INMUNOLOGIA

Profesora Myriam Navarrete

Profesora Sandra Henao Profesor Miguel Guzmán M.D.

AGLUTINACIÓN Es la interacción entre un anticuerpo y una partícula antigénica que se visualiza por la formación de agregados o grumos macroscópicos. En este proceso, el anticuerpo es conocido como aglutinina y el antígeno como el aglutinógeno. Las reacciones de aglutinación utilizan el mismo principio de las reacciones de precipitación. Cuando el anticuerpo está en exceso inhibe la reacción de precipitación, lo mismo ocurre en las reacciones de aglutinación. Esta inhibición es llamada el efecto prozona. Esta técnica es ampliamente usada para la identificación rápida de bacterias, hongos, grupos sanguíneos y otros antígenos; también es utilizada para la detección de anticuerpos que pueden ser indicativos de un estado de enfermedad. La temperatura, el pH , la concentración de electrolitos, son importantes para la realización de la prueba . La reacción final se evidencia por la formación de malla o grumos visibles macroscópicamente . Hemaglutinación Las reacciones de aglutinación son realizadas para la tipificación de células sanguíneas. En la tipificación de los antígenos del sistema ABO, las células sanguíneas son mezcladas en una placa con un antisuero especifico para los antígenos A y B del grupo sanguíneo. Si el antígeno está presente en las células, éstas se aglutinaran, formando agregados visibles en la placa. La determinación de los antígenos que están presentes en las células sanguíneas de un donador es básico para clasificar el tipo de sangre para las transfusiones. Hemoclasificación

Antígeno Glóbulos Rojos Anti – A Anti – B Rho (Anti - D)

A + - + o - B - + + o -

AB + + + o - O - - + o -

Aglutinación Bacterial Una infección bacterial conlleva a la producción de anticuerpos específicos contra los antígenos de superficie de la bacteria. La presencia de estos anticuerpos se puede detectar por reacciones de aglutinación bacterial. Se toma el suero de un paciente que ha tenido contacto con una bacteria y se realizan diluciones seriadas en tubos, a los que se les adiciona la bacteria. El último tubo que presente aglutinación visible, refiere el titulo de anticuerpos en el suero del paciente. El titulo de aglutinina es definida como el reciproco de la ultima dilución del suero que presenta una reacción de aglutinación positiva. Por ejemplo: se preparan diluciones seriadas en base dos del suero de un paciente, si la dilución 1/640 muestra aglutinación pero la dilución 1/1280 no muestra aglutinación, se deduce que el titulo de anticuerpos en suero del paciente es 640. El titulo de aglutinina de un antisuero puede usarse para el diagnóstico de una infección bacterial. Aglutinación En Látex Los anticuerpos o antígenos conocidos son unidos a partículas de látex, con el objeto de facilitar la visualización de la prueba. Se pueden emplear otras partículas insolubles como el poliestireno o la bentonita. POSITIVO NEGATIVO

Célula

Antígeno

Célula Antígeno

Anticuerpo

Anticuerpo

Algunas determinaciones que se realizan con esta prueba son la la determinación de la proteína C reactiva (PCR), Factor Reumatoideo (FR), Antiestreptolisinas (ASTOS), Staphylococccus aureus (proteína A), Haemophilus influenzae (antígeno capsular), Toxoplasma gondii (IgG), etc.

Factor Reumatoideo (FR) En 1937 Erik Waaler descubrió el Factor Reumatoideo (FR) y sus estudios fueron reproducidos por Rose en 1948. El Factor Reumatoideo son autoanticuerpos circulantes de la clase IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, siendo los mas comunes de la clase IgG e IgM con especificidad por epitopes del fragmento Fc de la IgG propia. El factor reumatoideo más común es de la clase IgM, está dirigido contra varios determinantes en los dominios CH2 y CH3 de la fracción Fc de la IgG. El FR se encuentra positivo en el 80% en pacientes con manifestaciones articulares como en la Artritis Reumatoide y en un 20% en la Artritis Juvenil. Otras entidades con FR positivo son algunas enfermedades autoinmunes como son el Lupus Eritematoso Sistémico, Síndrome de Sjogrën, Escleroderma, etc. También se puede encontrar positivo en bajos títulos en adultos mayores normales. Existen varias técnicas para detectarlos las más comunes son utilizando glóbulos rojos de carnero recubiertos con IgG humana (Técnica de Waaler Rose) y la aglutinación con partículas de látex de poliestireno recubiertas con IgG humana. Proteína C Reactiva (PCR) En 1930 se descubrió la proteína C reactiva, Inicialmente se detectó en el suero de pacientes con neumonía aguda, que formaban una reacción de precipitación con el polisacárido C de ciertos grupos de Neumococo. La PCR pertenece a la familia de las pentraxinas, proteínas plasmáticas que participan en las respuestas innatas a las infecciones bacterianas. Hace parte del grupo de reactantes de fase aguda, que se une al C1q (proteína del complemento) y puede de esta forma activar el complemento o actuar como opsonina mediante la interacción con los receptores C1q de los fagocitos. Normalmente se encuentra en pequeñas cantidades en sangre, se eleva en procesos infecciosos, inflamatorios o traumáticos. Su concentración aumenta entre las 24 a 48 horas después del estimulo inflamatorio; es una ayuda diagnóstica y en la evaluación terapéutica debido a que también disminuye rápidamente. Valores menores a 6 mg/L se consideran normales. El diagnostico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica de laboratorio en la cual el suero sanguíneo se coloca en un papel especialmente tratado y luego se expone a una corriente eléctrica. Las diferentes proteínas migran o se mueven en el papel con el fin de formar bandas que indican la proporción relativa de cada fracción de proteína. Este examen cuantifica aproximadamente las diversas fracciones de proteína en la porción sérica de una muestra de sangre.

