Informe8de micro

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PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8

OBJETIVOS

Determinar la importancia de Enterococos respecto a la calidad Higiene Sanitaria de los productos.

Útiles para medir la eficacia de las técnicas de limpieza y desinfección. Evidenciar la presencia de Enterococos como microorganismo indicador

de contaminación ambiental. Conocer la metodología que se va a utilizar.

FUNDAMENTO TEORICOSTREPTOCOCCUS

El género Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos grampositivos pertenecientes al filo firmicutes1 y al grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo de un eje. De allí que su nombre, del Griego στρεπτος streptos, significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena. Los Streptococci son oxidasa– y catalasa–negativos.

Las especies de estreptococus que producen enfermedades son:Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e impétigo.Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer.

Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad.Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales.

Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de estreptococos viridans.Algunas especies de los grupos C y G tienen en su pared la proteína G, que, por su capacidad de unión a anticuerpos, tiene importantes aplicaciones en biotecnología.

ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLÍTICOS

Grupo AS. pyogenes (también conocido como GAS) es el agente causal en las infecciones estreptocócicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis estreptocócica ("amigdalitis"), fiebre reumática aguda, fiebre escarlata,

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glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante. Si la amigdalitis no es tratada, puede desarrollarse fiebre reumática, una enfermedad que afecta las articulaciones y las válvulas cardiacas. Otras especies de Streptococcus también pueden poseer el antígeno del Grupo A, pero las infecciones en humanos por cepas no-S. pyogenes GAS (algunas cepas S. dysgalactiae subsp. equisimilis y del Grupo S. anginosus) parecen no ser comunes.La infección por Estreptococo Grupo A es diagnosticada generalmente con una Prueba Rápida de Estreptococos o mediante Cultivo.El método más comúmente empleado en los laboratorios clínicos para la identificación presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemolítico del grupo A (Streptococcuss pyogenes) es la prueba de susceptibiidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A mediante enzimoinmunoanálisis o inmunoaglutinación.

Grupo BS. agalactiae, o GBS, causa neumonía y meningitis en neonatos y en las personas más jóvenes, con bacteremia sistémica ocasional. Estos también pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisión al infante. El Colegio Americano de Obstétras y Ginecólogos, la Academia Americana de Pediatras y los Centros para el Control de las Enfermedades recomiendan a todas las mujeres embarazadas entre 35 y 37 semanas de gestación la evaluación para GBS. Las mujeres que obtengan un examen positivo debería recibir antibióticos profilácticos durante la labor, con lo cual usualmente prevendrá la transmisión al infante.Grupo CIncluye S. equi, el cual causa enfermedad en caballos,8 y S. zooepidemicus, el cual causa infecciones en varias especies de mamíferos incluyendo al ganado y caballos. Este también puede ocasionar muerte en gallinas y alces. Muchos habitantes de las montañas en Canadá han encontrado cadáveres de alces yaciendo en la mitad del camino; las pruebas post mórtem han establecido la presencia de estreptococos del grupo C en su sangre.

Grupo D (Enterococos) *hemolísis de tipo variableMuchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en el Género Enterococcus (incluyendo S. faecalis, S. faciem, S. durans, y S. avium).9 Por ejemplo, Streptococcus faecalis se conoce en la actualidad como Enterococcus faecalis.Las cadenas remanentes no-enterocócicas del Grupo D incluyen Streptococcus bovis y Streptococcus equinus.

Características generales del grupo•Cocos, Gram +, pares de cadena•Anaerobios facultativos algunos anaerobios obligados

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•No formadores de espora•Catalasa (–) •Inmóviles•División en un plano•Existen más 30 especies.

ENTEROCOCCUS

Enterococcus es un género de bacterias del ácido láctico del división Firmicutes. Los miembros de este Gro. fueron clasificados como Grupo D Streptococcus hasta 1984 cuando los análisis de ADN genómicos indicaron que un Gro. separado era más apropiado.[1]Los enterococos son cocos Gram-positivos que se presentan apareados como diplococos; siendo difícil distinguirlos de Streptococcus con solo las características físicas. Dos especies son organismos comensales en el intestino de humanos: E. faecalis y E. faecium. El enterococo es un organismo facultativo anaeróbico, i.e. prefieren usar oxígeno, pero sobreviven bien en su ausencia.[2] Típicamente exhiben gamma-hemolisis en sangre de cordero agar.

