Inmovilizacion de P. Stipitis Para Produccion de Etanol
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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE TIERRA BLANCA INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS TESIS “Establecimiento de las condiciones de inmovilización de Pichia stipitis ACL2-1 utilizando bagazo de caña de azúcar fresco para la producción de etanol” PRESENTA: Sonia Rodela Herrera ASESORES: Dr. Benigno Ortiz Muñiz Dra. María Guadalupe Aguilar Uscanga Dr. José Armando Vargas García Tierra Blanca, Ver., Mex. Mayo, 2012.
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i
INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE TIERRA BLANCA
INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
TESIS
“Establecimiento de las condiciones de
inmovilización de Pichia stipitis ACL2-1 utilizando
bagazo de caña de azúcar fresco para la
producción de etanol”
PRESENTA:
Sonia Rodela Herrera
ASESORES:
Dr. Benigno Ortiz Muñiz
Dra. María Guadalupe Aguilar Uscanga
Dr. José Armando Vargas García
Tierra Blanca, Ver., Mex. Mayo, 2012.
ii
Establecimiento de las condiciones de inmovilización de P. stipitis ACL2-1
utilizando bagazo de caña de azúcar fresco para la producción de etanol
Por
SONIA RODELA HERRERA
Tesis propuesta a la
División de Ingeniería de Industrias Alimentarias
del
Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca
Como requerimiento parcial para
obtener el título de
Ingeniero en Industrias Alimentarias
Mayo, 2012
iii
DEDICATORIA
Mi tesis la dedico con todo mi amor y cariño.
A ti Dios, por darme la oportunidad de vivir, y no abandonarme, gracias por
ayudarme a levantarme en mis fracasos, por aprender de ellos, por guiarme en mi
camino y principalmente por permitirme realizar la meta más importante de mi
vida.
A mis padres quienes con su confianza, cariño y apoyo me han convertido en una
persona de provecho, ayudándome al logro de una meta más: mi carrera
profesional. Por compartir tristezas y alegrías, regaños y consejos, éxitos y
fracasos y por hacer de mí lo que soy., por pasar noches en vela a mi lado, por
inculcarme valores y luchar por lo que quiero, y sobre todo por brindarme su amor
incondicional.
A mi hermana, gracias por estar conmigo siempre y apoyarme en todo momento,
por sus consejos y regaños.
A mi novio, quien me ha brindo su apoyo incondicional en los momentos más
difíciles que se me han presentado, por compartir conmigo momentos inolvidables
llenos de alegría, tristeza y enojo, por brindarme tu confianza, gracias por estar
conmigo y recuerda que siempre serás muy importante en mi vida.
A mis amigos, gracias por ser las personas más lindas que dios me ha puesto en
mi camino, por brindarme su amistad verdadera y desinteresada, y por su
confianza brindada.
iv
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Dr. Benigno y a la Dra. Guadalupe por darme la oportunidad de
trabajar en el laboratorio de Bioingeniería, por su paciencia brindada y guía en el
desarrollo de este trabajo.
A mis compañeros en especial a todos aquellos que compartieron conmigo
conocimientos en el laboratorio de Bioingeniería, momentos de alegría, y algunas
ocasiones de tristeza. (Betsy, Alba, Ana, Catalina, Claudia, Lorena, Alejandra,
María José, Beatriz, Francisco, Luis Enrique, Jesús, Martín, Levi, Daniel, y Omar).
También agradezco a mis compañeros de la carrera, por compartir momentos
maravillosos en nuestra vida como estudiantes (Emmanuel, Hugo, Madiam, Betsy,
Gabriela, Karen, Laura, Magbis, Yadira, Carmen, Irleg, Cesar, Eduardo, Jorge).
Al Dr. José Armando y al IBQ. Gerardo por dedicar su valioso tiempo en revisar
este trabajo y por sus aportaciones realizadas. Al MC. Ibis, Dra. Verónica y al Dr.
Adolfo, por ser muy buenos maestros y brindarme su apoyo en todo momento.
A CONACYT por el apoyo financiero para el desarrollo de este trabajo a través del
proyecto número 150625 (CONACYT SENER).
v
RESUMEN
RODELA HERRERA, SONIA; División de Ingeniería en Industrias Alimentarias, Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca. Abril de 2012. Establecimiento de las condiciones de inmovilización de P. stipitis ACL2-1 utilizando bagazo de caña de azúcar fresco para la producción de etanol. Asesores: Dr. Benigno Ortiz Muñiz, Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga y Dr. José Armando Vargas García.
El etanol es una opción de biocombustible que presenta ventajas ante otros
derivados del petróleo, y que puede solucionar el gran problema que habrá con el
agotamiento de los residuos fósiles. En su producción biotecnológica, por medio
de la fermentación, aún se sigue en la búsqueda de condiciones y cepas que
mejoren la productividad y rendimiento de etanol. También se busca mejorar
características de interés industrial como utilizar diferentes sustratos y que sean
resistentes a etanol. Por otra parte, la investigación sobre inmovilización de
organismos unicelulares ha generado gran interés en la comunidad científica,
debido a sus grandes ventajas técnicas y económicas respecto a la fermentación
tradicional. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas
biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el
manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales,
un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa
para su posterior reutilización. El objetivo de este trabajo fue establecer las
condiciones de inmovilización de P. stipitis ACL 2-1 utilizando bagazo de caña de
azúcar fresco para la producción de etanol.
Se realizaron las cinéticas de crecimiento celular evaluando diferentes tamaños de
inóculos: 3x106, 3x107, 3x108 cel mL-1. El incremento en el tamaño de inóculo de
3x106 a 3x108 cel mL-1 promovió la reducción en el tiempo de fermentación de 60 a
42 h. Únicamente, empleando el tamaño de inóculo mayor se obtuvo un consumo
total de sustrato. Los parámetros obtenidos fueron; Yx/s= 0.055 gg-1, Ye/s= 0.452
gg-1, Ye/x= 8.271 gg-1, Qx= 0.08 gL-1h-1, Qp= 0.65 gL-1h-1; µmax= 0.127 h-1; Vs=
vi
0.971 gg-1h-1; Vp= 0.367 gg-1h-1. Para llevar a cabo la optimización de las
condiciones de inmovilización en medio con glucosa se empleó el diseño de
superficie de respuesta Box-Behnken, en el cual se emplearon 3 variables: tamaño
de inóculo, relación liquido-soporte y tiempo. Las condiciones de inmovilización
optimizadas fueron: inóculo (12.2x106 cel mL-1), relación líquido- soporte (1:23.3) y
tiempo (16 h). Adicionalmente, se evaluaron las condiciones de inmovilización en
bagazo de caña utilizando una relación soporte-solución isotónica de 1:20,
empleando tres tamaños de inoculo (3x106, 3x107 y 3x108 cel mL-1). Al inmovilizar
P. stipitis ACL2-1 sólo se presentó adsorción celular empleando el inóculo mayor
(3x108 cel mL-1). Posteriormente, se realizó la cinética de inmovilización
obteniendo las mejores condiciones que fueron una viabilidad celular del 76 %,
una retención de 19.3 mgg-1 y una eficiencia de 57 % a las 42 h. El tiempo que
dura este proceso puede ser debido a que el bagazo, al no ser pretratado,
presenta una estructura integra de la hemicelulosa cristalina, por lo que el
proceso de adsorción de células en el soporte utilizado es lento.
Los resultados obtenidos permiten sugerir que es más recomendable inmovilizar
empleando medio de cultivo y no una solución isotónica debido a que se obtienen
mejores parámetros de inmovilización.
vii
CONTENIDO
RESUMEN V
CONTENIDO Vii
LISTA DE FIGURAS X
LISTA DE TABLAS Xii
1. INTRODUCCIÓN. 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 2
2.1. Material lignocelulósico. 2
2.2. Caña de azúcar. 3
2.2.1. Usos de la caña de azúcar. 5
2.2.2. Constituyentes de la caña de azúcar. 6
2.2.3. Variedades de la caña de azúcar 6
2.2.4. Principales productores de caña de azúcar. 8
2.3. Bagazo de caña de azúcar. 9
2.3.1. Composición del bagazo de caña de azúcar. 10
2.3.2. Principal uso del bagazo de caña de azúcar en México. 12
2.3.2.1 Alimentación a las Calderas. 12
2.4. Etanol. 12
2.4.1. Procesos productivos para la obtención de etanol. 13
2.4.2. Producción de etanol a nivel mundial. 14
2.4.3. Vías de producción de etanol. 16
2.4.3.1 Vía sintética, reacción de etileno con vapor. 16
2.4.3.2 Vía sintética fermentativa 16
viii
2.5. Levaduras. 17
2.5.1. Características morfológicas generales. 17
2.5.2. Reproducción de las levaduras. 18
2.5.3. Requerimientos nutricionales. 19
2.5.4. Fuentes de carbono. 19
2.5.5. Fuente de nitrógeno. 20
2.5.6. Oligoelementos. 21
2.5.7. El oxígeno. 22
2.6. Metabolismo de levaduras. 22
2.6.1. Asimilación y fermentación de la fuente de carbono. 22
2.6.2. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras. 23
2.7. Inmovilización de células. 26
2.7.1. Problemas con la inmovilización de células. 29
2.7.2. Métodos de inmovilización de células para procesos de
fermentación.
30
2.7.3. Inmovilización de levaduras para la producción de etanol. 32
3. JUSTIFICACIÓN. 34
4. OBJETIVOS. 35
4.1. OBJETIVO GENERAL. 35
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS. 35
5. MATERIALES Y MÉTODOS 36
5.1. Materia prima. 36
5.2. Material Biológico. 36
5.3. Medios de cultivo. 36
5.3.1. Medio de conservación. 36
5.3.2. Medio de fermentación. 36
5.4. Condiciones de cultivo. 37
5.5. Inmovilización de células. 38
ix
5.6. Métodos Analíticos. 38
5.6.1. Cuenta celular. 38
5.6.2. Determinación de peso seco. 40
5.6.3. Sustratos y productos. 41
5.6.3.1 Preparación de muestras. 41
5.7. Análisis de datos experimentales. 42
5.7.1. Cálculo de rendimientos y productividad. 42
5.7.2. Análisis estadísticos. 44
5.7.2.1
Método de Box Behnken. 44
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 46
6.1. Efecto del tamaño de inóculo. 46
6.2. Optimización de las condiciones de inmovilización en medio con
glucosa
53
6.3. Inmovilización de células con solución isotónica. 62
7. CONCLUSIONES. 64
8. RECOMENDACIONES. 65
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 66
10. ANEXOS. 73
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la lignocelulosa. 2
Figura 2. Caña de azúcar. 5
Figura 3. Bagazo de caña de azúcar. 10
Figura 4. Composición del bagazo de caña de azúcar. 10
Figura 5. Estructura de a) celulosa y b) hemicelulosa (xilana y
arabinoxilano).
11
Figura 6. Producción mundial de Bioetanol. 14
Figura 7. Gemación de la levadura. 18
Figura 8. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras. 24
Figura 9. Cuenta celular en cámara de Thoma. 39
Figura 10. Correlación de peso seco y densidad óptica de P. stipitis
ACL2-1.
40
Figura 11. Correlación de densidad óptica y número de células con P.
stipitis ACL2-1.
41
Figura 12. Diseño Box Behnken de tres factores. 45
Figura 13. Crecimiento de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaños de
inóculos.
47
Figura 14. Consumo de glucosa.de P. stipitis ACL2-1 en diferentes
tamaños de inóculos.
47
Figura 15. Rendimientos de biomasa por P. stipitis ACL2-1 a diferentes
tamaños de inóculo.
48
Figura 16. Efecto del tamaño de inóculo sobre la producción de etanol en
P. stipitis ACL2-1.
51
Figura 17. Velocidades específicas de producción de etanol por P. stipitis
ACL2-1 a diferentes tamaños de inóculo.
51
xi
Figura 18. Rendimientos de etanol por P. stipitis ACL2-1 a diferentes
tamaños de inóculo.
53
Figura 19. Graficas de contorno de retención durante la inmovilización de
P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de
cultivo (glucosa).