Las proteínas son constituyentes importantes de todas las células y los tejidos y están hechas de aminoácidos. Existen muchas clases de proteínas en el cuerpo, con muchas funciones diferentes; por ejemplo, las enzimas, algunas hormonas, la hemoglobina, el fibrinógeno, el colágeno, las inmunoglobulinas (anticuerpos), entre otras.

Las proteínas séricas están separadas aproximadamente en albúminas y globulinas, es decir, la proteína total = albúmina + globulina. La albúmina es la proteína de mayor concentración en el suero que sirve para trasportar muchas moléculas pequeñas, pero también juega un papel decisivo en el mantenimiento de la presión oncótica de la sangre, es decir, impedir que el líquido se filtre a los tejidos.

Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio mediante la electroforesis y la densitometría.

Los niveles de proteínas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de inflamación. La fracción beta incluye la transferrina, el plasminógeno y las beta lipoproteínas. La fracción gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (IgM, IgG e IgA).

Valores normales

• Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dl

• Albúmina: 3,5 a 5,0 g/dl

• Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dl

• Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dl

• Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dl

• Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dl

Significado de los resultados anormales

1. La disminución de la proteína total puede indicar:

• Desnutrición

• Síndrome nefrótico

• Enteropatía por pérdida de proteínas gastrointestinal

2. El aumento de las proteínas alpha-1 globulina puede indicar:

• Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)

• Malignidad

• Enfermedad inflamatoria aguda

3. La disminución de las proteínas alfa-1 globulinas pueden indicar:

• Deficiencia de alfa-1 antitripsina

4. El aumento de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:

• Inflamación aguda

• Inflamación crónica

5. La disminución de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:

• Hemólisis

6. El aumento de las proteínas beta globulinas puede indicar:

• Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)

• Terapia de estrógenos

7. La disminución de las proteínas beta globulinas puede indicar:

• Trastorno de coagulación congénito

• Coagulopatía de consumo

• Coagulación intravascular diseminada

8. El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:

• Mieloma múltiple

• Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)

• Hiperinmunización

• Infección aguda

• Macroglobulinemia de Waldenstrom

• Enfermedad hepática crónica

Los medicamentos que pueden afectar la medición de las proteínas totales incluyen clorpromazina, corticosteroides, isoniazida, neomicina, fenacemida, salicilatos, sulfonamidas y tolbutamida.

Tipos de soportes para electroforesis de zona Se han empleado varios tipos de soporte para la electroforesis de zona: 1) PAPEL. Aunque no es exactamente un gel, se puede considerar similar ya que realmente es una malla de fibras de celulosa. Es poco restrictivo, pero es difícil de obtener en tamaños de poro y espesores totalmente homogéneos. Además, muchas macromoléculas se adsorben a las fibras que lo forman, lo que da lugar a artefactos y separaciones defectuosas. Se emplea fundamentalmente para moléculas pequeñas, como péptidos y aminoácidos.

2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa forma un gel de poro grande, muy poco restrictivo para las proteínas de tamaño corriente. A diferencia del papel, es inerte frente a la mayor parte de las proteínas y se puede conseguir en láminas de características estructurales constantes y definidas. Esto, junto con su facilidad de manejo, costo relativamente bajo y la rapidez y reproducibilidad con que se pueden efectuar separaciones hace que este tipo de gel tenga utilidad en los laboratorios de análisis clínicos (proteínas séricas). 3) ALMIDON. Se emplean geles formados con almidón parcialmente hidrolizado procedente de diversas fuentes naturales. El poro es menor que para el caso del acetato de celulosa, y se suelen obtener mejores separaciones que con éste último, ya que la difusión es menor. Sin embargo, y a pesar de haber sido muy utilizados hasta hace algún tiempo, han sido sustituidos por geles de poliacrilamida debido a la dificultad que supone el obtener resultados reproducibles empleando un producto de origen natural.