PATOLOGÍA

Importantes infectiones clínicas causadas por Enterococcus incluye a vejiga, bacteremia, endocarditis, diverticulitis, y meningitis. Razas sensibles de estas bacterias pueden tratarse con ampicilina y vancomicina.[3]Desde un punto de vista médico, la acción más importante de estos géneros es su alto nivel de resistencia antibiótica. Algunos enterococos son intrínsecamente resistantes a β-lactam (algunas penicilinas y todas las cefalosporinas) y también muchos aminoglicósidos.[4] Desde 1980, particularlmente razas virulentas de Enterococcus resistentes a vancomicina han aparecido en infecciones hospitalarias de pacientes hospitalizados. En países desarrollados como UK han parado la epidemia, y en 2005, Singapur también manejó para detener una epidemia de VRE. VRE puede tratarse con Quinupristina/dalfopristina (Synercid) con respuestas favorables del 70 %.[5] CopyLa meningitis a enterococos es una rara complicación de neurocirugía. Suelen requerir tratamiento intravenoso de vancomicina intratecal. La vancomicina es usada y hay debate si tiene impacto en el sistema nervioso. La remoción de cualquier asunto neurológico es parte crucial del manejo de estas infecciones.

CALDO AZIDA GLUCOSA

Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de enterococos en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.Fundamento El medio permite un enriquecimiento selectivo de Enterococcus spp.La tripteína, el extracto de carne y la glucosa constituyen la fuente nutritiva, mientras que la azida sódica es inhibidora de la flora Gram negativa. El cloruro de sodio se usa para mantener el equilibrio osmótico del medio

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Fórmula (en gramos por litro)Instrucciones

Tripteína 15.0 Suspender 35 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 ºC.

Extracto de carne 4.8 Glucosa 7.5 Cloruro de sodio 7.5 Azida sódica 0.2

pH final: 7.2 ± 0.2

SiembraPor inoculación directa: cinco tubos por cada dilución.Caldo simple concentración: 10 mililitros.Caldo doble concentración: 1 mililitro.

IncubaciónAeróbica, a 35-37 ºC durante 48 horas.Características del medio: Medio preparado: ámbar claro

CALDO BHIUSO El medio de Infusión Cerebro Corazón es utilizado para el cultivo de microorganismos fastidiosos como estreptococos, neumococos y meningococos. Este medio también es conocido como BHI por sus siglas en inglés.EXPLICACION:El medio de Infusión Cerebro Corazón es una modificación de las formulaciones desarrolladas por Rosenow y Hayden en las que se adicionó infusión de cerebro de ternera y difosfato de sodio.El medio de Infusión Cerebro Corazón está especificado en varios procedimientos estándares para la industria alimenticia y el análisis de aguas. También es recomendado por la NCCLS para preparar el inóculo para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.En este medio la infusión de carne de corazón y de cerebro de ternera así como la peptona proveen la fuente de carbono, nitrógeno sulfuro y vitaminas. La dextrosa actúa como fuente de energía. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. El fosfato disódico actúa como buffer.Fórmula (en gramos por litro)

InstruccionesInfusión de Cerebro de Ternera

200.0 Suspender 37g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Dispensar en

Cloruro de Sodio 5.0Infusión de Corazón 250

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de Res tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15minutos.

Fosfato Disódico 2.5 Peptona de Gelatina 10.0

Dextrosa 2.pH 7.4 ± 0.2

PRUEBA DE CATALASASe utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

o Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).o Bacillus (+) de Clostridium (-).o Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las

excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) deErysipelothrix (-)

METODOLOGÍA

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Materiales a usarse en los experimentos

Placas Petri Tubos de ensayo

Mechero Bunsen Balanza analítica

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Asa de Siembra

Tripode

Malla de Asbesto Baño María

Pipeta Erlemeyer

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Reactivos usados en los experimento

Nombre del reactivoAgar m-enterococos

Caldo BHI

Peróxidos de hidrogeno al 3% H 2O2

Caldo Azida glucosa(Medio Selectivo)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparación y dilución de la muestra

1. Pesar 10 g de la muestra ambiental en este caso una muestra de pescado.

2. Colocar la muestra en la licuadora y diluir con 90 ml de agua peptonada, preparada previamente, de licua por dos minutos.

