Inmunohematologia Controles de Coombs

Universidad Estatal Del Sur De Manabí

TEMAS:

Integrantes:

Ponce Santistevan María

Parraga Cedeño Isaac

Fienco Uribe Andrea

Rodríguez Evelin

Catedrático:

Lcdo. Javier Reyes

4to Semestre “B”

Prueba de la Antiglobulina Directa e Indirecta Factores Que Afectan A La Antiglobulina Papel De Complemento De La Pruebas De Antiglobulina

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UNIVERSIDAD ESTATAL DEL SUR DE MANABICreada mediante Ley Nº 2001-38, publicada en el Registro Oficial 261 del 7 de Febrero del

2001Unidad Académica de Ciencias de la Salud

Carrera de Laboratorio Clínico

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA

Es usada para detectar la sensibilización in vivo de los glóbulos rojos, es de gran valor en el diagnóstico de la:

Enfermedad hemolítica del recién nacido Anemia hemolítica autoinmune Anemia hemolítica y sensibilización inducida por drogas Investigación de reacciones transfusionales

Procedimiento

1. En un tubo de ensayo de 10 o 12 x 75mm, colocar una gota de células rojas al 5% suspendida en solución salina fisiológica (SSF).

2. Agregar suficiente SSF al tubo, tratando de obtener una suspensión uniforme de las células.

3. Centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm para empaquetar los glóbulos rojos en el fondo del tubo. Decantar completamente toda la salina.

4. Agregar unas gotas de salina fresca al tubo, resuspender las células y luego agregar más salina para realizar el segundo lavado.

5. Centrifugar nuevamente y repetir el mismo procedimiento hasta completar 4 lavados.

6. Inmediatamente después del cuarto lavado, agregar 2 gotas de reactivo de antiglobulina humana y mezclar.

7. Centrifugar a 3400 rpm x 15 segundos, o 1000 rpm x 1 minuto8. Examinar el tubo para observar si hay aglutinación, graduarla en cruces y

anotar los resultados tubo en manos. Para facilitar la lectura es recomendable emplear ayuda visual.

9. Las pruebas negativas deben confirmarse con células control de Coombs. Al tubo de la prueba negativa se agrega una gota de células de control de Coombs, mezclar, recentrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.

Interpretación

Si la prueba de antiglobulina muestra aglutinación, se interpreta positiva, significa que hubo sensibilización in vivo de los eritrocitos y se informa: prueba de antiglobulina o de Coombs directo positiva, señalando en cruces la intensidad de la reacción por ejemplo, 4+.

Si no hubo aglutinación la prueba es negativa y significa que no existe Autosensibilización eritrocitaria.

La prueba de antiglobulina negativa será válida, solamente, si la prueba control de Coombs es positiva. En este caso, se informa: prueba de antiglobulina o de Coombs directo negativa.

Comentarios

Actualmente, la circular de instrucciones de los reactivos recomienda que las pruebas negativas se deben incubar durante un lapso de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, para luego a recentrifugar y leer. Algunas veces, una reacción negativa puede hacerse positiva; este procedimiento es de utilidad cuando se desea detectar sensibilización por complemento. No se debe

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Carrera de Laboratorio Clínicorecentrifugar la prueba de antiglobulina si esta ha sido positiva débil, porque puede nagativizarse si la reacción es debida a IgG.Para facilitar la lecturas de las pruebas es recomendable emplea una ayuda visual, por ejemplo una lupa o una lámpara de leer aglutinaciones, la cual debe estar provista de espejo amplificador. Algunos autores recomiendan leer las pruebas negativas al microscopio para detectar aglutinación no visible a simple vista. Es de primordial importancia controlar las pruebas de antiglobulina negativas, con células presensibilizadas con IgG.

