INFORME FINAL DE PROYECTO SIP - SAPPI

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN

BIOTECNOLOGIA APLICADA TLAXCALA

San Juan Molino Km. 1.5 Tepetitla, Tlaxcala Tel. (248) 4870765 Fax: 4870766

INFORME FINAL DE PROYECTO SIP

Clave SIP: 20080256

TITULO DEL PROYECTO: Biorremediación de un suelo contaminado con PAHs por una cepa de Aspergillus niger modificada genéticamente en cultivo sólido y sumergido. DIRECTORA DEL PROYECTO: Dra. Diana Verónica Cortés Espinosa.

Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada del IPN




RESUMEN. Los hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs, por sus siglas en inglés) son compuestos xenobióticos,

constituyentes del petróleo. Estos compuestos son encontrados principalmente en suelos y sedimentos por sus

propiedades hidrofóbicas. Algunos de estos son mutagénicos y carcinogénicos. Los PAHs son degradados

principalmente por los sistemas enzimáticos de hongos y bacterias. Los hongos ligninolíticos producen

peroxidasas extracelulares que son las responsables de la degradación de la lignina, estas enzimas han

mostrado tener la capacidad de degradar diferentes compuestos tóxicos, por lo que se han aplicado en sistemas

de biorremediación de suelos contaminados con compuestos xenobióticos. Los hongos filamentosos no

ligninolíticos tienen la capacidad de remover PAHs en cultivo sólido por sistemas enzimáticos diferentes a los

ligninolíticos pero con menor efectividad, ya que a diferencia de las enzimas ligninolíticas, estos sistemas

enzimáticos solo transforman el contaminante sin llegar a una mineralización y algunas veces los metabolitos

formados resultan en compuestos más tóxicos.

Algunos hongos del género Aspergillus tienen la capacidad de degradar PAHs por sistemas enzimáticos no-

ligninolíticos (citocromo P-450 monooxigenasa) en cultivo sólido. Se cuenta con una cepa de un hongo no-

ligninolítico que se identificó por la secuenciación de los fragmentos ITS (Internal Transcription Spacer) como:

Aspergillus niger, esta cepa tiene la capacidad de crecer en crudo maya, además de que puede tolerar altas

concentraciones de Phe (800 ppm) y remueve el 73% de este contaminante en cultivo sólido usando como

soporte bagacillo de caña y suelo contaminado.

Los metabolitos formados durante la degradación de PAHs por citocromo P450 monooxigenasa son

principalmente dihidrodioles y/o epóxidos, los cuales en muchos casos son más tóxicos que el compuesto

original como es el caso del pireno y el benzo(a)pireno que son PAHs considerados por la EPA como

compuestos altamente tóxicos por sus propiedades mutagénicas .

Por lo que esta cepa de A. niger se usó para la expresión heteróloga de una peroxidasa (manganeso peroxidasa,

MnP) de Phanerochaete chrysosporium con la finalidad de aumentar su capacidad de degradación para

mineralizar PAHs. La cepa transformante de A. niger SBC2-T3 presentó actividad de MnP. Esta cepa es capaz

de remover el 95% del Phe inicial (400 ppm) en cultivo sólido en 17 d a diferencia de la cepa silvestre que

removió el 73% bajo las mismas condiciones. La presencia de la enzima MnP en la cepa de A. niger, aumentó la

degradación del Phe, lo cual la hace una cepa que puede ser usada como una alternativa para la degradación de

PAHs.




Los microorganismos modificados genéticamente (GEMs, de las siglas en ingles Genetically Engineered

Microorganisms) han demostrado ser una buena alternativa para acelerar la degradación in situ de compuestos

xenobióticos en suelos contaminados hasta una mineralización. Por lo que objetivo general de este proyecto

consiste en la determinación de la tolerancia y degradación de pireno y benzo(a)pireno en cultivo sólido,

superficial y sumergido por una cepa transformante de A. niger SCB-T3 que produce MnP.




INTRODUCCION. Los hidrocarburos aromáticos polinucleares (PAHs) están formados por dos o más anillos bencénicos fusionados

en forma lineal, angular o agrupada. Debido a su baja solubilidad se encuentran en muy bajas concentraciones

en el agua y por su alta afinidad tienden a ser preservados en partículas de suelo, sedimentos comunes y en

ecosistemas acuáticos. La estabilidad relativa de los PAHs es debida a la disposición de los anillos; su

solubilidad en agua decrece con el incremento del peso molecular. El Phe es un compuesto formado por tres

anillos aromáticos y es encontrado como contaminante en suelos, sedimentos y estuarios. Es tóxico para

animales acuáticos como crustáceos, moluscos y peces. No es mutagénico, por lo que es utilizado como un

sustrato modelo para estudios de degradación de PAHs por microorganismos, ya que, es el más pequeño de

dichos compuestos. Su estructura está formada por una región-bahía y una región-K, además, se encuentra

formando parte de algunos PAHs cancerígenos, como el benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, etc. (Cerniglia y

col., 1985).

