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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Escuela Académico Profesional de Farmacia Y Bioquímica

FRACCIONAMIENTO CELULAR. DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTÉICO

INFORME N°03

CURSO: Bioquímica I

DOCENTE: Q.F. Mg. Yadira Fernández Jerí

ALUMNOS:

ALDERETE ESPEJO, Hattie.MOLEROS CORAL, Diego Alejandro.PORRAS COCHACHI, Katia Rubí.QUIÑONES HUAYANEY, María.TOLENTINO CHÁVEZ, Jorge Luis.

MESA: N° 03

AÑO: Tercero

SEMESTRE: 2013-I

FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

INTRODUCCIÓN

Por definición, y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un núcleo que contiene la mayoría del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas dentro de la célula.

Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula en base a su tamaño y densidad.

Finalmente, cabe resaltar que una separación pura de una proteína es esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad. Puesto que las células las contienen miles de tipos de diferentes proteínas.


I. OBJETIVOS

Adquirir destrezas en el manejo y en la obtención de órganos y fracciones celulares a partir de un ratón de laboratorio.Obtener homogenizados de hígado de rata.Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hígado de rata mediante el proceso de centrifugación diferencial.Determinar el contenido de proteínas en las diferentes fracciones obtenidas.Aplicar el método de Biuret en la cuantificación de proteínas totales.

II. MARCO TEÓRICO

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partículas suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).

Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeñas vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática. Después de la centrifugación algunas de las partículas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensión a velocidad creciente (centrifugación diferencial).

Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse después mediante centrifugación por gradiente de densidad, que se ilustra como el último paso en la figura. El condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad, por lo general compuesto de una solución de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los organelos y las membranas difieren, cada uno emigrará durante la centrifugación y formará una banda a una altura distinta en el gradiente. (1)

Centrifugación Diferencial o Pelleting

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las condiciones de centrifugación.


El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y está contaminado con cualquier partícula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantación de la solución sobrenadante del pellet. El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificación con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeño volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

FIGURA 1 ESQUEMA DE FRACCIONAMIENTO CELULAR

FIGURA 2: CENTRIFUGACION DIFERENCIAL


Otro método de separación es por gradiente de densidad, un método que es más complicado que la centrifugación diferencial pero tiene algunas ventajas: el método de gradiente de densidad permite la completa separación de algunos o todos los componentes de la mezcla y también permite que se puedan realizar mediciones analíticas.Hay dos métodos básicos de centrifugación por gradiente de densidad: La centrifugación zonal y la centrifugación isopícnica o al equilibrio.

Centrifugación Zonal

Es Cuando se coloca una pequeña cantidad de la disolución con las moléculas que se quieren caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un tubo de centrifugación, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte superior del gradiente y cuando se centrifuga el tubo las moléculas de la capa superior sedimentan a través del gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentación sedimentarán en una estrecha franja, sin embargo, si hay moléculas con distintos coeficientes de sedimentación, se separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugación y finalmente los diferentes componentes se resolverán en una serie de zonas o bandas, de ahí el nombre de centrifugación zonal.

Una vez completada la centrifugación, se fracciona el contenido del tubo generalmente por recolección de las gotas cuando se hace un orificio en el fondo del tubo y el goteo es lo suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una lámina del tubo y una fracción está representada por una o varias gotas. (2)

FIGURA 3: CENTRIFUGACIÓN ZONAL


La separación zonal es ideal para separar partículas de tamaño definido (ejemplo: proteínas, RNA y ribosomas), sin embargo, las partículas del mismo tipo son heterogéneas; en este caso, la separación por centrifugación zonal no es eficiente y es más apropiado separar las partículas en base a otro parámetro como la densidad; por lo tanto se recurre a la separación isopícnica.

Separación isopícnica

En este tipo de separaciones, partículas de una densidad en particular se hunden durante la centrifugación hasta que se alcanza una posición donde la densidad de la solución que las rodea es exactamente igual a la de las partículas. Una vez que se alcanza este cuasi equilibrio, la longitud de la centrifugación ya no influye en la migración de partículas. Un ejemplo común para este método es la separación de ácidos nucleicos en un gradiente CsCl. La Figura 4 ilustra la separación isopícnica y los criterios para su éxito.

Criterios para el éxito de la separación isopícnica:

La densidad de las partículas utilizadas debe estar dentro de los límites de las densidades de los gradientes.

Se admite cualquier longitud de gradientes. El tiempo de ejecución debe ser suficiente para que las partículas se agrupen en el punto isopícnica.