Electroforesis de proteínas séricas en almidón, teñidas con Amido Black. Aunque la separación es algo mejor que en acetato de celulosa, el número de proteínas que se pueden diferenciar es muy pequeño. 4) AGAROSA. Uno de los dos componentes del agar. Es un polisacárido lineal que forma geles de tamaño de poro muy grande. Se usa fundamentalmente para la separación de ácidos nucleicos y para inmunoelectroforesis. 5) POLIACRILAMIDA. A diferencia de los anteriores, el gel se forma "in situ" por la polimerización de una disolución del monómero. Es posible controlar el tamaño del poro de una forma muy reproducible. Es el tipo de gel más empleado para la electroforesis de proteínas de tamaño comprendido entre 10.000 a 250.000 dalton, y de otras moléculas de tamaños similares, incluyendo ácidos nucleicos. Son geles completamente inertes, mecánicamente estables y transparentes, lo que facilita tanto su manejo como la detección de las moléculas separadas en ellos. La técnica se conoce como PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).

PRUEBAS DE DIAGNOSTICO EN LA DETERMINACION DE COMPLEMENTO

La determinación de Complemento hemolítico en unidades de CH50 es un bio-ensayo que permite valorar “in toto” la actividad de este sistema. El complemento es un sistema que constituye la columna vertebral de los mecanismos humorales de defensa inespecífica del huésped. En el hombre, este sistema está integrado por un grupo de proteínas plasmáticas de características físico químicas diferentes que permiten individualizar once factores principales más el número de factores que cooperan en la activación y en la regulación. El complemento se designa con la letra mayúscula C y un sufijo que designa el factor individualizado así: C1, constituido por los subfactores C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 y C9. Estos factores circulan en el plasma en su forma inactiva y sólo entran en actividad cuando el huésped lo requiere, para lo cual se necesita una secuencia de reacciones, cuyo efecto final, es la alteración irreversible, estructural y funcional de las membranas biológicas. Si tales membranas se encuentran en bacterias, hongos, virus o parásitos, el resultado lógicamente es la muerte de estos organismos. Básicamente se reconocen en la actualidad 3 patrones de activación del sistema: la vía clásica, que involucra la interacción de un anticuerpo preexistente contra un antígenos localizados en una membrana, esta reacción se precipita como una cascada a través de una serie de reacciones enzimáticas irreversibles en las cuales el factor activado actúa como una enzima que tiene cono substrato al factor siguiente y en tal forma se llega al efecto final de la citólisis. Igual efecto se puede lograr por un proceso de activación alterna, mucho más eficiente, que ocurre a partir del factor C3, sin la activación de los factores iniciales C1, C2 y C4 y que además no requiere de la preexistencia de anticuerpos, ya que, compuestos tales como los polisacáridos (liberados durante la muerte bacteriana) pueden inducir esta vía. El tercer mecanismo se conoce como la ruta de las lectinas, se inicia sin la presencia de anticuerpos, involucra una proteína que se liga a mananos (MBP), preferiblemente se une a manosa, fucosa y glucosamina de polisacáridos, lipopolisacáridos o glicoproteínas de la pared bacteriana. En la valoración clínica de algunos pacientes es necesario conocer como se encuentra el sistema, lo cual se hace cuantificando algunos de sus componentes, o valorando “in toto” la actividad del mismo. Básicamente cuando el sistema se está consumiendo por algún proceso patológico los niveles individuales de sus factores están por debajo de los niveles normales y por tanto éste no está operando bien. La actividad biológica del complemento se determina en el laboratorio midiendo su actividad hemolítica en términos de la llamada “Unidad hemolítica CH50”, que es la mínima cantidad de complemento necesaria para producir la hemólisis del 50% de una suspensión de glóbulos rojos de carnero en este caso, previamente sensibilizados con anticuerpos anti-glóbulos rojos de carnero. El clínico tendrá que utilizar este procedimiento y deberá saberlo interpretar correctamente. El complemento debe investigarse en clínica en aquellas situaciones que promueven su consumo, como por ejemplo anemias hemolíticas autoinmunes, glomerulonefritis post-estreptocócica, lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencias primarias; aunque existen algunas situaciones clínicas que aumentan sus niveles circulantes. Su utilidad clínica es mayor en aquellas que lo disminuyen y en donde la recuperación del proceso patológico conlleva la normalización de los niveles de complemento.