56
Figura 20 Graficas de contorno de eficiencia durante la inmovilización de
P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de
cultivo (glucosa).
57
Figura 21 Graficas de contorno de viabilidad durante la inmovilización de
P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de
cultivo (glucosa).
58
Figura 22 Resultados de optimización de Minitab. 59
Figura 23. Cinética de inmovilización de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de
caña fresco en las condiciones óptimas.
60
Figura 24 Retención, eficiencia, viabilidad y pH de P. stipitis ACL2-1,
durante la inmovilización, utilizando como fuente de carbono
glucosa.
61
Figura 25 Cinética de inmovilización de P.stipitis ACL2-1 en bagazo de
caña de azúcar sin tratamiento, utilizando solución isotónica.
63
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición general de la caña de azúcar. 6
Tabla 2. Principales estados productores de caña de azúcar 2011. 9
Tabla 3. Composición del medio de conservación. 37
Tabla 4. Medio líquido sintético 37
Tabla 5. Velocidades globales de formación, productividades y
producción de biomasa en diferentes tamaños de inóculos.
47
Tabla 6. Velocidades globales de formación y productividades de etanol
en diferentes tamaños de inóculos.
51
Tabla 7. Variables utilizadas en la cinética de inmovilización de células
utilizando medio con glucosa.
52
Tabla 8. Coeficientes de regresión estimados para retención. 52
Tabla 9. Coeficientes de regresión estimados para la eficiencia 53
Tabla 10. Coeficientes de regresión estimados para la viabilidad. 53
Tabla 11. Tamaño de inóculo para la inmovilización de células de P. stipitis
ACL2-1 con solución isotónica, empleando un tiempo de 16 h.
58
1
1. INTRODUCCIÓN.
El etanol es un biocombustible renovable producido por la fermentación de
azúcares. Sin embargo, el costo del etanol como fuente de energía es
relativamente alto comparado con los combustibles fósiles. Una fuente potencial
para la producción de etanol a bajo costo son los materiales lignocelulósicos como
pastos, aserrín, astillas de madera y residuos sólidos de la Industria Alimentaria
(Sun et al, 2002); entre ellos, el bagazo de caña de azúcar es un producto de
desecho de los ingenios azucareros. Dentro de la industria alimentaria, la
inmovilización de microorganismos en soportes naturales o sintéticos proporciona
estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica permite alcanzar una mayor
densidad celular, así como la reutilización como biocatalizador y la implantación de
sistemas continuos de producción.
En el presente documento, el objetivo principal fue evaluar los diferentes tamaños
de inóculos para la producción de etanol, establecer las condiciones de
inmovilización de P. stipitis ACL2-1 en el bagazo de caña de azúcar y emplear un
diseño de superficie de respuesta (Box Behnken).
Posteriormente se presenta detalladamente una revisión bibliográfica, los
materiales y métodos empleados y los resultados obtenidos de evaluar el tamaño
de inóculo, las condiciones de inmovilización empleando un diseño de superficie
de respuesta (Box Behnken) y las condiciones de inmovilización empleando una
solución isotónica.
Finalmente, se presentan las conclusiones y recomendaciones del presente
proyecto.
2
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.
2.1 Material lignocelulósico.
La biomasa lignocelulósica (material vegetal) ha sido reconocida como una fuente
potencial de azúcares a bajo costo para la producción de etanol, debido a que, por
su origen, está disponible en grandes cantidades y es más barata que el maíz.
Estos suministros celulósicos incluyen rastrojos de maíz, trigo, arroz, bagazo de
caña de azúcar, pastos, etc. Los materiales lignocelulósicos están formados de
tres polímeros principales: celulosa, hemicelulosa y lignina, ver Figura 1. La
organización estructural exacta de esos polímeros depende de la variedad y el tipo
de planta (Pandey et al., 2000).
Figura 1. Estructura de la lignocelulosa.
La celulosa está constituida por moléculas de glucosa unidas por enlaces -
glucosídicos. Estas cadenas están enlazadas dentro de las microfibrillas por
puentes de hidrógeno y constituyen la estructura de soporte principal de la pared
celular de las plantas. Por su constitución rígida, se requiere de un tratamiento
3
severo para romperla. Los otros polímeros forman una matriz entre las uniones de
celulosa proporcionando la fuerza y rigidez del complejo. La lignina es el nombre
general para un grupo de polímeros constituidos por alcoholes aromáticos que
imparten fuerza considerable a la estructura de la pared celular. Es
extremadamente difícil de degradar y con la tecnología disponible hasta ahora es
prácticamente imposible fermentar a etanol (Kuijper, 2006). La hemicelulosa es
más diversa que la celulosa, es un polisacárido que consta de cadenas de
azúcares cortas, lineales y altamente ramificadas. En contraste con la celulosa, la
cual es un polímero de D-xilosa, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa y L-arabinosa
(Chandel et al., 2007).
2.2 Caña de azúcar.
La caña de azúcar (Saccharum officinarum) es una gramínea tropical, un pasto
gigante emparentado con el sorgo y el maíz, tiene un tallo macizo de 2 a 5 metros
de altura con 5 ó 6 cm de diámetro. El sistema radicular lo compone un robusto
rizoma subterráneo; El tallo acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al
ser extraído y cristalizado en el ingenio forma el azúcar. La sacarosa es
sintetizada por la caña gracias a la energía tomada del sol durante la fotosíntesis
con hojas que llegan a alcanzar de dos a cuatro metros de longitud. En su parte
superior encontramos la panocha, que mide unos 30 cm de largo.
La caña de azúcar se cultiva actualmente en prácticamente todas las regiones
tropicales y subtropicales del mundo. La parte más importante es su tallo, del cual
se extrae jugo dulce que se utiliza para la elaboración de sacarosa. La producción
de caña de azúcar en México se desarrolla bajo diversas condiciones, todo esto
se debe a la amplia distribución geográfica que tiene el país y de otros factores
que inciden. Las características del clima, los elementos socioeconómicos y la
competencia de otros cultivos son aspectos que en cada región cañera toman
particular importancia. La calidad de la materia prima que se recibe en el ingenio
depende de diferentes factores agrícolas relacionados, tanto en el cultivo como
4
en la cosecha de caña. En cuanto al cultivo se puede comentar que van desde la
variedad hasta el tipo de suelo en el que la siembra, los niveles de fertilización, el
régimen de lluvias, el riego, el clima, etc., y en la cosecha los factores son
esencialmente las materias extrañas que aparecen, desde el alza hasta la
introducción de las máquinas cortadoras.
Los principales factores que caracterizan el campo cañero mexicano y que
condicionan su comportamiento son los siguientes:
La superficie cultivada por productor.
La clase de tierra y el tipo de cultivo.
Los rendimientos por unidad de superficie.
La organización de la producción.
La aplicación de fertilizantes en los campos cañeros.
Los costos de producción de la caña de azúcar.
La competencia con otros cultivos.
El sistema de pago de la caña de azúcar.
Las superficies cultivadas con caña de azúcar se han establecido
predominantemente en áreas de temporal, aprovechando el amplio espectro de
condiciones de humedad en el suelo, bajo las cuales este cultivo se desarrolló,
desde que se planta el esqueje hasta que se llega el óptimo de madurez (el cual
coincide con la máxima acumulación de sacarosa en la caña), a los cultivos que
complementan este ciclo se les llama plantilla y después del primer corte al
segundo se le denomina soca. Ya en el tercer corte al año siguiente y los cortes
al segundo se les llama resoca dos, para México se recomienda que se realicen
como máximo cinco cortes ya que el rendimiento de jugo de caña va
disminuyendo. La producción del cultivo por unidad de superficie se le conoce
como rendimiento en campo, y un indicador que mide la cantidad de caña que se
obtiene por hectárea, varía según las zonas del país (Valdez Barrón et al., 1998).
En la Figura 2 se muestra la caña de azúcar.
5
Figura 2. Caña de azúcar.
2.2.1 Usos de la caña de azúcar.
Se utiliza preferentemente para la producción de azúcar, adicionalmente se puede
utilizar como fuente de materias primas para una amplia gama de derivados,
algunos de los cuales constituyen alternativas de sustitución de otros productos
con impacto ecológico adverso (cemento, papel obtenido a partir de pulpa de
madera, etc). Los residuales y subproductos de esta industria, especialmente los
mostos de las destilerías contienen una gran cantidad de nutrientes orgánicos e
inorgánicos que permiten su reciclaje en forma de abono, alimento animal, etc. En
este sentido es importante señalar el empleo de la cachaza como fertilizante, las
mieles finales y los jugos del proceso de producción de azúcar pueden emplearse
para la producción de alcohol, lo que permite disponer de un combustible líquido
de forma renovable y la incorporación de los derivados tradicionales (tableros
aglomerados, papel y cartón, cultivos alternativos para alimento animal y mieles
finales). Una pequeña parte la producción de caña de azúcar tiene fines de
producción de piloncillo, el cual se obtiene de la concentración y evaporación libre
del jugo de la caña, también es conocido como panela. El piloncillo tiene varios
usos, como materia prima en la industria de la repostería, pastelería, y como
endulzante en diversos alimentos y también se usa para la elaboración de alcohol
6
y otros licores. Otra cantidad de caña aún más pequeña se utiliza como fruta de
estación (http://w4.siap.gob.mx/sispro/Integra/Caracteristicas/CanaAzu.html)
2.2.2 Constituyentes de la caña de azúcar.
El tronco de la caña de azúcar está compuesto por una parte sólida llamada fibra
y una parte líquida, el jugo, que contiene agua y sacarosa. En ambas partes
también se encuentran otras sustancias en cantidades muy pequeñas como se
pueden observar las proporciones varían de acuerdo con la variedad (familia) de
la caña, edad, madurez, clima, suelo, método de cultivo, abonos, lluvias, riegos,
etc. Sin embargo, unos valores de referencia general se muestran en la Tabla 2.1.
La sacarosa del jugo es cristalizada en el proceso como azúcar y la fibra
constituye el bagazo una vez molida la caña.
Tabla 1. Composición general de la caña de azúcar (Chen, 1998).
2.2.3 Variedades de la caña de azúcar.
Las variedades se distinguen por tipos de colores:
El de las cañas verdes y amarillas, como la criolla y la cristalina
El relativo a las moradas y las coloradas, como la violeta.
La veteada o rayada como la listada.
Componente % (w/w)
Agua 73-76
Sacarosa 8-15
Fibra 11-16
Glucosa 0.2-0.6
Fructosa 0.2-0.6
Sales 0.3-0.8
Ácidos Orgánicos 0.1-0.8
Otros 0.3-0.8
7
La caña criolla cuya clasificación botánica es Saccharum offinarum, es la variedad
que trajo Hernán Cortés. Es la más antigua y la más repartida en la República
Mexicana; posee un jugo abundante y de la mayor riqueza en sacarosa, estando
dotada de gran vitalidad, pues a pesar de su larga estancia en nuestros campos,
no ha degenerado en lo más mínimo. No obstante, tiene el inconveniente de que
es muy sensible a los extremos de calor y frío. Llega a alcanzar 3.5 m de altura.
La Caña Cristalina que es la Saccharum lubridatium suelen adquirir sus tallos
hasta 6.5 metros. El nombre de Cristalina procede del aspecto de su tallo, cuyos
cañutos están cubiertos de una capa de vello blanquecino que le comunican
brillantes reflejos; el color de sus hojas, es de un verde más oscuro que el de las
otras variedades. Este tipo de caña es robusto y tiene mayor resistencia a las
adversas condiciones meteorológicas; pero tiene el defecto de ser muy dura,
exigiendo con este motivo mayor gasto de energía en los trapiches. Se cultiva esta
variedad en los estados de Morelos, Puebla y en algunas zonas de Campeche.
La Caña Violeta o Saccharum violaceum tiene los tallos con una coloración violeta
y las hojas ofrecen un color verde intenso. Tiene la ventaja de resistir mejor que
las otras a las bajas de temperatura. Una de sus desventajas es su tendencia a
secarse rápidamente y ser menos jugosa que sus congéneres.
