Informe de Bioprocesos- Cla (II Unidad)

CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO AIREADO

RESUMEN

2011CULTIVO LOTE ALIMENTADO AIREADO

Página 1L A B O R A T O R I O D E B I O P R O C E S O S G R U P O B - 4

INTRODUCCION

En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y

conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces importante el

conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos puedan optimizar sus

productos. Para ello la preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es

un buen punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el

seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y exactos sobre la

velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado.

La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una

etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de

los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un

rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento

y de formación de productos y además suministrar energía para la síntesis de metabolitos

y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varían

considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.

Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de

un microorganismo (Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126), iniciando desde su siembra

partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico,

empleando la glucosa como fuente de carbono, procurando su rápida activación, para que

luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo;

es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la

cinética de crecimiento.

Dentro de su importancia en la agroindustria la Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126

es muy valiosa para la conversión de fructosa en etanol que puede mejorar la economía

de una planta transformadora de azucares naturales de frutas a etanol. Con la conversión

de la fructosa, la potencial reducción del precio está en función de tres parámetros de

fermentación: el rendimiento, la tolerancia de etanol y la productividad. Asumiendo altos

valores para estos parámetros, la reducción máxima puede volverse de 40%. Hoy en día

es conocido que un número de levaduras fermenta sacarosa en etanol, siendo

Saccharomyces cerevisiae ATCC-4126 una de las más eficientes, especialmente en relación



con el rendimiento y la proporción volumétrica. Empleando esta levadura para la

fermentación de la D-xilosa, la reducción en el precio del etanol alcanza el 70% del

máximo asequible.

I. OBJETIVOS :

1.1. Objetivos generales:

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lote alimentado (CLA)

con alimentación constante utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae

ATCC-4126.

1.2. Objetivos Específicos:

Diseñar el medio de cultivo.

Realizar la activación y desarrollo del inoculo.

Identificar y describir las partes, a accesorios y geometrías, conocimiento de la

operación del fermentador, esterilización, carga y descarga y toma de muestra.

Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y control automático,

así como la calibración de los sensores

Puesta en marcha del cultivo por lote alimentado y determinar µmax y Y x/s.

Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y oxígeno disuelto a través

del tiempo de operación.

Observar las zonas de crecimiento exponencial y limitada.

Determinar el Y x/s y Qx del CLA.



II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL :

A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes

sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los

microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.También

es importante conocer las características de los microorganismos con el que se va a

trabajar.

Microorganismo.

La levadura usada es SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126, siendo el sustrato sacarosa

Condiciones del medio:

Sustrato limitante: SACAROSA( C12H22O11)

Duración: 6 horas de la etapa de CLA

Usar el fermentador automáticoBiotron Modelo Liflus G X de 2 litros

Control de pH medianteelectrodo

Medición de oxigeno disuelto mediante electrodo : 1,0 vim ; 200 rpm

La existencia de las zonas de crecimiento exponencial y limitado.

Utiliza macro nutrientes como: C.N.Mg,K,P

Utiliza micro nutrientes como: Ca,Na,Fe,Cu,Mn,Mo,Co,Zn

2.1. DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO

Para diseñar el medio de cultivo se realizara de acuerdo a los alcances que nos

proporciona la guía de práctica, en el cual podemos conocer los requerimientos del

microorganismo, para su mantención, activación y para la fermentación del cultivo

por lote alimentado.

Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado

(BA) o fedbatch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta

continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente



que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la

velocidad de crecimiento () del microorganismo.

El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular

y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante,

es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del

metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren

evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta

concentración de biomasa.

ESQUEMA

Donde F(t): caudal de alimentación

Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación

Vf: volumen final de trabajo

Vo: volumen al inicio de la alimentación

Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación

So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación



El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que V o, Xo y So son las

condiciones finales de dicho batch.

Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo

de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de

sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más

simple, es decir F=cte y Sr=cte.

Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en

batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como S r

sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o S r = Sr(t), dicha

funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas

2.2. PREPARACION DEL MEDIO:

2.2.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MANTENCIÓN

La preparación de este medio se realizara de acuerdo a los componentes que

se encuentran en la tabla Nº 01



Nutriente So (g/l) So (g/50ml)

Extracto de Levadura 3 0.15

Extracto de malta 3 0.15

Peptona 5 0.25

Agar 20 1

Glucosa 10 0.5

Tabla N°1: Composición de medio sólido de mantención (para 50 ml de

solución)

Procedimiento

La preparación del medio de mantención se inicia de acuerdo a las

concentraciones de la tabla Nº 01.

Los nutrientes se pesan en cantidades requeridas para 50ml. De la tabla

Nº 01,por lo que el medio de mantención se necesita en cantidades

menores a 50 ml.

Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.

Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer adicionando el

agua destilada.

Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz;

agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la

aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2

minutos.

Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 6ml de la

mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.

Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a

presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el intercambio de

gases.

Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a partir de ello

controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.

Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego

colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando con alcohol.

para tener una área estéril prendemos el mechero cinco minutos antes de

realizar la resiembra con el Saccharomycescerevisiae ATCC 4126.



Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen, flameando para

evitar la contaminación, teniendo la aza bacteriológica calentada al rojo

vivo esperamos un momento que se enfríe.

Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar, flameamos y

cerramos el tubo y así en los 8 tubos con agar.