El informe del Complemento Hemolítico CH50 se hace en UCH50/ml siendo el valor de referencia 100 – 200 UCH50/ml. RESPUESTA INMUNE CELULAR Los leucocitos comprenden diferentes tipos de células maduras: granulocitos, megacariocitos, monocitos, macrófagos, linfocitos y plasmocitos. Estas células se pueden diferenciar fácilmente al microscopio por la relación núcleo/citoplasma que presenta cada una de ellas. - FAGOCITOSIS Un aspecto de la fagocitosis se estudia mediante la evaluación de la actividad bactericida de los leucocitos. Para esta prueba se mezclan leucocitos de sangre periférica con una suspensión bacteriana y anticuerpos específicos permitiendo bajo condiciones adecuadas de medio, temperatura y tiempo, el proceso fagocítico. Aunque la técnica es compleja, el estudio opsónico puede ser utilizado en el diagnóstico de enfermedades asociadas a deficiencias del sistema inmune y en la medición de las defensas orgánicas desde el punto de vista inmunológico. Así como también forma parte del perfil inmunológico de pacientes inmunocomprometidos. Experimentalmente se puede establecer la mayor eficiencia del proceso fagocítico cuando el antígeno esta recubierto por anticuerpos específicos y se determina el índice opsono-citofágico relacionando el porcentaje de fagocitosis obtenido cuando el antígeno está opsonizado y cuando no lo está. La capacidad funcional de los monocitos y de los neutrófilos se mide en el laboratorio clínico como la fagocitosis de partículas o microorganismos cubiertos por anticuerpos y muertos por calor (valoración de la inmunidad celular inespecífica). La mayoría de los individuos normales desarrollan una serie de anticuerpos frente a antígenos ambientales. Estos surgen a partir de infecciones clínicas o contactos subclínicos con diferentes microorganismos. Los pacientes con defectos en la primera barrera inmune celular sufren frecuentes infecciones por bacterias piógenas, normalmente pueden deberse a un defecto en el número de células ó a defectos funcionales en las mismas. - LINFOCITOS

Los linfocitos presentan una estructura microscópica homogénea, pero comprenden a su vez un grupo heterogéneo de células. Se logró dividir este tipo leucocitario en dos grandes grupos: los linfocitos B (que presentan Inmunoglobulinas en su membrana) y los linfocitos T (que hacen rosetas en presencia de glóbulos rojos de carnero). Los linfocitos son semejantes morfológicamente, pero son heterogéneos en cuanto a densidad, su movilidad electroforética, vida media y respuesta a mitógenos. A nivel funcional existen varias subpoblaciones que participan por separado o en conjunto en la respuesta inmune. Con la aparición de los anticuerpos monoclonales, que son capaces de reconocer marcadores moleculares mono-específicos, se confirmaron las poblaciones leucocitarias descritas con base en su morfología. Esto quiere decir, que los diferentes linajes leucocitarios poseen, además de una morfología microscópica diferente, marcadores de membrana diferentes. Sin embargo, se encontró que los linfocitos presentaban marcadores intralinfocitarios exclusivos. Tal es el caso de las moléculas CD4 y CD8 expresadas por sub-poblaciones diferentes de Linfocitos T. Estos marcadores de sub-población se encuentran respectivamente en 60% y 30% de los

Linfocitos T (solamente 3-5% de los Linfocitos T co-expresan CD4 y CD8 en su membrana a nivel de sangre periférica). Se describieron también anticuerpos monoclonales que definen globalmente a los Linfocitos T (CD3 ó CD2), y otros que definen globalmente a los Linfocitos B (CD19,CD22 ó CD37). La importancia clínica de estas determinaciones estriba en que las diferentes subpoblaciones linfocitarias ejercen a "grosso modo" funciones diferentes. La alteración de la proporción de referencia 2/1 para CD4/CD8, puede llevar a estados de deficiencia inmunitaria. Los LT se pueden distinguir según sus diferentes receptores de antígeno (TCR) que caracterizan a las subpoblaciones de las células T, aunque también existen ciertas moléculas de superficie que se expresan en todas las células T (marcadores pan-T) y en algunos casos en otros tipos de células (por ejemplo, células asesinas naturales NKC), un buen ejemplo de los mismos es CD2, como receptor para glóbulos rojos de carnero, permitiéndoles que in vitro formen rosetas espontáneas, in vivo y en circunstancias normales, esta molécula junto con el complejo TCR-CD3 y otras glicoproteínas de membrana, colabora con la activación de las células T.

Los LB presentan inmunoglobulinas de membrana que son sintetizadas por la misma célula y se encuentran insertadas en la membrana celular en donde actúan como receptores de antígeno específicos. Estos receptores pueden ser detectados en la superficie de las células maduras mediante anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes y específicos de la inmunoglobulina en cuestión.

Cuando las células se tiñen en frío, se observa sobre la célula B una fluorescencia con aspecto anular. Los anticuerpos divalentes frente a las inmunoglobulinas de superficie se unen a los receptores de superficie y los entrelazan, dando lugar a parches de inmunoglobulinas distribuidos por la superficie celular. Cuando las células son sometidas a calentamiento, la mayoría de estos complejos se desplaza a lo largo de la superficie celular y se acumula en un extremo de la célula, observándose entonces una especie de caperuza. Una vez formada esta caperuza, la inmunoglobulina penetra en el interior de la célula donde es degradada. El CAP es una técnica inmunológica en la cual se utiliza una inmunofluorescencia directa para identificación de la población de linfocitos B.

