Implementacion y Estandarizacion de Diversas Tecnicas as Para Su Aplicacion en Estudios Experiment...

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICA ESCUELA DE BIOLOGÍA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

INFORME DE TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAR POR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOGÍA

IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN

ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA.

ADRIANA J. SABORÍO ARCE

PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

CARTAGO, 2008

INSTITUTO TECNOLÓGIC

INGENIERÍA EN BIOTEC

INFORME DE TRABAJOPOR EL GRADO DE BACH

IMPLEMENTACIÓN Y ESTTÉCNICAS HISTOLÓGICA

ESTUDIOS EXPERIMENTA

ADRIANA

PROGRAMA DE UNIVERSIDAD DE COSTA

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICAESCUELA DE BIOLOGÍA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAPOR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOG

IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVETÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN

ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE

ADRIANA J. SABORÍO ARCE

PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN EN NEUROCIENCIAS

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

CARTAGO, 2008

O DE COSTA RICA

GRADUACIÓN PARA OPTAR ILLER EN BIOTECNOLOGÍA

ANDARIZACIÓN DE DIVERSAS S PARA SU APLICACIÓN EN LES CON CEREBRO DE RATA.

ROCIENCIAS

IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA

Informe presentado a la Escuela de Biología del

Instituto Tecnológico de Costa Rica como requisito parcial

para optar por el título de Bachiller en Ingeniería en Biotecnología.

Miembros del Tribunal

______________________________ Jaime Fornaguera Trías, Ph.D.

Profesor asesor

______________________________ Maritza Guerrero Barrantes, MSc.

Profesora asesora

______________________________ Giovanni Garro Monge, MSc.

Lector

“Toda obra grande es el resultado de una gran pasión

puesta al servicio de una idea”

- Santiago Ramón y Cajal

i

IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE DIVERSAS TÉCNICAS HISTOLÓGICAS PARA SU APLICACIÓN EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES CON CEREBRO DE RATA

Adriana J. Saborío Arce 1

En el Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica se realizan estudios conductuales y neuroquímicos sobre ciertas enfermedades neurodegenerativas que involucran ratas albinas como animales de experimentación. La introducción de protocolos estandarizados de corte y tinción de tejidos por medio de métodos y sistemas biotecnológicos específicos, resulta fundamental para el estudio, la investigación y el análisis cuidadoso del cerebro de estos roedores. Esto permitiría entender los cambios funcionales y estructurales ocurridos en ellos bajo ciertas condiciones y al mismo tiempo permite la comparación entre diferentes grupos experimentales sometidos a condiciones diversas. El objetivo de esta investigación fue implementar varias técnicas de corte y tinción de cerebros de rata para el reconocimiento de regiones tanto sanas como disfuncionales. Para ello, se estandarizó un protocolo para el corte de las muestras utilizando el criostato Leica CM3050 S, y se definieron varios criterios: los cerebros de rata deben trabajarse a una temperatura de -26ºC, cortarse a una velocidad de 42 mm/s y deben tener un grosor mínimo de 25µm. Además, se desarrollaron protocolos de tinción de estos cortes utilizando los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, los cuales permitieron la visualización microscópica de algunas estructuras presentes en los cortes cerebrales. Se logró además identificar diferentes tipos de células nerviosas y de la neuroglia en regiones de interés (hipocampo, sustancia nigra, etc.). Por último, y para resaltar una de las aplicaciones de los protocolos desarrollados, se realizó una evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson y se logró determinar el punto exacto de llegada de una cánula, introducida unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague Dawley.