La bioaumentación se ha empleado como un sistema modelo para la remoción de PAHs en suelos

contaminados, utilizando hongos de pudrición blanca que producen enzimas ligninolíticas (las cuales son

capaces de oxidar una gran cantidad de compuestos tóxicos que presentan una estructura química compleja,

como es el caso de los PAHs). Sin embargo, el empleo de estos hongos en procesos de biorremediación

presenta varios inconvenientes debido a que su hábitat no es el suelo sino la madera en descomposición, con lo

que se puede correr el riesgo de que la flora autóctona del suelo los desplace, impidiendo su crecimiento,

alcanzando un tiempo de vida media muy limitado en el suelo y por consiguiente un bajo porcentaje de

eliminación del contaminante.

El cultivo sólido es un sistema apropiado para llevar a cabo la bioaumentación y se ha venido utilizando como

modelo para la remoción de residuos peligrosos en suelos como: PCB’s, PAHs, clorofenoles, etc. En este

sistema se puede utilizar una pequeña cantidad de texturizante, los cuales son residuos agrícolas (hojarasca,

aserrín de pino, bagacillo de caña, entre otros) con el suelo contaminado. Los texturizantes sirven como agente

de amontonamiento, fuente térmica, soporte para el crecimiento y algunas veces como fuente de carbono para

los microorganismos que se desean adicionar al suelo para la descontaminación. Este sistema se empezó a

utilizar a principios de los 90’s

para el tratamiento de hidrocarburos del petróleo y actualmente se usa para el tratamiento de grandes cantidades

de material contaminado.



La biorremediación de suelos en cultivo sólido se ha realizado con diferentes microorganismos, los cuales son

los encargados de llevar a cabo la remoción mediada por sistemas enzimáticos. El metabolismo del Phe por

hongos filamentosos es realizado por el sistema enzimático P-450 monooxigenasa y es muy parecido al

observado en mamíferos (Smith y Rosazza, 1974). Algunos hongos no ligninolíticos que ya se han estudiado

para la remoción del Phe son A. niger, Cunninghamella elegans y Penicillium janthinellum (Cerniglia y Yang,

1984; Casillas y col., 1996; Sack y col., 1997).

El zigomiceto Cunninghamella elegans oxida inicialmente el Phe en la posición 1,2 (figura 3.4) para formar el

fenantreno trans-1,2-dihidrodiol y un conjugado glucósido de 1-fenantrol. La oxidación puede ocurrir también en

la posición 3,4- y 9,10- (sitio que es oxidado preferentemente en mamíferos), para formar dihidrodioles con una

configuración trans. El principal enantiómero formado por C. elegans para cada uno de los dihidrodioles tiene una

configuración absoluta S-S-, la cual es opuesta a la formada (R-R-dihidrodiol) en mamíferos (Cerniglia y Yang,

1984; Cerniglia y col., 1989).

En el caso de los hongos ligninolíticos se han utilizado preferentemente los llamados hongos de pudrición blanca,

siendo el más estudiado Phanerochaete chrysosporium que tiene la capacidad de producir enzimas peroxidasas

(lignina peroxidasa, LiP, y manganeso peroxidasa, MnP), encargadas de la remoción de varios compuestos

tóxicos. Se ha descrito que las manganeso peroxidasas se producen con altos rendimientos en cultivo sólido.

(Cruz y col., 1999). La bioquímica y genética molecular del sistema ligninolítico de P. chrysosporium son muy

complejos. Se producen multiples isoenzimas y el genoma de este hongo contiene, al menos, 10 genes

estructurales que codifican para LiP. Estos genes han sido designados como lipA hasta lipJ (Gaskell y col.,

1994). Del mismo modo, se producen varias isoenzimas de la MnP (H3, H4 y H5) en cultivo sumergido y han sido

caracterizados tres genes de P. chrysosporium que codifican para las mismas.