Al principio de esta prueba se basa en que si el lavado de las células de la prueba de antiglobulina fue adecuado, deberán haberse eliminado las inmunoglobulinas libres o no fijadas a los glóbulos rojos. Si la prueba ha sido negativa, el suero de antiglobulina conservara su actividad anti-IgG y aglutinara las células de control de Coombs. El resultado se interpretara así:

a) Si la prueba control de Coombs es positiva, demuestra que la técnica de lavado fue correcta y que el reactivo de antiglobulina tiene actividad anti-IgG, por lo tanto, la prueba de antiglobulina es válida.

b) Si la prueba control de Coombs es negativa, la prueba de antiglobulina quedara invalidada y deberá repetirse (correctamente) todo el procedimiento.

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA

Esta permite detectar la sensibilización in vitro de los glóbulos rojos. El suero en estudio es incubado con los glóbulos rojos por el tiempo adecuado, luego se lavan para eliminar los anticuerpos y otras globulinas que no se han fijado al eritrocito, si la adición del reactivo de antiglobulina causa aglutinación de los glóbulos rojos, la conclusión es que en el suero existen anticuerpos irregulares específicos para los antígenos presentes en los eritrocitos. La detección de anticuerpos presentes en el suero se pueden efectuar con:

1. Células rojas especialmente seleccionadas, en las cuales se encuentran presentes los antígenos de grupos sanguíneos correspondiente a los anticuerpos de mayor frecuencia e importancia clínica.

2. Con células de genética conocida (panel) que permite hacer la identificación del anticuerpo presente. El panel se emplea una vez que se ha comprobado que en el suero existe un anticuerpo irregular, demostrando mediante las células detectoras.

3. Con células desconocidas, como en las pruebas de compatibilidad.

La prueba de antiglobulina indirecta se usa en:

Detección e identificación de anticuerpos irregulares. En la parte final de la prueba de compatibilidad. Detección de antígenos no demostrables por otras técnicas: Du, kell, Duffy,

kidd, etc. Identificación de anticuerpos presentes en eluatos. Pruebas especiales: consumo de antiglobulina, estudio de anticuerpos

antileucocitarios, antiplaquetarios, etc.

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Carrera de Laboratorio ClínicoPROCEDIMIENTO

1) En un tubo de ensayo de 10 o 12x75mm colocar 2 gotas de suero fresco en estudio.

2) Agregar 1 gota de una suspensión de células lavadas una vez y preparadas al 5% en SSF.

3) Agregar 2 gotas de albumina bovina polimerizada o albumina al 22 % o al 30%. Mezclar, centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.

4) Incubar a 37ºC por 15 a 30 minutos. Centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.

5) Lavar 4 veces con suficiente SSF como en la prueba indirecta, decantando cada vez toda la salina.

6) Agregar 2 gotas del reactivo antiglobulina humana poliespecífico y mezclar.7) Centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.8) Comprobar las pruebas negativas con células control de Coombs.

INTERPRETACION

Prueba de antiglobulina negativa + prueba control de Coombs positiva. Interpretación: prueba de antiglobulina negativa.Prueba de antiglobulina negativa + prueba de control de Coombs negativa. Interpretación: Prueba no válida.Repetir todo el procedimiento. Averiguar la causa del error.

FACTORES QUE AFECTAN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA

Fase de sensibilización (in vitro)

Los siguientes factores afectan la unión del anticuerpo con el antígeno:

Temperatura

Los anticuerpos de la clase IgG reaccionan ópticamente a 37ºC. la incubación a temperaturas menores puede reducir la unión del anticuerpo a su antígeno respectivo; las temperaturas mayores de 37ºC pueden dañar las células o el anticuerpo.

Medio de Reacción

El medio de suspensión para los glóbulos rojos puede ser SSF, albumina, suero inerte (Suero AB libre de anticuerpo) o solución de fuerza iónica baja (LISS). El efecto potenciador de la reacción antígeno anticuerpo de estas soluciones ya ha sido discutido el capítulo 2.

Proporción de células y suero

En la rutina del laboratorio, generalmente se emplea 2 gotas de suero más 1 gota de una suspensión de hematíes al 5%, lo que da una proporción aproximada de 40:1. Se ha demostrado que aumentando la proporción de suero a células (por ejemplo, 100:1), algunas veces es posible que no aparecen en los procedimientos de rutina.