Palabras clave: Criostato, Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina, Eosina, Luxol Fast Blue, Sprague Dawley

1 INFORME DE TRABAJO FINAL DE GRADUACIÓN PARA OPTAR POR EL GRADO DE BACHILLER EN BIOTECNOLOGÍA, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Cartago, Costa Rica. 2008.

ii

Dedicatoria

A mis queridos padres por su apoyo y confianza en mis años de estudio,

A mi hermano, por siempre estar ahí para mi y alentarme en todo momento,

A mi abuela Anita, por sus consejos durante toda su vida.

iii

Agradecimientos

La autora desea expresar su agradecimiento a las siguientes personas y/o instituciones

por sus valiosos aportes en el desarrollo de esta investigación:

A Dios, por darme la vida, por brindarme salud y fortaleza en cada momento, y por

las personas que puso en mi camino.

A mis padres, Licda. Virginia Arce Cortés y Lic. Arturo Saborío Alfaro; por su mejor

herencia: mis estudios.

Al Dr. Jaime Fornaguera Trías, director del Programa de Investigación en

Neurociencias (PIN) de la Universidad de Costa Rica; por brindarme la oportunidad

de realizar la práctica en el PIN y por su orientación, paciencia y labor de dirección

que emprendió con sabiduría en este proceso.

A la MSc. Maritza Guerrero Barrantes, profesora de la Escuela de Biología del

Instituto Tecnológico de Costa Rica; por su apoyo incondicional, su dirección y

asesoría técnica durante este trabajo.

Al Técnico Médico Juan José Ramírez Aguilar; por consejos y ayuda incondicional

que hicieron posible la presente investigación.

A todas las personas que trabajan en el PIN; por su compañerismo y amabilidad.

A los profesores, amigos y colegas del ITCR; por sus enseñanzas y todos los

momentos inolvidables que hemos vivido.

Finalmente, a todas las personas que se cruzaron en mi camino y que me dieron

palabras de aliento y apoyo para lograr mis objetivos.

iv

Índice General

Resumen ..................................................................................................................................... i

Dedicatoria ................................................................................................................................ ii

Agradecimientos ....................................................................................................................... iii

Índice General .......................................................................................................................... iv

Índice de Figuras ....................................................................................................................... v

Índice de Cuadros ................................................................................................................... viii

Índice de Anexos ...................................................................................................................... ix

Índice de Apéndices .................................................................................................................. x

Introducción .............................................................................................................................. 1

Revisión de Literatura ............................................................................................................... 3

Generalidades del Sistema Nervioso ............................................................................ 3

El cerebro de la rata ...................................................................................................... 6

Las técnicas histológicas .............................................................................................. 8

Colorantes para tejido nervioso .................................................................................. 12

Estudio experimental con cerebro de rata ................................................................... 14

Objetivos: General y Específicos ............................................................................................ 15

Materiales y Métodos .............................................................................................................. 16

Localización del estudio ............................................................................................. 16

Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato .................................................................... 16

Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata ........... 21

Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson .... 24

Resultados ............................................................................................................................... 26

Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato .................................................................... 26

Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata ........... 29

Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de Parkinson .... 43

Discusión ................................................................................................................................. 49

Conclusiones ........................................................................................................................... 57

Recomendaciones .................................................................................................................... 58

Bibliografía.............................................................................................................................. 60

Anexos ..................................................................................................................................... 64

Apéndices ................................................................................................................................ 67

v

Índice de Figuras Número Título Página

1 Esquema de una neurona y sus partes (Geneser, 2000). 4

2 Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).

6

3 Planos de corte de un cerebro de rata utilizados en estudios histológicos (Paxinos y Watson, 1998).

7

4 Corte coronal de cerebro de rata que muestra la región del hipocampo, en color verde, y de la sustancia nigra, en color morado (Wei, 2007).

8

5 Diferentes tipos de micrótomos utilizados para obtener cortes histológicos (Instrumental Parteur, 2008; Labequim, 2004; Labequim, 2005; Leica, 1996; Leica, 2000).

10

6

Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).

13

7 Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados durante el trabajo experimental. A) muestra almacenada a temperatura ambiente en una solución fijadora. B) muestra almacenada a -30°C sin solución fijadora.

