INFORME EJECUTIVO DE PROYECTO

I.1 Código y título del Programa Nacional de Ciencia e Innovación Tecnológica

Código: _DB 25 PRCT Diversidad Biológica

I.2 Titulo del proyecto:

“Selección de una colección de hongos Basidiomicetos de la Podredumbre Blanca para la biodegradación de colorantes industriales y otros xenobióticos”

I.3 Nombre y dirección de la Institución Ejecutora Principal del proyecto organismo,

dirección, fax, telef. E-mail Facultad de Biología, Universidad de la Habana (UH). 25 y J, Vedado. Ciudad Habana. Fax: 832-1321 Telef: 832-1321 e-mail: aotazo@fbio.uh.cu

I.4 Nombres y apellidos, grado y categoría científica e institución del jefe del proyecto

Dr. Miguel Ramos Leal Dr. en Ciencias Biológicas Investigador Titular. Dpto. Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de la Habana (UH). 25 y J, Vedado. Ciudad Habana. e-mail: ramosleal@fbio.uh.cu Telef: 836-7941

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Introducción.

El empleo de los Hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca (HPB) se ha convertido en los últimos 20 años en una de las alternativas más empleadas para disminuir las contaminaciones ambientales causadas por diferentes compuestos orgánicos persistentes (COPs), desde residuos de cosechas agrícolas hasta xenobióticos creados por el hombre. Todos estos compuestos de carácter lignocelulósico, son muy complejos, difíciles de degradar y causan serios problemas de contaminación ambiental, que se agravan con el tiempo. Los HPB aprovechan la producción de un grupo de enzimas ligninolíticas, que son sustrato- inespecíficas y pueden degradar no solamente la lignina del tejido vegetal, sino también estos COPs, entre ellos compuestos xenobióticos como: fenoles, hidrocarburos policíclicos aromáticos y colorantes (Awaluddin et al., 2001).Aunque hay varios grupos de enzimas que intervienen en la biotransformación, las enzimas ligninolíticas principales son un “tándem” compuesto por la lignina –peroxidasa (LiP), la peroxidasa dependiente de Manganeso o Manganeso – peroxidasa (MnP) y la lacasa (Lcc). Resultados previos han demostrado que las cepas empleadas en este proyecto, no son capaces de producir LiP. Los colorantes sintéticos tienen gran aplicación en diferentes sectores industriales entre los que se destacan: el teñido textil, la elaboración de alimentos, la impresión en papel y la fotografía a color. Debido a esto, la producción mundial es de aproximadamente 700 000 toneladas anuales. De ellas, se descargan al ambiente entre un 10 y un 15 %, fundamentalmente por la industria textil y la encargada de elaborar los colorantes. Su biotransformación puede producir productos tóxicos, mutagénicos y/o carcinogénicos. Este hecho ha causado que se dicten leyes que exigen la remoción de los colorantes de los efluentes industriales y que cada vez éstas cobren más fuerza (Robinson et al., 2000). Debido a lo antes expuesto, nos trazamos como objetivo general: Aislar y seleccionar cepas de basidiomicetos de la podredumbre blanca con capacidad para decolorar tintes empleados en la industria textil, así como determinar la influencia de diferentes factores sobre dicha capacidad. Para darle cumplimiento, se trazaron 10 objetivos específicos, que tendrán explicación a lo largo de este documento. Materiales y Métodos.

Objetivo 1.- Aislar e identificar taxonómicamente un grupo de cepas nativas de una colección de hongos Basidiomicetos ligninolíticos.

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Microorganismos.

Se aislaron 30 cepas autóctonas de basidiomicetos. También se utilizaron las cepas Trametes membranacea (B-1), Lentinus hirtus (B-8) y Pleurotus djamor (B-9) aisladas en el Jardín Botánico Nacional (Rojas, 2002).

Medios de cultivo.

Se empleó el medio de cultivo Kimura (1990), compuesto por 20 g.L-1 Glucosa, 5 g.L-1

Peptona bacteriológica, 2 g.L-1 Extracto de levadura, 1 g.L-1 KH2PO4, 0,5 g.L-1

MgSO4.7H2O, pH= 5,5 Las colectas se realizaron en los municipios Diez de Octubre, Plaza de la Revolución y la Lisa de la Ciudad de La Habana y en la zona de Topes de Collantes, Sancti Spiritus, en el período comprendido entre los meses de abril y junio del 2002. Los cuerpos de fructificación de cada una de las cepas se tomaron de árboles presentes en zonas húmedas y de restos de troncos en descomposición. Para ello se utilizaron pinzas y cuchillo para remover el sustrato y sobres para depositar y transportar las muestras. Se anotaron datos sobre la ecología del microhábitat de los hongos. Identificación. La identificación se realizó describiendo las fructificaciones teniendo en cuenta los siguientes aspectos: - Forma, dimensión, color y ornamentación del cuerpo fructífero; - Forma, diámetro, color y ornamentación del píleo. - Forma y color del himenóforo. - Color, diámetro, posición respecto al eje central y ornamentación del estípite. - Cambio de color de cualquiera de las pares al maltratarse. - Color de la esporada. - Longitud, forma y color de algunas estructuras microscópicas como esporas y basidios, - presencia o ausencia de cistidios en el himenio.

La esporada se obtuvo colocando el píleo sobre un papel con una parte blanca y la otra negra, con el himenóforo haciendo contacto con el mismo. Se realizaron cortes longitudinales y transversales a partir de los cuales se confeccionaron preparaciones microscópicas que permitieron la observación de caracteres tales como esporas, hifas y cistidios de algunos ejemplares. Las observaciones se realizaron con un microcopio óptico Novex con un aumento máximo de 1000 X y con un microscopio estereoscopio. Con los datos anteriores y el empleo de las Claves para la Identificación de los Macromicetos de Cuba (Kreisel, 1971) y Agaricales de las Antillas Menores (Pegler, 1983), se llevó a cabo la identificación de los hongos. Para la clasificación supragenérica se utilizaron las referencias de Minter, Rodríguez y Mena (2000) y Kirk et al. (2001). La siembra en placa se efectuó al eliminar la superficie del basidiocarpo y se tomaron porciones de la trama del cuerpo de fructificación que se sembraron en agar extracto de

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malta. Las placas fueron incubadas por 7 días a 30ºC. La pureza de los cultivos se chequeó periódicamente. Los inóculos se realizaron con dos porciones de micelio (5 mm de diámetro) de cultivos crecidos 7 días sobre placas con agar extracto de malta. Objetivo 2. Analizar la capacidad degradativa en Fermentación en estado sólido La fermentación en estado sólido se realizó en erlenmeyes de 100mL de capacidad, que contenían 4g de bagazo (diámetro de partícula de 1.6 mm), 0.25 % (w /v) (NH4)2SO4 y 70 % humedad. Este medio se esterilizó en autoclave a 121 oC por 30 min. Todos los frascos se inocularon con dos fragmentos de agar (5x5mm) a partir del borde con crecimiento activo en la placa. Después de separar el bagazo, se resuspendió en 32 mL de un tampón Tris tartrato de sodio (10m mol, pH 5) e incubado en zaranda orbital por 1 h. Luego se filtró y centrifugó a 4000 r.min-1 para separar las enzimas extracelulares. Objetivo 3. Seleccionar la(s) cepa(s) de Basidiomicetos ligninolíticos con mayor capacidad para degradar la lignina, el bagazo, decolorar tintes industriales y transformar otros COPs. Se emplearon erlenmeyers de 100 mL de capacidad a los que se le adicionaron 20 mL de medio Kimura con una concentración de 0.01 % de los colorantes reactivos: Cibacron marino FN-B, Cibacron rojo FN-3G y Cibacron amarillo P-6GS, agregados de manera independiente (estos compuestos fueron suministrados gentilmente por la compañía CIBA). Los recipientes fueron inoculados e incubados en zaranda MLW por 20 d a 30ºC. Como controles se utilizaron erlenmeyers con medio Kimura sin colorante y erlenmeyers con medio estéril con colorante. Se realizaron tres réplicas por cada variante.

Determinación de la influencia del pH en la decoloración.

A las diferentes variantes de medios de cultivos estériles con colorantes se les varió el pH

en el rango de de 2 a 12 y se observó si hubo variación en el color de los medios.

Objetivo 4. Determinar la influencia de compuestos auxiliares, utilizados en la industria textil, sobre la(s) cepa(s) con mayor capacidad decolorante.

Se estudió la influencia de diferentes auxiliares utilizados en la industria textil durante los procesos de descrude y blanqueo de la tela, teñido y enjuague. Los compuestos Dekol, Bublex H14, Hispogal Jet, Tinoclarit y Na2SO4, fueron donados amablemente por el Centro de Investigaciones Textiles (CITEX). En este caso se emplearon solamente las cepas seleccionadas por su mayor capacidad decolorante frente a los tres colorantes industriales. El experimento se desarrolló según se describe en el acápite anterior. Como medio basal se utilizó el medio Kimura con el colorante Cibacron rojo FN-3G (0.014%) al que se le añadió cada uno de los auxiliares textiles por separado y luego el conjunto de ellos (tabla I).

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Tabla I.- Variantes de medios de cultivo utilizadas para determinar la influencia de los auxiliares textiles sobre las cepas con mayor capacidad decolorante.

Variante Medio basal + auxiliar textil

Concentración del auxiliar textil (%)

I Dekol 0.004

II Bublex H14 0.003

III Hispogal Jet 0.01

IV Tinoclarit 0.001

V Na2SO4 0.9

VI Todos los

auxiliares

Con idéntica

concentración que en

las variantes

anteriores.

