INMUNOHEMATOLOGA

DEFINICIN: Es la parte de la hematologa que estudia los

procesos inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relacin con los elementos sanguneos.

Uno de los aspectos ms importantes de la inmunohematologa es el estudio y cuantificacin de los grupos sanguneos eritrocitarios que son componentes antignicos presentes en la superficie de los hemates, ya que se relaciona directamente con la teraputica transfusional y la prevencin de accidentes hemolticos graves.

En primer termino se identificaron sobre los hemates, pero luego se describieron determinantes antignicos plaquetarios, leucocitarios y sricos.

Los genes determinantes de los grupos sanguneos transmiten, generalmente, caracteres codominantes ( se expresan en homocigotos y heterocigotos).

Existen genes amorfos que no generan productos que puedan ser identificados como antgenos ( ej: gen d)

Todos los antgenos de los grupos sanguneos han sido definidos serolgicamente por la presencia de sus anticuerpos correspondientes.

Grupos Eritrocitarios y sus Antgenos

Fya, FybDuffy

Jka, JkbKidd

K, k, Kpa, KpbKell

Lua, LubLutheranP1, P2P

Lea, LebLewis

M, N, S, s, UMNS

D, C, c, E, eRh

A, B, AB, OABO

ANTGENOS MAS IMPORTANTES

GRUPOS SANGUNEOS

Karl Landsteiner (1868-1943)GRUPOS SANGUNEOS

1900

LOS GRUPOS SANGUNEOS SON ALOGNICOS.

La mayora de los individuos desarrollan anticuerpos frente a los antgenos ABO alognicos aunque no hayan sido expuestos a eritrocitos extraos; esta sensibilidad se debe al contacto con eptopes idnticos que casualmente expresan de forma rutinaria una gran cantidad de microorganismos.

Los anticuerpos frente a los antgenos ABO son muy frecuentes, lo que hace especialmente importante la verificacin de los grupos del donante y del receptor antes de llevar a cabo una transfusin sangunea.

SISTEMA ABO: GENTICA. Interaccin con el sistema Hh Un sistema de grupo sanguneo consiste en un locus

gnico que codifica un Ag de la superficie de las clulas sanguneas (generalmente de los eritrocitos). En cada uno de los sistemas puede haber 2 o mas fenotipos. Por ejemplo, en el sistema ABO existen 4 fenotipos ( A, B, AB y O ), por lo tanto son posibles 4 grupos sanguneos.

Un individuo con un determinado grupo sanguneo es capaz de reconocer los eritrocitos que posean antgenos de un grupo sanguneo alognico y producir ANTICUERPOS contra ellos.

El locus ABO tiene tres alelos: A, B y O, y por el hecho de ser diploide todo individuo ser portador de dos alelos.

Los genes A y B son codominantes,y producen enzimas que actuan como transferasas especficas, capaces de transformar por glicocilacin la SUSTANCIA H, presente en todos los hemates en los NTIGENOS A y B, mientras que el gen 0 es recesivo, no expresando ningn producto antignico.

Ello hace que existan seis genotipos diferentes (AA, AO, BB, BO, AB y OO) pero solo cuatro fenotipos posibles: A, B, AB y 0.

SISTEMA ABO: Genotipos posibles para cada Fenotipo.

Anti-A yAnti-B

ninguno

Anti-A

Anti-B

Anticuerpos sricos frente a

ABO

42,10HOOO

3,57A y BA1BA2B

A1BA2B

8,65BBBBO

B

45,56AA1A1A1A2A1 OA2 A2A2 O

A1A2

Frecuencia(%)

AntgenosGenotiposposibles

Grupo sanguneo( fenotipos)

SISTEMA ABO: GENTICA

Los genes A y B controlan la expresin de las sustancias A y B.

El gen 0 se denomina amorfo por no corresponderle ningun antgeno.

Sin embargo, los hemates del grupo 0 expresan un antgeno H, que es reconocido por determinados antisueros y lectinas vegetales.

Sustancia precursora TIPO I

Sustancia precursoraTIPO II

Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR

Unin 1,3 Unin 1,4

El precursor de TIPO I tiene una galactosa terminal (Gal)unida a una N-acetil-glucosamina subterminal(GlcNac) por una unin 1,3.

Los mismos azucares se unen mediante un enlace 1,4 en el precursor de TIPO II.