2.2.2. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN

Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 15 ml de solución)

Procedimiento

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2.

En un matraz Erlemenyer se colocó la cantidad pesada de sacarosa más

8 ml de agua destilada.

El extracto de levadura se colocó en tubo de ensayo y se agregó 10 ml

de agua destilada

En cuanto a la solución de sales también se colocó en tubo se ensayó y

se agregó 7 ml de agua.

Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un tubo de

ensayo cada uno, la sacarosa en un matraz de 125 ml todo esto en un

vaso precipitado colocado dentro de una olla a presión.

Después de haber esterilizado se dejó enfriar para luego mezclar y

realizar la activación con el microorganismo.



NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (G/L) PESAR (G)

Sacarosa 15 0.225

Extracto de

Levadura

3 0.045

Extracto de Malta 5 0.075

Solución de Sales 5 ml/L 0.075ml

Al mezclar estos componentes (las sales y la levadura con la sacarosa)

se procedió a activar el microorganismo “bajo mechero” para evitar la

contaminación.

Sacamos dos azadas y colocamos en el medio de activación, luego

tapamos con el tapón previamente elaborado.

Colocar en el shaker por un tiempo de 12h.

2.2.3. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN

Tabla N° 3: Composición Del Medio De Fermentación I

Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 100ml. El diseño del medio se realizó en un matraz Erlenmeyer de 500ml.

Elemento Nutriente % en Celula

% en nutriente

Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l) pesar (gr)

C Sacarosa (C12H22O11)

45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478 0.3847

N Sulfato de Amonio

(NH4)2SO4

9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457 0.1146

K Fosfato Potasico (KH2PO4)

0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471 0.0047

Mg Sulfato de Magnesio

Heptahidratado (MgSO4.7H2O)

0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095 0.0195

P Fosfato Potasico (KH2PO4)

2 22,79 11,395 0,1580 0,2369 0.02369

- Extracto de Levadura

- - - - 1,8 0.18

- Solucion de sales - - - - 10 ml/L 1



Condiciones de Cultivo :

pH inicial : 4,2SHAKER

Temperatura: 35ºC

Velocidad de agitación : 200 rpm

La fermentación se realizara en un matraz de 500 ml.


Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 800ml

Elemento Nutriente % en Celula

% en nutriente

Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)


45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478

N Sulfato de Amonio

(NH4)2SO4

9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457


0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471



0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095


2 22,79 11,395 0,1580 0,2369


- - - - 1,8

- Solucion de sales - - - - 10 ml/L





Temperatura: 35ºC


La fermentación se realizara en el fermentador de 2000 ml.

FERMENTACIÓN DEL CULTIVO

Inocular el caldo (medio rico + biomasa) a un matraz conteniendo medio de

fermentación, para el la adaptación del crecimiento

Durante el desarrollo del cultivo, para las evaluar el crecimiento de biomasa,

tomar una muestra inicial, al que se le mide la absorbancia y se centrífuga,

guardando el sobredanante en viales y la masa sedimentada en capachos que

serán expuestos a la estufa.

Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de

alimentación de tal manera que en tiempos determinados, se provoque en el

comportamiento del crecimiento.

Luego se llevara a cabo la alimentación, se llevara a cabo una segunda

fermentación para un volumen final del medio a 1600 ml de solución

Tabla N° 5: Composición Del Medio De Fermentación II

Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 3.65 g/l. para un volumen de 1600ml. Entonces se tendrá: ΔX=3.425gr/l

Elemento

Nutriente YX/SSo

(gr/l)S´o

(gr/l)Pesos (g)

Extracto de levadura

1.8002.880

N (NH4)2SO4 2.361.45

42.181

3.489

P KH2PO4 11.380.30

10.451

0.722

K KH2PO4 57.470.06

00.089

0.143



MgMgSO47H2O

24.660.13

90.208

0.333

Extracto de sales10.00

0 16.000


2.3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O.

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la

concentración de microorganismos a medida que avanza el tiempo, esto puede

ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640nm. Para ésta

determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado,

para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son

determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200rpm.

Durante 20 minutos.

Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua

destilada.

Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de

sustrato que pudiera alterar la determinación.

Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la estufa

a 80ºC hasta peso constante.





Temperatura: 35ºC




PREPARACION DE SALES

Se peso todas las sales

en la balanza analítica.

CaCl2 .2H2O: 1.12 g/L

ZnSO4.7H2O: 0.11 g/L

FeSO4.7H2O: 0.06 g/L

CuSO4.5H2O: 0.05 g/L

CoCL2.6H2O: 0.01 g/L

MoO3 : 0.0005 g/L

MnCl2.6H2O: 0.027 g/L

NaCl : 0.28 g/L

Cada sal me mezclo con agua y se le echo a la fiola de un litro.

2.4. AEREACION

Algunas consideraciones que se debe tomar son:

Proporcionar a los microorganismos el oxígeno necesario para llevar a cabo su proceso respiratorio.

La solubilidad del O2 es baja < 10mg/l Þ se necesita alimentar en forma continua este “nutriente”, dado que su demanda es aproximadamente de 1g/l.

Se pueden tener sistemas donde los microorganismos crecen con múltiples sustratos, pero en el caso que todos son limitantes. Ej, C, N, O2 , luego la cantidad de cada uno de ellos afecta la cinética de crecimiento.



Luego de haber pesado todas las sales y de haberlo echado a la fiola; a esta fiola se le enrazo con agua.