El problema de aplicar hongos ligninolíticos para la biorremediación de suelos se ha hecho un poco problemático,

ya que este medio no es su hábitat natural y son desplazados por los microorganismos autóctonos del suelo que

ya están adaptados al sitio, este desplazamiento impide que las enzimas peroxidasas ejerzan su función sobre

los compuestos tóxicos, es por ello que se ha optado por hacer aislamiento de microorganismos autóctonos del

suelo que tengan capacidades de degradar PAHs por sus propios sistemas enzimáticos (citocromo P-450), pero

estos sistemas enzimáticos transforman únicamente a los PAHs en compuestos que algunas veces son más

tóxicos que el compuesto original como pasa con el benzo(a)pireno que cuando es transformado por citocromo

P-450, se forma un intermediario de mayor toxicidad, ya que dicho intermediario es el encargado de hacer

modificaciones genéticas al ADN. La sobreexpresión de los genes que codifican para las peroxidasas (LiP y

MnP) en microorganismos nativos del suelo y el aumento potencial de la actividad enzimática en cultivo sólido

constituirían un aporte importante en los sistemas de biorremediación de suelos contaminados con compuestos

aromáticos.

En nuestro laboratorio contamos con una cepa de un hongo no-ligninolítico que fue aislada de bagacillo de caña

y se identificó por la secuenciación de los fragmentos ITS (Internal Transcription Spacer) como: Aspergillus niger,

esta cepa tiene la capacidad de crecer en crudo maya, además de que puede tolerar altas concentraciones de

Phe (800 ppm) y remueve el 73% de este contaminante en cultivo sólido usando como soporte bagacillo de caña

y suelo contaminado (Cortés y col., 2006). Esta cepa de Aspergillus, se cotransformó con dos plásmidos: el

pDLAM con gen de resistencia a higromicina B (HB) y el pTAAMnP1 con el gen mnp1 que codifica para una MnP

de P. chysosporium. Las transformantes se seleccionaron por resistencia a HB y por la decoloración del Poly R-

478 por actividad de la enzima en placa. Se obtuvo la cepa transformante A. niger SBC2-T3 que presentó

actividad de MnP y fue capaz de remover el 95% del Phe inicial (400 ppm) en cultivo sólido en 17 d mientras que

la cepa silvestre bajo las mismas condiciones. La presencia de la enzima MnP en la cepa de A. niger, aumentó la

degradación del Phe (Cortés, 2007).

Este microorganismo genéticamente modificado ha demostrado ser una buena alternativa para acelerar la

degradación in situ de compuestos xenobióticos en suelos contaminados. Por lo que objetivo general de este

proyecto consiste en la determinación de la tolerancia y degradación de pireno y benzo(a)pireno en cultivo sólido,

superficial y sumergido por una cepa transformante de A. niger SCB-T3 que produce MnP.




MATERIALES Y METODOS. Microorganismos. Cepas fúngicas: La cepa de Aspergillus niger SCB2-T3, que produce MnP por la expresión heteróloga del gen

mnp1 de Phanerochaete chrysosporium H-298 CDBB-500

Medios de cultivo.

Hongos.

Medio Cove (g L-1

): Solución de sales 50x (Ver apéndice A), 20 mL; maltosa, 50; tartrato de amonio, 0.92. Se

ajustó el pH a 6.8 con NaOH (Cove, 1966). Este medio se utilizó para detectar actividad de MnP de las

transformantes en cultivo superficial, agregando al medio 15 g L-1

de agar bacteriológico y 0.03% del colorante

poly R-478. Para la cuantificación de la actividad de MnP de las transformantes en cultivo sumergido se agregó 1

g L-1

de hemoglobina. Para obtener la degradación de Phe por la cepa transformante en cultivo sólido se utilizó

este medio concentrado 3 veces.

Agar Dextrosa y Papa (PDA): Medio de cultivo utilizado para la conservación de las cepas, selección primaria y

tolerancia en placa. Este medio se utilizó para propagar todas las cepas utilizadas en este trabajo. La

propagación se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer con 50 mL de PDA, se inocularon e incubaron a la

temperatura correspondiente de cada hongo durante 4 o 5 días para la esporulación y cosecha de esporas.

Medio Mínimo (MM) (g L-1

): Glucosa, 10.0; (NH4)2SO

4, 7.0; KH

2PO

4, 5.7; K

2HPO

4, 2.0; MgSO

4 7H

2O, 2.0. Para

medio sólido se agregó agar bacteriológico, 15.0. Medio utilizado para la selección primaria y tolerancia en placa.

TOLERANCIA A Pi Y B(a)Pi EN CULTIVO SUPERFICIAL. Se midió la capacidad para crecer y tolerar diferentes concentraciones de Phe en cultivo superficial en caja de

Petri de la cepa transformante de A. niger SCB2-T3, se usó como cepa control a la cepa silvestre de A. niger

para obtener el efecto por la expresión del gen mnp1. Para lo cual se siguió la siguiente metodología:




1. Se prepararon placas de Petri con dos medios diferentes medio Cove y medio MM. Se usó como

fuente de carbono maltosa, ya que el promotor para la expresión del gen mnp1 en la cepa transformante se

induce con maltosa para obtener el medio sólido se agregaron 15 g/L de agar noble.