Sustancia HTIPO I

Sustancia HTIPO II

Glc-NACGal GalGlc-NACGal Gal GR GR

Fuc Fuc

1,2 fucosiltransferasa

Gen H

ANTGENO A(TIPO II)Glc-NACGal Gal

GR

Fuc

Gal Glc-NAC Gal

GR

Fuc

NAcGal

GalANTGENO B

(TIPO II)

1,3 N-acetilgalactosaminiltransferasa

1,3 galactosiltransferasa

SUBGRUPOS ABO Von Durgern y Hirszfeld en 1910 descubrieron estos subgrupos. Al observar que si al suero del grupo B se adiciona sangre del

grupo A, hace perder su poder de aglutinacin y as mismo poda continuar aglutinando otras sangres de los grupo A y AB.

As surgieron los subgrupos de estos grupos A1, A2, A1B y A2B.

Sustancia H1 H1Precursora H2 H2

H3H4

Fenotipo A1 A2Frecuencia 80 % 20 %

GRUPO BOMBAY Los individuos con genotipo HH o Hh producen la enzima 1,2-

fucosiltransferasa que transforma la sustancia precursora en Sustancia H.

Los individuios con fenotipo BOMBAY con genotipo hh no producen dicha enzima, por lo que no pueden modificar la sust. precursora, lo que hace que no puedan sitetizar SUSTANCIA H.

Esto condiciona a que los genes del sistema ABO (si los tuviesen ) no pueden expresarse, por lo que parecen ser del grupo O.

Presentan de manera constante adems de anti-A y anti-B, unanticuerpo natural anti-H muy activo a 37C, capaz de hemolisar los hemates de cualquier individuo que no sea de fenotipo BOMBAY.

El antiAB producido en individuos de fenotipo O no es una mezcla de antiA y antiB, sino que se trata de un tercer anticuerpo que presenta reaccin cruzada con un antigeno presente en los hemates AB. Este antigeno se denomina Antigeno C o Compuesto AB.

Los ttulos de antiA y antiB con frecuencia estn disminuidos en pacientes ancianos y con hipogammaglobulinemia, por lo que puedo tipificar errneamente cuando haga el GRUPO SERICO.

Los RN no producen ttulos normales de antiA y antiB hasta los 36 meses de edad, alcanzando el titulo mximo entre los 5 a 10 aos de edad.

Anti-A y Anti-B No anticuerpos Anti-A Anti-B En el plasma

Noantgenos

Antgenos A y B

AntgenoB

AntgenoA

En la membrana

Glbulos rojos

OABBAGrupo sanguneo

SISTEMA RH En 1939 Levine descubre que una mujer embarazada

forma anticuerpos contra un antigeno eritrocitario de su hijo, el Rh (D). Es asi como se descubre la existencia de ALOANTICUERPOS.

En 1940 Landsteiner y Weiner inyectaron glbulos rojos de primates (Macacus rhesus) en conejos, luego extrajeron suero de los conejos inmunizados y observaron que aglutinaban el 85 % de los hemates de los primates y el mismo porcentaje en humanos.

FISHER-RACE:

Se heredan de cada progenitor 3 genes.

Situados en loci prximos.

Los alelos se designan: D y d, E y e, C y c.

Cada gen codifica para un Ag especifico: D, C, c, E , e.

La presencia o ausencia del Ag D determina si un individuo es Rh positivo o Rh negativo.

WIENER: Herencia de un solo gen procedente de

cada progenitor.

Cada gen con una estructura de mosaico.

Ej.: El gen R1, codificara factores que corresponden a C, D y e de la nomenclatura Fisher- Race; el gen r producira los antgenos c y e pero no D, C, ni E.

Comparacin de las nomenclaturas para los Ag del Sistema Rh

Rh5ehr

Rh4ch`r

Rh3Erh

Rh2Crh`

Rh1DRho

RosenfieldFisher RaceWiener

cde

cdE

Cde

CdERh-

cDe

cDE

Cde

CDERh+

GenesFenotipos

Fisher-Rice

Caractersticas del Antgeno D

10.000 a 40.000 sitios D

Ag de maduracin eritroide

Polipeptidos membranales hidrfobos (28-32 Kda)