De la población linfoide periférica humana, 50-80% forman rosetas espontáneas, 15-20% exhiben Ig de superficie de la clase IgM e IgD y 2-10% no tienen marcadores ni para T ni para B, esta población corresponde a los linfocitos "nulos" que podrían comprender la población celular implicada en linfocitotoxicidad y/o células precursoras de LT y/o LB.

Citometría de Flujo

Es una técnica que permite obtener información sobre poblaciones celulares a partir de células en suspensión (solución isotónica), que interfieren de forma individual con una fuente de luz. La intersección de cada célula con la luz láser provoca la emisión de una serie de señales luminosas que permite diferenciar poblaciones celulares dentro de la muestra analizada, por su tamaño relativo, por sus granulaciones o bien por su reactividad con fluorocromos previa incubación con diversos anticuerpos monoclonales.

Es un método de lectura rápido, que permite analizar un elevado número de células (de 10.000 a 50.000 para cada anticuerpo monoclonal) y proporciona un registro

computarizado de los resultados. La citometría de flujo permite la determinación de antígenos celulares de superficie, y por tanto, tiene utilidad en el inmunotipaje de leucemias agudas y sindromes linfoproliferativos crónicos. Así mismo, permite la cuantificación del ADN y la determinación de la actividad proliferativa de la población celular. La cuantificación de ARN celular se aplica al recuento de reticulocitos.

Las células teñidas entran en la cámara de flujo de una en una y al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por filtros apropiados y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema informático.

Aplicaciones de la Citometría de Flujo

- Detección y cuantificación de antígenos: La identificación de antígenos mediante anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, que permiten la identificación y clasificación de diferentes células tanto normales como patológicas. El isotiocianato de fluoresceína (FITC), la ficoeritrina y el PerCP son los fluorocromos más empleados en el marcaje de anticuerpos monoclonales.

En otras áreas también se ha demostrado su utilidad, como en la detección de autoanticuerpos e inmunocomplejos, en el diagnóstico de trombocitopatías adquiridas y en la realización del test cruzado linfocitario.

La citometría de flujo, utilizando yoduro de propridio, también permite realizar cuantificación de células en apoptosis (muerte celular inducida). Esta técnica se ha utilizado para estudiar células CD4+ de pacientes VIH+ con una alta tasa de apoptosis

PRUEBAS INTRADERMICAS La posibilidad de conocer en un huésped un estado de hipersensibilidad ante una sustancia extraña mediante la provocación de un fenómeno local introduciendo intradérmicamente una mínima cantidad de dicha sustancia ha sido ampliamente estudiada investigada y utilizada como herramienta inmunológica. Determinados compuestos integrantes de agentes biológicos pueden causar en el huésped un proceso que sigue exactamente el patrón normal de la respuesta inmune bien sea esta una respuesta humoral o celular pero cuyo resultante final al confrontar de nuevo la sustancia que originó el proceso es exagerada y en ciertos casos nociva para el huésped cayendo en un proceso que se denomina hipersensibilidad, dentro de la cual hay varias categorías, siendo la de tipo I o inmediata y la de tipo IV o retardada las que pueden investigarse por tal procedimiento. Las pruebas intradérmicas que investigan la hipersensibilidad Tipo I que está mediada por anticuerpos tipo IgE citotrópicos, se realizan con extractos derivados de cientos de productos que puedan haber sensibilizado al huésped y que al ser identificado puede utilizarse para desensibilizarlo. Las pruebas intradérmicas que investigan la hipersensibilidad retardada tipo IV ponen en evidencia un fenómeno celular mediado por Linfocitos T que reconocen específicamente la sustancia extraña y que se evidencia 48 horas después de que ésta ha sido inoculada. Este proceso que fue descubierto por Koch en la infección tuberculosa se presenta como consecuencia de algunas infecciones bacterianas, parasitarias, micóticas y algunas virales e implica un complejo proceso inmunológico. Koch utilizó para sus estudios un producto derivado de los cultivos del Mycobacterium tuberculosis denominado por él “Tuberculina” que fue posteriormente purificado y que se conoce como PPD (Purified Protein Derivative) por contraposición al producto de Koch llamado 0T (Old Tuberculine). Una tercera categoría de pruebas intracutáneas la constituye las pruebas de neutralización, cuyo ejemplo típico es la prueba de Shick para la difteria. Consiste en aplicar 1/50 de dosis mínima letal (DML) de toxina diftérica intracutáneamente para determinar si un paciente tiene o no anticuerpos anti-toxina diftérica y saber, en consecuencia, si es susceptible o no a la difteria. En caso de tener anticuerpos y ser resistente a la difteria, los anticuerpos neutralizan la toxina y no hay ningún fenómeno, el paciente es “Schick positivo” no requiriendo por tanto vacuna; en caso contrario, la toxina no es neutralizada produciendo a las 96 horas una pequeña ulceración. El paciente es “Schick negativo” debe por tanto vacunarse. Esta prueba ya no se utiliza. Las pruebas intradérmicas que investigan la hipersensibilidad tipo IV tienen 2 grandes campos de aplicación: el primero, es dentro de los estudios inmunológicos tendientes a establecer una adecuada respuesta celular, para ello se utilizan antígenos derivados de los agentes con los cuales un huésped ha estado normalmente en contacto y por tanto un 70-90 de las personas darían una reacción positiva, esas sustancias varían según las regiones geográficas. En Colombia algunos estudios demuestran que sustancias tales como: candidina, antígeno respiratorio mixto, lisado estafilococico, son muy útiles para dichos estudios. La segunda gran aplicación de estas pruebas es en el estudio de algunas infecciones en que pueden utilizarse bien como herramientas epidemiológicas o bien como recurso diagnóstico; una prueba positiva a un determinado antígeno indica que el paciente ha estado en contacto previo con dicho antígeno.