Se mezcló todas las sales y luego se vació a un pomo de vidrio.

Al pomo de vidrio se le llevo a la refrigeradora.

Transferencia de Oxígeno

El comportamiento de las fermentaciones está fuertemente influenciado por una serie de operaciones de transferencia.

Es posible que una determinada fermentación, en especial las aeróbicas, esté limitada en sus posibilidades de mejorar su rendimiento y productividad, no por razones propias de las características de las células sino que por problemas en el diseño que permita satisfacer la alta demanda de transferencia de masa, y en especial de oxígeno.

Necesidades de Diseño

Se diseño de un sistema de aireación-agitación debería satisfacer que:

DEMANDA DE OXIGENO = OFERTA DE OXIGENO

Por otra parte, el crecimiento microbiano se puede representar por:

1CaHbOC + m NH3 + n O2 à q CdHeOfNg + r CO2 + t H2O + u ChHiOjNk

CdHeOfNg: Biomasa

ChHiOjNk: Metabolito extracelular

De acuerdo con la ecuación anterior, el rendimiento de oxígeno en células se puede calcular por medio de la relación entre “n” y “q”

Si no se producen Metabolito extracelular, “u” igual a cero è

mws: Peso molecular de la fuente de carbono y energía

Proceso de transferencia de oxígeno (OFERTA)

Etapas

(i)Del seno de la burbuja a una capa interna de gas



μ=μmax( GKG+G )⋅( N

K N+N )⋅( OKo+O )

Y O 2x

=32 a+8b−16 cY x

s

⋅mws

+0 .01 f −0 .03 d+0.02 g−0 . 08 e

(ii) Difusión en la capa interna de gas.

(iii) Difusión a través de una capa externa de líquido que rodea a la burbuja ¡Etapa limitante!

(iv) Transferencia al seno del líquido

(v) Difusión a través de la capa de líquido que rodea a los microorganismos ¡Etapa limitante!

(vi) Difusión en el interior de los microorganismos

Velocidad de Transferencia de Oxígeno por área interfacial

La velocidad de transferencia por unidad de área interfacial, W, está dada por:

W = kl (Ci – C)

Como en la interfase se supone que hay equilibrio entre el oxígeno en el gas y el disuelto.

W = kl (Ci – C)= kG (P – Pi)

Las cantidades Pi y Ci resultan difíciles de determinar en la práctica, se prefiere hacer uso de las relaciones de equilibrio, trabajando con las concentraciones y



FO2

presiones de equilibrio C* y P*. Con ello se trabaja con la “ Velocidad de transferencia de oxígeno volumétrica”, NA

Velocidad de Transferencia de oxígeno volumétrica

Cuando el control de la transferencia de O2 se encuentra en el film líquido que rodea a la burbuja o a los microorganismos, la velocidad de transferencia de oxígeno, NA

se puede expresar como:

NA = kLa (C* - C) = H kLa (P – P*)

Se supone que hay equilibrio entre el oxígeno del gas y el disuelto en el líquido.

kL: Coef volumétrico de transferencia de O2 a la fase líquida (cm/hr)

a : Area interfacial específica (cm2/m3) Resulta difícil de medir è (kLa)

C*: Conc. de O2 en el equilibrio (mM/L) (Hipotético)

C : Conc. de O2 disueltro en el seno de la fase líquida (Este valor no puede ser inferior Ccrítico » 1mg/l)

P* : Presión de O2 en el equilibrio

P : Presión de O2 en el seno de la fase gas.

H : cte. de Henry..

Balance de Oxígeno

Se puede plantear una ecuación de balance de oxígeno en el fermentador:

O2 que entra – O2 que sale – O2consumido por unidad de volumen = Acumulación.

O2 que entra – O2 que sale = O2 que se transfiere = NA



Para que el cultivo pueda crecer sin limitación de Oxígeno, el suministro debe ser igual a la demanda.

Métodos de determinación k L a

Para la adecuada operación de un fermentador se hace necesario conocer el valor del coeficiente volumétrico de transferencia de O2

kL = f (Sc, Sn, GR)

kL × a a = f (D32, H)

Medición de los flujo de Oxígeno

o Titulación

o Oxidación de sulfito de sodio

o Eliminación del O2

o Método Dinámico.

o Balances de masa

o Medición Directa con analizador de O2



k L a⋅(C¿−C )− μ⋅xY o 2

x

=dCdt

k L a⋅(C¿−C )= μ⋅xY o 2

x

Estimado mediante Correlaciones

o Método del sulfito de sodio

Se basa en la rápida reacción química de oxidación del sulfito a sulfato mediante O2.

Se reemplaza el medio por solución de sulfito de sodio (sulfato cúprico como catalizador) y se burbujea aire por un cierto tiempo.

Sulfito + O2 à Sulfato

kLa C* : Representa la máxima velocidad volumétrica de transferencia de O2 en un sistema dado (fermentador).

o Método dinámico

En este caso la medición se realiza en el fermentador durante el crecimiento de un cultivo activo, registrándose el oxígeno disuelto. El proceso tiene 2 etapas.