3. Verter la solución en un tubo de ensayo y luego realizar diluciones sucesivas en los tubos que contienen 9ml de agua peptonada.

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10−1 10−2 10−3 10−4 10−5

Siembra por triplicado en caldo Azida Glucosa

1. Un mililitro de cada dilución se siembra en tres tubos de caldo Azida Glucosa que contienen 10ml del medio. Con una pipeta diferente por cada dilución.

2. Se coloca en un rejilla los tubos de ensayo con los caldos sembrados y se los lleva a incubar a 35-370C por un tiempo de 24 a 48 horas.

Siembra en placa de Agar Enterococos

1. Se seleccionan los tubos positivos obtenidos en la siembra en caldo Azida glucosa.

2. Los organismos de los tubos seleccionados se siembran por estriado en agar Enterococos en placa.

3. Se colocan las placas en la incubadora a 370C por 48 horas.

Siembra de colonias características en Caldo BHI

1. Se toma un asa de siembra y se la coloca al fuego hasta su coloración al rojo vivo.

2. Cerca

del mechero, se toma el tubo de ensayo que contiene el caldo estéril y se flamea la boca del tubo para esterilizar.

3. Se transfiere el inóculo hacia el caldo, descargando el inóculo mediante agitación del asa de siembra en aquél.

4. Una vez sembrado el inóculo se vuelve a flamear la boca del tubo antes de colocar el tapón.

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5. Este procedimiento se repite para cada colonias seleccionada, se siembra en distintos tubos. Terminado el proceso se coloca la rejilla de los tubos de caldo sembrados en la incubadora a 370C por 24 horas.

Tinción Gram.(Para confirmar Estreptococos fecales)

1. Se tendrá como muestra problema a los organismos que hayan crecido en los tubos de caldo BHI (medio de enriquecimiento).

2. Se realiza el frotis con dos asadas de la muestra, y la fijación con el mechero de alcohol.

3. Se hace la coloración con cristal violeta, dejar durante 1 minuto.4. Se lava con agua para eliminar el exceso de colorante.5. Se añade el lugol, aplicándose durante un minuto6. Lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de lugol.7. Decolorar con alcohol acetona durante 15 a 20 segundos 8. Lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de alcohol.9. Cubrir el portaobjetos con safranina por 20 a 30 segundos.10. Lavar, con con agua para eliminar el exceso de safranina.11.Secar al calor del mechero de alcohol.12.Colocar con capilar aceite de inmersión al portaobjetos.13.Observar al microoscopio con una resolución de 1000X e identificar

estreptococos fecales.

Prueba de Catalasa (prueba confirmativa de estreptococos fecales)

1. Se toma un tubo de ensayo pequeño.2. Con una pipeta se coloca 0.5 ml de peróxido de hidrogeno al 3% en el

tubo.3. Se agrega al tubo 3 ml del cultivo BHI.4. Se procede a observar la reacción catalasa que se espera que se

produzca.5. La reacción catalasa positiva se evidencia por la formación de burbujas

de lo contrario es una reacción catalasa negativa.6. Para la determinación de Estreptococos fecales el resultado de la prueba

catalasa tiene que ser negativo.7. Los resultados se comparan con la tabla del número más probable Y se

reporta como NMP/gramo de estreptococos fecales.

Siembra en Caldo BHI (al baño maría) y Caldo BHI con 6.5% de NaCl

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1. Si con la prueba catalasa y tinción gram se identificó NMP por gramo de estreptococos fecales, entonces recien se procede a realizar estas pruebas para identificar también dentro de los estreptococos fecales, la presencia de enterococos.

2. De los cultivo del caldo BHI de los cuales se realizó las prueba de catalasa y tinción Gram; y salieron positivos de estreptococos fecales se va ser una resiembra en otros tubos de caldo BHI estéril de cada uno.

