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Inhibición de recristalizacion en hielo debido a la actividad de la proteína de unión del hielo detectada por resonancia magnética nuclear
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Inhibición de
recristalizacion en hielo
debido a la actividad de la
proteína de unión del hielo
detectada por resonancia
magnética nuclear
Presentado por:
Castro Ángela
Ochoa Paula
Pineda Mónica
PALABRAS CLAVES• Resonancia magnética nuclear
• Hielo
• Proteína de unión de hielo
• Crioconcervacion
• Recristalizacion
• Biotecnología
RMN (resonancia magnética nuclear)
La resonancia magnética, hace
uso de las propiedades de
resonancia aplicando
radiofrecuencia a los núcleos
atómicos o dipolos entre los
campos aplicados de la muestra.
Es común denominar resonancia
magnética al aparato que obtiene
imágenes por resonancia
magnética.
Hielo:
El hielo se presenta en 12 estructuras o fases cristalinas
diferentes a la fase estable, esta fase suele denotarse como
fase I según la terminología de Tamman, esta fase I
presenta dos variantes relacionadas entre si, el hielo
hexagonal y el hielo cubico.
Proteína de unión de hielo:
Proteínas anticongelantes o proteínas estructurales del
hielo se refiere a una clase de poli péptidos producidos por
ciertos vertebrados, plantas, hongos y bacterias que
permiten su supervivencia en ambientes bajo cero.
La Crio-conservación
Proceso mediante el cual se
enfrían y almacenan
células, órganos o tejidos
para preservar sus
cualidades ante posibles
reacciones biológicas, esta
preservación debe ser a
temperaturas criogénicas
(bajas).
Recristalizacion: técnica instrumental utilizada para
llevar a cabo la purificación de sustancias solidas que
contienen impurezas.
Biotecnología: tecnología que estudia y aprovecha los
mecanismos e interacciones biológicas de los seres
vivos, en especial en células, mediante un amplio
campo multidisciplinario. Es decir es la aplicación de
principios de la ciencia para tratamiento de materiales
orgánicos por sistemas biológicos para producir bienes
y servicios.
RESUMEN
Se utilizo la resonancia magnética nuclear y mediciones de
tiempo de auto-fusión en el agua liquida presenta en el
hielo. Esto se realizo con o sin una proteína de unión de
hielo bacteriana (IBP). Se encontró una modificación de la
estructura de hielo por el IBP, ya que se indico una
inhibición de la recristalizacion del hielo.
Se lograron resultados que ponen en relieve el potencial de
las técnicas de RMN en la evaluación del impacto de los
IBP en la recristalizacion del hielo.
INTRODUCCION
Las proteínas con actividad de interacción con hielo han
sido identificadas en peces, plantas y en los insectos
resistentes al frio. Este estudio se realizo porque las
propiedades de las proteínas que interacciona con hielo son
útiles en áreas de la biotecnología, especialmente en la línea
de células de crio-conservación y la fabricación de
alimentos.
En la aplicaciones de la biotecnología se ha demostrados la
utilidad de la RMN para monitorizar la composición de la
fase de agua no congelada durante la formación de crio-
geles.
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron proteínas extracelulares (ECP) Y EL IBP
recombinante (rIBP).
para las proteínas extracelulares, las bacterias v3519-10 se
cultivaron en medios líquidos a 4 c .
El sobrenadante que contiene el IBP se filtro y se centrifugo
para obtener un extracto crudo de proteínas extracelulares de
V3519-10.
La concentración de las proteínas se determino mediante el
ensayo de Bradford, usando el reactivo de coomassie plus.
• Para IBP recombinante (rIBP) el ADN que codifica el IBP se
añadió a un lado del cubo del hielo , donde se clono y se
transformo en células BL21.
• Las células BL21 se cultivaron en medio LB a 37 c hasta una
densidad óptica de 0,8 , se añadió un reactivo para dar una
concentración final de 1 mM y reducir la temperatura a 18 c.
• Finalmente las proteínas se extrajeron del cultivo después de
encubar durante la noche y la rIBP se purifico, tomando un
tamaño aproximadamente de 52 Kda.
METODOLOGIA
• Se prepararon 5 muestras de hielo , todas las muestras
contenían un litro de solución de NaCl 7 g .
• IBP se añadió a 3 muestras.
• La muestra de hielo que contiene una preparación cruda de la
IBP consistía en 7 g /l, solución de NaCl con 10 g/ml de
3519-10 ECP, donde se denomino hielo con ECP.
• Las otras dos muestras contiene 7 g/l de NaCl con 2 y 4 mg
/L de IBP recombinante, y se conoce como hielo con rIBP.
• Se prepararon dos muestras de control, en la primera
solución de NaCl sin proteína, y en la segunda solución de
NaCl con albumina de suero bovina (BSA).
• Las muestras se analizaron mediante RMN en múltiples
puntos durante 1800 h y se almacenaron en un congelador a
-13,5 c entre las mediciones de RMN.
(a)- (c): t = 39, 578 y 1.705 h. El crecimiento de cristales de hielo a partir
de ~ 200 m hasta 1 mm se produce claramente en este período de tiempo.
(d) - (f): t = 102, 651 y 1730 h. La inhibición del crecimiento de cristales
de hielo es clara sobre este período de tiempo.
RESULTADOS
EVOLUCIÓN DE LA T 2 TIEMPOS DE ALOJAMIENTO
CON EL ENVEJECIMIENTO PARA CINCO MUESTRAS DE
HIELO
El control de hielo (diamantes negros), el hielo con BSA
(círculos abiertos), el hielo con ECP (círculos rellenos), el
hielo con rIBP (2) (triángulos rellenos) y hielo con rIBP (4)
(cuadrados rellenos).
Datos de tiempo de los desplazamientos de difusión dependiente Δ
con la edad de hielo: el control de hielo (rombos abiertos, t = 25 h;
cerrado diamantes, t = 1.922 h), hielo con ECP (círculos
abiertos, t = 92 h; cerrados círculos, t = 1.909 h) , hielo con rIBP (2)
(triángulos abiertos, t = 189 h; triángulos cerrados, t = 1,922 h) y
hielo con rIBP (4) (cuadrados abiertos, t = 20 h; cuadrados
cerrados, t = 1,914 h).
La longitud de poro lp p calcula a partir de T 2 tiempos de relajación
como función del envejecimiento de hielo para el control de hielo
(diamantes rellenos), hielo con rIBP (2) (triángulos rellenos) y hielo
con rIBP (4) (cuadrados rellenos).
La falta de cambio en la escala de longitud con el envejecimiento es
evidencia de que IBP inhibe el crecimiento del tamaño de la vena
líquida
CONCLUSION
La técnica de resonancia magnética nuclear, logro caracterizar
cuantitativamente la estructura de red de la hebra de hielo
líquido; entendiendo así que las técnicas RM pueden monitorear
los procesos de recristalización del hielo de forma no invasiva,
importante método que se utiliza en los procesos
biotecnológicos. También a partir de la lectura de este artículo se
logró interpretar que los resultados demuestran el gran potencial
de la RM en la supervisión de procesos de biotecnología
GRACIAS