Etapa 1: Durante la fermentación se corta el suministro de aire (T1) y se registra la disminución de O2 disuelto. En este caso el suministro es nulo.



k L a⋅C ¿=Sulfitoinicial−Sulfito final

Δt

μ⋅xY o 2

x

=dCdt

k L a⋅(C¿−C )=0

La pendiente de la curva es la demanda de O2:

El flujo de aire se repone antes que se alcance la concentración crítica de oxígeno, Cc (bajo este valor la velocidad de metabolismo se hace dependiente de la concentración C, pudiéndose causar daños irreversibles en los m.o.).

Cc ≈ 0.1*Concentración de Saturación

Bajo estas condiciones se cumple:

Desde la cual se despeja el término (-1/kLa)

Depende de la velocidad de respuesta de los electrodos

o Método medición directa



μ⋅xY o 2

x

=dCdt

C=C ¿− 1k L a [ μ⋅x

Y o2x

+ dCdt ]

Para aplicar este método se utiliza un electrodo de oxígeno disuelto y sistemas para determinar oxígeno en la fase gaseosa.

En este método se calcula la demanda de oxígeno midiendo el flujo de aire y la concentración de oxígeno en las corrientes gaseosas de entrada y salida.

Con estos valores y la lectura de oxígeno disuelta, se calcula kLa.

O2 que entra – O2 que sale = O2 que se transfiere = kL a (C* - C)

Método de alto costo debido al equipamiento analítico requerido.

2.5. AGITACIÓN

La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.

La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.

La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan.

La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxígeno, para la eliminación del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.

Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:

Dispersión del aire en la solución de nutrientes. Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de

nutrientes, en el fermentador. Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos. Dispersión de los líquidos inmiscibles.

Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de evitar el daño celular.



La agitación es una operación muy importante tanto del punto de vista técnico como económica.

La agitación es importante para:

• un mezclado homogéneo

• Una buena transferencia de masa y de calor, permite disminuir el espesor de la película líquida estática.

Diseño del sistema de agitación

El sistema de agitación tiene la función de generar la potencia necesaria para producir una mezcla perfecta para el sistema de cultivo y producir un régimen de agitación adecuado que, maximice la difusión de gases en el líquido y minimice la producción de esfuerzos cortantes y la presión hidrodinámica local y global, para optimizar los fenómenos de transferencia de momentum, calor y masa.

Un sistema de agitación consta de cuatro partes mecánicas:

Motor Impulsor: suministra la potencia al eje de potencia; debe ser de corriente alterna (a.c), preferiblemente de inducción y su potencia debe calcularse para manejar el doble (200%) de la potencia teórica requerida para agitar el fluido y el cultivo a Re≥3000. Motor de Inducción (A.C): dado que un biorreactor debe operar de forma continua durante todo el proceso de cultivo; se requiere un motor capaz de resistir largos periodos de operación continua y trabajo duro; por eso, el motor debe ser de inducción de corriente alterna (a.c) y debe ser acorazado, preferiblemente en acero inoxidable.

Eje trasmisor de la potencia: es una barra cilíndrica de acero inoxidable 316L y por lo general se diseña en diámetros estándar: ¾”, ½”, etcétera para mayor facilidad de ajuste a los estándares de motores a.c. Su longitud depende de la profundidad del contenedor (tanque).

Acople del Eje Transmisor: ajusta y fija al motor, el eje transmisor de potencia. Existen dos tipos de acople:

Acople-adaptador de tipo taladro: el puerto de entrada se acopla al eje del motor por fijación directa. El puerto de salida es un dispositivo que se adapta a varios diámetros de broca y sujeta o abraza firmemente el eje transmisor de potencia por presión y abrasión; similar al que utilizan los taladros mecánicos.

Acople-ajustador de tipo tornillo-rosca: el puerto de entrada se “enrosca” o se fija firmemente al eje del motor. El puerto de salida es un dispositivo que “abraza” el eje transmisor de potencia por un mecanismo de tornillo-rosca.



En ambos casos, el diámetro del puerto de entrada del acople que es la unión de éste con el eje del motor debe ser de diámetro interno igual al diámetro externo del eje del motor y el diámetro del puerto de salida que es dispositivo sujetador del eje transmisor de potencia debe ser el mismo que el diámetro externo del respectivo eje.

2.6. ESTERILIZACION

Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía.La razón fundamental para efectuar la esterilización en Microbiología Industrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos específicos.

Métodos de esterilización

Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:

a) Por destrucción total de microorganismos

Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino olas bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.

b) Por muerte o inactivación

La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación. En el caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmósferas. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor saturado bajo presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre también en el caso de los autoclaves)



porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Después de la esterilización se mantienen las condiciones asépticas, haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.

c) Por eliminación con medio físicos.

La eliminación física está restringida a la esterilización de gases líquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.

Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los microorganismos no es posible.

Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.

Cinética de la esterilización por calor

La cinética de la esterilización por calor húmedo, que es la única que consideraremos en ésta monografía por su aplicación a la esterilización de medios de fermentación, está caracterizada bastante aproximadamente por una reacción cinética de primer orden.

Si No es el número de organismos viables presentes inicialmente y N es número viable al final tendremos que la ecuación de velocidad de muerte será:

(1)e integrando entre los límites

No a tiempo = 0 y N al tiempo t = t, se obtiene

N/No es la fracción de organismos viables que sobreviven después del tratamiento por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destrucción, que depende de la temperatura según la clásica ecuación de Arrhenius:



Donde: A = constanteE = energía de activaciónR = Constante general de los gasesT = Temperatura en grados Kelvin

Si se gráfica el In k en función de 1/T se obtendrá una línea recta, siendo la inclinación igual a -E/R y la intersección de la recta con la ordenada, el valor de la constante de Arrtherius.