La Caña Veteada pertenece al grupo Saccharum versicola y alcanza una altura de
unos 3.5 metros; resiste muy bien a los efectos del frío, y se distingue de las otras
por su agradable aspecto rayado de amarillo y rojo violeta. Las variedades se
agrupan en claves y están compuestas por letras y números. Las letras señalan el
lugar de origen de la variedad y el número al año cuando fue producida y a la serie
que corresponde. (w4.siap.gob.mx/sispro/portales/agricolas/cania/Descripcion2008.pdf)
8
2.2.4 Principales productores de caña de azúcar.
Los principales productores de caña de azúcar son: Veracruz, Jalisco, Oaxaca,
San Luis Potosí, Tamaulipas, Chiapas, Morelos, Puebla, Quintana Roo y Nayarit.
El estado de Veracruz sobre sale en comparación con los estados mencionados,
al obtener 4, 765, 133 toneladas; sin embargo, el rendimiento que se obtiene es
inferior al registrado en Morelos: 115.383 toneladas por hectárea ó Sinaloa donde
se tienen rendimientos de 113.024 toneladas por hectárea, como se muestra en la
Tabla 2.
2.3 Bagazo de caña de azúcar.
El bagazo de caña es un desecho fibroso, residuo del tallo o cuerpo de la caña de
azúcar (Saccharum officinarum) que se genera después de haberle exprimido el
jugo durante la producción de azúcar (Figura 3). Por cada tonelada de caña de
azúcar que se muele se producen aproximadamente 259 kg de bagazo de caña.
La agroindustria azucarera es de gran relevancia en la mayoría de las áreas
tropicales y subtropicales. En México existen 56 ingenios azucareros, de los
cuales 21 se encuentran en el Estado de Veracruz. Anualmente se producen
alrededor de 50 millones de toneladas de caña de azúcar que se destinan a la
producción de azúcar. De la producción nacional, Veracruz aporta
aproximadamente el 40%, de los cuales genera 4.9 millones de toneladas de
bagazo de acuerdo a los datos proporcionados por la Unión Nacional de cañeros,
A.C.-CNPR (www.caneros.org.mx). El bagazo, generalmente se apila en el
exterior el ingenio para posteriormente ser utilizado en la producción de energía
para autoconsumo. No obstante, se tiene la posibilidad de obtener diversos
metabolitos de interés como el etanol, xilitol, furfural, papel, alimento animal, entre
otros, a partir de este residuo (Noa, 1986).
9
Tabla 2. Principales estados productores de caña de azúcar 2011. (Fuente:
Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) con datos del Sistema
de Información Agroalimentaria de Consulta (SIACON).
Estado Superficie (ha) Producción
(ton)
Rendimiento
(ton/ha)
Sembrada Cosechada Siniestrada Obtenida Obtenido
CAMPECHE 10,415 615 34,141 55.500
COLIMA 13,619 5,427 451,679 83.234
CHIAPAS 29,835 10,889 934,297 85.802
JALISCO 71,703 27,854 2,449,160 87.930
MICHOACAN 14,985 4,494 317,258 70.604
MORELOS 17,818 6,214 716,954 115.383
NAYARIT 33,546 6,938 550,074 79.284
OAXACA 61,206 24,657 8 1,605,374 65.109
PUEBLA 16,174 6,221 676,903 108.809
QUINTANA ROO 27,384 9,641 588,548 61.046
SAN LUIS POTOSI 68,787 23,646 1,553,533 65.700
SINALOA 21,748 2,210 249,784 113.024
TABASCO 31,817 1,138 72,329 63.558
TAMAULIPAS 58,238 12,781 1,016,866 79.561
VERACRUZ 264,831 69,696 756 4,765,133 68.370
TOTAL 742,106 212,419 764 15,982,033 75.238
10
Figura 3. Bagazo de caña de azúcar.
2.3.1 Composición del bagazo de caña de azúcar.
El tallo de la caña de azúcar está constituida por dos partes: una esponja central
llamada médula, que es la que realmente se exprime, y una fibrosa, periférica
denominada corteza. El bagazo es un material fibroso, heterogéneo en cuanto a
su composición granulométrica y estructural, que presenta relativamente baja
densidad y un alto contenido de humedades. En la Figura 4 se muestra la
composición de materiales aprovechables del bagazo (Aguilar-Uscanga et al.,
2005).
Figura 4. Composición del bagazo de caña de azúcar
40%
20%
30%
10%
Celulosa
Lignina
Hemicelulosa
Otros
11
La mayor fracción de estos residuos está compuesta por celulosa, la cual puede
ser convertida en glucosa, (ver Figura 5), que es la fuente de carbono más común
en las fermentaciones (Neureiter et al., 2002).
a)
b)
Figura 5. Estructura de: a) celulosa y b) hemicelulosa (xilana y arabinoxilano)
(Roubroeks et al., 2001).
12
2.3.2 Principal uso del bagazo de caña de azúcar en México.
2.3.2.1 Alimentación a las Calderas.
Uno de los principales usos que se le da al bagazo de caña de azúcar es para la
alimentación de calderas. El bagazo es llevado directamente de los molinos a las
calderas por transportadores de arrastre y se alimenta mecánicamente a las
calderas. El dispositivo mecánico más simple consiste en una tolva dotada de
una compuerta contrabalanceada. Los alimentadores rotativos están constituidos
por tambores movidos mecánicamente que sella la apertura todo el tiempo
mientras gira y entrega el bagazo a los hornos.
Los dispositivos automáticos que regulan la cantidad de bagazo alimentado a las
calderas se han vuelto muy comunes. Los transportadores de velocidad variable
operando en forma conjunta con un equipo automático de control de la
combustión mantienen una alimentación uniforme, una adecuada relación
aire/combustión y una buena eficiencia de la caldera.
2.4 Etanol.
El etanol es el biocombustible más ampliamente utilizado hoy en día los Estados
Unidos, Brasil, Japón, Colombia, India y la Unión Europea; millones de litros se
agregan al año a la gasolina para mejorar el rendimiento de los vehículos y
reducir la contaminación atmosférica. El etanol es un alcohol y su mayor parte se
produce convirtiendo los azúcares en etanol por fermentación, que
posteriormente es destilado en su forma final. El etanol se utiliza para aumentar el
octanaje de la gasolina y mejorar la calidad de sus emisiones, como la mezcla
E10 (10% de etanol y 90% de gasolina) pero puede ser usado en
concentraciones mayores, tal como la mezcla E85 o en su forma pura (Cabrera et
al., 2000).
13
2.4.1 Procesos productivos para la obtención de etanol.
La producción de etanol a partir de la agroindustria azucarera obliga a la
integración de la destilería con la producción de azúcar. Esto aumenta el potencial
de aplicación no sólo de las mieles finales, sino también de los jugos, mieles y el
bagazo en la producción biotecnológica de energéticos.
Se pueden emplear otras alternativas de materias primas del proceso azucarero
como éstas: que representan ventajas en el ahorro de mieles, disminución en el
consumo de combustible, incremento en la calidad del azúcar y una mayor
integración tecnológica azúcar-derivados dentro del complejo agroindustrial. En un
sentido general, las opciones de producción de etanol, a partir de la caña de
azúcar, son las siguientes (Murtagh, 2003):
A través el uso de las melazas, tal como se estila en México y en la mayoría
de los países azucareros.
Utilizar mieles intermedias “A” y “B”, con importantes aumentos del
rendimiento y para bebidas de calidad.
Empleándose para este fin directamente el jugo o guarapo. Esto se realiza
en destilerías autónomas; prescindiéndose, entonces, del área de
producción de azúcar.
Aprovechamiento de jugos pobres (maceración y filtrados).
Fermentación de azúcares de la biomasa cañera (bagazo o residuos de
cosecha).
La obtención de alcohol de melazas (A, B, o C) se diferencia de otras materias
primas, como maíz, papa, milo y otros, en que éstos son productos de plantas con
alto contenido de carbohidratos almacenados en la forma de almidón. Por lo tanto,
estos materiales deben pasar por un proceso de pretratamiento de cocción o
tratamiento enzimático para hidrolizar éstos hacia azúcares fermentables. En
contraste, los carbohidratos presentes en las melazas ya se encuentran
disponibles y no requieren tratamiento, con un fundamento en las propiedades que
14
tienen algunos microorganismos de metabolizar azúcares y producir como residuo,
alcohol etílico.
Para el caso particular de hidrólisis de materiales lignocelulósicos de la caña de
azúcar o ruptura de moléculas en medio acuoso, tiene como finalidad la
transformación de azúcares complejos (polisacáridos) en carbohidratos sencillos.
Esto se logra con ácido sulfúrico o clorhídrico a altas temperaturas y tiempos de
operación cortos o largos; el ácido actúa como catalizador y se obtiene una
mezcla de glucosa y xilosa con algunos productos de degradación como ácido
acético, furfural y derivados de la ruptura de la lignina (Canizalez, 2001; Krishna,
2000).
2.4.2 Producción de etanol a nivel mundial.
La producción de etanol está encabezada a nivel mundial por los Estados Unidos
(48%), Brasil es el segundo productor con 42% de producción, en tercer lugar está
China y le siguen países como Canadá y Francia (ver Figura 6).
Figura 6. Producción mundial de Bioetanol, Biofuels Platform (2007).
Estados Unidos, 48%
Brasil, 42%
China, 4%
Canadá, 2%
Francia, 1% Alemania, 1% Tailandia, 1% Colombia, 1%
15
Los procesos biológicos para la obtención de etanol, pueden realizarse con la
ayuda de enzimas, bacterias o levaduras, dependiendo del tipo de materia prima
que se utilice, por ejemplo en el caso de Estados Unidos, la producción de etanol,
se lleva a cabo a partir de almidón, usando maíz como fuente de carbono, donde
se utilizan enzimas para degradar los almidones y tener acceso a los azúcares
simples para el proceso fermentativo. Posterior a esta etapa se lleva a cabo la
fermentación. En el caso de Brasil, se utiliza el jugo de caña, en Francia y otros
países se usan la remolacha, el trigo, las melazas de soya y la yuca entre otros.
(Sánchez y Cardona, 2008).
En México la producción de etanol, se lleva a cabo principalmente en 12
destilerías a partir de las melazas, residuales del proceso de obtención de azúcar
de caña. La producción de etanol es de 6x107 L, con un rendimiento de 230-250
L/TM (Litros/Toneladas Métricas) de Melaza procesada. Con grandes cantidades
de mieles intermedias como efluentes además de vinazas, las cuales representan
una oportunidad para la producción de etanol. Dos de los ingenios productores de
etanol más importantes están en Veracruz, la Gloria y San Nicolás y producen
115,000 L día-1 de etanol, 1 Ton de caña genera 55 kg de miel intermedia “B”, que
a su vez puede producir 8.25 kg de azúcar y el resto de miel final (melaza): los
efluentes de vinazas son mayores a 750 millones de litros con restos de azúcares
y levaduras (11°Bx) los cuales son desechados presentando un problema de
contaminación ambiental. La producción de caña de azúcar a nivel nacional
representó 13,000 millones de pesos en 2010, miles de familias viven del cultivo
de la caña de azúcar y existen asociaciones y sindicatos que hacen más costosos
los procesos de producción. (Unión de cañeros AC, CNPR, 2007).
16
2.4.3. Vías de producción de etanol.
2.4.3.1 Vía sintética, reacción de etileno con vapor.
En la siguiente ecuación muestra el proceso de producción de etanol por vía
sintética, que es utilizada para producir etanol. El cual posteriormente es utilizado
en diferentes procesos industriales.
2.4.3.2. Vía fermentativa.
El proceso para la producción de etanol por vía fermentativa tiene dos etapas
fundamentales: la fermentación y la destilación.
La fermentación es la etapa principal del proceso, no solo porque en ella se
produce el etanol, sino porque se reproduce la masa fundamental de levadura y
además por formarse aquí los productos secundarios. En la etapa fermentativa se
emplean diferentes tipos de nutrientes, los más utilizados en Cuba son urea y
sulfato de amonio como suministradores de nitrógeno; como aportador de fósforo
se emplea el fosfato dibásico o simplemente fosfato de amonio. En la siguiente
ecuación, se muestra el proceso de transformación cuantitativa de la glucosa en
etanol y bióxido de carbono.