16

8 Fotografía del criostato Leica CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.

17

9

Fotografía de una muestra de cerebro de rata albina dentro de la cámara del criostato Leica, modelo CM3050 S. A) muestra montada en la “platina porta-muestras”. B) “bloque de congelación rápida”. C) “termobloque”.

18

10 Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloque” del criostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.

19

11

Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.

24

12

Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio histológico de un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se señala con una flecha la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.

25

13 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).

31

vi

Número Título Página

14

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).

31

15 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).

32

16 Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 400X).

32

17 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

34

18

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

34

19 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

35

20

Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).

35

21 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

37

22

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

37

23 Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

38

24

Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).

38

vii

Número Título Página

25

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

41

26

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).

41

27

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

42

28

Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).

42

29 Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

44

30 Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (100X).

44

31 Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

45

32 Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (400X).

46

33

Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).

47

34

Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

48

35

Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

48

viii

Índice de Cuadros Número Título Página

1

Resultados de la evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.

26

2

Resultados de la evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.

27

3

Resultados de la evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.

28

ix

Índice de Anexos Número Título Página

1 Panel de mandos del Criostato Leica CM3050 S (Leica, 2000). 60

2 Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con (3-Aminopropyl)- triethoxysilane (Sigma, A3648).

61

3 Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con gelatina (Food Grade-Merck, #1.04078.0500).

62

x

Índice de Apéndices Número Título Página

1 Protocolo para el corte de los cerebros de rata utilizando el criostato Leica CM3050 S.

63

2 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Azul de Metileno (Modificado a partir del protocolo de Rüdeberg (1967)).

64

3 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Aldana et al. (1996)).

65

4 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Hematoxilina y Eosina (Modificado a partir del protocolo de Bush (1877)).

66

5 Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de grosor, con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Klüver y Barrera (1954)).

67

6 Resultados y características del tratamiento histológico realizado a los cuarenta cerebros de rata en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

68

1

Introducción

La histología es una disciplina morfológica, que se fundamenta en la

observación e identificación de las células y su entorno, el material extracelular, y

sienta las bases estructurales para entender posteriormente las transformaciones que

tienen lugar en condiciones normales y en condiciones patológicas en el organismo

(Geneser, 2000). Existen varios instrumentos, como el microscopio, y otras ramas de

la ciencia, como la bioquímica, la fisiología, la inmunología y la patología, que han

contribuido a ampliar el campo de estudio de la histología, logrando que en la

actualidad se estudie en el contexto de la histoquímica, la histofisiología, la

inmunohistoquímica y la histopatología (Junqueira y Carneiro, 1996). Con la

neurohistología, por tanto, se fusionan todas estas áreas con el fin de permitir el

estudio de los componentes estructurales del sistema nervioso.

La ciencia contemporánea se diferencia de la antigua en la investigación y

elaboración de técnicas con tecnologías cada vez más automatizadas, y en este

aspecto, la biotecnología se visualiza como una expresión conceptual de la ciencia y

la técnica y sus consecuencias en la medicina moderna (Santi, 2006). El curso actual

de la biotecnología pretende dar un panorama general de las técnicas vigentes más

utilizadas, los productos y equipos más precisos, y proporciona un enfoque del

conocimiento y suministro de herramientas que facilitan un mejor estudio, control y

pronóstico en la medicina predictiva y preventiva, y finalmente en el diagnóstico de

enfermedades, junto a la patología (Carson, 1997). Asimismo, los métodos

histológicos son importantes para el estudio de los tejidos y sus componentes

celulares con fines diagnósticos, de enseñanza e investigación (UMSNH, 2007).

En el Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa

Rica se realizan proyectos de investigación conductuales y neuroquímicos, enfocados

en enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, y que involucran a ratas

albinas como animales de experimentación. Resulta fundamental, por tanto, el

2

desarrollo de técnicas histológicas de corte y tinción con el fin de estudiar lo que

sucede anatómicamente en el cerebro de estos roedores de forma macro y

microscópicamente.