2. Cuando las placas ya estaban solidificadas se agregó en la superficie el hidrocarburo en solución

acetónica. Se dejaron abiertas en un área estéril para evaporar la acetona y dejar en la superficie de la placa los

cristales de hidrocarburo.

3. Se inocularon inmediatamente en el centro de la placa por picadura esporas del hongo, las cuales se

encontraban en una solución de tween 80 al 1% a una concentración de 1x107 esporas/mL.

4. Se incubaron a 30ºC durante 15 días. Se hicieron mediciones del crecimiento radial (rr) cada 24 h.

Como control se usaron placas sin hidrocarburo, inoculadas con cada una de las cepas de igual manera.

Para medir la máxima tolerancia a los 3 diferentes PAHs, se usaron diferentes concentraciones y los diferentes

PAHs por separado y en mezcla (Phe, Pi y B(a)P cada una en la misma concentración) con cada una de las

cepas. Cada uno de los tratamientos se hizo por duplicado. El diseño experimental se muestra en la siguiente

tabla.

CEPAS PAHs

[ppm] Phe Pi B(a)P Mezcla (Phe+Pi+B(a)P)

A. niger SCB2 0

200

400

600

800

1000

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

A. niger SCB2-T3 0

200

400

600

800

1000

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

X X

Se midió el crecimiento radial cada 24 h durante 15 días o hasta que el control sin hidrocarburo llenó la placa.

Los resultados se graficaron para obtener las cinéticas y se hicieron observaciones fisiológicas.




CULTIVO SUMERGIDO PARA IDENTIFICACION DE INTERMEDIARIOS.

Se realizaron cinéticas de degradación de Phe y Pi en cultivo sumergido por la cepa transformante y silvestre de

A. niger SCB2, para comparar si había alguna diferencia en los intermediarios formados debido a la expresión

del gen mnp1 para producir la enzima MnP. Debido a la baja solubilidad de los PAHs en cultivo sumergido, en

primer lugar se tuvo que realizar una estandarización de las condiciones de cultivo para la poder solubilizar la

mayor cantidad de Phe y Pi, estos experiementos también sirvieron para estandarizar la forma de inoculación de

los cultivos, esto por la posible inhibición de las esporas por la presencia de diferentes compuestos que se

adicionan al medio para adicionar el hidrocarburo, tal es el caso del tween 80 que funciona en el medio como

tensoactivo para disolver el hidrocarburo en el medio y la adición de acetona, que es el solvente orgánico en el

cual se prepara la solución estándar de los hidrocarburos para poder adicionarla al medio líquido. Estos dos

compuestos si se adicionan en concentraciones altas pueden inhibir la esporulación de las esporas, por ello se

probaron diferentes concentraciones de tween 80 y diferentes concentraciones de PAHs con sus respectivos

controles. La metodología que se siguió, fue la siguiente:

1. Se prepararon matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio Cove estéril.

2. Se adicionaron diferentes concentraciones de tween 80 estéril al medio para solubilizar el hidrocarburo.

3. Se adicionaron 500 uL de una solución estándar de hidrocarburo a diferentes concentraciones para

determinar la máxima solubilidad que se puede alcanzar en cultivo líquido.

4. Se inocularon los matraces con 1x107 esporas/mL de medio.

5. Se incubaron los matraces a 30oC durante 5 días para hacer la extracción del hidrocarburo residual.

6. Se filtró el medio de cultivo para separar la biomasa del caldo.

7. Se hizo extracción del hidrocarburo del medio líquido con acetato de etilo dos veces con un volumen de

solvente. La fase orgánica se recuperó y se concentró por rotavapor a 1 mL. Se colocó en viales ámbar y

se pusieron a evaporar a sequedad en campana de extracción. El hidrocarburo fue resuspendido en

acetona grado HPLC para su cuantificación por HPLC.

8. El micelio filtrado fue resuspendido en 5 mL de acetona industrial para extraer el hidrocarburo adsorbido a

la pared del microorganismo, se sometió a agitación a 200 rpm por 30 min y se recuperó la fase orgánica.

Este proceso se realizó dos veces.

9. La fase orgánica recuperada, se concentró a 1 mL en rotavapor y se pasó a viales ámbar para secarlos en

su totalidad en campana de extracción. Las muestras se resuspendieron en 1 mL de acetona grado HPLC.




10. Las muestras generadas de cada matraz se analizaron por HPLC para cuantificar el hidrocarburo residual.

Se prepararon diferentes controles para también evaluar la eficiencia de extracción tanto del micelio como

del medio.