Objetivo 5. Realizar un estudio cinético de la producción de las enzimas ligninolíticas en presencia y ausencia de colorantes y auxiliares textiles.

El experimento se llevó a cabo usando las variantes que se muestran en la tabla II.

Tabla II.- Variantes de medios de cultivo utilizadas en el estudio cinético.

Variante Composición del medio de cultivo

I Medio Kimura

II Medio Kimura + Cibacron marino FN-B (0.014%)

III Medio Kimura + Cibacron rojo FN-3G (0.014%)

IV Medio Kimura + Cibacron amarillo P-6GS (0.014%)

V Medio Kimura + Cibacron marino (0.0047 %), Cibacron

rojo (0.0047 %), Cibacron amarillo (0.0047 %), Dekol

(0.004 %), Bublex H14 (0.003 %), Hispogal Jet (0.01

%), Tinocalrit (0.001 %), Na2SO4 (0.9 %).

Se tomaron muestras cada 4 días a las que se les determinó: peso seco de la biomasa, % de decoloración, actividad lacasa y actividad manganeso peroxidasa.

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Objetivo 6. Análisis de la toxicidad de los productos de la degradación causada por los HPB con el empleo de arroz (Oryza sativa L.) como modelo de estudio. La prueba de fitotoxicidad de los colorantes se realizó con el empleo de semillas de Oryza sativa como modelo de estudio, según el procedimiento informado por Telke et al. (2008). Se empleó la variedad de arroz J-104. Primeramente se realizó la desinfección de las semillas. Este procedimiento consistió en lavados con soluciones de Tween 80 (0,25 %v/v), Alcohol 70 % y Tween 80 con 10 ml de NaHCl2, durante 5, 1 y 20 min respectivamente. Por último se realizaron 4 enjuagues con agua destilada duante 1 min cada uno. Se colocaron 10 semillas en placas petri con papel de filtro Whatman 1, a las que se le adicionó 2 mL de las soluciones de los diferentes colorantes en las concentraciones de 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 y 0,75% (p/v). Como control negativo se empleó agua destilada para la germinación de las semillas y como control positivo, una solución de azida sódica (325 µg.mL-1). Cada 48 horas se adicionó 1 mL de la solución de colorante, agua o azida sódica correspondiente a cada tratamiento para mantener las condiciones de cámara húmeda. Se emplearon tres réplicas por variante. Luego de 7 días de incubación a temperatura ambiente se determinó el porcentaje de germinación y las longitudes de la plúmula y la radícula. Con estos valores se realizó el cálculo de la dosis inhibitoria media de los colorantes para el crecimiento de la radícula y la plúmula. con el empleo de cebolla (Allium cepa L.) como modelo biológico. La toxicidad de los colorantes se evaluó mediante el empleo de bulbos de Allium cepa L de la variedad Red creole como modelo de estudio. El procedimiento empleado fue descrito previamente por Ma y Xu, (1986). Previo al montaje de la prueba, los bulbos se limpiaron eliminando la epidermis seca y removiendo, con un bisturí los restos de tejido y raíces del área radicular. Se realizó el proceso desinfección con solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 15 minutos y se realizaron tres lavados con abundante agua. Luego se colocaron los bulbos en tubos con agua dura o corriente a temperatura ambiente por seis días. Previo al tratamiento se realizó el conteo de raíces y se determinó la longitud de cada una con un pie de rey. Después, los bulbos se transfirieron a tubos con las muestras (diferentes concentraciones de colorantes), un control positivo con azida sódica 325 µg.mL-1 y como control negativo agua corriente. Se emplearon tres réplicas por cada variante. La incubación se realizó durante 48 horas a temperatura ambiente. Finalizado este período se determinó nuevamente la longitud de las raíces. Con estos valores se realizó el cálculo de la dosis inhibitoria media para el crecimiento de la raíz Objetivo 7. Analizar los patrones de amplificación mediante PCR de los genes ribosomales 5,8S

Para la amplificación de los fragmentos de genes que codifican para la región ITS 5,8 S se partió del ADN aislado previamente. En la tabla 3 se describen las secuencias de los oligonucleótidos empleados.

Tabla 3. Secuencia de los cebadores utilizados en la PCR.

CÓDIGO SECUENCIA

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ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GAT A ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG

El PCR se realizó con volumen total de 50 µl. Cada tubo de reacción contenía aproximadamente 1 µl de muestra de ADN a 1 ng/µl, 5 µl de buffer PCR 10X, 36.6 µl de agua destilada, 2 µl de cada desoxinucleótido trifosfato de 1.25 mM, 2 µl de MgCl2 de 10 mM, 2 µl de cada uno de los cebadores de 10 µM y 0.4 µl de Taq (5 U/µl). Dos gotas de aceite mineral se colocaron en la superficie de cada mezcla de reacción antes del ciclo térmico. El marcador de peso molecular empleado fue el TM DNA ladder (Massruler) de 100 pares de bases. Los parámetros del ciclo fueron: desnaturalización inicial a 96 °C por 2 minutos seguido de 35 ciclos con una desnaturalización a 96 °C por 1 minuto, alineamiento a 55 °C por 1 minuto y elongación a 72 °C por 2 minutos. Al finalizar se realizó una elongación final a 72 °C por 10 minutos. Para chequear el producto amplificado de la PCR se realizó electroforesis submarina, utilizando cámara PHARMACIA BIOTECH EPS 2000, en un gel de agarosa (Agarose- LE ultrapuro) al 2% con tampón TBE 1X, teñido con bromuro de etidio (100 ng/mL). Se visualizó el producto amplificado a través de un transiluminador de luz ultravioleta y se fotografió posteriormente. Objetivo 8. Amplificar el gen lacasa mediante PCR Objetivo 9. Evaluar la acción de los HPB sobre un efluente simulado y un efluente textil real.

Se determinó el espectro UV-visible del medio Kimura suplementado con el efluente en estudio y de la biotransformación de este por las cepas seleccionadas y el estiércol de ganado vacuno a los 21 días de incubados los cultivos Objetivo 10. Ensayar tratamiento sobre otros COPs (DDT) Determinaciones analíticas.

Peso seco.

El cultivo se filtró a través de papel de filtro Whatman No.1 previamente tarado y se mantuvo durante 24 horas a 80ºC en estufa hasta peso constante. El peso de la biomasa se determinó gravimétricamente.

Determinación de pH.

Para determinar el pH final del filtrado se realizaron mediciones en un pHmetro Pracitronic.

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Porcentaje de decoloración.

Al caldo de cultivo y a los controles con colorante se le determinó la absorbancia a 420, 500 y 584 nm (máximos de absorción de los colorantes Cibacron amarillo P-6GS, Cibacron rojo FN-3G y Cibacron marino FN-B respectivamente). A partir de estos valores se calculó el porcentaje de decoloración según la fórmula: % de decoloración = 100 - 100* DOMUESTRA/ DOCONTROL

Donde: DO muestra: DO del caldo de cultivo filtrado

DO control: DO del medio de cultivo estéril con colorante

Actividad Manganeso Peroxidasa.

Se efectuó según la técnica descrita por Rojas (2002). El MnSO4 es oxidado directamente por la MnP en una mezcla de reacción compuesta por 0,1 mmol/L de MnSO4 y 0,1 mmol/L deH2O2 en tampón tartrato (0,1 mol/L), pH= 5. El producto formado Mn3+-tartrato, es un complejo estable, (є238=6,500 M-1 cm-1). Actividad Lacasa.

Se realizó según la técnica descrita por Muñoz et al, (1997). En la determinación se empleó tampón acetato de sodio (0,1 mol/L), pH=5, 10 mmol/L de ABTS [2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), (є436=29,300 M-1 cm-1).

Procesamiento Estadístico.

Antes de realizar el análisis estadístico de los datos, se comprobó la normalidad y la homogeneidad de varianza, mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Bartlett respectivamente. En el caso de los datos que cumplieron con las dos premisas anteriores, se empleó un análisis de varianza de clasificación simple y para comparar las medias se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan, en los casos contrarios se utilizaron las pruebas de Kruskal-Wallis y la de Student-Newman-Keuls (SNK) (Sigarroa,1985). Para determinar la existencia o no de relación directa entre el crecimiento de la biomasa y los porcentajes de decoloración alcanzados se utilizó el análisis de correlación de Spearman (Sigarroa,1985). Los datos fueron procesados con el paquete estadístico Tonystat. Con los porcentajes de decoloración de los tres tintes industriales que alcanzaron las diferentes cepas, se realizó un análisis de conglomerados (Cluster), a partir de una matriz de distancias Euclidianas. Para ello se utilizó el paquete estadístico SPSS 8.0

Resultados y Discusión. Aislamiento e identificación de basidiomicetos de la podredumbre blanca. La colecta se encaminó a la obtención de cuerpos de fructificación a partir de árboles o restos de troncos en descomposición, lugares donde es muy probable la existencia de basidiomicetos ligninolíticos. Como resultado de este trabajo se aislaron 30 cepas de hongos de la podredumbre blanca en cultivos puros (tabla III).