No estn glicosilados ni fosforilados

Poseen residuos palmitilados y acilados

Asociados al citoesqueleto

Marcadores de lnea celular

COMPLEJO RH

Polipptidos Rh

Glicoprotena asociada Rh50

Otras glicoprotenas LW, GPB, CD47 y Banda 3

Complejo Rh

RhD

Antgeno D debil

El antgeno Du aparece como un Rh(+) con ciertos antisueros y como Rh(-) con otros

El antgeno Du se transmite segn las leyes de Mendel

Existen dos tipos de Du: Alto grado Bajo grado (detectados slo por absorcin elucin)

Determinacin de Ag D debil

Coombs Indirecto

Enzimas proteolticas

Tcnicas en gel

Pruebas de absorcin-elucin (de referencia)

Importancia

Es especialmente importante su deteccin en los dadores de sangre (el antgeno Du esinmungeno)

En las mujeres embarazadas (no debeaplicarse la gamaglobulina anti-D)

Antgeno relativamente raro en la raza blanca

ANTICUERPOS anti-Rh

Todos los anticuerpos del Sistema Rh provienen de una alo-inmunizacin por embarazo o transfusin. Son Aloanticuerpos

Este sistema no posee anticuerpos naturales Clase IgG (IgG1 IgG3) no aglutinantes en salino

(enzimas, TCI) No fijan complemento Excepcionalmente IgM fuertemente aglutinantes

El antgenos D es el mas inmungeno.Los anticuerpos anti-Rh son clnicamente significativos.

Enfermedad Hemoltica ReaccinFetoneonatal Transfusional

Especificidades Anti-D: es el mas frecuente. Puede causar RT y

EHFN severa. Anti-c: muy frecuente. Puede causar RT y EHFN severa. Anti-E: muy frecuente. Puede causar RT y

EHFN severa. Anti-C: raramente solo; est presente en

mezclas: antiC+D. Pueden provocar RT y EHFN.

Anti-Cw: puede causar RT y EHFN. Anti-e: poco frecuente. Puede causar RT y

EHFN. Especificidad encontrada frecuentemente como autoanticuerpos

Asociacin a enfermedades

Los individuos con fenotipos Rh null padecen anemia hemoltica compensada.

Se ha observado una expresin reducida de los Ag Rh y mosaicismo Rh en leucemias, metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia.

Los genes Rh y la esferocitosis hereditaria estn ligados al cromosoma 1.

En poblaciones del sudeste asitico con ovalocitosislos antgenos del Rh estn expresados dbilmente.

Determinacion del fenotipo Rh

En la practica clnica se dispone de para la tipificacin del fenotipo Rh de :

anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti- e

Determinacion del genotipo Rh La identificacion del fenotipo no siempre permite la deduccion

confiable del genotipo, me permite deducir el genotipo mas probable.

Frecuencias fenotipicas del Sistema Rh

98e30E80c70C15D(-)85D (+)

Frecuencia ( %)ANTIGENO Rh

Otros grupos sanguneos Sistema Kell: Los antigenos mas importantes de este sistema son: K, k , Kpa,

Kpb, Kpc, Jsa y Jsb. Todos de importancia clnica. El anti- K es el anticuerpo irregulas mas comn despus del anti-

D, ya que puede causar severas reacciones transfusionales y EHFN. Es un anticuerpo del tipo IgG, que reacciona a 37 C por TCI.

El anti- k fue encontrado por primera vez en una mujer cuyo bebe desarrollo EHFN. Tiene las mismas caractersticas del anti- K.

Sistema Duffy. Sistema Kidd: Puede ocasionar EHFN y reacciones

transfusionales hemoliticas. Sistema MNSs :EHFN y reacciones transfusionales hemoliticas. Sistema I/ i

FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUSANGUNEOSNEOS Hay diferentes formas de evidenciar una

reaccin Antgeno-Anticuerpo:

Dado que los Ags eritrocitarios, se encuentran el la superfcie de la clulas, las formas mas utilizadas para su estudio son: AGLUTINACINy HEMLISIS.

AGLUTINACINHEMLISISINHIBICIN ABSORCIN Y

ELUCIN

ELISA

RIA

PRECIPITACIN

ETAPAS DE LA AGLUTINACIN

La aglutinacin se produce en dos etapas:

La primera es la unin Ag-Ac La segunda la formacin de puentes

intercelulares que producen el fenmeno visible de la aglutinacin.

