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OBTENCIÓN DE DIÓXIDO DE NITRÓGENO

DISEÑO Y CARACTERIZACIÓNDE UN SISTEMA SIMPLE Y ECONÓMICO PARA LA

Jael Reyes Doctora en Química

Por otro lado, el ●NO2 puede ser generado de manera normal en medios biológicos por rutas que incluyen reacciones catalizadas por enzimas peroxidasas, la autoxidación de NO y la dismutación de HNO2. El ●NO2 es capaz de reaccionar con biomoléculas, tales como aminoácidos, proteínas, lípidos y aminas secundarias. Debido a su capacidad de iniciar una secuencia de reacciones en cadena en la peroxidación lipídica, puede alterar la estructura de biomoléculas y generar otros intermediarios reactivos. Por ello, el ●NO2 es considerado un compuesto altamente tóxico y podría participar en varios procesos fisiopatológicos.

Si bien, el estudio de la reacción de ●NO2 con diferentes moléculas y biomoléculas es de vital importancia, uno de los principales problemas que se presentan al hacer estos estudios es la obtención de este gas, ya que su almacenamiento en cilindros genera el producto dimerizado, N2O4 y en Chile son pocas las empresas que lo comercializan y las enzimas que generan este gas son sensibles a cambios de pH y temperatura, lo que dificulta su manipulación. Por esta razón, en el presente estudio se caracterizó y se estandarizó un sistema simple y económico capaz de generar ●NO2 de manera continua y con parámetros conocidos.

INTRODUCCIÓN

La contaminación atmosférica es una grave amenaza para la salud en la mayoría de zonas del planeta. De acuerdo la OMS, cada año se producen más de 7 millones de muertes prematuras atribuibles a los efectos de la contaminación urbana, lo cual no es un problema exclusivo de los países más desarrollados, si no que más de la mitad de dicha carga recae sobre la población de los países en desarrollo.

Los principales contaminantes atmosféricos son los óxidos de nitrógeno, NOx (●NO2 y NO), los cuales son responsables del smog fotoquímico. En particular, el ●NO2 es un radical libre inorgánico, soluble en agua y altamente oxidante. De esta forma, el ●NO2 es importante, no sólo por sus efectos sobre la salud, sino también porque absorbe la radiación solar visible y contribuye a la visibilidad atmosférica deteriorada; como un absorbente de la radiación visible podría tener un papel directo potencial en el cambio climático global si sus concentraciones fueran lo suficientemente altas. Además, se ha determinado que una alta exposición a ●NO2 puede ser perjudicial para la salud humana. La exposición durante minutos a una hora a niveles de 50 a 100 ppm podría causar inflamación del tejido del pulmón. Es por esta razón que se han reportado estudios acerca de la reacción de ●NO2 con biomoléculas como ácido ascórbico, ácido úrico, lípidos y proteínas del plasma humano.

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(Ecuación 2); el gas generado es desplazado por arrastre con unacorriente del gas inerte, N2 y el gas de salida es conectado a la muestra en estudio. La solución se purgó con N2 para eliminar el O2 que podría estar presente en la solución. En estas condiciones, la reacción de Cu0 con HNO3 podría generar ●NO2 y NO como productos.

La Figura 1 muestra un esquema del sistema utilizado para la generación de ●NO2. La cuantificación del ●NO2 generado se hizo mediante su reacción con un exceso de antioxidante Trolox y, por lo tanto, se redujo cuantitativamente a nitrito, cuya concentración final se estimó mediante el ensayo de Griess, capaz de detectar el ●NO2 generado como producto de reacción.

Trolox + ●NO2 → Trolox (oxidado) + NO2- (3)

Se ha reportado que la proporción en que se generen estas especies depende de la concentración de HNO3 empleada. En presencia de HNO3 concentrado (en exceso) se genera mayormente ●NO2, el cual puede dimerizar a N2O4. De esta forma, en el sistema se podríangenerar las especies reactivas gaseosas NO, N2O4 y ●NO2.