No se producen efectos adversos ante el exceso de tiempo. (3)

USO DE COMPUESTOS PARA EL FRACCIONAMENTO CELULAR

FIGURA 4: ISOPYCNIC


Sacarosa:

La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formación de gradiente y es el más utilizado en la centrifugación zonal. Este material tiene aplicación en el fraccionamiento de organelos celulares y virus. La razón de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia del material biológico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentración y viscosidad, densidad e índice de refracción en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugación para la separación de un gran tipo de muestras biológicas.

La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoquímicas. Las soluciones de sacarosa tienen alta fuerza osmótica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertónicas y solo tienen una densidad de 1.03 g/cm3 lo que reduce su uso en la separación de partículas osmóticamente sensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones isopícnicas son muy viscosas, por lo que, las partículas pequeñas son incapaces de alcanzar su posición isopícnica en el gradiente.

La sacarosa es muy susceptible a hidrólisis de los enlaces glicosílicos a pH menores a 3. Cuando se calientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse por arriba de los 100 0C.

Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromoléculas y complejos macromoleculares, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, ribosomas y polisomas, también se utiliza gradientes de sacarosa para la separación isopícnica de virus, organelos celulares y de células si la viabilidad no es esencial.

Sales de sodio y potasio:

El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayoría de las macromoléculas.

METODOS DE DETERMIANCION DE PROTEINAS


Método de BIURET

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II)o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración tris y amoniaco. (4)

El método Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico.

1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces

peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de

proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE DIVERSOS METODOS DE DETERMINACION PROTEICA

FIGURA 5: Estructura complejo entre el CU y los enlaces peptídicos


III. RESULTADOS

Tabla 1: comparación entre métodos usados para la determinación de proteínas


1 2 3 4 5 6

estándar (mL) - 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

Agua (Ml) 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2

Concentración (mg/mL) - 10 20 40 60 80

NaCl 0.9% (mL) 4 4 4 4 4 4

Biuret(mL) 5 5 5 5 5 5

ABSORBANCIA 0.074 0.077 0.128 0.172 0.226 0.283

Solución Absorbancia Absorbancia Real (Abs. experimental – Abs. Del blanco)

BLANCO


Blanco 0.074 -

Cst1 0.077 0.003

Cst2 0.128 0.054

Cst3 0.172 0.098

Cst4 0.226 0.152

Cst5 0.283 0.209

MUESTRA PROBLEMA

Blanco Homogenizado Pellet A Pellet B Sobren. A Sobren. B

Vol. M.P - 0.2 1 1 0.5 1

Sucrosa 0.25 1 0.8 - - 0.5 -

Sol. De NaCl 0.9% 4 4 4 4 4 4

Reactivo de Biuret 5 5 5 5 5 5

ABSROBANCIA 0.107 0.263 0.373 0.137 0.215 0.332

Solución Absorbancia Absorbancia Real (Abs. experimental – Abs. Del blanco)

Blanco 0.107 -

Homogenizado 0.263 0.156


Pellet A 0.373 0.266

Pellet B 0.137 0.030

Sobrenadante A 0.215 0.108

Sobrenadante B 0.332 0.225

REFERENCIA:

Curva de calibración

Blanco Homogenizado

Pellet A Pellet B Sobren. A Sobren. B

- 300 mg/mL 90mg/mL 12mg/mL 84 mg/mL 82 mg/mL

IV. DISCUS

IONES

Dos de las

CONTENIDO PROTÉICO OBTENIDO EN CADA M.P


lecturas correspondientes a la muestra problema se salieron del rango trabajado con los estándares pero usamos el método geométrico para estimar una concentración en mg/mL, entonces para evitar este problema en futuras prácticas tendríamos que revisar bien la dilución a la que vamos a llevar cada muestra para que de preferencia tengamos resultados dentro del rango trabajado con estándares. Las concentraciones determinadas para cada muestra problema guardan relación a lo referido teóricamente y no hubo mayor discusión respecto a los resultados ya que si bien la absorbancia no corresponde a la concentración exacta, esto último se debe a pequeños errores de medición o manipulación, teniendo en cuenta la calidad de las mediciones espectrofotómetricas a causa del equipo y el manejo de las muestras debido a nuestra inexperiencia justifican dicha desviación.

A pesar de tener indicada la aceleración centrifuga aplicada respecto a cada velocidad en RPM y observando las diferentes lecturas obtenidas, surge la pregunta si en verdad tenemos en cada sedimento o sobrenadante lo que decimos tener, es por ello que averiguamos si existen técnicas para identificar en cada fracción celular el respectivo contenido, encontramos que se puede hacer un análisis con el microscopio electrónico pero esta técnica en la mayoría de los casos resulta cara y se necesita una preparación especial de la muestra.