PRIMERA ETAPA

Est influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4C, IgG a37C Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentracin relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminucin de

la aglutinacin cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag(postzona)

Fuerza inica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la unin Ag- Ac

Medios de potenciacin: *Soluciones de baja fuerza inica :LISS: reduce la neutralizacin de cargas opuestas aumentando la velocidad de reaccin y tambien la cantidad de Ac unido al hemate.

Tiempo de incubacin: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. Incubacin vara : 15 a 60 min

SEGUNDA ETAPA

Potencial Z Densidad del Ag Clase de Ig involucrada Para potenciar las reacciones de aglutinacin se

emplean diversos mtodos: centrifugacin controlada, adicin de medios macromoleculares, de Enzimas proteolticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizacin de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinacin

Potencial Z

Enzimas proteolticas que eliminan las cargas (-) de la superfcie celular

Papana Bromelina Eliminan el Acido Slico Tripsina

Otras sustancias: Albmina bovina Dextrn

GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unin por molculas de IgG.

Solucin salina de baja fuerza inica :LISS

Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Agy Ac.

Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentracin y de baja

afinidad Permite reducir el Tiempo de incubacin de la Coombs

de 30 a 10 Por esta razn el TCI en LlSS es la prueba de eleccin para la deteccin e identificacin de Acde tipo IgG

Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusionaly deteccin de Ac irregulares en donantes y receptores, deteccin de Ac irregulares en embarazadas y tipificacin de Ag eritrocitarios.

Antisueros especficos Anti-A Anti-B Anti-D :pueden ser de origen

Humanos,animal o monoclonales,tambien pueden ser extractos de tejidos vegetales (Lectinas).Se debe considerar la especificidad, ttulo,intensidad de la aglutinacin, avidez

Anticuerpos obtenidos por inmunizacin: Son policlonales (mezcla de Ac contra distintos epitopes

d euna misma molcula) Se obtienen por imnunizacin de animales o persona

sensibilizadas

Anticuerpos monoclonales Se obtienen de los hibridomas son monoclonales (clon

de clulas que poseen especificidad contra un nico epitope).

Los antisueros hemoclasificadores anti-A, anti-B yanti-AB son monoclonales

El antisuero anti-D : mezcla de monoclonal IgM que favorece la reaccin en placa y un Ac IgG policlonalhumano para el TCI en la determinacin del Du

Reactivo Antiglobulina Humana Se obtiene inyectando a conejos con globulinas

humanas purificadas Reactivos poliespecficos : Contiene 2 anticuerpos :anti-IgG y anti-C3d en los

estudios de Ac irregulares ,la presencia de anticomplemento favorece la deteccin de anti-Jka ,anti-JKb, anti-K

Cuando el test de CD da (+) ,debe investigarse mediante los sueros antiglobulina monoespecificos el tipo de anticuerpo o fraccin del complemento unido al GR

Reactivo Monoespecifico: Anti-IgG ,Anti-IgM, Anti-IgA Anti-C3d, Anti-C3b, Anti-C4b Se obtienen de modo anlogo ,inyectndolas distintas

fracciones separadas y purificadas a los conejos TCD: Sensibilidad : permite detectar entre 100 y 500

molculas de Ig/GR y entre 400-1100 molculas de C3d/GR

PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs)

Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR.

Existen dos tcnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR in vivo.

b) Indirecta: Determina Acsexistentes en el suero o plasma del paciente, previa incubacin del suero con GR apropiados.

DIRECTA: TCD Diagnostico de AH y EHRN. Investigacin de reacciones dudosas

en una transfusin. Investigacin de enfermedades autoinmunes.

INDIRECTA: TCI Screening de sueros de donantes y pacientes para

Acs. Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin.Identificacin y titulacin de Acs encontrados ensueros.

PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD

AGLUTINACIAGLUTINACIN N HEMHEMLISIS EN CUALQ. PASO ( +): LISIS EN CUALQ. PASO ( +): INCOMPATIBLE.INCOMPATIBLE.

SUSPENSISUSPENSIN HOMOGENEA EN TODOS LOS PASOS ( N HOMOGENEA EN TODOS LOS PASOS ( -- ):):COMPATIBLE.COMPATIBLE.