Las más utilizadas en clínica son: - Entidades micóticas: Histoplasmosis Histoplasmina Coccidioidomicosis Esferulina Paracoccidioidomicosis Paracoccidioidina - Entidades parasitarias: Leishmaniasis tegumentaria americana Reacción de Montenegro - Entidades Bacterianas: Tuberculosis Tuberculina Lepra Reacción de Mitsuda En la tuberculosis la reacción de tuberculina o reacción de Mantoux se hace positiva luego de la infección o la vacunación con BCG. La reacción de Mitsuda tiene una interpretación diferente en el sentido que define un estado de no respuesta o anergia, indicando una Lepra Lepromatosa o de hipersensibilidad indicando una Lepra Tuberculoide. El informe del laboratorio es: - Reacción positiva: formación de una pápula indurada mayor a 0.5 mm de diámetro - Reacción Negativa: ninguna manifestación hasta las 48 horas

TECNICAS INMUNOENZIMATICAS Los ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas se basan en la habilidad de los materiales biológicos de adsorberse a superficies plásticas tales como poliestireno (fase sólida). Existen diferentes maneras de configurar ELISAs, las cuales dependen de la naturaleza de la muestra, la viabilidad de los reactivos y la precisión y sensibilidad requeridas. En muchas situaciones, no es necesario tener una medida precisa de la concentración de una muestra dada, por ejemplo en el tamizaje de hibridomas o en las pruebas de rutina para medir la presencia de aditivos en alimentos. Bajo tales circunstancias es sólo suficiente dar el resultado con un si o un no, o baja, media o alta concentración. Estos métodos semi-cuantitativos requieren ser desarrollados cuidadosamente. El uso de la ELISA se ha incrementado por la gran disponibilidad de anticuerpos monoclonales y de antígenos recombinantes específicos para un número de enfermedades autoinmunes e infecciosas. Por medio de esta técnica también se pueden determinar niveles sanguíneos de hormonas, drogas, marcadores tumorales etc. La prueba de ELISA está basada en la habilidad del antígeno o anticuerpo de: 1) Adsorberse a un soporte - fase sólida, manteniendo su actividad inmunológica; 2) Unirse a una enzima y que el complejo antígeno o anticuerpo- enzima conserven tanto su actividad inmunológica como su actividad enzimática. Este método es empleado para la determinación de antígenos o anticuerpos a partir de diferentes muestras. Para realizar el ensayo es preciso disponer de una preparación pura de un antígeno (Ag) o un anticuerpo (Ac) o de ambos. El componente (Ag o Ac) se acopla a un soporte sólido como por ejemplo a placas de poliestireno, papel, perlas, etc., que absorberá una cierta cantidad de la proteína; a uno de los componentes de la reacción, sea Ag o Ac, se le marca o conjuga con una enzima y luego se escoge el substrato adecuado para la enzima utilizada. Componentes de la ELISA - Fase sólida: Se puede utilizar para la fase sólida: plástico, nitrocelulosa, vidrio, celulosa, poliacrilamida, papel o dextrán. - Conjugado: Enzima + Ag o Ac : Se conjuga o marca el Ag o Ac con una enzima. La enzima utilizada debe ser estable, fácil de conjugar, fácil de detectar y de bajo costo. Las enzimas más utilizadas para las pruebas de ELISA son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la β-D-galactosidasa. - Substrato: El substrato utilizado debe producir una reacción con un producto coloreado fácilmente medible, también debe ser estable y de bajo costo. Para la enzima peroxidasa se utiliza el substrato o-fenilendiamina (OPD) y para la enzima fosfatasa alcalina, el substrato más utilizado es el p-nitrofenilfosfato (pNPP). - Solución frenadora: Se utiliza para detener la reacción, los más utilizados son HCl, H2SO4, NaOH, H2O, dependiendo del tipo de enzima utilizada en el conjugado. Tipos de ELISA Métodos no competitivos 1- Placa cubierta con antígeno