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Tabla III.- Resumen de la ubicación taxonómica de los hongos de la podredumbre blanca colectados. Cepa Especie Familia Orden B-15

Hexagonia hydnoides Polyporaceae Polyporales B-16 B-17 B-18

Ganoderma zonatum Ganodermataceae Polyporales

B-19 B-20 B-21 B-22 B-23 B-24 Pycnoporus sanguineus Polyporaceae Polyporales B-25 B-26 Lentinus tigrinus

Polyporaceae Polyporales

B-27

Lentinus hirtus

B-28 B-29 B-30 B-31 B-32 B-33 B-34 Panus crinitus B-35 Pleurotus smithii

Pleurotaceae

Agaricales B-36 Pleurotus djamor

B-37 Coriolopsis floccosa Polyporaceae Polyporales B-38

B-39 B-40 Oudemansiella canarii Marasmiaceae Agaricales B-41 B-42

Lenzites elegans Polyporaceae Polyporales B-43 B-44 Contar con estas cepas resulta de gran importancia por las múltiples aplicaciones que los hongos de la podredumbre blanca pueden tener. Además, el hecho de que estas sean autóctonas y se encuentren adaptadas a nuestro clima, pudiera facilitar la aplicación de alguna de ellas en sistemas de tratamiento a gran escala donde generalmente no existe un gran control de los factores abióticos sobre el proceso. Objetivo 2. Analizar la capacidad degradativa en Fermentación en estado sólido (FES) El empleo del bagazo mostró la capacidad de este sustrato de inducir la síntesis de las enzimas lacasa y MnP. Las cepas Earliella scabrosa(7), Trametes maxima(13) y

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Ganoderma zonatum(B-18) pudieron crecer y producir las enzimas ligninolíticas en fermentación sólida, usando bagazo de caña de azúcar como única fuente de carbono Fig. 6. A) Cinética de la producción de enzimas ligninolíticas y (B) Decoloración de las cepas: a) Earliella scabrosa, b) Trametes maxima and c) Ganoderma zonatum crecidas en Lecho sólido durante 21 d.

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Objetivo 3. Seleccionar la(s) cepa(s) de Basidiomicetos ligninolíticos con mayor capacidad para degradar la lignina, el bagazo, decolorar tintes industriales y transformar otros COPs. La realización de un pesquisaje con una apropiada cantidad de microorganismos es una de las metodologías que se pueden llevar a cabo para obtener cepas con las características deseadas que permitan resolver una determinada problemática (Crueger y Crueger, 1990). En este caso, el interés fundamental es seleccionar cepas con buena capacidad para decolorar tintes industriales. En este trabajo, se utilizaron los colorantes reactivos de tipo azóico: Cibacron marino FN-B, Cibacron rojo FN-3G y Cibacron amarillo P-6GS, que son producidos por la compañía CIBA. Esta selección estuvo basada en que alrededor del 50 al 70% de los colorantes que se producen en el mundo son de tipo azóico (Carliell et al., 1995), de ahí que sean los que predominen en los efluentes industriales y provoquen mayores problemas ambientales, sobre todo porque pueden ser reducidos bajo condiciones de anaerobiosis en sedimentos y en el intestino, dando lugar a la formación de aminas tóxicas y carcinogénicas (Banat et al., 1996). Dentro de este grupo de tintes se ha informado que los colorantes reactivos son de los compuestos más problemáticos en los efluentes textiles porque generalmente pasan a través de los tratamientos convencionales sin ser modificados (Carliell et al., 1994, 1996; Willmott et al., 1998). Decoloración del tinte industrial Cibacron marino FN-B. Todas las cepas de basidiomicetos empleadas fueron capaces de crecer en presencia del compuesto Cibacron marino FN-B y la biomasa de16 de ellas presentó una coloración azul grisosa una vez culminado el tiempo de incubación. En la figura 6 se muestran los cultivos de 9 de las cepas más representativas, luego de crecer 20 días en medio Kimura líquido con dicho colorante. Se puede apreciar a simple vista la gran disminución de la coloración del medio de cultivo provocada por las cepas con elevada capacidad decolorante (H. hydnoides B-16, G. zonatum B-18, B-23, P. sanguineus B-25, P. djamor B-36 y C. floccosa B-37). En el caso de las cepas L. hirtus B-27, P. smithii B-35 y L. elegans B-42, que no presentaron buena capacidad para decolorar este tinte, el color del medio resultó muy similar al del control. En la figura 7 se observa el crecimiento y los porcentajes de decoloración del compuesto Cibacron marino FN-B alcanzados por las 33 cepas de basidiomicetos. Todas las cepas fueron capaces de decolorar este compuesto y de ellas 16 alcanzaron más del 70% de decoloración.

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Cepas

% decoloración

peso seco biomasa (g/L)

Figura 7.- Crecimiento y porcentajes de decoloración obtenidos por las cepas de basidiomicetos de la podredumbre blanca, luego de 20 días de incubación en medio Kimura con 0.01% del colorante Cibacron marino FN-B.

El análisis estadístico evidenció que existen diferencias significativas (p<0.05) entre los porcentajes de decoloración obtenidos por las cepas estudiadas. La que mayor capacidad decolorante presentó fue P. sanguineus B-25 con un 94.9% de decoloración, seguida por las cepas G. zonatum B-21, B-22 y B-23 (con 92.2, 91.7 y 91.6% de decoloración respectivamente). A continuación se encuentra el grupo de H. hydnoides B-17 (87.1% de decoloración), G. zonatum B-20 (87.8 % de decoloración) y C. floccosa B-37 (87.6% de decoloración). Seguidamente está el conjunto formado por las cepas G. zonatum B-18, B19, O.canarii B-40 y B-41, que alcanzaron 77.9%, 76.1%, 78.6% y 77.2% de decoloración respectivamente y luego se encuentran las cepas L. hirtus B-30 (73.8% decoloración), B-32 (72.2% decoloración) y P. djamor B-36 (70.4% decoloración). P. smithii B-35 y P. djamor B-9, fueron las cepas que presentaron menor capacidad para decolorar el Cibacron marino FN-B, decolorando sólo el 16.8% y el 14% de este compuesto respectivamente. Un resultado interesante es que cepas de una misma especie difieren en su capacidad para decolorar este tinte. Existen diferencias significativas entre los porcentajes de decoloración alcanzados por las cepas H. hydnoides B-15, B-16 y B-17. Lo mismo ocurre con las cepas pertenecientes a las especies P. sanguineus, P. djamor, C. floccosa y L. elegans. En el caso de G. zonatum y L. hirtus, hay algunas cepas que presentan similitud en la capacidad de decolorar este compuesto y otras que difieren (figura 7). La prueba de correlación de Spearman indicó que no existe una relación directa entre el crecimiento de la biomasa y los porcentajes de decoloración obtenidos por las diferentes cepas. Esto resulta evidente al comparar las cepas P. sanguineus B-25 y P. djamor B-9, pues ambas tuvieron un crecimiento muy similar en el medio Kimura con Cibacron marino FN-B (5.1 y 5.8 g/L respectivamente), sin embargo, la primera alcanzó el mayor porcentaje de decoloración (99.4%) y la segunda fue la que presentó menor capacidad decolorante (14%). Por otra parte, P. smithii B-35, que creció prácticamente el doble que las cepas

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anteriores (10 g/L) es una de las cepas que alcanzó menores valores de decoloración, con solamente 16.8 %. Decoloración del tinte industrial Cibacron rojo FN-3G. Finalizados los 20 días de incubación, se pudo observar que todas las cepas de basidiomicetos fueron capaces de crecer en presencia del compuesto Cibacron rojo FN-3G y que con excepción de H. hydnoides B-16, la biomasa de todas presentó una coloración rojiza. En la figura 8 se puede apreciar a simple vista la gran disminución de la coloración del medio producida por algunas de las cepas que tienen mayor capacidad decolorante (H. hydnoides B-16, G. zonatum B-18, B-23, P. sanguineus B-25, P. djamor B-36 y C. floccosa B-37), a diferencia de lo que ocurre con los cultivos de las cepas L. hirtus B-27 y L. elegans B-42, en los cuales el color del medio resultó muy similar al del control. En la figura 9 se muestran los porcentajes de decoloración del compuesto Cibacron rojo FN-3G y la biomasa de las cepas empleadas. Las 33 cepas de basidiomicetos fueron capaces de decolorar este tinte, pero sólo 8 de ellas lo hicieron en más de un 70 %.

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4Cepas

% decoloración

peso seco biomasa (g/L)

Figura 9.- Crecimiento y porcentajes de decoloración obtenidos por las cepas de basidiomicetos de la podredumbre blanca, luego de 20 días de incubación en medio Kimura con 0.01% del colorante Cibacron rojo FN-3G.