C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2H2O
2.5. Levaduras.
Las levaduras son hongos unicelulares que producen colonias opacas, cremosas
o pastosas. La reproducción vegetal tiene lugar habitualmente por gemación. En
comparación con otros grandes grupos de microorganismos, las levaduras
presentan escasa diversidad (39 géneros, 350 especies). No constituyen una
C2H4 H2O C5H5OH
17
cantidad taxonómica propiamente dicha. Este grupo está formado por especies
relacionadas con distintos grupos de hongos filamentosos. Muchos hongos
pueden presentar dos fases: miceliar y unicelular. Las levaduras sólo se presentan
en forma de células aisladas o, con mucho, pseudomicelios.
2.5.1. Características morfológicas generales.
Las características generales de las levaduras por las que se las diferencian entre
sí son más bien morfológicas. La reproducción vegetal tiene lugar habitualmente
por gemación como se observa en la Figura 7, también se reproducen de manera
sexuada formando ascosporas o sólo asexualmente por gemación o división
binaria. El punto de sexualidad puede ser homolactica o heterocíclica y da por
resultado la formación ya sea de cuatro o de ocho esporas en saco que recibe el
nombre de asco, de ahí el nombre de ascosporas (Julian, 2001). Las levaduras
tienen forma elíptica, aunque algunas veces son alargadas o esféricas. Cada una
de las especies tiene forma característica, pero aún en los cultivos puros, las
células ofrecen notable variedad en el tamaño y la forma, según la edad del cultivo
y el medio en que se desarrolla su tamaño es mayor que el de las bacterias,
pueden medir entre 1 y 5 micras de ancho por 5 a 30 micras de longitud.
18
Figura 7. Gemación de la levadura.
2.5.2. Reproducción de las levaduras.
Se reproducen por ascosporas o sólo asexualmente por gemación o división
binaria. En observación microscópica se les distinguen a primera vista por no
poseer pigmentación verde, de los protozoos por presentar pared rígida y ser
inmóviles, y de las bacterias por presentar un tamaño mucho mayor, ya que las
levaduras son organismos eucariotas. La mayoría de las levaduras se reproducen
principalmente mediante gemación, la célula madre forma una zona de
crecimiento hacia el exterior, la que finalmente se separa como célula hija.
(Julian, 2001).
19
2.5.3. Requerimientos nutricionales.
Los requerimientos nutricionales de las levaduras, son un factor importante a
cubrir ya que de ello depende una propagación adecuada y al mismo tiempo una
fermentación o producción de etanol eficiente. Las levaduras requieren sustancias
básicas para realizar los procesos bioquímicos, en proporciones y relaciones
óptimas. Estos comprenden los elementos básicos al igual que todos los
microorganismos (Carbono, Hidrógeno, Oxígeno, Nitrógeno, Fósforo y Azúfre) y
algunas sales (K, Na, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Cu, Co) y vitaminas (B1, B5, B6,
Biotina, etc.) (Walker, 1998). De estos elementos los que se consumen en mayor
proporción durante la fase de crecimiento, son la fuente de carbono, la cual, la
célula deberá tomar de su ambiente cercano.
2.5.4. Fuentes de carbono.
Las levaduras son microorganismos anaerobios facultativos, capaces de
metabolizar diferentes fuentes de carbono, como azúcares simples, polioles,
ácidos orgánicos y ácidos grasos, alcoholes alifáticos y varios compuestos
heterocíclicos y poliméricos. La capacidad de metabolizar diferentes fuentes de
carbono, para la obtención de ATP, su selectividad por los diferentes nutrientes,
varía de especie a especie y se relaciona con los diferentes nichos en los que
habitan. Es esta capacidad de metabolizar diferentes sustratos lo que las hace
tan interesantes para diversos procesos industriales (Walker, 1998).
El azúcar más común es la glucosa sin embargo, esta no se encuentra sola en la
naturaleza, generalmente se encuentra en la sacarosa. Existen materias primas
complejas que contienen diversos azúcares como fuentes de carbono. El azúcar
es principalmente producido a partir de la caña de azúcar, la cual se cultiva en la
mayoría de las regiones tropicales del mundo. Los azúcares son la principal forma
de carbohidratos y probablemente son encontrados en casi todas las plantas
verdes, también se encuentran en cantidades significativas en la mayoría de las
20
frutas y vegetales. Hay tres azúcares simples principales, la sacarosa, la glucosa
y la fructosa. La sacarosa es de hecho la combinación de una molécula de
glucosa y una de fructosa, y una vez dentro del organismo esta se degrada a los
azúcares simples. El azúcar se produce generalmente de caña de azúcar, maíz,
remolacha y yuca, entre otros, pero en la mayoría de los países, la caña es usada
para la producción de azúcar, ya que son considerados varios aspectos como: el
costo total, los efectos ambientales, la velocidad de producción de azúcar y el
porcentaje de sacarosa presente en las diferentes materias primas (Chauhan et
al, 2011). El azúcar producido se obtiene principalmente de tres tipos de jugos:
Jugo de caña producido por molienda y clarificación (93% pureza).
Jugo de la remolacha producido de la difusión de azúcar de remolacha y
purificación (92% pureza).
Solución de hidrolizado de maíz producido después de la sacarificación
(hidrólisis) y filtración (95%pureza) (Chauhan et al, 2011).
Del proceso de producción de azúcar, además hay varios subproductos como la
cachaza, la miel intermedia “A” y “B”, resultante de los primeros pasos de
cristalización, y la melaza final que es la miel final después de la tercera
cristalización, la cual ha sido utilizada por muchos años. Se han empezado a
utilizar directamente los jugos de caña (García et al, 2011).
2.5.5 Fuente de nitrógeno.
La fuente de nitrógeno pueden ser compuestos como ácido glutámico, sales de
amonio, o bien directamente de una mezcla de aminoácidos, estas opciones han
sido probadas por Albers et al. (1996), quien reportó que la mejor opción es usar
una mezcla de aminoácidos, sin embargo, esta no es una opción
económicamente viable para cantidades industriales, por lo cual, frecuentemente
se recurre a opciones como el sulfato de amonio y sulfato diamónico. En el caso
de las levaduras, puede formarse el ácido glutámico a partir del ión amonio, el
21
cual es importante en la síntesis de aminoácidos en la célula, además de
proporcionar al mismo tiempo azufre y fósforo; aunque la asimilación de la fuente
de nitrógeno puede variar dependiendo de la cepa en cuestión y de algunas otras
condiciones de cultivo (Aguilar, 1998).
2.5.6. Oligoelementos.
Existen algunos minerales que son esenciales para el crecimiento de células, en
cantidades de trazas menores a 0.1%, y que en exceso son tóxicos para la célula.
En el caso del magnesio por ejemplo, existen reportes de que participan en
funciones fisiológicas, ya que participan como co-factor de al menos 300 enzimas,
en funciones como la división celular, y de la ruta glicolítica, ayuda a incrementar
o disminuir del intercambio de iones y por ende la permeabilidad de la membrana
plasmática interactuando con los fosfolípidos de la membrana y dando como
resultado la estabilización de la bicapa lipídica de la misma, además participa en
los sistemas de señalización de la membrana. Se cree que el magnesio, está
implicado de los efectos de liberación o deteriorativos del estrés por etanol en las
levaduras (Walker, 1998). Un caso similar tiene la presencia de sales de potasio,
participando como reguladores de la concentración osmótica de las células, por lo
que se cree que es el mineral cuantitativamente más importante en las levaduras.
Otros elementos indispensables para el crecimiento son el manganeso y el zinc.
En el caso del zinc en conjunto con el magnesio, participan como co- factores del
crecimiento y en la funcionalidad de enzimas de la ruta glicolítica, así como
moduladores del estrés (Walker et al., 2006).
El fosforo es otro elemento necesario para el crecimiento y el proceso de
fermentación en las levaduras, además mantiene la integridad de la pared celular
y participa generalmente en el metabolismo energético de los microorganismos,
además participa en la síntesis de lípidos y carbohidratos. Este elemento
generalmente se agrega en la forma de sales como el fosfato de potasio di-
hidrogeno (KH2PO4) o hidrógeno de fosfato di-sódico (Na2HPO4) (Walker et al.,
22
2006). Sin embargo cuando hay exceso de algunas sales, se presenta estrés por
aumento en la presión osmótica, lo que ocasiona la producción de metabolitos no
deseados en el caso de la fermentación alcohólica.
2.5.7. El oxígeno.
El oxígeno es un factor de crecimiento importante para las levaduras, este es
necesario para las reacciones de oxidación de la biosíntesis de esteroles y ácidos
grasos insaturados, mismos que forman parte de las membranas. O bien son
necesarios, para la respuesta al estrés. Las levaduras se pueden clasificar en
base a su capacidad para desarrollarse en presencia de oxígeno como:
Aerobias estrictas.
Aerobias facultativas.
En este tipo de microorganismos no existen levaduras anaerobias estrictas.
Además participan en combinación con la concentración de sustrato presente en
el medio como represor o activador del metabolismo respiratorio y fermentativo de
las levaduras, mismos que son de suma importancia para obtener los
rendimientos adecuados ya sea de células o bien de productos de fermentación
en los procesos industriales (Walker, 1998).
2.6. Metabolismo de levaduras.
2.6.1. Asimilación y fermentación de la fuente de carbono.
Existen diferentes rutas metabólicas involucradas en el metabolismo del carbono
y la generación de energía. El fundamento de cómo son reguladas estas rutas se
conoce como metabolismo de azucares y permite optimizar rendimientos de
biomasa y fermentación así como la producción de metabolitos de interés y con
ello el mejor aprovechamiento biotecnológico (Walker, 1998).
23
El catabolismo de los azucares se lleva a cabo por la ruta de glucolisis, en el
citoplasma, para generar energía para la célula y poder reductor (NAD+),
partiendo de la glucosa (hexosa), por reacciones oxidativas realizadas por varias
enzimas; mismas que sirven como reguladoras de estas reacciones, en respuesta
a varios factores activadores o inhibidores de las reacciones (Dawes, 1986).
Durante la primera parte de esta catálisis, se consume energía en la forma de
ATP, generando azúcares intermediarios más pequeños. Estos intermediarios
podrán desviarse a la ruta metabólica de la gluconegénesis, además en las
últimas etapas se produce ATP y treosas, hasta llegar al piruvato. El piruvato a su
vez podrá convertirse en acetaldehído y posteriormente a etanol o bien en Acetil
Co-A y entrar al ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) donde finalmente se
oxidará a CO2 y agua (Figura 8).
2.6.2. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.
El organismo es el principal activador o represor del metabolismo respiratorio o
fermentativo de las levaduras, es el responsable de la presencia o ausencia de
efectos como el Pasteur, Crabtree, y Custer. El metabolismo de tipo respiratorio,
de las levaduras es un proceso catabólico en el cual el aceptor final de electrones
es el oxígeno, y el metabolismo de tipo fermentativo, en el cual el aceptor final de
electrones es un compuesto orgánico. El metabolismo respiratorio, genera
producción de biomasa, al utilizar el ATP, para la síntesis de componentes de la
célula (Figura 8). Mientras que el metabolismo fermentativo, degradará el piruvato
a compuestos orgánicos como el etanol, CO2, reoxidando el NADH a NAD+,
(regeneración que resulta primordial para mantener el balance redox y controlar la
glucolisis) y con la participación de la piruvato descarboxilasa, enzima reguladora
de esta reacción. Las levaduras son capaces de asimilar directamente los
azúcares simples como glucosa y fructosa, seguido de su paso a través de la
membrana plasmática. Los azúcares simples son transformados en alcohol y
CO2. (Figura 8) en el metabolismo fermentativo, el cual se resume en la siguiente
ecuación (Dawes, 1986; Walker, 1998):
24
Figura 8. Metabolismo respiratorio-fermentativo de las levaduras.
Las flechas gruesas indican flujo preferencial y las flechas delgadas flujo limitado.