Por lo tanto, el desarrollo de protocolos estandarizados de corte y tinción de

tejidos, en instituciones como la Universidad de Costa Rica, por medio de métodos y

sistemas biotecnológicos específicos, se perfila como una necesidad para el estudio,

la investigación y el análisis cuidadoso de los componentes de las muestras

histológicas, con el fin de obtener un alto porcentaje de éxito, con resultados

replicables, en estudios experimentales que beneficien a la sociedad. Con la presente

investigación se pretenden implementar diversas técnicas de corte y tinción para el

reconocimiento de regiones cerebrales de ratas en el Laboratorio de Histología del

Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.

3

Revisión de Literatura

• Generalidades del Sistema Nervioso

En este estudio es fundamental describir y ubicar los componentes

estructurales más importantes del sistema nervioso; por tanto, seguidamente se

puntualizan algunos aspectos generales al respecto.

En los mamíferos, el sistema nervioso comprende el tejido que recibe

estímulos del medio ambiente, los transforma en impulsos nerviosos, y los envía a

zonas de recepción, donde son interpretados y devueltos a los órganos efectores para

integrar respuestas adecuadas. Estas funciones son llevadas a cabo por las neuronas

que, junto con células de sostén y material extracelular, forman el sistema nervioso

(Leeson y Leeson, 1983).

El sistema nervioso se divide anatómicamente en: a) sistema nervioso central

(SNC), compuesto por el encéfalo y la médula espinal, que están protegidos por

envolturas óseas, que son el cráneo y la columna vertebral respectivamente, y b)

sistema nervioso periférico (SNP), formado por los nervios y los ganglios nerviosos,

que son pequeños agregados de células nerviosas (Junqueira y Carneiro, 1996). La

mayoría de las neuronas de los mamíferos se encuentran en el SNC y, desde el punto

de vista histológico, se caracterizan como un epitelio (tejido formado por una o varias

capas de células yuxtapuestas) muy especializado, dado que las células están

densamente empaquetadas y unidas por contactos celulares frecuentes (sinapsis)

(Geneser, 2000; Leeson y Leeson, 1983).

El tejido nervioso está constituido por dos elementos principales: las neuronas

y la neuroglia. La neurona es la unidad estructural y funcional del sistema nervioso y

consiste en el cuerpo de la célula nerviosa con todas sus prolongaciones (Fig. 1).

Posee características morfológicas típicas que sustenta sus funciones: un cuerpo

celular o soma, que generalmente

prolongaciones citoplasmáticas

relación con el tamaño celular

dendritas (gr. dendrites, á

celular; y la prolongación larga, en forma de cono,

conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana

2000).

Figura 1. Esquema de una neurona

La mayoría de las neuronas tiene un solo axón y suelen tener muchas

dendritas; por lo que las neuronas se pueden clasificar según las cantidad de

prolongaciones que se extienden desde el cuerpo neuronal: la neurona multipolar

tienen un axón y dos dendri

dendrita, y la neurona unipolar o pseudounipolar tiene el axón que se divide cerca del

soma neuronal en dos largas prolongación (Ross

4

generalmente es de forma poligonal, esférico o angular, emite

prolongaciones citoplasmáticas y comprende al núcleo, que es redondo y grande en

relación con el tamaño celular; las prolongaciones cortas ramificadas se denominan

, árboles) y generalmente transmiten impulsos hacia el soma

; y la prolongación larga, en forma de cono, se designa axón (gr.

conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana

Esquema de una neurona y sus partes (Geneser, 2000)




tienen un axón y dos dendritas o más, la neurona bipolar posee un axón y una


soma neuronal en dos largas prolongación (Ross et al., 2005).

o angular, emite

l núcleo, que es redondo y grande en

; las prolongaciones cortas ramificadas se denominan

lsos hacia el soma

(gr. axon, eje) y

conduce los impulsos desde el soma hacia otra neurona u órgano diana (Geneser,

).




