reportes

14 Hrs. Tiempo promedio to . ta l por semana.

Así tenemos que siendo de 10 a 11 semanas por t r imestre , cada

curso consta de entre 130 a 143 Hrs.,irnpartiendo cuatro^ cursos - hacen un t o t a & de 520-572 Hrs . de s e r v i c i o soc i a l . g segun l o re-

quis i tado en e l ins t ruc t i vo , para t rabajos de t i p o ru t ina r i o e l

pasante, debe cubr i r de 350-400 Hrs. de trabajo.

Por akaa parte, l a razón por l a que sólo se imparen cuatro - prácticas en és t e t i p o de cu.rsos, es debido a que cada p d c t i c a ,

emplea para, su r ea i i rnc i ón d s de una ses ión de l?,Loom.tori3, a s í

tezexios “ue ?ara l a ;?r$ctics de esteril.iz.a,ci6n y medios 6e c a l t i - vo, ocupa dos sesiones de labora tor io , a l igual que l as prácticas

de aná l i s i s de bases y mutagenesis. En tanto que para l a obtenci - de DNA y RNA, se emplean cuatro sesiones más t raba jo extrac lase ,

dadas l a s circunstacias de 1.a técnica empleada. Así puks teiiemos

que son d i e z sesiones por curso d s el tiempo dedicado a l a a p l i - cación de dos exámenes parc ia l es y un f i n a l , lo cual hace un to-

t a l de orice sesiones por curso.

. . .

En e l r epor te corresrondiente a éstt: pcoyecto se h a d n l a s obr

servac ioces y proposic iones oe r t inen tes n2.m v e r de que manem s e

pueden impartir .ds prác t i c ss o ?ids conocimientos a l alumno e n e l

iiis.?io iiúmero ? e s t - i o n e s .