Existen diferencias significativas (p<0.05) entre los porcentajes de decoloración alcanzados por las cepas de basidiomicetos. H. hydnoides B-16, G. zonatum, B-22, B-23 y C. floccosa B-37 fueron las que tuvieron mayor capacidad para decolorar el Cibacron rojo FN-3G con 85.7%, 82.9%,87.7% y 86.1% respectivamente. Seguidamente se encuentra la cepa P. sanguineus B-25 (81.7% de decoloración), que difiere significativamente del grupo anterior. Luego está la cepa G. zonatum B-18 (76.4%) y a continuación se encuentra el grupo de G. zonatum B-21 y P. djamor B-36, que alcanzaron 73.3 % y 73.2% de

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decoloración respectivamente. La cepa con menor capacidad para decolorar fue L. hirtus B-29, que decoloró sólo el 3.2% de este compuesto. Al igual que con el Cibacron marino FN-B, se puede observar que existe variabilidad entre la capacidad decolorante que tienen las cepas de una misma especie. Existen diferencias significativas entre los porcentajes de decoloración alcanzados por las cepas de H. hydnoides, P. sanguineus, L. hirtus, P. djamor y O. canarii. Dentro de las especies G. zonatum, C. floccosa y L. elegans se encuentran cepas que tienen igual capacidad de decolorar este tinte y otras que difieren (figura 9). El análisis estadístico confirmó que no existe correlación entre el crecimiento de las diferentes cepas y los porcentajes de decoloración alcanzados. De hecho se puede observar que C. floccosa B-37 y L. hirtus B-29 presentaron un crecimiento muy similar (6.3 y 6.4 g/L respectivamente) en medio Kimura con Cibacron rojo FN-3G, sin embargo, la primera se encuentra entre las cepas de mayor capacidad decolorante (86.1% de decoloración) y la segunda fue la que menos decoloró este compuesto (3.2% de decoloración). Decoloración del tinte industrial Cibacron amarillo P-6GS. Al observar los cultivos de las cepas de basidiomicetos en medio Kimura con Cibacron amarillo P-6GS se pudo apreciar que hubo crecimiento en todos los casos. Al finalizar el período de incubación la biomasa de todos los microorganismos estudiados presentó un color amarillo claro, pero no fue posible distinguir a simple vista cambios en la coloración del medio de cultivo. En la figura 10 se pueden observar la biomasa y los porcentajes de decoloración del compuesto amarillo P-6GS obtenidos por las diferentes cepas. De las 33 cepas estudiadas sólo 18 fueron capaces de decolorar este compuesto y ninguna alcanzó el 70% de decoloración. El análisis estadístico confirmó que existen diferencias significativas (p<0.05) entre los porcentajes de decoloración de las cepas analizadas. P. smithii B-35 y H. hydnoides B-16 fueron las que presentaron mayor capacidad decolorante con 48.6% y 39.6% de decoloración respectivamente. Seguidamente, están las cepas G. zonatun B-18 y C. floccosa B-39, que obtuvieron 28.2% y 33.3% de decoloración y difieren significativamente del grupo anterior. Luego se encuentra la cepa G. zonatum B-23 (26.5% de decoloración) y a continuación P. djamor B-36 con un 17.9%. También en este caso existe variabilidad entre la capacidad decolorante que presentan las cepas de una misma especie. Ésta es mucho más evidente en el caso de H. hydnoides, G. zonatum, L. hirtus, C. floccosa y L. elegans pues algunas cepas de estas especies alcanzan altos porcentajes de decoloración del compuesto Cibacron amarillo P-6GS y otras no son capaces de transformarlo. Solamente las cepas pertenecientes a las especies P. sanguineus y O.canarii, tuvieron un comportamiento similar ya que ninguna fue capaz de decolorar este compuesto (figura 10).

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b

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4

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6

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9

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1

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B-3

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6

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7

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0

B-4

1

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2

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3

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4

Cepas

% decoloración

peso seco biomasa (g/L)

Figura 10.- Crecimiento y porcentajes de decoloración obtenidos por las cepas de basidiomicetos de la podredumbre blanca, luego de 20 días de incubación en medio Kimura con 0.01% del colorante Cibacron amarillo P- 6GS. En este caso, el análisis estadístico también confirmó que no existe correlación entre el crecimiento y la decoloración alcanzada por las diferentes cepas. Se puede observar por ejemplo que la cepa H. hydnoides B-16 tuvo un crecimiento moderado (5.8 g/L) en medio Kimura con Cibacron amarillo P-6GS y se encuentra entre las cepas con mayor capacidad decolorante (36.9%). Sin embargo, cepas como H. hydnoides B-17, G. zonatum B-20, L. hirtus B-28, B-33, O. canarii B-40 y B-41, que tuvieron un mayor crecimiento en este medio (7.6, 7.2, 7.6, 7.7, 10.5 y 7.7 g/L respectivamente), no fueron capaces de decolorar este tinte industrial. Análisis general de la decoloración de tintes industriales y selección de las mejores cepas. Los hongos de la podredumbre blanca que han sido más estudiados por su potencial para decolorar efluentes industriales, son P. chrysosporium y T. versicolor (Coulibaly et al., 2003); sin embargo, en la actualidad se ha incrementado el interés por el estudio de otros basidiomicetos, no sólo para compararlos desde el punto de vista biológico, sino con la expectativa de encontrar hongos con sistemas ligninolíticos más potentes para su uso en varias aplicaciones biotecnológicas (Levin et al., 2004). En el presente trabajo se incluyeron 33 cepas autóctonas de basidiomicetos pertenecientes a 11 especies. Con excepción de P. sanguineus y L. tigrinus, no hemos encontrado informes en la literatura que hagan referencia de la capacidad decolorante de estas especies, lo que podría abrir nuevas perspectivas en la biorremediación de ecosistemas contaminados con colorantes u otros xenobióticos. Como se puede apreciar en las figuras 7, 9 y 10, el colorante Cibacron marino FN-B fue el más fácilmente transformado por las cepas de basidiomicetos ligninolíticos (48% de ellas decoloraron más del 70% de este compuesto). El tinte Cibacron rojo FN-3G tuvo un comportamiento intermedio (el 24% de las cepas lo decoloraron eficientemente). En el caso

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del Cibacron amarillo P-6GS, este resultó el de más difícil transformación, ya que ninguna cepa estudiada alcanzó el 70 % de decoloración y el 45 % de ellas no fue capaz de transformarlo. Claus et al., (2002), plantearon que la resistencia a la decoloración puede deberse a la estructura de los tintes. Aunque no contamos con las estructuras químicas de estos colorantes, por ser propiedad intelectual de la compañía CIBA, es probable que existan diferencias estructurales entre ellos que influyan en la facilidad con que las enzimas ligninolíticas, producidas por las cepas estudiadas, puedan actuar sobre estos compuestos. La capacidad ligninolítica puede variar enormemente entre las distintas especies de basidiomicetos, e incluso, entre cepas de una misma especie (Pelaez et al., 1995; Levin et al., 2004). Como las enzimas que actúan sobre la lignina son las que degradan los colorantes, la variabilidad entre los porcentajes de decoloración de las distintas especies y cepas, que se observa en las figuras 7, 9 y 10 no es sorprendente y concuerda con la diversidad encontrada por Claus et al., (2002) y Levin et al., (2004). En este trabajo se utilizaron cepas que pertenecen a una misma especie y que se aislaron en diferentes lugares; tal es el caso de G. zonatum B-20, B-21 y B-23, P. sanguineus B-24 y B-25, L. hirtus B-8, B-27, B-28 y B-31, P. djamor B-9 y B-36, entre otros. Es posible que la variabilidad que existe entre la capacidad que tienen para transformar los tres colorantes, se deba a que las condiciones ambientales hayan ejercido diferentes presiones selectivas que hayan provocado variaciones en las enzimas ligninolíticas de estos microorganismos, ya que como se ha informado, la presencia de condiciones estresantes pueden provocar cambios en los microorganismos que conducen a variaciones en las propiedades de sus enzimas, incluidas su estabilidad y especificidad (Neidleman, 1993). También cabe señalar que cepas como H. hydnoides B-16 y B-17, G. zonatum B-18, B-19 y B-22, L. hirtus B-29 y B-30, C. floccosa B-37, B-38 y B-39, L. elegans B-42, B-43 y B-44, que fueron aisladas de distintos troncos presentes en los mismos lugares, también muestran variabilidad en su capacidad decolorante. Es posible que la recombinación entre cromosomas homólogos, que tiene lugar durante la meiosis que antecede a la formación de las basidiosporas, sea la causa de la misma. Entre las cepas estudiadas también hay variabilidad entre la capacidad que tienen para transformar uno o más tintes industriales. Hay cepas que son capaces de decolorar bien los tres tintes industriales analizados, entre ellas se encuentran G. zonatum B-18 y B-23. Las cepas P. sanguineus B-25 y C. floccosa B-37, decoloran de manera eficiente los compuestos Cibacron marino FN-B y Cibacron rojo FN-3G, pero no son capaces de transformar el Cibacron amarillo P-6GS. Por otra parte tenemos cepas que decoloran preferencialmente un tinte, tal es el caso de L. hirtus B-30 y P. smithii B-35. La primera decolora bien el Cibacron marino FN-B, pero obtiene valores de decoloración muy bajos para el Cibacron rojo FN-3G y el Cibacron amarillo P-6GS y la segunda es la que más decolora el Cibacron amarillo P-6GS pero no transforma eficientemente los otros colorantes. Un comportamiento similar fue informado por Knapp et al., (1995) y pudiera estar dado por la(s) enzima(s) ligninolítica(s) que presentan estos microorganismos y la especificidad de las mismas. Muchos autores han informado que la decoloración producida por los hongos de la podredumbre blanca no se debe solamente a la acción de las enzimas ligninolíticas, sino también a la “biosorción” del colorante por la biomasa (Tatarko y Bumpus, 1998; Bustard et al., 1998; Coulibaly et al., 2003). En este trabajo, la biomasa de muchas de las cepas