3. Se esteriliza el asa de siembra calentándolo hasta el rojo vivo.4. Se toma el tubo del cultivo de con microorganismos y se agita para

dispersarlos.5. Se destapa el tubo y se flamea la boca.6. Con el asa de siembra esterilizada se retira los microorganismos del

tubo.7. Se retira el asa de siembra con cuidado y se vuelve a flamear la boca del

tubo antes de taparlo.8. Cerca del fuego se toma un tubo de caldo BHI estéril, se lo destapa, se

flamea la boca y allí se siembra la primera asada del inoculo extraído. Se sembraran dos asadas en cada tubo.

9. El procedimiento se repite pero con caldos BHI con cloruro de sodio NaCl al 6.5%.

10.Los tubos de caldo BHI sembrados de llevaran a Baño maría a 460C por 48 horas.

11.Los tubos con caldos BHI con cloruro de sodio NaCl al 6.5% se llevarán a la incubadora a 35-370C por 72 horas.

12.Si luego del tiempo transcurrido para ambos casos hay crecimiento o turbidez en ambos entonces será una prueba positiva de enterococos y se reportará NMP/ gramo de enterococos utilizando la tabla del número más probable.

OBSERVACIONES/RESULTADOS

Tubos positivos de BHI incubados

Dilución 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Tubos positivos

No se hizo

3 1 1 0

Prueba Catalasa

Negativos:- 10-4

- 10-3 C- 10-2 B

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- 10-1 C

Positivos: - 10-2A

BHI (baño maria)

En todos hay turbidez:- 10-4

- 10-3 C- 10-2 B- 10-1 C

-

Dilución 10-2 10-3 10-4

Tubos positivos

2 1 1

BHI + NaCl

En todos hay turbidez:- 10-4

- 10-3 C- 10-2 B- 10-1 C

Dilución 10-2 10-3 10-4

Tubos positivos

2 1 1

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Se concluye que el color rojo cereza de la interfase se produce debido a que el indol reacciona con él para-dimetil-aminobenzaldehido

El alfa Naftol actúa como catalizador y la sosa o potasa hace al medio alcalino y reacciona con la Acetoìna formando un precipitado

Se concluye que la producción del acido tiene que ser suficiente para producir el viraje del indicador (rojo de metilo) y que el microorganismo fermenta la glucosa por via acido mixto

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Tal y como se esperaba se pudo lograr esta vez un buen resultado en el NMP debido a que esta vez si se realizo un buen trabajo

Debido a la confirmación realizada en el caldo BHI bajo el microscopio y con la prueba de catalasa pudimos llegar a la conclusión de que obtuvimos estreptococos fecales con una cantidad mayor de1100 NMP /gr

La prueba para enterococos resulto negativa pues todas las siembras realizadas en caldo BHI con NaCl al 6.5% resultaron negativas pues no presentaban turbidez para lo cual llegamos a la conclusión de que se había realizado una mala práctica pues ya se tenía indicios de que esto fuese así.

RECOMENDACIONES A la hora de sembrar es preferible estar cerca del mechero de

bunsen para así poder evitar alguna contaminación a la muestra. En la prueba de la catalasa mirar que el peróxido de hidrogeno a

utilizar sea reciente y que no se hay cencido. Manejar con cuidado el microscopio ya que se puede dañar los

lentes ópticos. Realizar de forma correcta las inoculaciones, para evitar errores

en los resultados. Seguir las indicaciones del profesor encargado del curso para que

el experimento sea un éxito. A la hora de la tinción no tener mucho tiempo el alcohol acetona

en el portaobjetos ya que dañaría a las bacterias y se obtendría otros resultados inesperados.

BIBLIOGRAFIA Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas

bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo ll, Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.

Alonso Urmeneta y otros. Manual Práctico de Microbiología.

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Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo l, Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.

ANEXOS

Galería

Se muentra el Caldo BHI, Se muestra la prueba de la Catalasa.

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Se muestra una placa petri con Agar m-enterocos. Las placas petri con Agar m-enterococos se lleva a la incubadora.

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