Se conoce también como ELISA Indirecta para determinación de anticuerpos. Esta técnica mide los niveles de Acs del paciente contra un Ag especifico. El Ag especifico de la prueba es fijado en el soporte-fase sólida. Se agrega la muestra del paciente, si el paciente tiene Acs específicos para el Ag se forma un complejo Ag-Ac que es detectado por un segundo anticuerpo que es una anti-gammaglobulina marcada con una enzima. Luego es adicionado el substrato específico para la enzima, observándose el desarrollo del color el cual puede ser medido en un espectofotómetro. La intensidad del color es proporcional a la concentración de Acs en la muestra del paciente. Ejemplo: ELISA para VIH, Hepatitis A,B,C, Rubéola, Toxoplasma, anti DNA, Antifosfolípidos, etc. 2- Placa cubierta con anticuerpo Se conoce también como ELISA Directa en la detección de antígeno. Esta técnica determina los niveles de antígeno en la muestra del paciente. Se utiliza un Ac unido a la fase sólida, estos ensayos son también llamados ELISA de captura o ELISA sándwich, donde el Ag en la muestra es capturado por el anticuerpo unido a la fase sólida, luego es añadido un segundo anticuerpo especifico contra un epítope antigénico diferente marcado con una enzima. Ejemplo: ELISA para hormona estimulante de la tiroides (TSH), gonadotropina coriónica subunidad Beta (βHCG), antígeno prostático (PSA), Inmunoglobulina E (IgE) etc. Métodos competitivos

Reacción de color

Antígeno Específico

Suero con Anticuerpos

Anticuerpos marcados

con enzima

Adición del substrato

Reacción de color

Anticuerpo Específico

Suero con Antígeno

Anticuerpos marcados

con enzima

Adición del substrato

Estos métodos hacen posible obtener una cantidad estimada de un particular anticuerpo y antígeno, aún cuando éstos no pueden aislarse del medio en donde ellos se encuentran. Ellos pueden dar una información útil acerca de la presencia de determinantes antigénicos comunes y diferentes. 1- ELISA competitivo para detectar Antígeno En esta prueba se añaden simultáneamente la muestra del paciente con el Ag o Ac marcado con la enzima. Luego se adiciona el substrato. Los niveles de Ag o Ac presentes en la muestra del paciente son inversamente proporcionales a la intensidad del color desarrollado en la reacción.

Ejemplos: ELISA para anticuerpos anti-core VHB, niveles de Tiroxina (T4).

2- ELISA competitivo para detectar Anticuerpos

Técnicas in situ Técnicas inmunohistoquímicas Dotblot Inmunoblot Ensayo de ELISA en placa

WESTERN BLOT El fundamento es la separación por la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE SDS) de una mezcla de proteínas cargadas negativamente gracias al uso de un detergente aniónico (Dodesil sulfato de sodio – SDS), donde la posición de cada una de ellas depende de su peso molecular. El grupo de proteínas separadas se transfiere desde el gel separador de poliacrilamida hasta una membrana de soporte (membrana de nitrocelulosa) por capilaridad (blotting) o por corriente eléctrica, de forma que la membrana adquiere una réplica del grupo de proteínas separadas en el gel. Se puede detectar la posición del antígeno proteico en la membrana colocando un anticuerpo específico y realizando técnicas como ELISA para detectarlo. Habitualmente se utiliza una variación de la técnica para detectar la presencia de anticuerpos anti VIH en el suero de los pacientes. En este caso, se separa una mezcla definida de proteínas del VIH y se transfiere a la membrana; la

Anticuerpo Específico

Adición del substrato

Suero con antígeno + Antígeno marcado con

enzima

Reacción de color

Reacción de color

Suero con anticuerpos +

Anticuerpo marcado con enzima

Antígeno Específico

Adición del substrato

membrana se incuba con el suero problema y se continúa con una prueba de ELISA para detectar dichos anticuerpos anti-VIH. La técnica de transferir proteínas de un gel a una membrana se llama "Western blotting" Las bandas proteicas transferidas son teñidas evidenciando así su presencia y peso molecular ya que se utilizan patrones de peso molecular. En el caso de la búsqueda de anticuerpos contra el antígeno (Western blot para VIH) si las bandas proteicas se tiñen luego de aplicada la técnica de ELISA, significa que la muestra analizada tiene anticuerpos contra esos antígenos proteícos específicos del virus. Se utiliza para determinar la presencia y tamaño de una proteína en una muestra biológica. En el caso del la prueba de Western blot para VIH se detectan los anticuerpos presentes en los pacientes contra algunas de las proteínas del virus. Su aplicación es muy amplia tanto en clínica como en investigación.

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- Wistreich, George A. Microbiology Laboratory. Prentice-Hall, Inc. 1997. USA.