En la práctica de la esterilización es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razón por la cual, es imprescindible diseñar un ciclo de esterilización lo más efectivo posible pero al mismo tiempo lo más corto posible. Podremos definir un término nabla (V) que representa la magnitud de la disminución del número de organismos viables de manera que:

Y por tanto

Sin embargo, como ya dijimos, parte de la destrucción ocurre en la etapa de calentamiento y otra parte en la de enfriamiento, de manera tal que:



Las partes de calentamiento y enfriamiento son obtenidas a temperatura variable de manera tal que es necesario integrar la ecuación:

para el período de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos períodos. Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 °C para la esterilización completa del mismo.

2.7. MONTAJE DE EQUIPO

El biorreactor antes de ser puesto en marcha se llenara con alcohol de 96º para

ser esterilizado.

El biorreactor será puesto en marcha con un volumen inicial igual a 0.75Lt para

llegar a un volumen final de 1.65Lt y utilizando la siguiente formula:

Se determinó q el tiempo de fermentación será de 6 h para un flujo constante de

alimentación de (3/20)Lt/h.

Se trabajara con 1,5 vvm y 150 rpm como será un cultivo por lote alimentado

aireado no habrá flujo de salida.


RESERVORIO BOMBABIORREACTOR

F(t)SR(t)

VR = Vf - V0

V0, X0, S0

Vf, Xf


V=V0+Ft

Para esta experiencia se utilizara un El sistema Liflus GX fermentación es un

fermentador a escala de laboratorio, que está diseñado para la fermentación de

usos múltiples. Varios esquemas de fermentación, tales como fedbatch e incluso

el cultivo de células animales pueden ser pertalined con la serie BioGM. El

monolítico monitor LCD se instala en el cuerpo de la torre controlador de

tamaño medio y se puede visualizar todos los valores medidos y los parámetros

de control.

El biorreactor del laboratorio es un biorreactor marca boitron- liflus GX.

El biorreactor del laboratorio de la universidad nacional del santa posee las

siguientes partes:

Determinación de PH (4.2)

Sensor de PH

Sensor de Tº

Sensor Oxígeno Disuelto.

Antiespumante



Condensador

Motor de rotor

Posee cuatro bombas peristaticos: acido- base- alimentación-

espumante

2 Sensores de aire (1%)

Un vaso con capacidad de 6lt

2.8. PREPARACION DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (1L)

Pesar las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales

concentradas para sepa de SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126 lo cual se

muestra en la guía de Práctica de Bioprocesos:

Fuente de Ca : 2,9 g CaCl2. 2H2O

Fuente de Fe : 0.6009 g FeSO4.7H2O

Fuente de Cu : 0,25 g CuSO4.5H2O

Fuente de Co : 0,24 g CoCl2.6H2O



Fuente de Zn : 0,4015 g ZnSO4.7H 2O

Fuente de Mg : 2,20 g MgSO4.7H2O

Fuente de B : 0.06 g H3BO3

Fuente de Cl : HClconc.

Cada compuesto se pesara con cuidado.

Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de

precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador

de vidrio, la solución se colocara en una fiola de 1 litro y se enrazara con agua

destilada hasta completar 1litro.

Una vez realizado el preparado se llevara a refrigeración para su posterior

utilización.

2.9. SOLUCIÓN BUFFER O TAMPÓN

Una solución buffer o tampón o amortiguadora es una mezcla de un ácido débil y

una base débil, la cual se puede obtener mezclando un ácido débil con una de sus

sales correspondientes, “tampón ácido”, puesto que el anion del ácido es una base

débil. También se puede preparar la solución amortiguadora mezclando una base

débil con una de sus sales correspondientes “tampón básico”. El ácido débil

reacciona con cual quien cantidad de OH- agregado, mientras que el papel de la

base débil es consumir el H+ que pueda haberse introducido. Esto impide que se

perturbe en mayor grado el equilibrio:

H2O H+ + OH- y del cual dependa el PH mayor de la solución.

El efecto amortiguador de estas soluciones se presenta cuando se les agrega

pequeñas cantidades de ácidos fuertes o bases fuertes. El responsable de este efecto

es una o más reacciones que ocurren dentro del sistema y en las cuales se consume

casi totalmente el ácido o base agregados. Esta reacción puede determinarse

fácilmente sobre la base del equilibrio que predomina en el sistema aplicando el



teorema de Chatelier y teniendo en cuenta que siempre que un ácido esta en

presencia de dos bases reacciona con aquella que produzca la sustancia más estable

o que posee la menor constante de disociación y lo mismo puede decirse si se trata

de una base en presencia de dos ácidos.

III. MATERIALES INTRUMENTOS Y REACTIVOS

3.1. Medio de mantención y resiembra del microorganismo.

Materiales y equipos

Balanza analítica

Olla a presión

Mechero Bunsen

Pipetas de 10 ml.

Aza bacteriológica

Tubos de ensayo con tapas (8 tubos)

Varilla de vidrio

Matraz Erlenmeyer (250ml)

Guantes.

Espátula

Probeta graduada

Capachos de papelmetalico

Reactivos

Muestra: Saccharomycescerevisiae ATCC 4126

Sustrato: sacarosa

Agua destilada.