1: Transporte de piruvato a la mitocondria, 2: complejo piruvato deshidrogenasa,
3: Piruvato descarboxilasa, 4: Alcohol deshidrogenasa, 5: Acetaldehído
deshidrogenasa, 6: Acetil CoA sintetasa (citoplasmático), 7: Acetil CoA sintetasa
(mitocondrial), 8: Transporte de acetil CoA mediado por la vía carnitina.
Formación de ésteres, 9: Acetiltransferasa, 10: éster sintasa. (Adaptado de Bai et
al., 2008).
25
Glc + 2ADP + 2Pi + 2 Etanol + 2CO2 + 2ATP + 56 Kcal.
Entre los productos del metabolismo fermentativo se encuentran en orden de
importancia el glicerol, que ayuda a mantener el balance redox en la célula.
Además de la formación de otros ácidos orgánicos, estos metabolitos pueden
variar dependiendo de las condiciones de cultivo y de las cepas, y resultan muy
importantes en el desarrollo de sabor y aroma en las bebidas alcohólicas; sin
embargo, cuando el objetivo es etanol para diversos usos, el glicerol es un
metabolito no deseado, ya que infiere en el proceso de destilación (Walker, 1998).
Las levaduras también tienen un metabolismo respiratorio, este se lleva a cabo en
presencia de oxígeno, y es en este tipo de metabolismo donde se produce la
mayor cantidad de células. El metabolismo tipo respiratorio, se puede resumir en
la siguiente ecuación:
Glc + 6CO2 + 38ADP + 38Pi 6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 kcal.
Entender el proceso por el cual las levaduras adquieren el azúcar y otros
nutrientes sólidos es de suma importancia en biotecnología, ya que el transporte
eficiente conlleva un crecimiento y metabolismo adecuado de las células. Y por
ende, se puede dirigir de manera óptima la producción del metabolito de interés, o
bien de la biomasa de acuerdo a lo que se busque (Walker, 1998).
26
Otro metabolito importante es el ácido succínico, el cual puede sintetizarse por
algunas enzimas del ciclo del ácido cítrico. Además del ciclo de las hexosas
monofosfato, donde se incorporan compuestos importantes como la xilosa, está el
ciclo de degradación de las pentosas fosfato, el cual en un solo ciclo puede
convertir azucares de 6C a ribulosa 5-Fosfato y CO2. Esta ruta del xilitol es
importante en algunas levaduras que usan pentosas como Candida shehatae y
Pichia stipitis, que generan azucares de 2 carbonos por respiración y
fermentación. Además recientemente se ha promovido el uso de este edulcorante
en la industria alimentaria y farmacéutica, por lo que su producción aprovecha el
conocimiento de estas rutas (Evans y Ratledge, 1984).
De manera simultánea a la ruta de la glucolisis, se lleva a cabo el catabolismo de
azúcares por la ruta de las hexosas monofosfatos, en la cual, se genera el
NADPH citosólico, para reacciones de biosíntesis como producción de ácidos
grasos, aminoácidos y azúcares alcoholes, el poder reductor generado por esta
ruta, no está relacionado con la respiración, sino que también participa en la
formación de azúcares de ribosa, para síntesis de ácidos nucleícos y coenzimas
de nucleótidos (Walker, 1998).
La producción de etanol por células de levadura inmovilizadas ha sido
ampliamente investigada en las últimas décadas. Los métodos de inmovilización
más ampliamente utilizados se basan en el atrapamiento en geles de células,
tales como alginato de carragenina. A continuación se describen los métodos de
inmovilización de células para procesos de fermentación, los problemas que en
dicho método se presentan, etc.
2.7. Inmovilización de células.
La investigación sobre inmovilización de organismos unicelulares ha generado
gran interés en la comunidad científica, debido a sus grandes ventajas técnicas y
económicas respecto a la fermentación tradicional. Entre las principales ventajas
27
que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se
encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado
con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible
recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En general, los
materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser
grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y
aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996;
Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los
métodos de inmovilización de células más usados son la autofloculación
(Verstrepen y Klis, 2003; Stewart y Russel, 1986), la adsorción sobre soportes
(Bardi et al., 1996) y la incorporación de levaduras en matrices solidas. La
floculación es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y
Russel, 1986). La adsorción consiste en la adhesión de las levaduras a la
superficie externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel,
1986) o de la DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporación de
células a matrices solidas se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno
de un material polimérico. Las matrices más adecuadas son polímeros naturales
como el alginato, el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy
suaves aunque también se pueden usar matrices sintéticas como poliacrilamida y
poliuretano (Groboillot et al., 1994).
El “atrapamiento” de levaduras en matrices solidas puede realizarse por difusión
de las células en matrices solidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert,
2004) o por formación de las matrices alrededor de las células Este método de
inmovilización permite conseguir grandes concentraciones de biomasa (Stewart y
Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados. Además se pueden inmovilizar
en matrices independientes células que no podrían coexistir en contacto directo
debido al efecto “killer” (Pérez et al., 2001). No obstante, al igual que los otros
métodos de inmovilización presenta desventajas. Las más importantes son los
posibles problemas de difusión de nutrientes y productos a través de la matriz
porosa y la pobre resistencia mecánica de los soportes sólidos (Verbelen et al.,
2006). La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha
28
utilizado con éxito en la fermentación de vino blanco y en la producción de etanol
(Cachon y Divies, 2001). Debido a cambios en la composición de las células por
interacción con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven más activos
y se observa que la fermentación ocurre a mayor velocidad respecto a los casos
en los que se emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja
importante de estos sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura
de la acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas.
Además, a diferencia de los floculos de biomasa, estos sólidos al ser más sencillos
de manejar, permiten un mejor control de la actividad catalítica en reactores de
tipo lote y continuos.
La implementación de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial
interés para el área de los vinos espumosos. La forma tradicional de preparación
de estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior eliminación de estas
por medio del “degorgement” (degüelle), esto es mediante congelación (-25°C) del
cuello de la botella donde las levaduras se acumulan por sedimentacion durante el
“remuage” (cribado). Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante
el uso de levaduras inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cinética del
proceso se vea afectada consiguiéndose las mismas propiedades organolépticas
que los vinos producidos de manera tradicional (Yokotsuka et al., 1997). En el año
2001 el “Institute Oenologique des Vins de Champange (IOC)” reportó la
fabricación de tres millones de botellas mediante el uso de este tipo de tecnologia
(Divies y Chacon, 2005). También se han reportado estudios en los que se usan
estos dispositivos para la producción de sidra espumosa y vinos de pina (Divies y
Deschamps, 1986). Cabe destacar que combinando esta tecnología con el uso de
reactores de alta presión y reactores de flujo continuo ha sido posible la
producción a gran escala de vinos espumosos con composiciones y propiedades
sensoriales similares a los fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras
libres (Iconomopoulou et al., 2002) En el campo de los vinos espumosos también
se ha implementado el uso de membranas acopladas al tapón de la botella que
permiten el contacto entre el vino y las levaduras durante la fermentación final
(Lemonnier, 1992). Esta técnica alarga los tiempos de fermentación, pero ofrece la
29
posibilidad de realizar el “degorgement” de manera más sencilla sin necesidad de
enfriar la botella. Otro proceso de interés en el que la inmovilización de células
exhibe gran potencial es en la fermentación maloláctica. Este proceso es esencial
en la preparación de muchos vinos, ya que la transformación de acido maloláctico
en acido láctico y anhídrido carbónico reduce la acidez y mejora la calidad de los
mostos. Esta fermentación es difícil de controlar mediante las técnicas de
fabricación tradicionales, ya que las bacterias que catalizan dicha fermentación,
principalmente Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura,
pH y concentración de SO2. En 1991, se reporto que el O. oeni inmovilizado en
perlas de alginato se puede adaptar fácilmente a procesos en continuo sin que se
observe pérdida de actividad en procesos de fermentación maloláctica (Fleet et al.,
1991). Sin embargo, también se han reportado resultados en los que si se observa
una pérdida importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991).
Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la producción de
vinos espumosos se ha beneficiado con el uso de tecnologías que involucran la
inmovilización de células. No obstante, es de esperar que con un mejor
entendimiento de los procesos de fermentación y la fisiología de los
microorganismos inmovilizados, sea posible implementar esta tecnología a otros
procesos de producción.
2.7.1. Problemas con la inmovilización de células.
Si bien, el uso de células inmovilizadas en matrices sólidas ha permitido la
implementación de procesos de fermentación en sistemas de flujo continuo,
existen numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales se
describen a continuación.
Los sistemas floculados presentan un difícil manejo debido a que la floculación
depende de factores como el pH, la concentración de Ca2+, temperatura y la
agitación (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Además, cada cepa
de levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999). Otro caso,
30
es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las levaduras en
el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores continuos.
El mayor problema que presenta esta técnica es el bloqueo que eventualmente
sufren los poros de la membrana debido a partículas o a las mismas levaduras
(Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilización de células por adsorción
sobre la superficie de materiales es fácil de conseguir, pero al ser la adsorción un
fenómeno fundamentalmente electrostático, durante los procesos en continuo,
especialmente por efecto de la agitación, las células se liberan del soporte.
Además, por este método es difícil inmovilizar grandes cantidades de biomasa
(Verbelen et al., 2006).
2.7.2. Métodos de inmovilización de células para procesos de fermentación.
Si bien, existe una problemática alrededor del uso de células inmovilizadas, hoy en
día se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan
el desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos
diferentes a los polímeros de origen natural que se han usado hasta ahora muchos
de estos sólidos porosos podrían encontrar un lugar importante en los procesos de
producción de vinos y fermentaciones alcohólicas en general. Las zeolitas y los
diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en diversos
procesos catalíticos, prueba de ello es su extensa aplicación (Corma, 1995).
Debido a su tamaño de poro pequeño, no sería posible inmovilizar levaduras
dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeoliticas si podría
ser de gran utilidad en procesos de fermentación en los que se requiere eliminar el
etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicación se
podrían emplear materiales zeoliticos hidrofóbicos convencionales como la zeolita
beta (Camblor et al., 1996) o materiales híbridos orgánicos-inorgánicos como los
metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatos–beta (Maeda et al., 1997). Cabe
mencionar que la producción de membranas zeoliticas compactas y con
propiedades mecánicas adecuadas no es sencilla y hoy en día sigue siendo un
reto para muchos grupos de investigación.
31
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares
(Taguchi y Schuth, 2005), aunque siguen sin presentar el tamaño de poro
adecuado para la inmovilización de levaduras, si permiten la inmovilización de
enzimas (Yiu y Wright, 2005). Esto hace que estos sólidos tengan un interés
especial en la industria vinícola ya que mediante el uso de enzimas podrían
modificarse la naturaleza de algunas sustancias responsables de aromas y
sabores característicos del vino consiguiéndose productos con propiedades
organolépticas diferentes. Los materiales mesoporosos más adecuados para la
inmovilización de enzimas serian los sólidos del tipo SBA-15 debido a su gran
tamaño de poro (Zhao et al., 1998). La inmovilización de las enzimas se
conseguiría por difusión de las mismas en los poros del solido previamente
funcionalizado con moléculas que “anclarían” la enzima a la pared del material
(Hartmann, 2005). Sólidos como los que se proponen aquí podrían usarse en
procesos en continuo o en sistemas fluidizados. La inmovilización de levaduras
requiere de materiales macroporosos con radios del orden de algunas micras,
estos materiales pueden sintetizarse mediante dos técnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerización en microemulsión,
que posteriormente son usadas como moldes que se recubren con precursores de
óxidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008; Marrero-López et al.,
2008). Por medio del proceso de calcinación de las esferas es posible sintetizar
materiales macroporosos de cavidades esféricas regulares conectados por
ventanas de menor tamaño. Mediante esta técnica sería posible sintetizar
biosólidos de gran resistencia mecánica en los que no habría grandes problemas
de difusión de reactivos o productos. El paso más complejo de síntesis sería la
inoculación de las células en el interior del sólido, ya que aunque los poros pueden
ser muy grandes, las levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los
poros. La estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podría resultar
de interés para la fabricación de membranas para la retención de levaduras en
reactores en continuo.