El diseño experimental para definir la solubilidad de Phe y Pi en medio líquido quedó de la siguiente forma:

PAHs

Tween (mg/mL)

Concentración (ppm)

10 20 30 40 50 60 70 80

Phe 500 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

Pi 500 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

Con este diseño se seleccionó una concentración que fuera soluble y donde pudiera crecer el microorganismo

sin problema, por lo que se cuantificó la biomasa producida a los 4 días de incubación. Los resultados obtenidos

en este experimento, sirvieron para establecer el siguiente diseño experimental, donde se evaluó la

concentración de surfactante y la técnica de extracción.

Tween 80 (g/mL)

PAHs ( ppm)

A. niger (1x107 esp/mL)

0.5 +Phe (60) + 0.5 -Phe (60) + 0.5 +Phe (60) - 1 +Phe (60) + 1 -Phe (60) + 1 +Phe (60) - - +Phe (60) + - -Phe (60) +

0.5 +Pi (50) + 0.5 -Pi (50) + 0.5 +Pi (50) - 1 +Pi (50) + 1 -Pi (50) + 1 +Pi (50) - - +Pi (50) +

Dentro de este diseño se prepararon muestras control para estandarización de la técnica de extracción. Y para

obtener resultados sobre el efecto de la concentración de surfactante sobre el crecimiento del hongo.




Para la determinación de los intermediarios formados por la cepa transformante se hicieron cinéticas de

crecimiento en cultivo sumergido con medio Cove siguiendo la metodología que se menciona anteriormente

usando 60 ppm de Phe y 50 ppm de Pi. Se sacrificaron matraces por duplicado cada 24 h. Se hizo la extracción

de los PAHs tanto de medio líquido como del micelio como se menciona en la metodología descrita arriba. El

hidrocarburo extraído se cuantificó por HPLC y los intermediarios se analizaron por cromatografía de gases

acoplado a espectroscopia de masas (CG-MS). Usando dicloromentano para su identificación.

DEGRADACIÓN DE PAHS EN CULTIVO SÓLIDO. Para la degradación de una Pi y B(a)P en cultivo sólido se realizó el experimento en botellas serológicas de 50

mL con suelo contaminado artificialmente con 600 ppm de cada uno de los PAHs usando como soporte para el

crecimiento del hongo bagacillo de caña, la metodología utilizada para el cultivo sólido se preparó como se

describe a continuación:

1. Se molió el bagacillo en un molino y fue tamizado por malla No. 30 para homogenizar el tamaño de

partícula.

2. Posteriormente, se hizo una extracción de los compuestos que pudieran interferir en la cuantificación del

Phe en los experimentos en cultivo sólido. Para ello se pretrató el bagacillo previamente con agua

caliente y fría (método estándar TAPPI T-12 m-45 y t-6 m-54).

3. Se secó en una estufa a 60ºC durante 24 h.

4. El bagazo fue pesado y colocado en viales serológicos donde se llevaría a cabo el cultivo sólido. Los

viales fueron tapados y esterilizados 4 veces consecutivas a 15 lb/in2 durante 15 min cada tercer día,

con intervalos de incubación a 37ºC.

5. Se tomó un vial y se le agregó agua estéril para poder tomar una asada, la cual se inoculó en placas de

Petri con PDA para hacer una prueba de esterilidad del bagacillo.

6. El bagacillo fue impregnado de medio de cultivo según el tratamiento, e inoculado con esporas del hongo

(2x107 esporas/g BH) en estudio, alcanzando una húmedad del 30%. Los viales se sellaron

perfectamente.

7. Se incubaron los viales a 30ºC durante 5 días, y se midió la producción de CO2 cada 24 horas (para

hacer un seguimiento del crecimiento del hongo). Los viales fueron aireados después de cada medición

de CO2.




8. Por otro lado, se esterilizó el suelo a 15 lb/in2 durante 30 min. Debido a que el suelo cuenta con una

flora muy diversa, se dificulta tener una esterilización total, por lo que este procedimiento se repitió 5

veces (para evitar el desarrollo de algún microorganismo que pudiera contaminar el sistema), cada tercer

día, con incubaciones a 37ºC entre las dos primeras esterilizaciones. A partir de la tercera esterilización

se colocó en una incubadora a 70ºC durante 24 h para que se secara completamente.

9. Una vez esterilizado el suelo, se contaminó con los PAHs en una solución de acetona a una

concentración de 600 ppm/g de suelo seco. El contaminante se agregó de forma homogénea en todo el

suelo y se evaporó la acetona.