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Carrera de Laboratorio ClínicoEn las investigaciones de reacciones hemolíticas, en las cuales no se detectaron anticuerpos irregulares en la prueba cruzada, puede ser útil aumentar la proporción de suero con el fin de incrementar la concentración del anticuerpo (por ejemplo, usar 3 gotas de suero).

Tiempo de Incubación

Un periodo de incubación de 15 a 30 minutos es suficiente para detectar la mayoría de los anticuerpos clínicamente importantes, cuando se emplea albumina como medio de reacción. La solución de fuerza iónica baja (LISS) permite acortar el tiempo de incubación de 10 a 15 minutos sin pérdida de sensibilidad a la prueba.

FASE DE LAVADO

Tanto en la prueba de antiglobulina directa como la indirecta, el lavado de las células es un procedimiento muy importante; las siguientes consideraciones deben ser tomadas en cuenta en ambos casos:

Tiempo de Lavado

Terminada la fase de incubación, el lavado de las células debe iniciarse inmediatamente y debe ser continuo, para evitar la elución del anticuerpo fijado a los glóbulos rojos.

Volumen de Salina Deben usarse volúmenes de SSF adecuados para diluir y eliminar de manera efectiva las globulinas no unidas a los glóbulos rojos. Los tubos deben ser llenados hasta aproximadamente 1cm por debajo de la boca y deben practicarse 4 lavados para remover todos los anticuerpos no fijados. Mollison ha estimado que la presencia de una cantidad muy pequeña de inmunoglobulinas residuales después del último lavado, del orden de 2ug IgG/ml, pueden neutralizar el reactivo de antiglobulina agregado.

Decantación de la Salina Para eliminar las globulinas no fijadas al glóbulo rojo, es importante que después de cada lavado la salina sea decantada totalmente. Ello se logra invirtiendo completamente el tubo y sacudiéndolo con un movimiento firme; una vez que se ha vaciado, se termina de eliminar el residuo de salina sacudiéndolo con fuerzas varias veces. Las células se quedaran adheridas al fondo del tubo y podrán ser resuspendidas agregando unas gotas de salina fresca y agitando el tubo con movimientos rápidos; luego, se completa el llenado del tubo hasta el nivel señalado, descargando la salina con cierta presión por el interior de las paredes.No se debe introducir la punta de la pizeta dentro del tubo, por el riesgo de contaminación. Las lavadoras automáticas pueden realizar este procedimiento más eficientemente que cuando se hace en forma manual, sin embargo, se deben calibrar periódicamente para asegurar un lavado adecuado. La eficiencia de un buen lavado, se puede apreciar en el cuadro.

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Carrera de Laboratorio Clínico

0.1 ml de0.2 residuo

0.05 ml de Residuo

0.01ml de residuo

Volumen de Salina 2ml 3ml 2ml 3ml 2ml 3ml

Ug IgG remanente**Después de: 1 lavado

750 500 375 250 75 50

2 lavados 37.5 16.66

9.375 4.16 0.375 0.166

3 lavados 1.875 0.55

0.234 0.07 0.0018 0.0005

d) Contaminación

Si se tapa la boca del tubo con el dedo para resuspender las células, se expone a la contaminación con proteínas provenientes de la piel, las cuales pueden inactivar el reactivo de antiglobulina. S e ha calculado que en una gota de dilución de suero humano en 1:4000 puede neutralizar una gota de antiglobulina.

e) Elución

El anticuerpo fijado puede separarse de los glóbulos rojos muy pronto, si son dejados en suspensión salina; por tal razón, es importante que una vez iniciado el procedimiento, esté no se detenga. Al finalizar el lavado, debe agregarse inmediatamente el suero de antiglobulina; si esto no se hace, el anticuerpo se despega del glóbulo rojo y al quedar libre, puede neutralizar el reactivo agregado dando un resultado falso negativo.