Extracto de levadura.

Peptona.

Agar.



3.2. Medio de activaciónMateriales y equipos

Matraz de 250ml.

Matraz de 125 ml

Tubos de ensayo con tapa

Algodón

Gasa

Varilla de vidrio

Balanza analítica

Espátula

Agua destilada

Pinzas

Guantes

Shaker

Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

Olla a presión

Pipetas

Capachos de papel metálico.

Reactivos

Componentes según Tabla Nº 2

Alcohol

HClcc.

3.3.Medio de fermentación y proliferación

Materiales y equipos

Matraz de 1 L

Matraces de 125 ml

Varilla de vidrio

Capachos de papel metálico.



Balanza analítica

Reactivos

Según la tabla Nº 3 y 5 de anexos

Agua destilada

Alcohol

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES :

Tabla Nº: Programación y actividades a realizar

ACTIVIDADES FECHA Recepción de guía de practicas 02/11/10

Explicación del procedimiento de

práctica.

02/11/10

Presentación del preinforme de

practicas

07/11/10

Esterilización de materiales preparación

de medios e inoculo para la curva de

calibrado

09/11/10

Toma de muestras para determinación

de la curva de calibrado rápido

16/11/10

Preparación de instrumentos y esterilización de los mismos

Preparación del medio de activación

22/11/10

Inoculación al medio de activación Preparación del medio de fermentación

22/11/10

Inicio de la cinética y toma de muestras 23/11/10

Discusión y conclusión de la experiencia 23 – 24/11/10

Imprevistos de la experiencia 25/11/10

Presentación del informe final 30/11/10



V. BIBLIOGRAFIA

Jay, J. 1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Zaragoza, España: Acribia.

Doran M, P. Principios de Ingeniería de los Bioprocesos. Zaragoza, España:

Instituto Politécnico Nacional. 2007. Laboratorio de Biorreactores: Manual de

Prácticas. México. p. 48

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?

Mostrar=quimicos

http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf.

http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml

QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica

www.sciencedirect.com

MEDIOS DE FERMENTACION.PDF

Microbiología General Tema 2.- Cultivo de microorganismos.PDF

Diseño de fermentadores o bioreactores.PDF

http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema12MI.html

http://www.monografias.com/trabajos63/fermentadores-cultivo

sumergido/fermentadores-cultivo-sumergido2.shtml



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http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=quimicos

http://es.wikipedia.org/wiki/

Biorreactor#Dise.C3.B1o_de_un_Biorreactor_de_Tanque_Agitado


ANEXOS


En la Guía de prácticas de curso Laboratorio de Bioprocesos se parte de las siguientes condiciones:

Referencias de composición de medios de mantención, activación y cultivo para SaccharomycesCerevisiae ATCC 4126

MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (GR/L)Solido de mantención

(YM solido)Extracto de levaduraPeptonaExtracto de maltaAgarGlucosa

3532010

Activación SacarosaExtracto de levaduraExtracto de maltaSolución de sales

15355 ml/L

Fermentación SacarosaExtracto de levadura(NH4)2SO4

KH2PO4

MgSO4.7H2OSolución de salespH 4,2

1.8

10 ml/L

Condiciones de cultivo: temperatura 35°C y velocidad de agitación 200 rpm en el agitador orbital (shaker)

COMPOSICIÓN DEL M.O:

COMPONENTES % DE COMPOSICIONC 45 %N 9 %

Mg 0.4 %



K 0.5 %P 2.0 %

µmax = 0.37 h-1 en glucosa a 35° C ( Lane, M. y Morrissey, J. 2010

COMPOSICION DE NUTRIENTE (g) PARA UN MEDIO DE

MANTENCION PARA 50ml

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN

Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 15 ml de solución)



Nutriente So (g/l) So (g/50ml)

Extracto de Levadura 3 0.15

Extracto de malta 3 0.15

Peptona 5 0.25

Agar 20 1

Glucosa 10 0.5

NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (G/L) PESAR (G)

Sacarosa 15 0.225

Extracto de

Levadura

3 0.045

Extracto de Malta 5 0.075

Solución de Sales 5 ml/L 0.075ml

2.9.1. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN


Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 100ml. El diseño del medio se realizó en un matraz Erlenmeyer de 500ml.

Elemento Nutriente % en Célula

% en Nutriente

Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l) pesar (gr)


45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478 0.3847

N Sulfato de Amonio

(NH4)2SO4

9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457 0.1146


0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471 0.0047



0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095 0.0195


2 22,79 11,395 0,1580 0,2369 0.02369


- - - - 1,8 0.18

- Solucion de sales - - - - 10 ml/L 1

La fermentación se realizara en un matraz de 500 ml.