10. A los 5 días de incubación de los viales con bagacillo fueron abiertos en un área estéril para agregar a

cada vial el suelo contaminado más medio de cultivo para que el sistema alcanzara la humedad del 30%

inicial. Los viales nuevamente se sellaron y se dejaran incubando a 30°C, pero ahora durante 15 días. Se

midió la producción de CO2 cada 24 horas y fueron aireados con aire húmedo estéril (para evitar la

perdida de la humedad del 30%) cada 24 horas durante 15 min, con la finalidad de remover el CO2

producido y dejar la atmósfera del vial con O2, el cual es utilizado por el hongo.

Todos los viales fueron incubados a 30oC debido a que se realizaron cinéticas de degradación, cada tercer día

se sacrificaron viales para la extracción de los PAHs por la técnica de Soxthlet y cuantificar los PAHs residuales

por HPLC. A todos los viales se les midió la actividad heterotrófica, por medio de la cuantificación del CO2

producido cada 24 h.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Tolerancia a Pi y B(a)P en cultivo superficial. Se probaron diferentes concentraciones de Pi y B(a)P (0, 200, 400, 600, 800 y 1000 ppm) con dos medios de

cultivo diferentes como se describe en la metodología. Se usaron las cepas transformante y silvestre. Se midió el

crecimiento radial cada 24 h hasta que el control sin PAHs llenó la placa. Se hicieron curvas de crecimiento radial

y se calculó la velocidad de crecimiento radial para cada una de las cepas en los diferentes medios de cultivo

probados.



A continuación se muestran las curvas de crecimiento radial tanto de la cepa silvestre y transformante en medio

mínimo (MM), donde se observó que el Phe presenta un efecto tóxico mayor que el Pi y B(a)P, en ambas cepas.

Donde se presentó menor efecto tóxico para la cepa silvestre, fue en presencia de B(a)P, ya que no se

presentaron diferencias significativas en el crecimiento radial con respecto al control sin hidrocarburo por el

contrario la cepa transformante presentó ligera inhibición más marcada que la silvestres con B(a)P y las placas

se llenaron en menos tiempo con respecto al Pi y Phe. Estos resultados se deben a que el potencial redox que

tiene el Phe es mayor que los otros dos PAHs y este potencial no favorece la actividad de las enzimas que

intervienen en la degradación de los hidrocarburos, por lo que la degradación debe iniciarse por otro sistema

enzimático que disminuya el potencial del Phe para que pueda ser posteriormente atacado por las enzimas

correspondientes.

A) B) C)

Fig. 2. Cinética de crecimiento radial de la cepa silvestre de A. niger en medio mínimo A)Phe, B) Pi y C) B(a)P

A) B) C)

Fig. 3. Cinética de crecimiento radial de la cepa transformante de A. niger en medio mínimo A)Phe, B) Pi y C) B(a)P




Los efectos mostrados por la inhibición del Phe en cultivo superficial se corroboraron con la morfología que se

observó del micelio cuando se incubaron estas placas, ya que además de que se observó un crecimiento más

lento en ambas cepas, se perdió la capacidad de esporulación, creciendo únicamente en forma de micelio blanco

con ligeras tonalidades amarillas. En la figura 4, se muestras las imágenes del crecimiento radial de la cepa

transformante y silvestre en diferentes concentraciones de Phe en medio Cove. Comparando ambas cepas, se

observó una inhibición mayor en la esporulación de la cepa silvestre que de la transformante, esto podría

deberse a que la cepa transformante puede iniciar la degradación más rápido por la presencia del gen mnp1 que

está provocando la producción de la MnP, acelerando el proceso de degradación.

a) A. niger silvestre

b) A. niger transformante

Fig. 3 Efecto del Phe a diferentes concentraciones sobre el crecimiento radial de las cepas: a) silvestre y b) transformante en cultivo superficial.

También se analizó el crecimiento radial en placas con una mezcla de los 3 PAHs (fig. 5) en cultivo superficial y

los resultados mostraron que con la mezcla de PAHs si hay un efecto de inhibición del crecimiento radial, ya que

se observó que conforme más aumenta la concentración de mezcla, menos crece el hongo, a diferencia de los

PAHs por separado, en estas placas se observa una disminución del crecimiento desde 200 ppm de mezcla,

aunque curiosamente si hay esporulación en todas las concentraciones probadas a diferencia de lo que pasa en

presencia de solo Phe.




A)

B)

Fig. 5. Crecimiento radial en cultivo superficial con medio mínimo y diferentes concentraciones de una mezcla de PAHs. A) cepa transformante de A. niger y B) cepa silvestre de A. niger.

Identificación de Intermediarios en cultivo sumergido.