La formación de NO en el sistema se determinó mediante técnicas electroquímicas, donde el NO es detectado a través de la intensidad eléctrica generada. Con este objetivo, se incubó HNO3 y Cu0 durante 2 horas y se evaluó la generación de NO. La Figura 2 muestra la concentración de NO generado a partir de una solución de HNO3 concentrado (66% en masa) en ausencia y presencia de Cu0 evaluado a tiempo cero, una y dos horas de reacción. El resultado muestra que el HNO3 concentrado genera cerca de 0,9 μM de NO, mientras que en presencia de Cu0 se generó una concentración de 1,3 y 1,5 μM de NO. Esto indicaría que en el sistema no se generó una cantidad de NO apreciable.

FIGURA 2

Concentración de NO generado en presencia de HNO3 y durante la incubación de Cu0 con HNO3.

→→

FIGURA 1

Representación del sistema empleado para la generación de ●NO2

FlujómetroHNO3N2

Cu0 + H2O Muestra

MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos: Rojo de pirogalol (PGR), NONOate dietilamina (1,1-dietil-2-hidroxi-2-nitrosohidrazina) fueron obtenidos desde Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EEUU). Cobre, ácido nítrico concentrado, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio y nitrito de sodio fueron obtenidos desde Merck (Darmstad, Alemania). Todos los compuestos fueron de grado analítico y fueron empleados tal como se recibieron.

Soluciones: Las soluciones madre de PGR (300 μM) fueron preparadas diariamente en tampón fosfato 75 mM, pH 7,4. Las soluciones de nitrito de sodio fueron preparadas en agua ultra pura.

Métodos:

Evaluación de la Generación de NO

Curva de calibrado de producción de NO: el método de calibración es el recomendado por el fabricante del equipo (WPI Inc., Sarasota, FL, EEUU) y se basa en la reacción cuantitativa:

2 KNO2 + 2KI + H2SO4 → 2 NO + I2 + H2O + K2SO4 (1)

Para esto se realizaron soluciones patrones de NO2-, las cuales produjeron óxido nítrico (NO) cuantitativamente y la respuesta de corriente eléctrica se graficó en función de la concentración de nitrito adicionada, la que corresponde a la concentración de NO generada.

Sistema de generación de NO2

La generación de ●NO2 se realizó mediante la reacción redox entre cobre metálico (Cu0) y ácido nítrico concentrado (HNO3), según la Ecuación:

Cu0 + 4HNO3 → Cu(NO3)2 + 2 NO●2 + 2H2O (2)

Esta reacción se realizó en un balón de tres bocas con una capacidad de 500 mL (equipado con una placa agitadora) adaptado con una entrada de N2. En el balón se agregaron 10 mg de Cu0 finamente pulverizado en 20 mL de agua. A esta suspensión se le agregaron 30 mL de HNO3 concentrado y se mantuvo en agitación durante 15 minutos. El ●NO2 generado se arrastró mediante un flujo de gas inerte (N2) a una cubeta que contenía una muestra oxidable capaz de reaccionar con ●NO2. La salida del gas ●NO2/N2 se mantuvo a una velocidad de flujo constante de 45 mL/min.

Determinación de la concentración de nitrito

Las concentraciones de nitrito (NO2-) se cuantificaron mediante el método de Griess [5]. Para ello, se preparó una solución con 3 mg de N-(1-naftil)etilendiamina en 3 mL de agua bidestilada (Componente A). Por otro lado, se agregaron 30 mg de sulfanilamida en 2,8 mL de agua y 0,2 mL de ácido fosfórico (componente B, reactivo de Griess). Se mezclaron 1,5 mL del componente A con 1,5 mL de reactivo de Griess. La solución estándar de nitrito se preparó adicionando 13,8mg de nitrito de sodio en 2 mL de agua bidestilada.