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estudiadas estuvo coloreada al finalizar la fermentación (figuras 6 y 7) lo que evidencia que el proceso de biosorción tiene lugar en esta interacción. Sin embargo, el hecho de que no haya correlación entre el crecimiento de las cepas y la decoloración de los tres tintes analizados sugiere que la acción de las enzimas ligninolíticas es la principal responsable de los porcentajes de decoloración alcanzados. Este resultado coincide con lo planteado por Glenn y Gold (1983) y Levin et al. (2004) quienes obtuvieron que la biosorción del colorante a la biomasa tiene una influencia mínima en la decoloración. En la figura 11 se muestra el análisis de agrupamiento realizado a partir de los porcentajes de decoloración de los tres tintes industriales, que alcanzaron las diferentes cepas de basidiomicetos ligninolíticos. Puede apreciarse claramente la formación de tres grupos. En el A, se ubican 19 cepas que no alcanzan elevados valores de decoloración de los tres tintes industriales analizados. Dentro de este grupo aparecen dos subgrupos bien diferenciados. En el primero se encuentran las cepas H. hydnoides B-15, L. hirtus B-30, O. canarii B-41, P. sanguineus B-24, P. crinitusB-34, L. hirtus B-28, C. floccosa B-38, H. hydnoides B-17, L. elegans B-43 y B-44, que muestran mayores valores de decoloración del Cibacron marino FN-B que las cepas L. tigrinus B-26, L. hirtus B-33, B-27, B-8, B-31, L. elegans B-42, L. hirtus B-29 y P. djamor B-9, que integran el segundo subgrupo. El grupo B, está formado por las cepas H. hydnoides B-16, G. zonatum B-18, P. djamor B-36, G. zonatum B-23, B-19, L. hirtus B-32, O. canarii B-40, G. zonatum B-20, B-21, B-22, P. sanguineus B-25, C. floccosa B-37, T. membranacea B-1 y C. floccosa B-39, que alcanzan valores elevados de decoloración de los compuestos Cibacron marino FN-B y Cibacron rojo FN- 3G, pero varían en su capacidad para transformar el Cibacron amarillo P-6GS. El grupo C, está integrado solamente por la cepa P. smithii B-35. Ésta difiere grandemente del resto de las cepas pues es la que más decolora el Cibacron amarillo P-6GS, pero no presenta buena capacidad para decolorar los otros tintes ensayados. El subgrupo formado por G. zonatum B-18, P. djamor B-36 y G. zonatum B-23, que se encuentra dentro del grupo B, incluye a las cepas que obtuvieron mayores porcentajes de decoloración de los tres tintes industriales. Como los efluentes de la industria textil presentan una composición muy variable y en ellos generalmente se pueden encontrar mezclas de colorantes (Correia et al., 1994), las cepas que presentan mayor capacidad para decolorar un mayor número de tintes son las que resultan más promisorias para una posible aplicación en el tratamiento de las aguas residuales de esta industria (Knapp et al., 1995; Rodríguez et al, 1999).

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Figure 11.- Análisis de agrupamiento (cluster) obtenido a partir de los porcentajes de decoloración de los tres tintes industriales, usando las cepas de basidiomcetos.

Determinación de la influencia del pH en la decoloración de los tintes industriales. Para determinar si las variaciones en el pH influyen en la decoloración, a los medios de cultivo estériles con los colorantes industriales, se les varió el pH en el rango de 2-12 y no se observó variación en el color de los mismos. El pH de los distintos cultivos al finalizar la fermentación tomó valores entre 4.12 y 8.47. Como estos valores se encuentran dentro del rango en el cual se mantiene la estabilidad del color en los medios de cultivo, se puede inferir que los porcentajes de decoloración obtenidos se deben a la acción de los microorganismos y sus enzimas y no a las variaciones del pH que ocurren producto del metabolismo microbiano.

Strains Specie Strains Specie B-1 T. membranacea B-34 P. crinitus B-15 a B-17 H. hydnoides B-35 P. smithii B-18 a B-23 G. zonatum B-36, B-9 P. djamor B-24, B-25 P. sanguineus B-37 a B-39 C. floccosa B-26 L. tigrinus B-40 y B-41 O. canarii B-27 a B-33 y B-8 L. hirtus B-42 a B-44 L. elegans

18

Objetivo 4. Determinar la influencia de compuestos auxiliares, utilizados en la industria textil, sobre la(s) cepa(s) con mayor capacidad decolorante. En los efluentes textiles, además de los colorantes, están presentes sales, agentes quelantes, surfactantes, etc. (Wesenberg et al., 2003). Debido a ello, resulta de interés conocer el efecto de estos auxiliares sobre los microorganismos que potencialmente puedan ser aplicados en el tratamiento de estas aguas residuales. En este experimento, se utilizó el colorante Cibacron rojo FN-3G. La selección estuvo motivada por el hecho de que este compuesto obtuvo un comportamiento intermedio en cuanto a la facilidad con que fue transformado por las cepas de basidiomicetos. La concentración de este tinte en el medio de cultivo, se incrementó a 0.014%. Este valor y las concentraciones de los auxiliares textiles empleados, son valores aproximados de las concentraciones máximas de estas sustancias en los efluentes de la industria textil. En la figura 12 podemos apreciar el efecto de cada uno de los auxiliares textiles así como del conjunto de ellos, sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de la cepa G. zonatum B-18.

cepa B-18

ba

bbbba

a'a'a'a'a'a'a'a'

0

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60

80

100

Medio

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K+ C. rojo

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l)

contro

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ublex H

14

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contro

l + Ti

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contro

l + N

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contro

l + D

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contro

l + to

dos

variantes

% decoloraciónpeso seco biomasa (g/L)

Figura 12.- Efecto de los diferentes auxiliares empleados en la industria textil sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de la cepa G. zonatum B-18. El análisis estadístico permite afirmar que los auxiliares textiles no afectaron el crecimiento de la cepa G.zonatum B-18, ya que no existen diferencias significativas entre los valores de peso seco de la biomasa alcanzados en las diferentes variantes de medios de cultivo. Existen diferencias significativas (p<0.05) entre los porcentajes de decoloración que alcanza esta cepa en los diferentes medios de cultivo. La decoloración que obtuvo en la

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variante con medio Kimura + Cibacron rojo FN-3G (control), no difiere estadísticamente del valor que alcanzó cuando está presente el Dekol en el medio de cultivo, o sea, que este compuesto no afectó la capacidad decolorante del microorganismo. Sin embargo, en las variantes en que se adicionó Bublex H14, Hipogal Jet, Tinoclarit, Na2SO4 y el conjunto de auxiliares textiles, si hubo afectación de la capacidad de la cepa para transformar el colorante industrial ya que ocurrió una disminución de los porcentajes de decoloración con respecto al control. Es necesario señalar que la presencia de todos los auxiliares textiles no causó mayor afectación en la capacidad de decoloración de este microorganismo, que la ocurrida cuando se adicionó al medio los auxiliares de manera independiente. En la figura 13 se muestra el efecto de los diferentes auxiliares textiles y del conjunto de ellos sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de G. zonatum B-23.

cepa B-23

a ac

a a b

d

c'b'a'b'b'c'a'b' a'b' a'b'

0

20

40

60

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100

Medio

Kimura

(K)

K+ C. rojo

FN-3

G (contro

l)

contro

l + B

ublex H

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contro

l + H

ispogal

contro

l + Ti

noclarit

contro

l + N

a2SO4

contro

l + D

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contro

l + to

dos

variantes

% decoloraciónpeso seco biomasa (g/L)

Figura 13.- Efecto de los diferentes auxiliares empleados en la industria textil sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de la cepa G. zonatum B-23. En este caso, existen diferencias significativas (p<0.05) entre los porcentajes de decoloración que alcanzó G. zonatum B-23 en las distintas variantes de medio de cultivo y, además, entre los valores de peso seco de la biomasa. La decoloración que mostró esta cepa en el medio control (Kimura + Cibacron rojo FN-3G) no difiere estadísticamente de la que alcanzó cuando se le adicionó al medio Bublex H14, Tinoclarit o Na2SO4, o sea, que ninguno de estos compuestos afectó la capacidad que tiene este microorganismo de decolorar el Cibacron rojo FN-3G. La adición de estos compuestos auxiliares tampoco afectó el crecimiento de la biomasa. En presencia de Hispogal Jet y Dekol disminuyó solamente la capacidad de decoloración de la cepa, siendo el primero de estos compuestos el que provocó una mayor afectación

20

Cuando G. zonatum B-23 se cultivó en presencia de todos los auxiliares, manifestó una afectación mucho más brusca. Su crecimiento fue mucho menor y sólo alcanzó 56,7% de decoloración. Es probable que la combinación del Hispogal Jet y el Dekol, compuestos que afectaron esta cepa de manera independiente, sea mucho más tóxica para este microorganismo. En la figura 14 se puede apreciar el efecto de cada uno de los auxiliares textiles y del conjunto de ellos sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de la cepa P. djamor B-36.

cepa B-36

aab

ab

aa

a'a'a'a'a'a'a'a'

0

20

40

60

80

100

Medio

Kimura

(K)

K+ C. rojo

FN-3

G (contro

l)

contro

l + B

ublex H

14

contro

l + H

ispogal

contro

l + Ti

noclarit

contro

l + N

a2SO4

contro

l + D

ekol

contro

l + to

dos

variantes

% decoloraciónpeso seco biomasa (g/L)