Se realizaron cinéticas de degradación por la cepa silvestre y transformante en cultivo sumergido usando para

ello medio Cove, en el primer diseño experimental que se muestra en materiales y métodos, se probaron

diferentes concentraciones de Phe y Pi para seleccionar la más apropiada que se pudiera detectar en el HPLC y

que no inhibiera el crecimiento del hongo, estos resultados mostraron que si aumentamos la concentración de

Phe y Pi arriba de 60 ppm hay una disminución del crecimiento del hongo, además se observó que el

hidrocarburo se adhiere a las paredes del matraz, provocando que no haya una concentración homogénea que

esté en contacto directo con el microorganismo. Por lo que se decidió trabajar con la concentración de 60 ppm.

Cabe mencionar que debido a los resultados obtenidos en placa donde se observó un efecto muy marcado entre

Phe y los otros dos PAHs que tuvieron cinéticas similares, se decidió que en lugar de probar B(a)P se hiciera la

cinética con Phe y Pi únicamente.

Con el segundo experimento planteado en materiales y métodos se probaron dos concentraciones de Tween 80

para solubilizar al microorganismo, inocularon y se dejaron incubar a 300C durante 4 días para posteriormente

hacer la extracción. El tiempo de retención en el cual se obtiene el Phe es a 2.38 min y el Pi se obtiene a 3.86

min. Se corrieron las muestras extraídas del medio de cultivo y del micelio, obteniéndose que la mayor cantidad

de Phe y Pi se encontró en las muestras extraídas del micelio, este resultado demuestra que la mayor parte del

hidrocarburo se encuentra adsorbida en la pared celular del microorganismo, además que el adicionar el

surfactante al medio permite que se obtengan de mejor forma la extracción del hidrocarburo, ya que en los

controles sin inóculo con 100 y 200 uL de tween 80 e hidrocarburo, se logró obtener el 96 y 97% respectivamente




del hidrocarburo adicionado al medio con respecto al control que no llevaba tween 80, donde se obtuvo

únicamente el 80% del hidrocarburo adicionado al medio.

A)

B)

Fig. 6 Comatogramas obtenidos del tratamiento con 1 mg/ml tween+200 ppm Phe+inóculo de A. niger transformante. A) Phe extraído de medio de cultivo y B) Phe extraído de micelio.

Los cromatogramas que se muestran en la figura 6, son los que se obtuvieron del Phe residual del caldo de

cultivo y del micelio después de 4 días de incubación, donde se puede apreciar que efectivamente se encontró el

hidrocarburo en mayor concentración en el micelio, además se observó que el tween presentó dos efectos

importantes más, el primero es que el crecimiento del hongo en presencia de tensoactivo es mayor que en

ausencia, probablemente porque el microorganismo encuentra al hidrocarburo un poco más disponible para que

lo pueda consumir y esta hipótesis se confirma con el segundo efecto que presentó la presencia del tween en el

medio, ya que en los tratamientos que llevaban inóculo+PAH y mayor cantidad de tween, fueron los que

presentaron mayores tasas de degradación que los tratamientos que no llevaban el tween. En los tratamientos

con 1 mg/mL de tween se obtuvieron tasas de remoción del 87%, en cambio en el control sin tween, se

obtuvieron tasas de remoción del 30%




A)

B)

Fig. 7. Phe residual de tratamientos con Phe sin tween, inoculados con cepa transformante. A) Phe en micelio y B) Phe en medio de cultivo. Con estos resultados se puede concluir que si resultó ser muy necesario la adición de un tensoactivo al medio de

cultivo para promover la solubilidad del hidrocarburo, favorecer la producción de biomasa y lo más importante

aumentar las tasas de degradación de los PAHs, perfiles muy similares se presentaron para Pi, aunque se ha

observó que el crecimiento del hongo es más rápido en matraces con Pi que con Phe, esto también tiene que ver

con el potencial de oxidación de estos compuesto.

Con respecto a los intermediarios, se lograron identificar dos intermediarios para el caso del Phe se encontró 1-

fenantrol y 2-fenantrol, estos compuestos se encontraron a los 4 d de iniciado el cultivo. En el caso del Pi se

encontraron 3 intermediarios1,6-dihidroxipireno en menor cantidad, además del 1-pirenol y el 1-metoxipireno. El

1-fenantrol y el 1-pirenol pueden ser precursores de los derivados metoxilados de PAHs. Hasta ahora solo se

sabe que los grupos hidroxil de compuestos monoaromáticos ha sido reportada para hongos de pudrición blanca

como P. chrysosporium, por lo que es probable que este resultado se esté generando por la enzima MnP que

ahora produce esta cepa. Casillas y col. Ha reportado que el 1-phenanthrol y phenanthrene trans-9,10-dihidrodiol

es el mayor intermediario formado del metabolismo de Phe por A. niger.