f) Centrifugación

La centrifugación para el lavado de células difiere de la centrifugación para acelerar la aglutinación y efectuar una lectura más precisa. En el lavado, se requiere que las células se precipiten y se empaquen en el fondo del tubo para evitar que al quedar células suspendidas, éstas se pierdan cuando se decante la salina. Para ello es suficiente centrifugar a 3400 rpm durante 2 minutos. Para la lectura de la prueba, se ha especificado que debe ser de 3400 rpm durante 15 segundos o 1000 rpm por 1 minuto. El exceso de centrifugación en este paso puede conducir a interpretaciones falsas positivas sobre lectura.

g) Lectura de la prueba

Para una correcta interpretación, las células deben desprenderse totalmente del fondo del tubo y ello se logra manteniendo el tubo en ángulo agudo, haciendo coincidir el menisco del líquido con el borde del botón de células; si se agita el tubo suavemente el

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Carrera de Laboratorio Clínicolíquido desprende fácilmente el botón. Cuando todas las células se han desprendido, el tubo se debe inclinar hacia la posición horizontal agitándolo suavemente para obtener una suspensión uniforme de las células o el desplazamiento de los aglutinados. La agitación fuerte rompe los aglutinados o dispersa las aglutinaciones débiles, induciendo a lecturas falsas negativas.

La intensidad o magnitud de la aglutinación debe expresar en cruces (0 a 4+) y es importante que todo el personal emplee el mismo sistema de lectura.

Controles

En la rutina de laboratorio, el reactivo de antiglobulina poliespecífico es el de uso general, porque contiene combinadas la actividad anti- IgG y anti-C3d, ambas de relevante importancia en clínica. La actividad anti-IgG permite detectar la gran mayoría de anticuerpos que conducen a la destrucción in vivo de los glóbulos rojos.

La actividad anticomplemento permite detectar los componentes del complemento fijados en la membrana celular por efecto de la reacción antígeno anticuerpo, pudiendo estar presentes tanto el anticuerpo como el complemento.

En algunas ocasiones el anticuerpo se escapa de la membrana durante el lavado pero queda fijado el complemento, que es detectado mediante la actividad anti-C3d del reactivo.

Las normas de control de calidad en el banco de sangre establecen que el reactivo de antiglobulina debe ser controlado diariamente, al igual que cada frasco que se abre. Para ello se emplean las células de grupo O, D-positivo sensibilizadas con suero diluido IgG anti-D.

Debe recordarse que la pérdida de potencia del reactivo de antiglobulina, puede ser causada por contaminación inadvertida con suero humano o por conservación inadecuada del reactivo, razón por la cual, es importante chequear cada prueba de antiglobulina que resulte negativa. Una prueba negativa en ausencia de controles equivale a una prueba falsa negativa, es decir, una prueba mal hecha. Si las células han sido lavadas en forma inadecuada el reactivo agregado se inactiva; si se ha dejado un exceso de salina, el reactivo se diluye y la reacción será muy débil o negativa; y será igualmente negativa si por cualquier razón se omitió la adición del suero antiglobulina.

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Carrera de Laboratorio ClínicoEstas fallas se detectan agregando a la prueba negativa una gota de células control de Coombs, recentrifugando y observando si hay o no aglutinación. El uso del reactivo de antiglobulina de color verde no substituye la prueba de células control de Coombs, pues el color solamente confirma que el reactivo fue agregado, pero no garantiza que el procedimiento fue bien hecho y que el suero antiglobulina está activa.

CAUSAS DE ERROR

Son causa de resultados falsos negativos

1. Lavado incorrecto, porque conduce a inactivación del reactivo.2. Contaminación con proteínas, por ejemplo, cuando se tapa el tubo con el dedo

para mesclar o re suspender los eritrocitos.3. Contaminación del reactivo con suero humano.4. Erección del anticuerpo durante el proceso de lavado.5. Suspensión de célula, muy fuerte o muy débil (mayor de 5% y menor de 2%).6. Las células mal conservadas, hemolizadas, calentadas o envejecida, sufren

alteración de los antígenos y perdida de la reactividad.7. En el suero viejo, el calentamiento, la descongelación repetidas, alteran la

actividad de los anticuerpos y del complemento.8. El empleo del plasma interfiere con la actividad del complemento y conduce a

falsos negativos.9. Anticuerpos que fijan complemento, este no se podrá demostrar si el reactivo

de anti globulina poli específicos tiene escasas o ninguna actividad anti-C3d.10. Incubación inadecuada durante la fase de sensibilacion.11. Perdida de células durante el lavado, cuando queda un botón celular

insuficientes para una lectura adecuada.12. Omisión del reactivo de Coombs.13. Retardo en agregar el reactivo de antiglobulina después de terminado el lavado