Se prepararon 6 muestras que contenían 100 μL de reactivo de Griess; 5, 10, 20, 40, 80 y 100 μM de nitrito y agua bidestilada hasta completar los 3 mL de volumen total en cada muestra. Las muestras se incubaron por 30 minutos y se mantuvieron protegidas de la luz a 4°C. La concentración de NO2- se determinó midiendo la absorbancia de las muestras a λ= 543 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La generación de ●NO2 se realizó de acuerdo a un sistema involucra la reacción entre Cu0 y HNO3 en un matraz redondo cerrado

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III.2.2.2. Estandarización del sistema

Posterior a la determinación de la generación de ●NO2, se procedió a estandarizar el sistema y evaluar los diferentes factores que podrían afectar la generación de ●NO2. Se evaluó el curso temporal de consumo de PGR mediado por ●NO2 mediante espectroscopía UV-visible a pH 7,4 en diferentes condiciones experimentales. Las variables estudiadas fueron:

i) volumen de HNO3ii) volumen de agua dentro del balóniii) cantidad de Cu0 yiv) velocidad de flujo de salida de la mezcla de gases ●NO2/N2.

i) Volumen de HNO3: para determinar el efecto del volumen de HNO3 adicionado, se evaluó la oxidación de PGR utilizando diferentes volúmenes de HNO3 (5, 10, 30 y 80 mL). El perfil cinéticoobtenido con 30 y 80 mL de HNO3 presentó un rápido consumo de PGR, mientras que en ausencia de HNO3 no se observaron cambios en la absorbancia de PGR (Figura 6). A partir de estos resultados se decidió utilizar 30 mL de HNO3 como volumen óptimo (adicionado a tiempo cero de incubación).

ii) Tiempo de incubación de HNO3 y Cu0: la adición de HNO3 a la mezcla Cu0/agua da inicio a la reacción redox donde se genera ●NO2 como producto. Sin embargo, se requiere conocer el tiempo inicial en el cual ●NO2 se genera de manera constante en el sistema. Con este objetivo, se evaluó el consumo de PGR a diferentes tiempos de incubación de la mezcla acuosa Cu0/HNO3.

La formación de especies oxidantes (●NO2) se determinó utilizando la sonda rojo de pirogalol (PGR, Figura 3) como sustrato oxidable (a pH 7,4). Esta sonda fue elegida debido a que ha demostrado reaccionar de manera eficiente con diferentes especies reactivas en medio acuoso como ácido hipocloroso (HOCl), y radicales peroxilo (ROO●). La Figura 4 muestra el espectro UV-visible inicial de PGR (5 μM, negro) y los obtenidos durante 20 minutos de reacción con el gas proveniente del sistema (Cu0-HNO3). Como se puede apreciar en esta figura, hay un consumo de la banda original de PGR a λ= 540 nm y se observa la aparición de una nueva banda de absorción a λ= 390 nm con formación de dos puntos isosbésticos. Un resultado similar se obtuvo durante la reacción de PGR con HOCl, y ROO● [7] [8]; lo cual se asoció a la formación de una quinona como producto de oxidación de PGR.

Por otra parte, se evaluó la generación de ●NO2 a través del consumo de la sonda ABTS. Esta sonda ha sido utilizada ampliamente para la detección de especies reactivas, en particular ●NO2.

El ABTS tiene la capacidad de reaccionar rápidamente con ●NO2 (k= 2,2x107 M-1s-1), generando el catión radical estable ABTS●+. Las características espectroscópicas de ABTS permiten evaluar su consumo a λ= 310 nm y, además permiten evaluar la formación del catión radical ABTS●+ a λ= 660 y 750 nm. La Figura 5 corresponde al espectro UV-visible inicial de la sonda ABTS (20 μM) y su consumo durante 15 minutos de reacción con el ●NO2 proveniente de la reacción entre Cu0 y HNO3. Es importante mencionar que durante la incubación de ABTS (20 μM) con el flujo de N2 procedente de una suspensión de Cu0 (sin HNO3), no se observaron cambios en su espectro inicial de absorbancia.