DETECCIN DE ACS IRREGULARES

TITULACIN

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9

S F - 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L100 L 100 L

100 L 100 LDEL TUBO 2 SE TOMA 100 L Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA

SUCECIVARESERVAR 100 L DEL TUBO 10 SUEROS 100 L 100 L

100 L 100 L

100 L 100 L

GR 100 L 100 L 100 L 100 L 100 L 100 L 100 L 100 L 100 L

DILUCION 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

CRIOAGLUTININAS

TUBOS 1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024 1/4096

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

6 Gts SF 2 Gts Suero

2 gotas

2 gotas

SERIE 1

SERIE 2

SERIE 3

AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2GTS SUSPENSIN HEMATIES N HEMATIES PACIENTEPACIENTE

AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS SUSPENSIN HEMATIES DEL N HEMATIES DEL GRUPO O IGRUPO O I

AGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIAGREGAR A TODOS LOS TUBOS 2 GTS DE LA SUSPENSIN DE N DE HEMATIES DE CORDON O iHEMATIES DE CORDON O i

Incubar los tubos a 4 Incubar los tubos a 4 c c -------- 24hs24hs

SERIE 1

SERIE 2

SERIE 3

PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES PARA DETERMINAR RANGO TERMICO , EFECTUAR LAS TITULACIONES E INCUBARLAS A 37 E INCUBARLAS A 37 C ( 1H ) ,A 20C ( 1H ) ,A 20 C ( 4 HS ) y A 4 C ( 4 HS ) y A 4 C ( 24 HS ) C ( 24 HS )

V N : TV N : TTULO MAYOR 32 TULO MAYOR 32

SI DSI D (+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GL(+ ) EN LA SERIE CON AUTOGLOBULOS Y GLBULOS BULOS DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I DE ADULTO, LA ESPECIFICIDAD ES ANTI I

SI DSI D ( + ) EN LA SERIE DE AUTOGL( + ) EN LA SERIE DE AUTOGLBULOS Y GLBULOS Y GLBULOS BULOS DE CORDDE CORDN , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i N , LA ESPECIFICIDAD ES ANTI i

SI DSI D ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO ( + ) CON LAS 3 SUSPENSIONES ES NECESARIO EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .EFECTUAR UN PANEL IDENTIFICADOR .

E H F N

CLASIFICACINSegn la especificidad del Ac

EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( ms severa )Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D

EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa )

Madres de grupo 0

EHFN : por acs contra ags de otros sistemas

ENFERMEDED HEMOLTICA DEL RECIN NACIDO (EHRN)

* Ictericia Signos * Anemia

* Esplenomegalia* Hepatomegalia

Causas + comn ( Incompatibilidad sangunea materno-fetal)

DIAGNSTICO : Etapa prenatal + ABO , Fenotipo R D dbil ( RH negativo ) Determinacin Ag Kell

INCOMPATIBILIDAD POTENCIALMujer O C c D E E kHombre A C c D e e k

INCOMPATIBILIDAD REAL

Investigar Acs irregulares ( panel eritrocitario select)- Medio salino- Medio enzimtico- LISS / Coombs

Acs irregulares : ttulo e identificacin 16 / 18 semSi es ( - ) repetir 28 / 32 semSi es ( + ) repetir 20 / 22 sem c/ 15 dias

si aumenta* Estudios de LA ( mujeres con ttulo > 16 + historia obstetrica

* Genotipificacin R H D fetal

* Feto Ultrasonido -----EC ( hgado- bazo )_ Muestra sangre fetal ( 18 sem )

ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA

PRUEBAS DE CONFIRMACIN

* A la madre : Tipificacin ABO Y RH ( VARIANTES DU )Panel selector ( aloanticuerpos maternos )

* En el nio : Tipificacin A B O y R H P C DH b , Hto cordn , BRR I de cordnReticulocitos

T T O de la mujer aloinmunizada

PLASMAFRESIS ( pueden ser removidos hasta un 75 % de alo Acs pero tienden a rebotar )

ADMINISTRACIN DE GAMMA GLOBULINA ( en altas dosis 400mg / kg de peso materno durante 5 das)

El tratamiento del neonato ya afectado depende de la severidad de la condicin.

LEVE: Aumento agresivo de

lquidos Fototerapia usando

lmpara de bilirrubina.KERNICTERUS:

Exanguinotransfusion(pueden requerirse varias)

Fototerapia

HALLAZGOS HEMATOLGICOS EN EL RECIEN NACIDO

* Aumento de reticulocitos . 10- 30 %evidencia de proceso hemoltico

compensado

* Eritroblastos en sangre perifrica 8---15 %

* Microesferocitos 80 %