(elución del anticuerpo).14. El exceso de salina residual después del último lavado, causa dilución del

reactivo de antiglobulina.15. Los movimientos violentos para desprender el botón de células del fondo del

tubo, producen la dispersión de los aglutinados débiles e interpretación errónea de la lectura.

SON CAUSA DE RESULTADOS FALSOS POSITIVOS.

1. La contaminación bacteriana de la muestra de sangre y de los reactivos.2. Los glóbulos rojos provenientes de pacientes sépticos (activación de

antígeno T, Coombs directo positivo).3. La contaminación de la SSF con sílice coloidal proveniente de los

envases de vidrio donde este se almacena, igual problema se ha señalado cuando se usan tubos rayados; o la contaminación con iones metálicos cuando la salina se conserva en envase de metal.

4. Los tubos de ensayo mal lavados contaminados con polvo, detergente y otros materiales (sulfato de cobre).

5. Los reactivos de antiglobulina mal preparados, pueden contener trazas de anticuerpos especie-específicos.

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Carrera de Laboratorio Clínico6. Las muestras de sangre coaguladas y refrigeradas provenientes de

personas con anticuerpos fríos, pueden dar una prueba de Coombs directo positiva por activación del complemento. Ello se evita empleando glóbulos rojos de muestra tomadas con anticoagulante (ACD, CPD, EDTA), que inactivan el complemento.

PAPEL DEL COMPLEMENTO EN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA.

Los glóbulos rojos pueden sensibilizarse con componentes del complemento sea in vivo o in vitro, a través de dos mecanismos principales:

1. Por efecto de anticuerpo que fijan complemento.2. Por complejos inmunes presente en el plasma, los cuales de depositan sobre

los glóbulos rojos y causan activación no especifica del complemento, cuyos componentes se fijan en el membrana eritrocitarias.

Cualquiera que sea mecanismo, el resultado es que los glóbulos rojos se sensibilizan con componentes de cascada del complemento, pudiendo llegar o no a hemolisis. Si los glóbulos rojos no se hemolizan, fracciones de componentes del complemento quedan en su membrana, donde son detectados por el reactivo de antiglobulina. Complemento solo, sin inmunologlobia, puede estar presentes en la membrana del glóbulo rojo en ci9ertas circunstancia, por ejemplo:

a) En presencia de anticuerpos fríos IgM, que ocasionalmente sensibiliza los glóbulos rojos sin causar su aglutinación, pero, como invariablemente estos anticuerpos fijan complemento, este puede ser detectado mediante la prueba de anti globulina. Debemos de recordar que una molécula de IgM puede fijar cientos de moléculas de C3.

b) Un 10% al 20% de las anemias hemolíticas autoinmunes por anticuerpos calientes, tiene la prueba de antiglobulina directa positiva directa positiva (actividad anti-C3), sin demostrarse la presencia de inmunoglobulina IgG, Igm o IgA en la membrana9. Si piensa que estos casos si existen IgG, pero en cantidades tan pequeñas que no es demostrable por el reactivo de antiglobulina.

c) En el síndrome de anticuerpo fríos, el anticuerpo IgM se fija a los glóbulos rojos cuando hay descenso de la temperatura a 300C, lo cual sucede en la piel y en los sitios descubiertos. El anticuerpo unido a las células generalmente fija complemento y si las condiciones son óptimas, se produce la hemolisis. Pero si los glóbulos rojos escapan al fenómeno hemolítico, ellos retornan a la circulación central donde la temperatura es de 370C. a esta temperatura, el anticuerpo IgM usualmente de desprender de las células pero quedan los componentes del complemento fijados firmemente, pudiendo ser detectados por la prueba de anti globulina.

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