Conjuntamente con los resultados obtenidos empleando PGR, la generación de ABTS●+ demostró la formación de ●NO2 en el sistema Cu0 y HNO3.

FIGURA 3

Estructura química de rojo de pirogalol (PGR).

FIGURA 5

Consumo de ABTS (20 μM) inducido por ●NO2 entre 0 y 30 minutos de reacción. La solución fue incubada a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 6

Consumo de PGR (5 μM) inducido por ●NO2 utilizando diferentes volúmenes de HNO3. (●) 0 (●) 5 (●) 10 (●) 30 y (●) 80 mL de HNO3 concentrado. Condiciones del sistema: flujo de salida de 45 mL/min, 10 mg de Cu0 y 20 mL de agua destilada.

FIGURA 4

Consumo de PGR (5 μM) inducido por ●NO2 entre 0 y 20 minutos de reacción a pH 7,4 y 25°C.

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y HNO3. Esta mezcla se mantuvo en agitación constante durante cada medida realizada. A través de los perfiles de consumo de PGR se determinó que el volumen de agua adicionada (10- 100 mL) no afecta la velocidad de oxidación de PGR.

iv) Masa de Cu0: se realizaron experimentos por separado utilizando diferentes cantidades de Cu0 en el balón (0,1; 1; 10 y 50 mg), el cual contenía 20 mL de agua y 30 mL de HNO3. Al adicionar 0,1 mg de Cu0, PGR se consumió de manera considerablemente más lenta que al adicionar 1, 10 y 50 mg (Figura 9). El experimento control (en ausencia de Cu0) no mostró cambios en la absorbancia de PGR evaluada a λ= 540 nm. Se determinó adicionar 10 mg de Cu0 como cantidad óptima.

v) Velocidad de flujo de gas: la oxidación de PGR se evaluó a diferentes velocidades de flujo de salida del gas ●NO2/N2 (10, 20 y 45 mL/min). Los resultados mostrados en la Figura 10 indican que la mayor velocidad de consumo de PGR con un flujo de salida de flujo de 45 mL/min.

A partir de los resultados presentados, las condiciones óptimas escogidas para la generación de ●NO2 fueron: 20 mL de agua ultrapura, 30 mL de HNO3, 10 mg de Cu0 utilizados y una velocidadde flujo de 45 mL/min.

La estandarización del sistema fue establecida diariamente utilizando como referencia la vo de PGR 5 μM inducido por ●NO2 (a pH 7,4 y 25°C, vo= 0,45 μM/min).

Sin incubación previa de Cu0/HNO3 se observó un consumo lento de PGR para luego consumirse rápidamente (Figura 7). No obstante, cuando Cu0/HNO3 fueron preincubados durante 15 minutos se observó un consumo constante de PGR en los primeros minutos de incubación.

Con la finalidad de evaluar si la generación de ●NO2 es un proceso constante durante el tiempo de incubación de Cu0/HNO3 se realizaron experimentos de inyección consecutiva de PGR a la solución de trabajo. Esto se hizo inyectando 30 μL de PGR (concentración final 5 μM en la celda) a diferentes tiempos de incubación de Cu0 con HNO3: 15, 40, 60 y 85 minutos. La cinética deconsumo de PGR en todos estos tiempos presentó velocidades iniciales similares (Tabla 1), lo cual confirma una producción constante de ●NO2 en el sistema (Figura 8).

iii) Volumen de agua: se adicionaron diferentes volúmenes de agua al balón: 0, 10, 20, 40 y 100 mL y posteriormente se adicionó Cu0

FIGURA 9

Perfil cinético de consumo de PGR (5 μM) inducido por ●NO2 utilizando diferentes cantidades de Cu0. Control (●) 0,5 mg (●) 1 mg (●) 10 mg (●) y 50 (●) mg de Cu0. Condiciones del sistema: 30 mL de HNO3, 20 mL de agua destilada y flujo de salida de 45 mL/min. Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 10