Figura 14.- Efecto de los diferentes auxiliares empleados en la industria textil sobre el crecimiento y la capacidad decolorante de la cepa P.djamor B-36. El análisis estadístico evidenció que el crecimiento de la cepa P. djamor B-36 no fue afectado por ninguno de los auxiliares textiles ni por la presencia del conjunto de ellos ya que no se obtienen diferencias significativas entre los valores de peso seco de la biomasa en las distintas variantes de cultivo. Existen diferencias significativas (p< 0.05) entre los porcentajes de decoloración obtenidos por este microorganismo en los diferentes medios de cultivo. La decoloración que alcanzó esta cepa en el medio control (Kimura + Cibacron rojo FN-3G) no difiere estadísticamente de la que obtuvo en los medios con Bublex H14, Tinoclarit, Dekol y el conjunto de los auxiliares textiles. Sin embargo, en las variantes en que se adicionó Hispogal Jet y Na2SO4, los porcentajes de decoloración disminuyeron a 66.4% y 64.3% respectivamente. La presencia de todos los auxiliares textiles, no afectó la capacidad decolorante de este microorganismo, aún cuando estaban presentes el Hispogal Jet y Na2SO4, que disminuyeron los porcentajes de decoloración cuando se adicionaron al medio de manera independiente. Es probable que alguno(s) de los auxiliares que no afectan la capacidad

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decolorante de este microorganismo, proteja(n) las enzimas ligninolíticas del efecto tóxico del Hispogal Jet y el Na2SO4. Al comparar las figuras 12, 13 y 14, se observa que el efecto de los distintos auxiliares textiles, varía en las diferentes cepas. Bublex H14 y Tinoclarit sólo disminuyeron la capacidad decolorante de G. zonatum B-18. Hispogal Jet afectó dicha capacidad en las tres cepas estudiadas. Dekol solamente afectó la decoloración de G. zonatum B-23. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Abadulla et al., (2000) y Wesenberg et al. (2003), quienes plantearon que ciertos detergentes presentes en los efluentes textiles inhibieron en un 20% la capacidad de decoloración de Polyporus sp. y de Trametes villosa, mientras que la cepa Schizophyllum commune LMEs resultó afectada en un 70%. Hardin, (2001), informó que la presencia de NaCl fue perjudicial para la decoloración causada por hongos de la podredumbre blanca. Sin embargo, en el presente trabajo, la sal Na2SO4 solamente afectó la decoloración alcanzada por G. zonatum B-18 y P. djamor B-36. Como se aprecia en la tabla IV, existen diferencias significativas entre los porcentajes de decoloración que obtuvieron las tres cepas de basidiomicetos, en el medio de cultivo que simula en cierta medida un efluente textil (medio Kimura + 0.014 % Cibacron rojo FN-3G + todos los auxiliares textiles). Tabla IV.- Porcentajes de decoloración alcanzados por las cepas G. zonatum B-18, B-23 y P. djamor B-36, luego de 20 días de incubación en medio K con 0.014 % de Cibacron rojo FN-3G y el conjunto de todos los auxiliares textiles.

Cepa % decoloración G. zonatum B-18 76.5 a G. zonatum B-23 59.7 b P. djamor B-36 79.0 a

Las cepas G. zonatum B-18 y P. djamor B-36 son las que mayores porcentajes de decoloración obtienen bajo estas condiciones, no existiendo diferencias significativas entre las mismas. De ellas, la que resulta más interesante para este fin es G. zonatum B-18 pues además, alcanzó mayores valores de decoloración de los tintes Cibacron marino FN-B y Cibacron amarillo P-6GS que la cepa P. djamor B-36. Objetivo 5. Realizar un estudio cinético de la producción de las enzimas ligninolíticas en presencia y ausencia de colorantes y auxiliares textiles. Con vistas a profundizar un poco más en el conocimiento de la fisiología de la cepa G. zonatum B-18, se realizó un estudio cinético que permitiera además obtener un cúmulo de informaciones útiles para una futura aplicación práctica.

22

En la figura 15 a, se puede apreciar que al cultivar la cepa G.zonatum B-18 en medio Kimura (control), ésta comenzó a crecer rápidamente y alcanzó la fase estacionaria a los 12 días. En este medio de cultivo, se pudo detectar la presencia de las enzimas ligninolíticas lacasa y MnP. La primera fue sintetizada por el microorganismo desde el comienzo de su crecimiento y se expresó de forma máxima (46.1 mU/mL) a los 4 días. Sin embargo, la MnP comenzó a producirse al final de la fase de crecimiento y alcanzó su máxima expresión (9.8 mU/mL) en la fase estacionaria. Al adicionarle a este medio de cultivo, 0.014% del colorante Cibacron marino FN-B (figura 15 b), el crecimiento del microorganismo ocurrió más rápidamente que en el medio sin colorante y alcanzó la fase estacionaria a los 8 días. De igual manera que en el medio Kimura, la síntesis de lacasa comenzó desde los primeros momentos de la fermentación y nuevamente alcanzó su máximo a los 4 días, sólo que en este caso los valores de actividad (29.4 mU/mL) fueron inferiores a los del control. La presencia de este tinte industrial indujo la producción de la enzima MnP desde el inicio del crecimiento y se alcanzó su máxima expresión (14.2 mU/mL) a los 8 días. La decoloración comenzó desde los primeros momentos del crecimiento y alcanzó su máximo valor (95.9%) a los 12 días, momento a partir del cual sufre una ligera disminución. En presencia de 0.014% del Cibacron rojo FN-3G (figura 15 c), el crecimiento del microorganismo fue muy similar al que se obtuvo en el medio Kimura. La síntesis de lacasa tuvo lugar nuevamente desde el inicio del crecimiento y alcanzó un máximo a los 4 días, sólo que en este caso los valores de actividad (96.6 mU/mL) fueron muy superiores a los obtenidos en el medio control. Este colorante industrial también indujo la producción de la enzima MnP desde los primeros momentos del crecimiento y los niveles más altos de actividad se alcanzaron a los 4 y 12 días. La decoloración comenzó desde el inicio de la fermentación y el valor máximo (89.1%) se obtuvo a los 12 días. Cuando se le añadió al medio Kimura, 0.014% del colorante Cibacron amarillo P-6GS (figura 15 d), la curva de crecimiento fue muy parecida a la que se obtuvo en el control. Como en los casos anteriores, la síntesis de la lacasa comenzó desde el principio del crecimiento y también alcanzó su máximo (68.5 mU/mL) a los 4 días, valor que resulta superior al que se obtuvo en el medio Kimura. La síntesis de MnP se adelantó en el tiempo con respecto al control pero no comenzó desde el inicio del crecimiento. Se obtuvieron dos picos de actividad, uno el día 8 con 4.8 mU/mL y otro el día 15 con 11.4 mU/mL. La decoloración máxima de este colorante (38.1%) ocurrió a los 15 días y a partir de este momento disminuyó. El porcentaje de decoloración obtenido en este caso fue mucho más bajo que los alcanzados por esta cepa con los otros colorantes. Es de señalar que el crecimiento que experimenta este microorganismo parece depender de la glucosa como única fuente de carbono. La ausencia de un comportamiento diáuxico evidencia la no utilización de las complejas fuentes de carbono que aportan los colorantes. Como se observa el la figura 16 a, cuando el microorganismo se cultivó en presencia de la mezcla de los tres colorantes industriales, la curva de crecimiento fue muy parecida a la que se obtuvo en medio Kimura. Al igual que el Cibacron rojo FN-3G y el Cibacron amarillo P-6GS, el conjunto de los tres tintes provocó un aumento de los niveles de actividad de la enzima lacasa a los 4 días (64.7 mU/mL).

23

0102030405060708090

100

0 4 8 12 15 20

t (días)m

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/mL

0

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/mL

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mU lacasa/mL % decoloraciónpeso seco biomasa (g/L) mU MnP/mL

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0 4 8 12 15 20

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L

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25

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a (g

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mU

MnP

/mL

mU lacasa/mL % decoloraciónpeso seco biomasa (g/L) mU MnP/mL

Figura 15.- Comportamiento cinético de la cepa G. zonatum B-18 al ser cultivada en: a) Medio Kimura (K), b) K+ Cibacron marino FN-B, c) K + Cibacron rojo FN-3G, d) K+ Cibacron amarillo P-6GS.

a)

b)

c)

d)

24

0

50

100

150

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(g/L

) m

U M

nP/m

L

mU lacasa/mL % decoloración Am%decoloración R % decoloración Azpeso seco biomasa (g/L) mU MnP/mL

Figura 16.- Comportamiento cinético de la cepa G. zonatum B-18 al ser cultivada en: a) K+

mezcla de colorantes ( Cibacron marino FN-B (Az), Cibacron rojo FN-3G (R ) y Cibacron amarillo P-6GS (Am)), b) K+ mezcla de colorantes y de auxiliares textiles.