Degradación de Pi y B(a)P en cultivo sólido.

Para determinar la degradación en cultivo sólido se realizaron cinéticas de degradación con un suelo

contaminado con PAHs con una concentración inicial de 600 ppm/g de suelo seco. La cepa que más degradó

PAHs fue la cepa transformante, en la fig. 8, se muestra la cinética de degradación de Pi y B(a)P, donde se hace

una comparación de esta cepa con la silvestre. Se observó que a partir de los 4 días la cepa transformante ya




había degradado alrededor del 55-65% de los dos PAHs sin embargo, la cepa silvestre al mismo tiempo de

análisis también presentó una remoción del 50% pero solo del Pi, ya que el B(a)P no pudo ser degradado por

esta cepa ya que a los 14 días de incubación solo presentó un 10-15% de porcentaje de degradación. Aunque la

cepa transformante fue capaz de metabolizar ambos hidrocarburos, también la degradación del B(a)P fue menor

con respecto al Pi, ya que esta cepa fue capaz de degradar el 68% del B(a)P adicionado al cultivo (Fig.9).

Fig. 9. Cinética de degradación de Pi y B(a)P por la cepa transformante y silvestre en

cultivo sólido

Las mayores tasas de degradación de la cepa transformante pueden deberse por la secreción al medio de la

enzima recombinante MnP que está produciendo la cepa por la modificación que se realizó, este resultado es

muy importante, ya que se ha demostrado que la expresión heteróloga del gen mnp1 en la cepa de A. niger. Al

igual de lo que pasó en cultivo superficial donde el B(a)P no presentó diferencia significativa en el crecimiento

radial conforme aumentó la concentración del hidrocarburo, las cinéticas de CO2 para medir la actividad

metabólica del microorganismo mostraron un comportamiento similar, ya que comparado la producción de CO2

con el control sin B(a)P, no presentaron diferencias significativas. Lo mismo ocurrió con la cepa silvestre, no

presentó diferencia significativas en la actividad metabólica con respecto al control sin B(a)P, esto nos lleva a la

conclusión de que tanto la cepa silvestre como la transformante son capaces de tolerar altas concentraciones de

este hidrocarburo pero la diferencia entre la silvestre y la transformante es que la transformante ha adquirido la





capacidad de degradar más eficientemente este compuesto, por lo que la modificación genética que ha sufrido

esta cepa ha mejorado notablemente sus capacidades para degradar compuestos tóxicos.

CONCLUSIONES. Las dos cepas son capaces de tolerar altas concentraciones de PAHs en cultivo superficial de Pi y B(a)P.

Las dos cepas presentaron diferencias significativas en la velocidad de crecimiento radial en presencia de Phe y

de una mezcla de PAHs en cultivo superficial, obteniéndose un efecto más tóxico en la cepa silvestre que en la

transformante.

Se observó una inhibición de la esporulación de las dos cepas por la presencia de Phe y mezcla de PAHs en

cultivo superficial.

Se lograron estandarizar las condiciones para la identificación de los intermediarios formados durante la

degradación de Phe y Pi en cultivo sumergido, observándose que la adición de tween 80 al medio de cultivo

favorece la solubilidad del hidrocarburo, el crecimiento del microorganismo y la degradación de los PAHs.

Si identificaron como intemediarios principales al 1-fenantrol y el 1-pirenol que son los precursores para los

derivados metoxilados de estos PAHs.

Se obtuvieron altas tasas de degradación de Pi y B(a)P por la cepa transformante en comparación con la

silvestre.

El B(a)P no fue degradado en su totalidad por la cepa silvestre, aunque no se presentó diferencia significativa en

la actividad metabólica de las dos cepas en cultivo sólido por la presencia de B(a)P.

IMPACTO. La cepa de A. niger transformante es capaz de tolerar altas concentraciones de PAHs y además adquirió la

capacidad de degradar más eficientemente que la cepa silvestre en cultivo sólido, con este resultado se cumple

con las hipótesis planteadas en este trabajo, por lo que, esta cepa es una alternativa para la biorremediación de

suelos contaminados con PAHs en cultivo sólido hasta posiblemente su mineralización evitando la formación de

intermediarios que puedan resultar más tóxicos que el compuesto original, además de que es una cepa de

crecimiento rápido que no sería desplazada por la microflora autóctona del sitio, ya que es su habitat. Es

necesario realizar estudios de degradación con esta cepa de una mezcla de PAHs para posteriormente

evaluarla con suelos reales con la finalidad de en un futuro pueda aplicarse in situ para la remedición de suelos

contaminado.

INFORME FINAL DE PROYECTO SIP - SAPPI

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Transcript of INFORME FINAL DE PROYECTO SIP - SAPPI