Perfil cinético de consumo de PGR (5 μM) inducido por ●NO2 utilizando diferentes velocidades de flujo. 10 (●) 20 (●) y 45 (●) mL/min. Condiciones del sistema: 30 mL de HNO3 , 10 mg de Cu0 y 20 mL de agua destilada. Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 7

Perfil cinético de consumo de PGR (5 μM) inducido por ●NO2 a tiempo cero de adición de HNO3 (●) y a los 15 minutos de adicionar HNO3 (●). Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 8

Perfil cinético de consumo de PGR (5 μM) adicionado a diferentes tiempos deincubación de Cu0/HNO3. La solución fue incubada a pH 7,4 y 25°C.

Tabla 1. Velocidad inicial de consumo de PGR en función del tiempo de incubación

Tiempo de incubaciónCu0-HNO3/ min

15

40

60

85

v0 PGR /μM min-1

0,44

0,43

0,47

0,45

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III.2.2.3. Determinación de la velocidad de generación de ●NO2

La Figura 11 presenta la dependencia de la velocidad inicial de consumo de PGR mediado por ●NO2 en función de su concentración inicial. Se observa que hasta una concentración 20 μM la reacción siguió un orden uno en PGR, mientras que por sobre esta concentración inicial de ustrato se observó un orden cero con respecto a PGR. En estas condiciones (orden cero en PGR) y tomando en cuenta que PGR ha demostrado reaccionar con especies oxidantes con una estequiometría de dos moléculas de especie reactiva por cada molécula de PGR, se estimó que el ●NO2 es generado a una velocidad de 1,8 μM/min.

III.2.2.4. Cuantificación de ●NO2

Para cuantificar la concentración de ●NO2 generado se utilizó la siguiente reacción:

●NO2 + Trolox → Trolox oxidado + ●NO2- (4)

El NO2- formado se cuantificó a través del método de Griess. Para

ello, el ●NO2 generado se redujo a NO2- a través de su reacción

con exceso de antioxidante (Trolox, 200 μM). La cuantificación de NO2

- se realizó a diferentes tiempos de incubación con Trolox utilizando una curva de calibración (Figura 12), según lo descrito en Metodología. La Figura 13 muestra que cada 20 minutos de reacción se generó una concentración de ~40 μM de NO2

-. Este resultado está de acuerdo con la velocidad de generación de ●NO2 (1,8 μM/min) evaluada mediante el consumo de PGR.

Es importante destacar que el sistema de generación de ●NO2 montado en el laboratorio requiere de una estandarización diaria. Adicionalmente, es necesario renovar cada una hora el sistema (Cu0, agua y HNO3).

CONCLUSIONES

El sistema Cu0 pulverizado con agua y HNO3 es eficiente en la generación del NO2 gaseoso, donde el ●NO2 es la especie mayoritaria y la cantidad de NO generado es despreciable. La generación de ●NO2 que presentó una mayor eficiencia es utilizando las siguientes condiciones: 20 mL de agua ultrapura, 30 mL de HNO3, 10 mg de Cu0 utilizados y la velocidad de flujo de 45 mL/min.

La estandarización del sistema se debe realizar diariamente, en este estudio se utilizó como referencia la vo de PGR 5 μM inducido por ●NO2 (a pH 7,4 y 25°C, vo= 0,45 μM/min).

FIGURA 11

Dependencia de la velocidad inicial de consumo de PGR inducido por ●NO2 en función de su concentración. Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 12

Curva de calibración de nitrito. Dependencia de la absorbancia (evaluada a λ= 543 nm) con la concentración de nitrito. Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

FIGURA 13

Concentración total (acumulada) de ●NO2 generado por el sistema Cu0/HNO3. La concentración de ●NO2 fue evaluada por el método de Griess utilizando un exceso de Trolox. Las soluciones fueron incubadas a pH 7,4 y 25°C.

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