El segundo método que posee gran potencial es el uso de materiales porosos
sintetizados por congelación unidireccional y posterior liofilización (Choi et al.,
32
2009). Esta técnica de preparación de sólidos macroporosos, al ser reciente, es la
menos explorada en el campo de la catálisis. Este método implica la congelación
de una solución de partículas que pueden ser poliméricas, silíceas, metálicas etc.
a temperatura de nitrógeno líquido de manera unidireccional y a velocidad
controlada.
El proceso que parece complejo, es en realidad un método sencillo de fabricación
de materiales macroporosos que, además, permite la incorporación de especies
biológicas in-situ en la matriz durante la síntesis del material debido a que no se
requiere calcinación de ningún molde orgánico. Para inmovilizar bacterias dentro
de una matriz polimérica (Gutiérrez et al. 2007).
2.7.3 Inmovilización de levaduras para la producción de etanol.
Se ha empleado la tecnología de utilizar células inmovilizadas como medio eficaz
para mejorar la fermentación de etanol. La inmovilización de las células da lugar a
densidades celulares más altas, con el consiguiente incremento en las
velocidades de reacción y la productividad, dando como resultado, el tiempo de
residencia más corto.
La producción de etanol por células de levadura inmovilizadas ha sido
ampliamente investigada en las últimas décadas. Los métodos de inmovilización
más ampliamente utilizados se basan en el atrapamiento en geles de células,
tales como carragenina y alginato de Ca (Luong, 1985; Godia et al., 1987;
Hamamchi y Ryu, 1987). Otros métodos se basan en la adherencia a las
superficies pasivas, tal como perlas de vidrio, esferas de alambre de acero
inoxidable (Van Haecht et al., 1985; Vega et al., 1987; Sho et al., 2001). En el
primer caso, el principal inconveniente de estos sistemas es la inestabilidad de los
Ca-alginato contra los fosfatos y la interrupción de las partículas de gel, debido a
la evolución de CO2 durante la fermentación. Para la segunda, las células se unen
a la superficie de los transportistas, por interacciones electrostáticas o unión
covalente de las células, los dos inconvenientes principales son la limitación de la
33
carga de biomasa por la superficie portadores, y el efecto de diversos factores
que pueden causar a la célula desorción limitando con ello la estabilidad.
Las células se han inmovilizado sobre una variedad de soportes naturales y
sintéticos. Se han utilizado ampliamente materiales lignocelulósicos como son:
aserrín, astillas de madera o virutas, cascarilla de arroz y paja (Shukla et al.,
1988; Das et al, 1993; Maryse y Zdravko, 1996). Sin embargo, existen algunos
inconvenientes, por ejemplo, algunos de estos soportes tienen estructuras no
uniformes que a menudo están presentes en forma de partículas y las caídas de
presión o de flotación se observan a menudo especialmente cuando los sustratos
de densidad son altos.
34
3. JUSTIFICACIÓN.
En la actualidad, no se satisface la demanda de etanol a nível nacional para su
uso en la indústria. Además es necesario utilizar procesos para la obtención de
fuentes de energías renovables (biocombustibles) que atiendan las demandas del
sector energético.
Existen varias características y ventajas que ofrecen los sistemas de
inmovilización para la explotación de células inmovilizadas en lugar de la
utilización de células libremente suspendidas; proporcionan una larga estabilidad,
existe mayor rendimento de la fermentación, alta actividad biocatalítica, el agente
biologicamente activo se concentra en un volúmen pequeño tanto como sea
posible, reutilización de las células inmovilizadas, durabilidad funcional del sistema
de inmovilización.
35
4. OBJETIVOS.
4.1. Objetivo General.
Establecer las condiciones de inmovilización de Pichia stipitis ACL2-1,
utilizando bagazo de caña de azúcar fresco para la producción de etanol.
4.2. Objetivos Específicos.
Evaluar el efecto del tamaño de inóculo sobre el crecimiento y producción
de etanol en P. Stipitis ACL2-1.
Establecer las condiciones óptimas de inmovilización de Pichia stipitis
ACL2-1 para la producción de etanol (tamaño de inóculo, relación líquido-
soporte y tiempo).
Evaluar la cinética de inmovilización bajo las condiciones óptimas
establecidas.
36
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Materia prima.
Se utilizó bagazo procedente del Ingenio Adolfo López Mateos (zafra 2007-2008),
se procedió a ser tamizado, utilizando un de tamiz de 4.75 mm, posteriormente el
bagazo fue lavado con agua destilada, se puso a secar al sol y después se secó
en estufa a 75℃ durante 72 horas.
5.2. Material Biológico.
La cepa de levadura utilizada en el presente trabajo fue Pichia stipitis ACL2-1, la
cual fue mutada por Rasgado Mellado (2011). Y que presenta el fenotipo
deficiente respiratorio, es capaz de fermentar xilosa y glucosa a etanol, presenta
baja producción de ácido acético y glicerol.
5.3. Medios de cultivo.
5.3.1. Medio de conservación.
La cepa fue conservada en refrigeración a 4℃ y resembrada cada mes en el
medio de cultivo, cuya composición se indica en la Tabla 3.
5.3.2. Medio de fermentación.
El medio sintético utilizando para activar la levadura fue preparado como se
muestra en la Tabla 4.
37
Tabla 3. Composición del medio de conservación.
Componente gL-1
Agar –agar 20
Glucosa 20
Extracto de levadura 10
pH 5.5
Tabla 4. Medio líquido sintético
Componente gL-1
Glucosa 70
Extracto de levadura 1
Fosfato de potasio 5
Sulfato de magnesio 0.4
Sulfato de amonio 2
5.4. Condiciones de cultivo.
Se tomaron tres asadas de las que contenían la levadura de conservación y se
inoculó en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo y se
incubó a 150 rpm y 30 ℃. Después de transcurridas 12 h de incubación para
Pichia stipitis ACL2-1
Se activó la cepa tomando tres asadas de las cajas de medio sólido que contenían
la levadura y se pasó al medio sintético líquido en un matraz Erlenmeyer de 250
mL con 100 mL de medio, incubándolo durante 12 h a 250 rpm y 30 °C, para ello
se utilizó una incubadora con agitación/refrigeración marca New Brunswick
Scientific, modelo C24KC. Después de 12 h de activación, se realizó un precultivo
ó preinóculo con el mismo medio a utilizar.
38
5.5. Inmovilización de células.
Se inocularon y se incubaron matraces Erlenmeyer de 250 mL con 58 mL de
medio y 12.2x106 cel mL-1 durante 24 h, para posteriormente ser retirados de la
incubadora, realizando un lavado con agua estéril destilada, siendo a la vez
decantado el matraz para extraer el agua presente en el. Del agua que fue
extraída se tomó una alícuota para conocer la viabilidad y ser analizada en HPLC
(cromatografía líquida de alta resolución), después se colocaron los matraces en
la estufa de secado a 75 ℃ durante 72 horas. Una vez transcurrido el tiempo de
secado los matraces fueron pesados para conocer la eficiencia y retención de
células presentes en el soporte.
5.6. Métodos Analíticos.
5.6.1. Cuenta celular.
La cuenta celular se determinó por conteo al microscopio el número de
microorganismos contenidos en un volúmen conocido, empleando una cámara de
Thoma en un microscopio MEIJ (objetivo 40X), usando una tinción con azul de
metileno (haciendo una relación 1:1). Se dejó reposar durante 5 min,
posteriormente se colocó una alícuota de la solución celular teñida en la cámara
de Thoma (celda hemacitométrica). Esta cámara tiene un volúmen conocido,
delimitado por líneas (Figura 9). El cual se llena con una suspensión de células, la
cual puede estar teñida o no con algún colorante, esto permite contar las células,
en cada cuadrante y calcular el número total de células. Para diferenciar entre las
células vivas y las células muertas se hace una tinción con solución de azul de
metileno, el cual penetra en la membrana de las células muertas teñiendolas de
azul. La cual permite observar un área de volúmen conocido y contar las células
vivas, las cuales aparecen transparentes mientras que las muertas se observan de
color azul.
39
Figura 9. Cuenta celular en cámara de Thoma.
Existen dos teorías que explican por qué las células se tiñen con el azul de
metileno.
a) Al ser el azul de metileno un colorante de óxido-reducción, al cambiar a su
forma reducida, se vuelve incoloro; esta reacción puede realizarse por una
hidrogenasa, si la célula está viva.
b) La segunda teoría consiste en que cuando las levaduras mueren, su
membrana se debilita y permite el paso del azul de metileno a través de la
membrana.
Las células contadas deben ser no más de 500, para lo cual se hicieron las
diluciones pertinentes.
Para obtener el número de células totales por mililitro de medio, se uso la
siguiente fórmula:
No. cel* 106 / mL=
De acuerdo a lo reportado por (Lange, 1993), se calculó la viabilidad celular:
Viabilidad =
40
5.6.2 Determinación de peso seco.
Para la determinación de peso seco a partir de las cinéticas realizadas en medio
sintético con glucosa como fuente de carbono a 70 gL-1, (por duplicado), se
filtraron 20 mL del medio de cultivo en crecimiento, para recuperar las células en
membranas Millipore de 0.45 µm, previamente a peso constante. Enseguida estas
membranas fueron llevadas a estufa de secado ya con la muestra de células
filtradas, hasta su peso constante, al término de las cuales, se determinó el peso
seco de las células contadas en cada muestra y se hizo una correlación entre el
peso seco de las células y la D.O. (Densidad óptica). La ecuación de correlación
obtenida fue Y = 0.7558x - 0.0327, con una R2 = 0.998. También se realizó otra
correlación entre el peso seco de las células y el número de células por mililitro. La
ecuación obtenida para este caso fue: Y = 5x109x + 0.0926, con una R2 = 0.9918.
Estas correlaciones se usaron para calcular el peso seco del bagazo de caña de
azúcar, a partir de las células contadas (Figura 10 y 11).
Figura. 10. Correlación de peso seco y densidad óptica de P. stipitis ACL2-1.
y = 0.7558x - 0.0327 R² = 0.998
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
Co
nce
ntr
ació
n d
e c
élu
las
(gL-
1)
Densidad óptica (620nm).
41
Figura. 11 Correlación de Densidad óptica y número de células con P. stipitis
ACL2-1.
5.6.3. Sustratos y productos.
5.6.3.1. Preparación de muestras.
Antes de inyectar las muestras en el cromatógrafo, se centrifugaron a 10,000 rpm,
por 10 minutos, se enfrío por 5 minutos y a partir del sobrenadante se tomó una
alícuota para realizar una dilución de manera que se tuvieran menos de 70 gL-1de
azúcares, esta dilución se filtró con membranas Millipore de 0.22 µm, para retirar
cualquier partícula que pueda bloquear la columna del cromatógrafo.
Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) Waters 600,
detector de índice de refracción, una columna Shodex SH-1011, con H2SO4 5 mM
como fase móvil, temperatura 50 ℃, flujo 0.6 mL min-1, se determinaron las
concentraciones de azúcares totales (glucosa), glicerol, ácido acético y etanol.
y = 5E-09x + 0.0926 R² = 0.9918
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
0.00E+00 5.00E+08 1.00E+09
De
nsi
dad
óp
tica
(6
20
nm
)
Concentración de células (cel mL-1)
42
5.7. Análisis de datos experimentales.
5.7.1. Cálculo de rendimientos y productividad.
La ecuación de rendimiento Y x/s (g de biomasa/ g de sustrato) que expresa la
biomasa respecto al sustrato es definido como:
Y x/s = –
Donde:
Y x/s = rendimiento de biomasa / sustrato.
xf = biomasa final.
x0 = biomasa inicial.
s0 = sustrato inicial.
sf = sustrato final.
La ecuación de rendimiento Y p/s (g de producto /g de sustrato) que expresa el
producto respecto al sustrato es definido como:
Yp/s = –
Donde:
Y p/s= Rendimiento de producto/sustrato.
Pf = Producto final.
P0 = Producto inicial.
s0 = Sustrato inicial.
sf = Sustrato final.