tas o más, la neurona bipolar posee un axón y una


5

La neuroglia (gr. glía, pegamento), son células especiales que además de darle

sostén a las neuronas, participan en la actividad neural, en la nutrición de las neuronas

y en los procesos de defensa del tejido nervioso (Junqueira y Carneiro, 1996). En los

cortes histológicos habituales del SNC, las células nerviosas y sus prolongaciones

siempre están rodeadas por pequeños núcleos dispersos pertenecientes a las células de

la glía, de las cuales se establece que en proporción hay, aproximadamente, y

dependiendo de la región, de diez a cincuenta células neuróglicas por cada neurona

(Leeson y Leeson, 1983). De este tipo celular se diferencian los astrocitos (gr. astron,

estrella) que son células con forma de estrella y numerosas prolongaciones

citoplasmáticas, los oligodendrocitos (gr. oligos, pocos) que producen la vaina de

mielina, y la microglia, que son células macrofágicas y forman parte del sistema

mononuclear fagocítico (Geneser, 2000; Leeson y Leeson, 1983).

En el SNC hay cierta separación entre los somas celulares de las neuronas y

sus prolongaciones, lo que hace que se identifiquen en el encéfalo y en la médula

espinal dos partes distintas, la sustancia blanca y la sustancia gris (Geneser, 2000). La

sustancia gris, que se denomina así porque muestra esta coloración cuando se observa

macroscópicamente, está formada por los cuerpos celulares de las neuronas, fibras

amielínicas, y algunas fibras mielínicas, astrocitos protoplasmáticos, oligodendrocitos

y células de la microglia. La sustancia blanca no contiene somas celulares de

neuronas y está constituida por fibras mielínicas, oligodendrocitos, astrocitos fibrosos

y células de la microglia. Su nombre se debe a la presencia de gran cantidad de un

material blanquecino, denominado mielina, que envuelve los axones de las neuronas

(Geneser, 2000; Junqueira y Carneiro, 1996).

• El cerebro de la rata

La experimentación animal

y aclarar fenómenos biológicos sobre

animal de experimentación es una de las piezas

tanto en los proyectos de investigación

controles de los productos farmacológicos

Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más selecciona

investigación en neurociencias; entres estas se puede citar que: 1) son individuos con

un tamaño adecuado, es decir, son lo suficientemente pequeños

fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente gr

(Fig. 2) lo que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son

individuos muy resistentes a las infecciones; y 3)

anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen

modelos experimentales

Figura 2. Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).

En estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos

anatómicos principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.

6

El cerebro de la rata

La experimentación animal es una actividad que tiene como misión evidenciar

y aclarar fenómenos biológicos sobre individuos determinados (UMSNH, 2007)

animal de experimentación es una de las piezas fundamentales en la biomedicina,

tanto en los proyectos de investigación, como en las pruebas diagnósticas y en los

controles de los productos farmacológicos (Paxinos y Watson, 1998).

Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más selecciona


un tamaño adecuado, es decir, son lo suficientemente pequeños lo que permite su

fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente gr

que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son

individuos muy resistentes a las infecciones; y 3) por sus características cerebrales,

anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen

elos experimentales (Paxinos y Watson, 1998).

Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).

estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos

principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.

una actividad que tiene como misión evidenciar

(UMSNH, 2007). El

fundamentales en la biomedicina,

sticas y en los

Existen varias razones por las que la rata es el sujeto más seleccionado para la


que permite su

fácil manipulación en el laboratorio y poseen un cerebro lo suficientemente grande

que facilita su localización estereotáxica de ciertas áreas cerebrales; 2) son

por sus características cerebrales,

anatómicas y bioquímicas, similares a las del ser humano, se constituyen en buenos

Fotografía de un cerebro de rata adulta que muestra su tamaño (25,28mm de largo).

estudios histológicos, el cerebro de la rata suele cortarse en tres planos

principales, a saber: plano coronal, plano sagital y plano horizontal (Fig.