Como en los tres casos anteriores, también se indujo la producción de MnP desde el inicio del crecimiento. La actividad de esta enzima alcanzó su máxima expresión el día 4 (con 10.7 mU/mL) y el día 12 (con 10.9 mU/mL). Esta cepa es capaz de decolorar los tres tintes cuando de encuentran juntos, proceso que comenzó desde el inicio y alcanzó su máximo a los 12 días para el Cibacron marino FN-B (92.4% de decoloración) y a los 15 día para los compuestos Cibacron rojo FN-3G (85.1% de decoloración) y Cibacron amarillo P-6GS (56.5% de decoloración). Luego de alcanzado el máximo valor de decoloración, ésta siempre disminuyó.

b)

a)

25

Awaluddin et al., (2001), al enfrentar la cepa ME 446 de P. chrysosporium a una mezcla de cinco colorantes, obtuvieron también una disminución en los porcentajes de decoloración de cuatro de los cinco compuestos estudiados, luego de alcanzado el máximo. La causa de este fenómeno fue una disminución progresiva durante la fase estacionaria del colorante unido a la biomasa. Estos autores informaron que los valores máximos de decoloración alcanzados por esta cepa fueron: 61.9%, 13.3%, 26.6% y 13.8% para los compuestos CI Direct Red 26. CI Disperse Red 72, CI Reactive Blue 19 y CI Basic Green 4 respectivamente. Es necesario destacar que los valores máximos de decoloración obtenidos por la cepa G. zonatum B-18 para cada uno de los colorantes presentes en la mezcla (figura 16 a), fueron superiores a los anteriores, aún cuando en este experimento se utilizó una concentración inicial de cada colorante que prácticamente fue el doble de la empleada por ellos y las condiciones para la decoloración no han sido optimizadas. Al cultivar la cepa G. zonatum B-18 en medio Kimura más la mezcla de colorantes y auxiliares textiles (figura 16 b), el microorganismo durante los primeros 12 días permaneció en un estado de latencia en el que prácticamente no creció. Sin embargo, durante este período sintetizó grandes cantidades de enzimas lacasa, MnP y se alcanzaron valores máximos de actividad (241.7 mU lacasa/mL y 25.3 mU MnP/mL) superiores a los obtenidos en todas las variantes de medios de cultivo anteriores. Durante este periódo, la decoloración de los tres tintes industriales se incrementó lentamente. Neidleman, (1993), planteó que las altas concentraciones de sales, los sustratos inusuales y los surfactantes podían ser causa de estrés. Es probable que bajo esta condiciones, la cepa se vea afectada y desvíe la mayor parte de su metabolismo a la producción de enzimas que le permitan detoxificar en cierta medida el medio de cultivo (Thurston, 1994). La fase de latencia tan larga provocada probablemente por la complejidad del medio, podría evitarse si el inóculo se obtiene en el mismo medio de cultivo. A partir de este momento, la cepa comenzó a crecer y la decoloración de los tres tintes aumentó progresivamente hasta que a los 20 días alcanzó 60.2%, 59.3% y 36.8% de decoloración para los compuestos Cibacron marino FN-B, Cibacron rojo FN-3G y Cibacron amarillo P-6GS respectivamente. Ha sido demostrado por varios investigadores que las enzimas lacasas y MnP están involucradas en la decoloración de los tintes industriales (Swamy y Ramsay, 1999; Kirby et al., 2000; Conneely et al., 2002). En este trabajo, se detectó la producción de ambas enzimas en todas las variantes estudiadas; sin embargo, no se puede descartar que en la decoloración provocada por esta cepa, también estén interviniendo otras enzimas y metabolitos de bajo peso molecular no determinados. Es importante destacar que la inducción de las enzimas lacasa y MnP que ocurrió debido a la presencia de los tintes industriales, la combinación de ellos y la mezcla de tintes y auxiliares (que simula un efluente textil) está en correspondencia con lo obtenido por diferentes autores (Swamy y Ramsay, 1999; Wesenberg et al., 2002). El hecho de que la cepa G. zonatum B-18 haya sido capaz de decolorar los tres tintes industriales de manera independiente, el conjunto de ellos y la mezcla de colorantes y auxiliares textiles, incluso en condiciones que no han sido optimizadas, hace que sea muy promisoria en la biorremediación de ecosistemas contaminados con colorantes. Además, la posibilidad de inducir las enzimas lacasa y MnP podría permitir la realización de estudios

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moleculares que permitan la obtención de cepas con actividad sobre-expresada para la decoloración y/o degradación de compuestos orgánicos complejos. Objetivo 6. Análisis de la toxicidad de los productos de la degradación causada por los HPB Empleo de Oryza sativa y Allium cepa L como modelo biológico. La fitotoxicidad de colorantes textiles de diversa estructura química se evaluó a través del empleo de semillas de arroz (Oryza sativa) como modelo de estudio. Ninguno de los colorantes ensayados inhibió la germinación de las semillas de esta planta (datos no mostrados) sin embargo, su presencia si afectó el crecimiento de la radícula y/o el de la plúmula (Fig 16). Se observó que a medida que aumentaron las concentraciones de los colorantes, el comportamiento de las semillas se asemejó al control positivo compuesto por azida sódica (325 µg.mL-1), sustancia considerada altamente tóxica para células vegetales, animales y microbianas. Los mayores daños se visualizaron sobre las raíces y no sobre las plúmulas de Oryza sativa. El tinte que provocó mayor afectación en el crecimiento de la raíz de Oryza sativa fue el Remazol azul brillante R seguido por el Cibacron amarillo P-6GS, Bezantrene verde FFB, Solofenil rojo 7BE, Cibacron violeta W-HB, Bezantrene verde olivo MWE, Reactivo negro 5 y Bezantrene negro R (Tabla 2). Los valores de dosis inhibitoria media (DI50) de estos compuestos para el crecimiento de la raíz estuvieron en el rango entre 0,09 y 0,32%. El colorante Solofenil azul BFF fue el que presentó la menor inhibición del crecimiento de la raíz de todos los colorantes ensayados (DI50= 0,52). El cálculo de la DI50 permitió confirmar que el crecimiento de la plúmula en presencia de los colorantes fue menos afectado que el de la radícula. Los tintes de mayor toxicidad fueron en este caso el Bezantrene verde FFB y el Cibacron violeta W-HB con valores de DI50 0,13 y 0,29 respectivamente. Un comportamiento intermedio mostraron Remazol azul brillante R, Solofenil rojo 7BE, Solofenil azul BFF, Reactivo negro 5 y Cibacron amarillo P-6GS. La DI50 de estos compuestos para el crecimiento de la plúmula estuvo en el rango entre 0,46 y 0,73. Los tintes Bezantrene negro R y Bezantrene verde olivo MWE fueron los menos tóxicos pues no alcanzaron la DI50 para las concentraciones de tintes analizadas (0,01-0,75%). De los colorantes ensayados, los más dañinos para el crecimiento de los órganos de la planta en su conjunto, fueron el Bezantrene verde FFB y el Cibacron violeta W-HB pues afectaron de forma severa tanto el crecimiento de la plúmula como el de la radícula. Se evaluó también la toxicidad de los tintes directos S. rojo 7BE y S. azul BFF en Allium cepa L (cebolla), otro modelo vegetal ampliamente empleado con estos fines. Se evidencia el efecto drástico, a elevadas concentraciones de colorantes, sobre el crecimiento de las raíces de las cebollas. Los tintes Solofenil rojo 7BE y Solofenil azul BFF se seleccionaron para este ensayo pues ambos son tintes directos, ampliamente empleados en la industria textil. Estos compuestos tuvieron un comportamiento intermedio en cuanto a la afectación de la plúmula, con una DI50 igual a 0,57%. Sin embargo, sus efectos sobre las radículas fueron muy diferentes, ya que el tinte Solofenil rojo 7BE les provocó severos daños mientras que el Solofenil azul BFF presentó la menor afectación de todos los colorantes ensayados. Se mostró mediante este ensayo, que estos tintes también inhibieron el

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crecimiento de la raíz de Allium cepa L. De ellos, Solofenil rojo 7BE fue el de mayor toxicidad con un valor de DI50 de 0,26 % . Objetivo 7. Analizar los patrones de amplificación mediante PCR de los genes ribosomales 5,8S Los métodos moleculares tienen utilidad en estudios taxonómicos y en análisis genéticos que permiten la caracterización precisa de los genes que codifican enzimas que intervienen en diferentes procesos celulares. Tal es el caso de los métodos de amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La región ITS ribosomal, altamente conservada y con un elevado número de copias, presente en los eucariotas ha sido ampliamente utilizada en estudios de taxonomía molecular y en general en trabajos de caracterización genética. En nuestro estudio se utilizaron tres cebadores específicos de la región ITS 5,8 S en diferentes combinaciones, para determinar el par específico que permitiera la amplificación de dicha región para el basidiomiceto G. zonatum (B-18). En este trabajo se utilizaron como controles negativos dos especies de oomicetos, Phytophtora cinnamomi y P. capsici. La extracción del ADN genómico empleando el método basado en el uso del CTAB en presencia de β-mercaptoetanol rindió un ADN intacto y suficiente para la amplificación por PCR de la región ITS 5,8 S. En la figura 17 puede apreciarse el resultado de la amplificación mediante PCR del ADN genómico aislado de la especie fúngica en estudio. Los carriles 1 y 7 del gel muestran el marcador de peso molecular correspondiente a un “ladder” de 100 pb. Los carriles 2 y 3 contienen las muestras de Phytophtora amplificadas con el par de cebadores ITS1-F e ITS4. Como se puede apreciar, los cebadores ITS1-F (específico para hongos) e ITS4 (cebador universal) amplificaron una banda de 600 pares de bases a partir del ADN aislado de los cultivos puros de oomicetos. Por el contrario, En el carril 10, donde se aplicó la muestra correspondiente al basidiomiceto G. zonatum (B-18) empleando el mismo par de cebadores, no se obtuvo banda de amplificación. Los carriles 5 y 6 que contienen las muestras del género Phytophtora amplificadas con los cebadores ITS1-F e ITS4-B (específico para basidiomicetos) no revelaron bandas con este par de cebadores. Sin embargo, cuando se amplificó la región ITS con la pareja de cebadores ITS1-F e ITS4-B (carril 9) se obtuvo una banda de 400 pares de bases, correspondiente a la cepa G. zonatum (B-18). Este resultado confirma la especificidad del par de cebadores ITS1-F e ITS4-B y que la cepa G. zonatum (B-18) pertenece a la división Basidiomycota. El cebador ITS1-F, específico para hongos, el cebador ITS4, cebador universal y el cebador ITS4-B específico para basidiomicetos, se diseñaron a partir de la región ITS 5,8 S ribosomal (Jasalavich et al., 2000). Los dos primeros se utilizaron para la amplificación de la región ITS de los oomicetos. El cebador ITS4-B, combinado con el cebador ITS1-F para amplificar la región ITS, permitió la amplificación diferencial de los basidiomicetos de la podredumbre blanca estudiados. Este efectivo par de cebadores para la amplificación de la

28

región ITS 5,8 S de los basidiomicetos, ITS1-F e ITS4-B, ha sido ampliamente utilizado en numerosos trabajos (Jasalavich et al., 2000; Martin and Rygiewicz, 2005).