43
La ecuación de productividad P (g de producto L-1 h-1) que expresa la velocidad de
formación de producto es definido como:
P =
Donde:
P = Productividad.
Pf = Producto final.
tf = Tiempo final.
La ecuación de eficiencia E (% del producto) es definida como:
E =
Donde:
E = Eficiencia.
xi = Células inmovilizadas.
xf = Células libres.
La ecuación de retención de células R (gg-1 de soporte) es definida como:
R=
Donde:
R = Retención.
Pf = Producto final.
Pi = Producto inicial.
44
5.7.2. Análisis estadísticos.
Se empleó el software Minitab 15 (Minitab Inc.), para determinar mediante un
análisis ANOVA la diferencia significativa entre los experimentos, así como para
realizar el análisis del método de optimización.
5.7.2.1. Método de Box Behnken
Se empleó el diseño de superficie de respuesta Box-Behnken (Box Behnken,
1960), el cual fue llevado a cabo con tres factores: Tamaño de inóculo, relación
líquido-sólido y tiempo. El ensayo constó de 15 corridas base y se llevó a cabo por
duplicado (30 en total). Para evaluar la variable de respuesta se empleó un
análisis de regresión con el fin de obtener un modelo empírico que relacionara la
respuesta medida para las variables independientes. La relación entre estas y la
respuesta fue calculada mediante la ecuación polinomial de segundo orden:
Donde Y es la respuesta predicha, β0 una constante, β1 el coeficiente lineal, βii el
coeficiente del producto cruzado, k es el número de factores (Jian-Zhong Yin et al.,
2003)
Los diseños de Box Behnken poseen combinaciones de tratamiento que se
encuentran en los puntos medios de los bordes del espacio experimental y
requieren un mínimo de tres factores. La siguiente Figura (Figura 12) muestra un
diseño Box Behnken de tres factores. Los puntos del diagrama representan las
corridas experimentales que se realizan:
45
Figura 12. Diseño Box Behnken de tres factores.
Estos diseños permiten una estimación eficiente de los coeficientes de primer y
segundo orden. En virtud de que los diseños de Box Behnken con frecuencia
tienen menos puntos de diseño, la aplicación de este tipo de diseños resulta
menos costosa que ejecutar diseños compuestos centrales con el mismo número
de factores.
46
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
El presente trabajo, consistió en evaluar el efecto del tamaño de inóculo. Es por
ello que se manejaron tres variables las cuales fueron: relación líquido- soporte,
tamaño de inóculo y tiempo. Dichas variables se trabajaron a diferentes
concentraciones y tiempos, con la finalidad de observar el efecto de los diferentes
tamaños de inóculos evaluados.
6.1. Efecto del tamaño de inóculo.
Fue necesario realizar cinéticas del crecimiento celular de P. Stipitis ACL2-1
manejando tamaños de inóculo de: 3x106, 3x107, 3x108 cel mL-1 en el medio de
cultivo con 70 gL-1 utilizando como medio de sustrato (glucosa). Las variables de
respuesta fueron la producción de etanol y el consumo de sustrato.
Posteriormente se seleccionó la condición que presentó la mayor producción de
etanol en menor tiempo.
En la Figura 13 se muestra la formación de biomasa con respecto al tiempo.
Puede observarse que al incrementar el inóculo de 3x106 a 3x107 cel mL-1 no
existió cambio en la cantidad de biomasa producida. Sin embargo, cuando se
empleó 3x108 cel mL-1, mostró un incremento notable en la producción de
biomasa. En la Figura 14 se puede observar notablemente que en el inóculo
mayor (3x108 cel. mL-1) se presentó un consumo muy rápido de sustrato (glucosa).
La velocidad de consumo de sustrato fue mayor en el inóculo mayor, comparado
con los otros dos tamaños de inóculos. Puede observarse además que el
consumo total de sustrato ocurrió a las 42 horas para el inóculo mayor, mientras
que esto no fue logrado con los otros inóculos evaluados (3x106 y 3x107 cel mL-1).
47
Figura 13. Crecimiento de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaños de inóculos.
Inóculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108 ().
Figura.14. Consumo de glucosa.de P. stipitis ACL2-1 en diferentes tamaños de
inóculos. Inóculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108().
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80
Bio
masa (
gL¯¹)
tiempo (h)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80
Glu
cosa (
gL¯¹)
tiempo (h)
48
En la siguiente Figura se muestran los rendimientos obtenidos de biomasa por P.
stipitis ACL2-1, evaluando diferentes tamaños de inóculos. Se observa que los
rendimientos de biomasa disminuyeron conforme se incremento el tamaño de
inóculo. Lo anterior, es un factor de interés, puesto que la biomasa es un producto
secundario en la producción de etanol y por lo tanto es deseable minimizar la
producción de biomasa e incrementar la producción de etanol. No obstante es
importante mencionar que es necesario preservar un equilibrio de modo que se
mantengan parámetros cinéticos de la fermentación adecuados.
Figura 15. Rendimientos de biomasa por P. stipitis ACL2-1 a diferentes tamaños
de inóculo. Inóculo (cel mL-1): 3x106 (), 3x107 (), 3x108, ().
Cuando el tamaño de inóculo es mayor, al haber más células activas, el
crecimiento en sí se detiene sin afectarse la viabilidad, esto puede ser observado
en el inóculo mayor donde la producción de biomasa llegó a 7.2 gL-1 a las 27 h,
mientras que para el inóculo menor fue de 4.3 gL-1 a las 48 h, ver Tabla 5.
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
Re
nd
imie
nto
s d
e B
iom
asa (
gg
-1)
3x10⁶ cel mL-1 3x10⁷cel mL-1 3x10⁸cel mL-1
Tamaño de inóculo.
49
Tabla 5. Velocidades globales de formación, productividades y producción de
biomasa en diferentes tamaños de inóculos.
Inóculo (cel mL-1) 3x106 3x107 3x108
Biomasa producida (gL-1)
Productividad (gL-1h-1)
4.3
0.15
4.0
0.09
7.2
0.15
Velocidad global
de crecimiento (gg-1h-1) 0.03 0.05 0.11
A continuación se comparan los resultados obtenidos del presente trabajo con los
resultados de diferentes autores y utilizando otros tamaños de inóculos.
Campos (2008) evaluó tres tamaños de inóculos con S. cerevisiae ITV-01 medio
sintético con sacarosa reportando que el inóculo más adecuado para la producción
de etanol era el 6x106 cel mL-1. Jones et al., (1983), observaron que factores físico
químicos, y así como el oxígeno, el tamaño de inóculo, el tiempo del inóculo y las
condiciones en las que se cultivó el preinóculo pueden afectar el desempeño de la
cepa, ya que se desean mayor número de células metabólicamente activas para
iniciar la fermentación, propiamente dicha como producción de etanol y así
disminuir los nutrientes, porque es en el crecimiento donde sucede dicha
disminución, es decir que el consumo de sustrato se dirija todo a producción de
etanol y no a biomasa. Campos (2008) reportó que es importante el estado
metabólico en el que se encuentra la cepa cuando va a ser inoculada, y
recomendó utilizar microorganismos en fase exponencial.
Fernández (2011), incrementó el volumen del tamaño de inóculo a 1x107 cel mL-1,
observó la misma tendencia, con respecto a la biomasa, el rendimiento disminuyó
con el aumento de la concentración de azúcares totales, de 0.13 a 0.004gg-1, el
cual coincide con lo reportado por Ergun y Moutlu (2000) reportaron que se afecta
el crecimiento a concentración de sustrato de 250 gL-1 obteniendo una biomasa de
11 gL-1.
50
En este trabajo se utilizó la levadura P. stipitis ACL2-1, y se trabajaron con
diferentes tamaños de inóculos (3x106, 3x107, 3x108), sin embargo con los
resultados obtenidos se puede establecer que a mayor tamaño de inóculo se
obtiene mayor producción de biomasa, utilizando una concentración de 70 gL-1,
obteniendo así una biomasa de 7.2 gL-1. Algunos autores han reportado que existe
una influencia del tamaño de inóculo sobre la pérdida momentánea de la viabilidad
después de adicionar el inóculo, también se ha observado que se mejora la
velocidad de fermentación con cantidades mayores de levadura, D’ Amore et al.,
(1990), pero no se afecta la producción de etanol. Otros trabajos reportan que la
velocidad a la que se realiza el inóculo también tiene efecto, ya que esto ayuda
con el control de la contaminación por bacterias u otras levaduras, ayuda al
desarrollo de compuestos volátiles y al perfil de sabores, lo cual es de suma
importancia en la producción de vinos (Erten et al., 2006).
En la Figura 16 se muestra el efecto del tamaño de inóculo sobre la producción de
etanol. La producción de etanol se vio favorecida con el tamaño de inóculo mayor,
la concentración alcanzada fue 30 gL-1. Al utilizar tamaños de inóculos mayores la
viabilidad se mantiene alcanzando así concentraciones mayores de etanol a
comparación de los otros tamaños de inóculos. De esta forma se puede establecer
una relación que indica que mayor tamaño de inóculo, se obtiene una mayor
producción de etanol en menor tiempo.
51
Figura 16. Efecto del tamaño de inóculo sobre la producción de etanol en P. stipitis
ACL2-1. Inóculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(), 3x108().
En la Figura 17 se muestran las velocidades específicas de producción de etanol
obtenidas con P. stipitis ACL2-1 en los diferentes tamaños de inóculo evaluados.
Figura 17. Velocidades específicas de producción de etanol por P. stipitis ACL2-1
a diferentes tamaños de inóculo. Inóculo (cel. mL-1): 3x106 (), 3x107(),
3x108().
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80
Eta
nol (g
L¯¹)
tiempo (h)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
3x10⁶ cel ml¯¹ 3x10⁷ cel ml¯¹ 3x10⁸ cel ml¯¹
Velo
cid
ades e
specíf
icas d
e
pro
ducció
n d
e e
tanol (g
g-1
h-1
)
Tamaño de inóculo.
52
Puede verse en la Figura que la velocidad específica fue menor en el tamaño de
inóculo mayor (aproximadamente en un 15%) en comparación con los otros dos
tamaños de inóculos evaluados. Sin embargo la aplicación del mayor tamaño de
inóculo (3x108 cel mL-1) permitió la mayor productividad de etanol, presentando así
mayores velocidades globales de formación y la mayor producción de etanol se
obtuvo en el inóculo mayor en menor tiempo a diferencia de los otros tamaños de
inóculos evaluados (ver Tabla 6). En la Figura 18 se muestra que el inóculo que
presentó un mayor rendimiento de etanol fue el inóculo mayor (3x108 cel mL-1) el
cual es de 0.452 gg-1. Por lo que, con respecto a los rendimientos obtenidos, es
recomendable que se utilicen grandes tamaños de inóculos, para poder así
obtener un mayor rendimiento de etanol.
Tabla 6. Velocidades globales de formación y productividades de etanol en
diferentes tamaños de inóculos.
Inóculo (cel mL-1) 3x106 3x107 3x108
Etanol producido (gL-1)
Productividad (gL-1h-1)
19.4
0.47
19.7
0.46
29.8
0.71
Velocidad global de
producción de etanol (gg-1h-1)
0.61 0.69 1.31
53
Figura 18. Rendimientos de etanol por P. stipitis ACL2-1 a diferentes tamaños de
inóculo. Inóculo (cel mL-1): 3x106 (), 3x107 (), 3x108, ().
En lo que respecta a la producción de glicerol y ácido acético en todos los
tratamientos la cantidad obtenida de éstos metabolitos fue muy baja. Este
comportamiento característico de dirigir el metabolismo mayoritariamente a la
producción de etanol y no a la producción de otro tipo de metabolitos es típico de
la levadura P. stipitis ACL2-1 (Rasgado-Mellado, en proceso).
6.2. Optimización de las condiciones de inmovilización en medio con
glucosa
Para la cinética de inmovilización se evaluaron tres tamaños de inóculos
diferentes, así como también fueron evaluados el tiempo y la relación L-S. En la
siguiente (Tabla 7) se muestran las variables utilizadas
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
3x10⁶ cel ml¯¹ 3x10⁷ cel ml¯¹ 3x10⁸ cel ml¯¹
Rendim
iento
s d
e e
tanol (g
g-1
)
Tamaño de inóculo.