3), y dependiendo del estudio histológico por realizar así se

corte se debe ejecutar (

coordenadas de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales

Bregma, Lambda e Interaural

esta especie de animales

Plano coronal

Figura 3. Planos de corte de y Watson, 1998).

El cerebro de la rata, al igual que el del resto de mamíf

secciones, hemisferios, lóbulos, córtex, áreas,

de interés dos zonas importantes: la región h

(Fig. 4), puesto que en el PIN se realizan investigaciones

asociadas a estos sectores cerebrales

estructura comprendida entre la corteza cerebral y el tálamo,

algunos neurotransmisores importantes, entre estos serotonina y acetil

un papel importante en la memoria, el aprendizaje y la

2007). La sustancia nigra

importante del sistema de ganglios basales

control motor, por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de

Parkinson; además, muestra dos principales divisiones que son fácilmente

7

dependiendo del estudio histológico por realizar así se determina cuál plano

(Beresford, 2000; Paxinos y Watson, 1998). Para definir las

s de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales

Bregma, Lambda e Interaural, que se obtienen del Atlas estereotáxico específico para

esta especie de animales (Paxinos y Watson, 1998).

Plano sagital Plano horizontal

Planos de corte de un cerebro de rata utilizados en estudios histológicosy Watson, 1998).

El cerebro de la rata, al igual que el del resto de mamíferos, se divide en

secciones, hemisferios, lóbulos, córtex, áreas, etc. (Walter, 1963). En este estudio son

erés dos zonas importantes: la región hipocampal y la zona de la sustancia nigra

, puesto que en el PIN se realizan investigaciones que involucran las funciones

asociadas a estos sectores cerebrales. El hipocampo o cuerno de Amón

estructura comprendida entre la corteza cerebral y el tálamo, donde se localizan

algunos neurotransmisores importantes, entre estos serotonina y acetilcolina,

un papel importante en la memoria, el aprendizaje y la orientación espacial

gra es una porción heterogénea del mesencéfalo y un elemento

importante del sistema de ganglios basales, es la zona que lleva a cabo

por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de

muestra dos principales divisiones que son fácilmente

determina cuál plano de

ara definir las

s de cada plano de corte, se hace referencia a las suturas craneales

, que se obtienen del Atlas estereotáxico específico para

lano horizontal

utilizados en estudios histológicos (Paxinos

eros, se divide en

este estudio son

ipocampal y la zona de la sustancia nigra

que involucran las funciones

o cuerno de Amón es una

donde se localizan

colina, y juega

orientación espacial (Escobar,

es una porción heterogénea del mesencéfalo y un elemento

, es la zona que lleva a cabo la función de

por lo que se estudia mucho en modelos de la enfermedad de

muestra dos principales divisiones que son fácilmente

diferenciadas por sus neurotransmisores: la sustancia nigra reticulada (SNR) que es la

región más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra

compacta (SNC) que contiene altas concentraciones de dopamina (Abdala, 1998).

Figura 4. Corte coronal de cerebro de rata que muestra la verde, y de la sustancia

• Las técnicas histológicas

Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo

al avance tecnológico, lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta

área (Junqueira, 1988). S

de la muestra, de: fijación, deshidratación

conocer el propósito de cada paso de esta técnica, con el fin de entender la evolución

de las posteriores (Alzola, 2001).

La fijación permite

cuales tienen como fin mantener las estructuras al generar la formación de enlaces

entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación

aumentando su dureza, destruyendo bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en

8


más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra


Corte coronal de cerebro de rata que muestra la región del hipocampo, en color ustancia nigra, en color morado (Wei, 2007).