Fig. 17. Amplificación por PCR del ADN aislado de los cultivos fúngicos. Carriles 1 y 7: marcador de peso molecular; carriles 2, 3: muestras de los oomicetos Phytophtora cinnamomi y P. capsici, amplificadas con el par de cebadores ITS1-F e ITS4; Carriles 5 y 6: Phytophtora cinnamomi y P. capsici, amplificadas con el par de cebadores ITS1-F e ITS4-B; Carriles 9 y 10: basidiomiceto de la podredumbre blanca Ganoderma zonatum (B-18), amplificados con el par de cebadores ITS1-F e ITS4-B y el par ITS1-F e ITS4 respectivamente. La región ITS 5,8 S del ADN ribosomal se ha utilizado ampliamente en la reconstrucción de filogenies en varios niveles taxonómicos (Hughes y Petersen, 2001). La misma ha sido extensamente empleada para inferir relaciones filogenéticas entre especies de basidiomicetos degradadores de la madera dentro de un género en particular e incluso, entre especies complejas (Paulus et al., 2000; Lim 2001). Sin embargo, Taylor et al., (1990) mostraron que existe variabilidad en esta región en dependencia del taxón fúngico, además de que regiones no simples pueden ser utilizadas para inferir relaciones filogenéticas para todos los hongos. Especies de Phanaerochaete han sido incluidas en varios estudios que emplean la región ITS para inferir relaciones filogenéticas (De Koker et al., 2003). La posibilidad de detectar la presencia de hongos basidiomicetos degradadores de la madera en troncos, árboles caídos, etc, donde la probabilidad de que otros hongos que no son degradadores colonicen la parte interna de este material es muy baja. El desarrollo del PCR utilizando estos cebadores específicos, ITS1-F e ITS4-B, es una herramienta útil para tal propósito (Jasalavich et al., 2000).

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

700 600 500 400

29

Objetivo 8. Analizar la amplificación del gen lacasa mediante PCR Se amplificaron fragmentos de los genes lacasa de las cepas Ganoderma zonatum B-18 y Pleurotus djamor B-36, mediante la técnica de PCR. Los cebadores empleados fueron diseñados a partir de los sitios II y IV altamente conservados, obtenidos del alineamiento de los genes de lacasa de diferentes organismos (Cu1F (5´-CAT(C) TGG CAT(C) GGN TTT(C) TTT(C) CA-3´) y Cu2R (5´-G G(A)CT GTG GTA CCA GAA NGT NCC-3´ (Luis et al., 2004). Pueden apreciarse los productos de amplificación diferenciales para cada tipo de hongo, según su clasificación taxonómica

Fig. 19. Amplificación mediante PCR de genes lacasa. Carril 1 Corynespora cassicola; 2. Ganoderma zonatum; 3. Pleurotus djamor; 4 y 5: Phytophthora spp. ; 6: Buffer; 8: MW ladder

1 2 3 4 5 6 7 8

500

30

Objetivo 9. Evaluar la acción de los HPB sobre un efluente simulado y un efluente textil real.

La fig 20 muestra la determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) de un residual textil. El análisis permitió determinar que el valor inicial de DQO fue de 660,6 mg.L-1 lo que evidencia su gran contaminación. La utilización de lagunas de oxidación inoculadas con estiércol de ganado vacuno es la solución actual de tratamiento en muchas de las industrias textiles, con el objetivo de purificar los residuales antes de su liberación al medio ambiente. Es válido destacar que a pesar de utilizar una mayor cantidad de inóculo de estiércol, con respecto al utilizado en la industria textil de donde procede el efluente estudiado en nuestro trabajo, pudimos constatar que la biotransformación producida por la biota del mismo fue menor que la producida por la cepa de basidiomiceto empleada. El biotratamiento empleando la cepa de Ganoderma zonatum B–18 logró una disminución de la DQO hasta 183,5 mg.L-1, lo que permitió disminuir en más de 5 veces los niveles de contaminación para las condiciones de laboratorio estudiadas. Este resultado confirma el notable efecto causado por este hongo de la podredumbre blanca sobre el efluente estudiado, además del elevado carácter biodegradativo de estos basidiomicetos de la podredumbre blanca al ser enfrentados con efluentes textiles industriales. La figura 21 muestra a la cepa de G. zonatum B-18 cultivada en medio Kimura suplementado con el efluente textil. Durante los primeros 12 días el microorganismo permaneció en fase de latencia donde prácticamente no se apreció crecimiento. Durante este período sintetizó uniformemente concentraciones de lacasa en forma creciente, alcanzando su valor máximo (26.14 mU.mL-1) a los 9 días de fermentación. A partir de este momento comenzó la fase lineal. Durante los siguientes días de fermentación no se observó actividad enzimática lacasa y la misma comenzó a detectarse nuevamente a los 15 días en concentraciones muy bajas (2.7 mU.mL-1), coincidiendo con el comienzo de la fase estacionaria. A partir de los 18 días no hubo más indicios de actividad lacasa. La enzima MnP no fue detectada durante el estudio cinético realizado a la cepa B- 18.

Objetivo 10. Ensayar tratamientos sobre otros COPs Los valores de actividad lacasa de 69,71 U.L-1 en el medio suplementado con DDT, valor que no presentó diferencias significativas con respecto al obtenido en el medio control (50,27 U.L-1). Los niveles de actividad enzimática lacasa obtenidos por T. maxima resultaron significativamente superiores a los alcanzados por G. zonatum, tanto en la variante suplementada con DDT como en su respectivo control. A diferencia de la actividad lacasa, la biosíntesis de la enzima MnP no se favoreció con la adición de DDT. Las cepas cultivadas en los medios suplementados con DDT no presentaron diferencias significativas entre ellas, pero si con el control (medio Kimura) de la cepa 13, donde se encontró el máximo valor de actividad enzimática (50,27 U.L-1). Este resultado sugiere que el DDT no indujo la síntesis de MnP en las condiciones de cultivo ensayadas. Un resultado peculiar lo constituye la elevada actividad enzimática encontrada en el medio Kimura utilizado como control donde se dieron las condiciones favorables para la biosíntesis.

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La cepa B-18 no mostró diferencias significativas en cuanto a producción de las enzimas lacasa y manganeso peroxidasa, mientras que la cepa 13 produjo más lacasa que MnP en los medios con DDT.

Fig. 20. Espectro de absorción UV- visible del efluente textil sin tratamiento (control) y tratado con las cepa G. zonatum B-18 y el estiércol de ganado vacuno en cultivo estático a 30 °C.

Fig. 21. Comportamiento cinético de la cepa G. zonatum B-18 cultivada en medio Kimura con 50 % de efluente textil durante 21 días en cultivo estático a 30 °C.

0

36

912

15

1821

2427

30

300

314

328

342

356

370

384

398

412

426

440

454

468

482

496

Longitud de onda (nm)

Abs

orba

ncia

B-18 efluente estiércol

0

20

40

60

80

100

0 3 6 9 12 15 18 21t(días)

Lcc,

MnP

(mU/

mL)

0

5

10

15

20

Peso

sec

o (g

/L)

Lacasa MnP Peso seco biomasa

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Conclusiones

1. Se obtuvo una colección de hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca, que ha mostrado una elevada capacidad para degradar diferentes contaminantes orgánicos persistentes. 2. Las enzimas ligninolíticas presentes en todas las cepas estudiadas fueron la Manganeso-peroxidasa y la lacasa, sin poder detectar en ningún caso la lignina- peroxidasa. 3. Los análisis de toxicidad empleando como modelos biológicos células vegetales de arroz y cebolla confirmaron el alto nivel toxico de los colorantes empleados en estos trabajos. 4. Los estudios moleculares permitieron confirmar las diferencias taxonómicas entre hongos de diferente nivel de organización, así como evaluar en detalle, la expresión del gen lacasa en las condiciones de trabajo. 5. Las cepas de mejor desempeño son capaces de degradar otros contaminantes orgánicos persistentes, en particular el DDT. Recomendaciones A partir de los resultados obtenidos, se propone darle continuidad a estos trabajos, recomendando lo siguiente: 1. Evaluar la nueva toxicidad de los productos de degradación causado por los hongos de la podredumbre blanca. 2. Completar la secuenciación de los fragmentos amplificados que permitan concluir los estudios moleculares relacionados con las diferencias taxonómicas y la expresión del gen lacasa. 3. Ensayar la producción a mayor escala de un Bioproducto que facilite los trabajos de biorremediacion de colorantes textiles y otros COPs de amplia distribución en Cuba y otras regiones.

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