54
Tabla 7. Variables utilizadas en la cinética de inmovilización de células utilizando
medio con glucosa.
Inóculo (cel.mL-1) Relación L:S Tiempo (h)
-1 3x106 -1 1:16 -1 16
0 3x107 0 1:20 0 20
1 3x108 1 1:24 1 24
Para el bagazo de caña de azúcar se realizó un análisis utilizando unidades
codificadas y se obtuvieron coeficientes de regresión lineal, gráficos de contorno y
valores óptimos. En la Tabla 8 se presentan los coeficientes de regresión
estimados de retención y se observa que existe efecto sobre las variables de L-S
(Líquido-Sólido) y tiempo, ya que dichas variables son muy importantes en el
método de inmovilización.
Tabla 8. Coeficientes de regresión estimados para retención.
Término Coeficiente Probabilidad
Constante 0.317 0.000
Inóculo -0.002 0.617
Relación LS 0.013 0.003
Tiempo 0.012 0.005
Inóculo*Inóculo -0.010 0.095
Relación LB*Relación LS -0.009 0.122
Tiempo*Tiempo 0.000 0.983
Inóculo*Relación LS -9.94E-04 0.861
Inóculo*Tiempo -0.008 0.131
Relación LS*Tiempo 0.006 0.236
En la Tabla 9 se muestran los coeficientes de de regresión lineal estimados para la
eficiencia, donde se observa que la variable que tiene efecto significativo es el
tamaño de inóculo
55
Tabla 9. Coeficientes de regresión estimados para la eficiencia
Término Coeficiente Probabilidad
Constante 0.965 0.000
Inóculo 0.591 0.000
Relación LS 0.591 0.679
Tiempo 0.591 0.706
Inóculo*Inóculo 0.870 0.001
Relación LB*Relación LS 0.870 0.269
Tiempo*Tiempo 0.870 0.973
Inóculo*Relación LS 0.836 0.126
Inóculo*Tiempo 0.836 0.541
Relación LS*Tiempo 0.836 0.761
En la Tabla 10 se representan los coeficientes de regresión lineal, estimados para
la viabilidad, es notable que solo exista efecto significativo sobre la variable del
tamaño de inóculo.
Tabla 10. Coeficientes de regresión estimados para la viabilidad.
Término Coeficiente Probabilidad
Constante 0.965 0.000
Inóculo 0.591 0.000
Relación LS 0.591 0.679
Tiempo 0.591 0.706
Inóculo*Inóculo 0.870 0.001
Relación LB*Relación LS 0.870 0.269
Tiempo*Tiempo 0.870 0.973
Inóculo*Relación LS 0.836 0.126
Inóculo*Tiempo 0.836 0.541
Relación LS*Tiempo 0.836 0.761
En las Tablas anteriores se muestran los coeficientes de regresión del bagazo de
caña de azúcar estimados para: la eficiencia, viabilidad y retención, en cada
término se puede observar que existen variables que afectan en mayor proporción
ya que son las que tienen mayor relevancia en comparación con las demás.
56
En las Figuras 19, 20 y 21 se muestran los gráficos de contorno los cuales
presentan el comportamiento de cada una de las variables como son: relación L-S
(Líquido-Sólido), tamaño de inóculo y tiempo, con respecto a los coeficientes de
retención, viabilidad y eficiencia para el bagazo de caña de azúcar, utilizando
medio sintético de glucosa.
Figura 19. Gráfica de contorno de retención durante la inmovilización de P. stipitis
ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de cultivo (glucosa).
57
En la Figura anterior se muestran las graficas de contorno para retención. A través
de estos gráficos puede observarse que la variable que presentó efecto
significativo fue la relación Líquido-Soporte y el tiempo de acuerdo al análisis de
regresión lineal. También se observa que el inóculo no presentó cambio
significativo con respecto a la relación Líquido-Soporte.
Figura 20. Gráfica de contorno de eficiencia durante la inmovilización de P. stipitis
ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de cultivo (glucosa).
58
Por otra parte, en la Figura anterior, a través de las gráficas de contorno para
eficiencia puede observarse una gran superficie de respuesta para la relación
Líquido-Soporte, lo cual sugiere que es posible la optimización en niveles máximos
o mínimos, por lo que no existe efecto de la relación Líquido- Soporte; con
respecto al tiempo. Puede verse también en estas gráficas de acuerdo a los
resultados obtenidos en la evaluación por el análisis de regresión lineal, que existe
mayor efecto sobre el inóculo,
Figura 21. Gráfica de contorno de viabilidad durante la inmovilización de P. stipitis
ACL2-1 en bagazo de caña empleando medio de cultivo (glucosa).
59
Las graficas de contorno para viabilidad presentados en la Figura anterior
muestran que el inóculo tuvo efecto significativo, lo cual confirmó lo obtenido en el
análisis de regresión lineal. También se observa que la relación Líquido-Soporte
no tuvo efecto significativo sobre el tiempo y el inóculo.
Los datos de optimización que se obtuvieron de la optimización, empleando el
programa de Minitab se muestran en la Figura 22. De los resultados óptimos que
se obtuvieron del programa, de acuerdo a ello se hicieron los cálculos pertinentes
para saber el tamaño de inóculo, la relación L-S, y el tiempo, los cuales se
muestran la continuación.
Figura 22. Resultados de optimización de Minitab.
Por lo tanto de acuerdo a lo obtenido por el programa Minitab, se obtuvo un
tamaño de inóculo de 12.2x106 cel mL-1, utilizando así una relación de líquido-
soporte de de 1:23.3 (58 mL), con un tiempo de 24 h. Una vez que se obtuvieron
los datos, se realizó una cinética de inmovilización, utilizando como sustrato
glucosa, posteriormente las muestras fueron analizadas en el HPLC, para conocer
los resultados, ver Figura 23.
Con respecto a la cinética de inmovilización que se realizó se pudo establecer que
la mayor cantidad de etanol obtenida se dio a las 24 h, alcanzando una producción
máxima de biomasa al mismo tiempo.
60
Figura 23. Cinética de inmovilización de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caña
fresco en las condiciones óptimas. Etanol () y biomasa (), con respecto al
tiempo y al consumo de glucosa ().
En Figura 24 se muestran la retención, eficiencia, viabilidad y pH, donde se
observa que la retención mayor (22.96 mgg-1) a las 16 h y el pH se mantiene
estable con respecto al tiempo, también se observa que se obtiene una viabilidad
de 95.7%, con una eficiencia de 90.1%.
0
10
20
30
40
50
60
70
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0 5 10 15 20 25 30
Glu
cosa
(g
L-1
)
Eta
nol y B
iom
asa (
gL
-1)
tiempo (h)
61
Figura 24. Retención, eficiencia, viabilidad y pH de P. stipitis ACL2-1, durante la
inmovilización, utilizando como fuente de carbono glucosa. Retención (), pH ()
eficiencia (), y viabilidad ().
0
10
20
30
40
50
60
70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25 30
pH
y R
ete
nció
n (
mgg
-1)
Eficie
ncia
y V
iabili
dad (
%)
tiempo (h)
62
6.3 Inmovilización en solución isotónica.
En la Tabla 11 se presentan los resultados de la inmovilización de P. stipitis ACL2-
1 empleando una solución isotónica a diferentes tamaños de inóculo sobre la
viabilidad, la retención y la eficiencia. Puede observarse de acuerdo a los
resultados mostrados en la tabla que sólo se presentó inmovilización celular con el
tamaño de inóculo de 3x108 cel mL-1. Ya que para los otros dos tamaños de
inóculos evaluados no se presentó retención y por tanto la eficiencia fue nula.
Tabla 11. Tamaño de inóculo para la inmovilización de células de P. stipitis ACL2-
1, con solución isotónica, empleando un tiempo de 16 h.
Inóculo (cel mL-1)
Viabilidad (%)
Retención (mgg-1)
Eficiencia (%)
3x106 85.5 0.00 0.00
3x107 86.0 0.00 0.00
3x108 95.5 11.76 34.00
Por lo anterior, se realizó la cinética de inmovilización utilizando como medio una
solución isotónica, empleando una relación LS de (1:20), con el inóculo de 3x108
cel mL-1 y trabajando con un tiempo 0-42 horas. De la cinética de inmovilización
se puede observar en la Figura 25 la retención de células presentes en el soporte
utilizado, pH, eficiencia y viabilidad con respecto al tiempo, ya que el mejor tiempo
para la inmovilización fue a las 42 horas. Además se pudo observar que el pH
permanece constante, se obtuvo una viabilidad del 76 % a las 42 h, una retención
de 19.3 mgg-1 y una eficiencia de 57 %.
63
Figura 25. Cinética de inmovilización de P. stipitis ACL2-1 en bagazo de caña de
azúcar sin tratamiento, utilizando solución isotónica. Retención (), pH (),
eficiencia () y viabilidad ().
Los resultados obtenidos se compararon con los previamente reportados por Tan
(2007) quien utilizó como soporte bagazo de sorgo, utilizando la levadura
Saccharomyces cerevisiae para la producción de etanol y que obtuvo una
eficiencia de 52.3 %. Considerando este dato los resultados permiten sugerir que
la inmovilización con el bagazo de caña de azúcar fue mejor que con el bagazo de
sorgo. Por lo tanto la inmovilización de células de P. stipitis ACL2-1 en el bagazo
de caña de azúcar es factible.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50
pH
y R
ete
nció
n (
mgg
-1)
Eficie
ncia
y V
iabili
dad (
%)
tiempo (h)
64
7. CONCLUSIONES.
Cuando se empleó un tamaño de inóculo de 3x108 cel mL-1 se presentó la mayor
productividad de etanol (0.65 gL-1 h-1) y un menor tiempo de fermentación (42 h)
debido al consumo total de sustrato; por lo que el incremento en el tamaño de
inóculo en P. stipitis ACL2-1 aumentó la eficiencia del proceso. P. stipitis ACL2-1
tolera concentraciones mayores de 50 gL-1 de glucosa, sin presentar inhibición de
la producción de etanol, presentando sus mejores rendimientos de etanol y
biomasa a concentraciones de sustrato de 70 gL-1.
Las condiciones óptimas para la inmovilización de Pichia stipitis ACL 2-1 en
bagazo de caña de azúcar sin tratamiento para la producción de etanol utilizando
medio con glucosa fueron: inóculo: 12.2x106 cel mL-1, relación líquido soporte de
1:23.3 y tiempo de 16 h. A estas condiciones se obtuvieron una retención de 22.9
mgg-1, una eficiencia de 90.1% y una viabilidad del 95.7%.
Al ser inmovilizada P. stipitis ACL2-1 en el bagazo de caña de azúcar únicamente
se presentó adsorción celular con el mayor inóculo evaluado (3x108 cel mL-1) con
16 horas de contacto.
Mediante la cinética de inmovilización empleando una solución isotónica, el
bagazo de caña de azúcar presentó una retención, eficiencia y viabilidad celular
de 19.3 mgg⁻¹, 57 % y 76 % respectivamente y se observó que el tiempo que se
requiere para la inmovilización de Pichia stipitis ACL 2-1 es lento (42 h). El tiempo
que dura este proceso de inmovilización se debió, a que el bagazo al no ser
pretratado, presentó una estructura cristalina de la hemicelulosa la cual no es
dañada, es por este motivo que el tiempo de adsorción de células en el soporte
utilizado es lento. Por lo anterior, las mejores condiciones fueron empleando
medio de cultivo como medio para la inmovilización celular y no el uso de una
solución isotónica.
65
8. RECOMENDACIONES.
Realizar un tratamiento químico o físico al bagazo de caña de azúcar, que
permita romper la estructura de la hemicelulosa formando una superficie
porosa, y reducir el tiempo de adsorción de las células.
• Realizar una cinética de inmovilización con hidrolizado líquido neutralizado
y enriquecido con nutrientes para estudiar la producción de etanol.
66
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
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