Temperatura: 35ºC



Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 1.8 g/l. para un volumen de 800ml

Elemento Nutriente % en Célula

% en Nutriente

Y x/s (g/g) S`0 (g/l) S0 (g/l)


45 42,105 0,4678 3,8478 3,8478

N Sulfato de Amonio

(NH4)2SO4

9 21,21 2,3567 0,7638 1,1457


0,5 28,676 57,352 0,0314 0,0471



0,4 9,86 24,65 0,0730 0,1095


2 22,79 11,395 0,1580 0,2369


- - - - 1,8

- Solucion de sales - - - - 10 ml/L






Temperatura: 35ºC


Tabla N° 5: Composición Del Medio De Fermentación II

Composición del Medio de Cultivo deSaccharomycescerevisiae- ATCC 4126 para un crecimiento en biomasa de 3.65 g/l. para un volumen de 1600ml. Entonces se tendrá: ΔX=3.425gr/l

Elemento

Nutriente YX/SSo

(gr/l)S´o

(gr/l)Pesos (g)

Extracto de levadura

1.8002.880

N (NH4)2SO4 2.361.45

42.181

3.489

P KH2PO4 11.380.30

10.451

0.722

K KH2PO4 57.470.06

00.089

0.143

MgMgSO47H2O

24.660.13

90.208

0.333

Extracto de sales10.00

0 16.000

Fuente de carbono y energía: Sacarosa (C12 H22 O11), M =342 g





Temperatura: 35ºC


YX/S= % de C en el nutriente / % de C en la célula.

% de C en el nutriente = 12(12) x 100 / 342 = 42.105 %

% de C en la célula = 45 %

YX/S=(42.105/45) x0.6 (este factor por ser aireado)

YX/S = 0.936x 0.5 = 0.468g/g

1. CALCULO DE % NUTRIENTE:

Sacarosa: C12 H22 O11

PM = 342

342 100%

12x12 x

x = 42.105

KH2PO4

P:

PM = 136.1

136.1 100%

31 x

x = 22.777

KH2PO4

K:

PM = 136.1

136.1 100%

39.1 x

x = 28.73

(NH4)2SO4:

PM = 132

132 100%

28 x

x = 21.21

MgSO47H2O

PM = 246.3

246.3 100%

24.3 x

x = 9.866



2. CALCULO DE YX/S:

Y x /s=%nutriente% celula

×0 . 6

Sacarosa:

Yx/s=(42.105/45)x0.5

Yx/s= 0.468g/g

KH2PO4:

P:

Yx/s=(22.777/2)

Yx/s= 11.3885 g/g

KH2PO4:

K:

Yx/s=(28.73/0.5)

Yx/s= 57.46 g/g

(NH4)2SO4:

Yx/s=(21.21/9)

Yx/s= 2.3567 g/g

MgSO47H2O

Yx/s=(9.866/0.4)

Yx/s= 24.665 g/g

3. CALCULO DE S0

Y x /s=x−x0

s0−s

Sacarosa:

0.468= 1.8/S0

S0= 1.8/0.468

S0 = 3.8462g/l



KH2PO4

P:

S0= (1.8/11.3885)x1.5

S0 = 0.2371 g/l

K2HPO4

K:

S0= (1.8/57.46)x1.5

S0 = 0.046989 g/l

(NH4)2SO4:

S0= (1.8/2.3567)x1.5

S0 = 1.14567 g/l

MgSO47H2O

S0= (1.8/24.665)x1.5

S0 = 0.10946 g/l

Extracto de levadura :

S0= 1.8

Solución de sales

S0= 10ml/L

COMPOSICION DE SOLUCIONES DE SALES:

COMPONENTES CONCENTRACION(gr/L)

CaCL2,2H2O 1.12ZnSO4.7H2O 0.11FeSO4.7H2O 0.06CuSO4.5H2O 0.05CoCL2,6H2O 0.01

MoO3 0.0005MnCL2,6H2O 0.027

NaCl 0.28

DESARROLLO DE LA FERMENTACION (CAPACIDAD 2L)

MEDIO DE ALIMENTACIÓN: (para 1000ml de solución)

Dato del biorreactor: F = 2.67ml/ min = (0.16)L/ h



X0 = 1.8 gr/L

S0 = 0

Sf = 3.77 gr/L

CONDICIONES INICIALES DADAS:

COMPOSICION ELEMENTAL DEL MICROORGANISMO

C 45% N 9% Mg 0.4% K 0.5% P 2.0%

Calculemos el Yx/s, teniendo a la fuente de Carborno (Sacarosa) como factor limitante, asi

tenemos:

Y x /s=%nutriente% celula

×0 . 6

Yx/s=(42.105/45)x0.5

Yx/s= 0.468 g/g

Así mismo, de acuerdo con las condiciones de cultivo:

umax=0.37h-1

T=35°C

Volumen Total del fermentador= 2L

Tiempo total del CLA= 6h



Como sabemos, el CLA con aireación necesita antes el microorganismo tener un

CULTIVO POR LOTE, en el cual haya comenzado su crecimiento exponencial, hasta

obtener hemos creído conveniente una concentración de células de 2g/L.

Condiciones para el CULTIVO POR LOTE

Vo=800ml

Xo=0.2g/L

Xf=2g/L

ΔX=1.8 g/l

So=?

Supongamos que tras el inicio de la fermentación, tenemos que encontrar el tiempo óptimo

donde se inicia la fase de crecimiento exponencial, para ello hemos querido conveniente

fijar una ∆X=1.8g/L, suponiendo que se ha consumido todo el sustrato, entonces tendremos

que:

Sf=0 (inicio del CLA)

Y x/ s=X f−X 0

S0−S f

Entonces, So=?