UNHEATED SERUM REAGIN (USR)

Profesora Maye Bernal Rivera

INTRODUCCIÓN En la confirmación diagnóstica de las Enfermedades Infecciosas, no siempre es posible la identificación directa del agente etiológico; en muchas ocasiones será posible llegar a la precisión diagnóstica mediante la investigación de anticuerpos específicos en el suero de pacientes, contra componentes antigénicos del agente etiológico , es decir, establecer un Diagnóstico Indirecto. La Sífilis, una de las Infecciones de Tansmisión Sexual (ITS) más importante, cuyo agente etiológico (treponema pallidum) sólo se puede observar en las fases iniciales de la enfermedad (Sífilis primaria y Sífilis secundaria) ; para poder establecer el diagnóstico en las otras fases (latente y Sífilis terciaria) , se requiere la invesigación de anticuerpos dirigidos contra componentes de treponema pallidum. Aunque estos anticuerpos no son altamente específicos , su hallazgo junto con la historia clínica bien hecha, constituye una base importante, tanto para el diagnóstico de la enfermedad, como para su seguimiento. La prueba de oro para el diagnóstico serológico de la Sífilis, es el VDRL; el antígeno utilizado para la búsqueda de los anticuerpos es una preparación artificial de; colesterol-cardiolipina – lecitina, preparada en alcohol absoluto y desarrollada por los laboatorios de Enfermedades de transmisión sexual de los Estados Unidos (Venéreal Diseases Research Latoratories), de donde la prueba toma la sigla VDRL. La prueba se realiza en suero calentado a 56ºC, para destruir factores que puedan interferir con la reacción. Derivadas de esta prueba, está la Rapid Protein Reagine (RPR) en la cual el antígeno viene listo para usarse, no requiere el calentamiento del suero ni el uso del microscopio para la visualización de la reacción ya que el antígeno incorpora particulas de carbón, que facilitan la observación del fenómeno cuando la prueba es reactiva. Otra prueba derivada del VDRL es la Uniheated Serum Reagin (USR) que utiliza el mismo antígeno que el VDRL, pero suspendido en Clorhidrato de colina, que hace innecesario el calentamiento del suerop y, viene listo para usarse . Todas la pruebas: VDRL, RPR y USR, tienen la misma especificidad, sensibilidad e interpretación. OBJETIVO Conocer y utilizar un recurso de diagnóstico indirecto en el manejo clínico de una entidad específica : Sífilis. MATERIALES Antígeno USR Suero a procesar Suero Control Positivo

Suero Control Negativo Solución salina 0.9% Láminas planas con anillo de cerámica de 14 mm de diámetro Pipetas de 0.1 ml Agitador de Manzzinni a 180 rpm (hoja de papl con un círculo de 16 cm) Microscopio (objetivo de 10X) METODOS

1. Colocar 50 microlitos del suero control positivo en el primer círculo de la lámina, 50 microlitros del suero control negativo en el segundo círculo y 50 microlitos del suero del paciente en el tercer círculo.

2. Mezclar fuertemente el antígeno de USR durante 10 segundos, con movimientos de rotación e inversión.

3. Adicionar 16 microlitos del antígeno mezclado a cada uno de los círculos. 4. Colocar las láminas en el agitador durante 4 minutos, a 180 rpm (manualmente

dibujar 4. un círculo de 18 centímetros de diámetro y sobre él, tomar cuidadosamente la lámina, durante 4 minutos , con movimientos suaves y constantes.

5. Colocar la lámina en el microscopio y leer en 10X. LECTURA E INTERPRETACION La ausencia de grumos se interpreta como una prueba NO REACTIVA (negativa), es decir, ausencia de anticuerpos anti – Treponema pallidum. La presencia de grumos se lee como REACTIVA (positiva). Si los grumos son muy tenues, la reacción se interpreta como RECTIVA DEBIL. Cuando la reacción es REACTIVA O REACTIVA DEBIL, debe hacerse una prueba cuantitativa. Para ello se hace diluciones dobles del suero (1:2,1:4,1:8, ....) hasta la dilución en que la reacción se haga débil. : Esta última dilución, indica el título de reactividad y si por ejemplo corresponde a la dilución 1:32, entonces se informa como REACTIVA 32 DILS . Si el suero sin diluir es débil reactivo y en la dilución siguiente es NO REACTIVO, la prueba se informa como REACTIVA O DILS. Una prueba REACTIVAindica que hay anticuerpos anti pallidum es decir, que el paciente ha estado infectado. Estos anticuerpos se negativizan con el tratamiento y por lo tanto para el médico constituyen un gran indicador de la efectividad o no del tratamiento. La prueba aunque altamente sensible, no lo es tanto en especificidad y bien puede ocurrir que en ciertas circunstancias la prueba sea REACTIVA en ausencia de infección sifilítica ; esas pruebas se denominan “Falsas Reactivas” y deberán aclararse con pruebas confirmatorias específicas. BIBLIOGRAFÍA • Guzmán MA, Sífilis Manual de Procedimientos Diagnísticos. Serie de

ublicaciones Científicas No. 8 Insituto de Salud.