Otra técnica consiste en el uso de marcadores enzimáticos de organelas:

Fracción nuclear: medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las fracciones, una mayor actividad corresponde a la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: mayor actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: mayor actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: mayor actividad del lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras enzimas porque supondría que algunos orgánulos se han roto.

Empleando dichas técnicas podríamos determinar si hemos llevado a cabo correctamente todos los procedimientos desde la homogenización en solución isotónica hasta la correcta centrifugación.

Si bien hemos usado la centrifugación diferencial averiguamos qué otras técnica de centrifugación se usa generalmente en el fraccionamiento subcelular y consultando en la web algunos otros manuales de prácticas de bioquímica notamos que la otra técnica que más se usa es la centrifugación isopicnica que consiste en separar las partículas en función a su densidad. Dicha separación tiene lugar en el seno del disolvente que presenta un gradiente continuo de densidad. El desplazamiento de la partícula se detiene cuando ésta encuentra un


medio cuya densidad es igual a la propia.Además este tipo de centrifugación también se usa para purificar cada sedimentado obtenido en cada centrifugación diferencial, ya que así se pueden separar partículas de igual coeficiente de sedimentación según su diferente densidad.

Otra duda que surgió fue sobre la importancia del tiempo, si tendríamos los mismos resultados duplicando el tiempo de centrifugación o si detuviéramos el proceso a la mitad; pues la respuesta se halla en la Ley de Stokes. Ya que no hemos modificado ni el diámetro ni la densidad de las partículas, ni la densidad ni viscosidad del medio; la única variable a la que le podemos hacer cambios es a la gravedad y esto se logra con las diferentes fuerzas de centrifugación aplicadas a cada tubo en cada parte del experimento. Si cambiásemos el tiempo de centrifugación nos distanciaríamos del objetivo que realmente queremos retener en cada pellet o mantener en cada sobrenadante.

V. CONCLUSIONES

El método de centrifugación diferencial es el adecuado para separar fracciones subcelulares previas a una homogenización.Se determinó fracciones celulares como núcleos, mitocondrias, lisosoma por centrifugación diferencial.El contenido proteico fue determinada por el método de Biuret y se obtuvo lo siguiente: Homogenizado >Pellet A>Sobrenadante A>Pellet B>Sobrenadante B.

VI. CUESTIONARIO

1. ¿Con qué fin obtenemos fracciones celulares?

Las fracciones celulares son ampliamente usados para la investigación en la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por el método de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y estimar el coeficiente de sedimentación de los organelos.


2. ¿Qué se supone determinar en cada una de las fracciones obtenidas?

Las células se lisan y los componentes subcelulares se separan mediante una serie de centrifugaciones que van aumentando de velocidad. Después de cada centrifugación, los orgánulos que se han sedimentado en el fondo del tubo, se recogen en forma de precipitado sólido. El sobrenadante se centrifuga a una mayor velocidad para sedimentar la siguiente organela más grande. Se sedimentan las estructuras más grandes y pesadas con mayor rapidez.

Se puede determinar de las fracciones:

Uso enzimas marcadoras de orgánulos: Consiste en que cogemos una fracción de cada precipitado

y medimos la actividad característica de un orgánulo.

Fracción nuclear: medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las fracciones, el mayor pico debe salir en la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras enzimas porque supondría que algunos orgánulos se han roto.


3. Explique el fundamento de la determinación de proteínas por el método de Biuret.

Los péptidos y proteínas producen una reacción del Biuret .Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta .Se necesita 2 o más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado.

4. ¿Cuál es el coeficiente de sedimentación de los lisosomas y mitocondrias?

Coeficientes de Sedimentación:

Mitocondrias: Entre 105 y 107 S. Lisosomas: entre 50 y 9000 S.


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Villee, Cluade. Biología. Fraccionamiento celular; 1998.

2. Montero Hilda. Métodos. Centrifugación. Disponible en

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf

3. THERMO. Conceptos Básicos de centrifugación. Disponible en

http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle/910

4. PAPIME. Análisis de alimentos, fundamentos y técnicas. Disponible en

http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret.

5. Pruebas cualitativas .Identificación de compuestos bioquímicos.Disponible en

http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/2_EstructuradeCompue

stosBioquimicos/9-1_ReaccionesIdentificacion.pdf

6. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregma. cell

fractionation. Link available at:

http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm

7. Marino Villavicencio Núñez. Bioquímica. Tomo primero. Capítulo V. Universidad

Nacional Mayor de San Marcos.

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