So=1.8

0.468

So=3.8462 g /L

Calculando el tiempo aproximado de fermentación del Cultivo por Lote:



t= 1umax

ln (x f

xo

)

t= 1(0.37)

ln ( 20.2

)

t=6.22horas

Condiciones para el CULTIVO POR LOTE ALIMENTADO

En la zona de crecimiento exponencial de masa celular

So=0 gr/L

Xo=1.8gr/L

Vo=800ml

umax=0.37h-1

Yx/s= 0.47 g/g

BIOMASA INICIAL(XoVo)= (1.8g/l)(0.8L)=1.44gr

De acuerdo a la bibliografía revisada, hemos creído conveniente trabajar con un

volumen final de 1.60L (80% del volumen total), entonces se tendrá:

Como el tiempo total del CLA = 6horas

dVdt

=F entonces : F=V f −V 0

t=1.6−0.8

5=0.16 L/h=2.67 ml/min

Condiciones de transición



Como se tiene dos zonas de crecimiento, por teoría sabemos que se debe cumplir:

Entonces debemos calcular el tiempo de transición, a partir de:

(XV) crecimiento exponencial= (XV) crecimiento limitado

Asimismo se debe cumplir, para un buen desarrollo del microorganismo, teniendo un tiempo de transición =2.5horas

Entonces, sabemos que:

BIOMASA ZONA CRECIMIENTO EXPONENCIAL= BIOMASAZONA

CRECIMIENTO LIMITADO

XoVo eumax.t = FSfYX/S t + SoVo + XoVo

Despejando Sf, obtenemos que:

SF=(XoVo eu max. tT−SoVo−XoVo)

F Y X /StT

Reemplazando:

SF=(1.8∗0.8 e0.37∗2.5−0∗0.8−1.8∗0.8)

0.16∗0.47∗2.5

SF=11.66 g/ L

En la zona de crecimiento limitado de masa celular

Tendremos que:

XV= FSfYX/S t + SoVo + XoVo…………………. (α)



Biomasa producida en la zona de crecimiento exponencial

= Biomasa producida en la zona de crecimiento limitado

Como según la bibliografía revisada, se tiene que Xf= ¿

Entonces en Vf= 1.60L, se tendrá:

Asimismo, Sf=? y So=0gr/l

De la ecuación (α), reemplazamos los datos obtenidos:

XV= (0.16)*(11.66)*(0.468)*(5) + 1.8*0.8

XV=5.8055gr de biomasa

Como: Vf=1.6L

Xf= (5.8055/1.6)=3.62844 gr/L

ASIMISMO:Sf=?A partir de: Sabiendo que: ks=0.01

umax=0.37h-1

Yx/s= 0.47 g/g

Reemplazando:

SF=(0.16∗11.66∗0.467∗0.01)

0.16∗11.66∗0.467 (0.37∗5−1 )+(0+1.8∗0.8 )∗0.37

SF=0.01368 gr /L

CALCULO DEL VALOR DEL N A:

NA=µ. xyo2



Donde:

NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno

x: Biomasa

Yo2: Rendimiento de O2

El valor de µ teórico para la Saccharomyces cerevisiae es 0,4 h -1 y el rendimiento de O2 es de 1,25 mg de O2 / L.h.

NA=(0,4

1h )( 5 gcel .

L)

(1,25gO 2L.h

)NA=1,6

g celgO 2

Calculo del valor del KLA:

KLA= NA(CL∗−CL)

Donde:

CL*: Concentración Crítica de Oxigeno disuelto

CL: Concentración de Oxigeno disuelto

El valor de CL* teórico para la Saccharomyces cerevisiae es 0,6 mg O2/L y el CL es de 20 % del valor de CL*, entonces es 0,12 mg O2/L.

KLA=(1,6 g

celgO 2

)

(0,6−0,12 ) mgO2L

KLA=3333,3 gcel /L

PREPARACION DE SOLUCION TAMPON

A= 57.5 g ácido cítrico/250 ml P.M=192.13gr/mol

Entonces: [A]= (57.5/192.13*250)=1.19M



B= 29.41 g citrato/100 ml P.M=170.14 gr/mol

[B]= (29.41/170.14*100)=1.73M

Luego, se tomo:

157.5 ml A + 92.5 ml B ajuste pH HCl y KOH

+

250 ml Agua Destilada

Entonces tendremos que:

[A]= (1.19*157.5/500)=0.375M

[B]= (1.73*92.5/500)=0.32M

pka=3.13

pH =pka + log([sal]/[acido])

pH = 3.13 + log(0.32/0.375)

pHinicial = 3.726, se utilizó KOH para ajustar el pH a 4.2

Solución Tampón: 500 ml

pH citrato= 4.2

CÁLCULO DE LA VELOCIDAD DE AIREACIÓN ESPECÍFICA: “VVM”

vvm=2,035 ×10−4 NA ×Tε

Donde:

NA: Velocidad de Consumo de Oxigeno

T: Temperatura en °K

Ɛ: Eficiencia de Absorción



Los valores típicos de vvm:

Laboratorio: 0,5 – 2.0 vvm

El valor teórico del vvm es 0,5 g . ° KL .h

a nivel de laboratorio.

CÁLCULO DEL CAUDAL DE AIRE: “Q ”

Q=vvm ×VLDonde:

vvm: Velocidad de Aireación Específica

VL: Volumen del Líquido del Fermentador

Reemplazando: VL= 1,8 L vvm= 0,5 g.°K / l.h

Q=0,5g .° K

l. h× 1,8 L

Q=0,9Lh



L A B O R A T O R I O D E B I O P R O C E S O S G R U P O B - 4


Informe de Bioprocesos- Cla (II Unidad)

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