Las técnicas histológicas

Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo

lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta

Se trata de una técnica que incluye los pasos previos al corte

de: fijación, deshidratación, aclaramiento e inclusión; es importante


es (Alzola, 2001).

permite dar tratamiento a los tejidos con sustancias químicas, las


entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación



más voluminosa y sus neuronas contienen GABA; y la sustancia nigra


ipocampo, en color

Las técnicas histológicas han sido mejoradas con el pasar del tiempo, gracias

lo cual ha permitido optimizar el quehacer científico en esta

previos al corte

e inclusión; es importante


tratamiento a los tejidos con sustancias químicas, las


entre las proteínas constituyentes del tejido, logrando una conservación de los tejidos,


9

estos e interrumpiendo los procesos celulares dinámicos que ocurren con la muerte

celular (Alzola, 2001; Beresford, 2000). Después de que la muestra ha sido fijada, se

elimina el fijador, por lavado en agua o en alcohol, y se deshidratan los tejidos, en

forma progresiva, con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos hidratados (70°,

80°, 90°, 96°, 100°) (Beresford, 2000). El aclaramiento permite que el alcohol de los

tejidos sea reemplazado por un líquido (solvente) que disuelva el medio de inclusión

con el cual el tejido va a ser impregnado (Alzola, 2001). En la inclusión o

impregnación los tejidos se envuelven en una sustancia de consistencia firme, que

permite obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio; las

sustancias usadas para este fin en microscopía óptica son la gelatina, la celoidina, el

polietilenglicol y la parafina (Alzola, 2001; Geneser, 2000).

El paso a seguir en el procesamiento histológico es el corte o sección de la

muestra, con el cual se corta el tejido en láminas lo suficientemente delgadas (0,5 -

20µm) como para permitir, en el microscopio, el paso de la luz a través de él; las

secciones finas y parejas se obtienen con el micrótomo (Alzola, 2001; Beresford,

2000).

El micrótomo es un instrumento de gran precisión que proporciona cortes

delgados, lisos y de espesor graduable (UAB, 2005). Se han desarrollado cinco tipos

de micrótomos (Fig. 5), y seguidamente se da una breve descripción de cada uno

(Aimale y Gatti, 2008). En el micrótomo de deslizamiento el tejido queda fijo

mientras la cuchilla se desliza por unas guías especiales. En el tipo Minot o de

rotación la cuchilla queda fija y el tejido se desliza sujeto a una platina. El micrótomo

de congelación es semejante al micrótomo de deslizamiento, pero la cuchilla no se

desliza, sino que gira sobre un eje, y utiliza gas carbónico para el congelamiento de la

muestra. El criostato consta de un micrótomo tipo Minot incluido en una cámara de

congelación, normalmente a -20º C, que utiliza gas freon para este fin. Finalmente, el

ultramicrótomo que se distingue de los anteriores en que secciona los tejidos con una

hoja de vidrio o diamante (Aimale y Gatti, 2008; UAB, 2005).

10

Micrótomo de deslizamiento Micrótomo de rotación

Leica SM 2000R Leica RM 2155

Micrótomo de Congelación Criostato Leitz 1213 Leica CM3050 S

Ultramicrótomo

Leica Ultracut UCT

Figura 5. Diferentes tipos de micrótomos utilizados para obtener cortes histológicos (Instrumental Parteur, 2008; Labequim, 2004; Labequim, 2005; Leica, 1996; Leica, 2000).

Una modificación de la metodología anterior de preparación de la muestra,

que incluía los pasos de fijación, deshidratación, aclaramiento e inclusión, surgió al

utilizar la técnica de congelación de tejidos, sumergiendo la muestra de tejido en

11

nitrógeno líquido para obtener una congelación rápida, y luego se corta con un

micrótomo de congelación (Aimale y Gatti, 2008).

En la actualidad, el criostato es un aparato más elaborado y eficiente para los

cortes de congelación, ya que permite la obtención de cortes mucho más delgados y

sin pasar por todas las etapas descritas antes, es decir, no se requiere un tratamiento

previo de la muestra (Aimale y Gatti, 2008). En un criostato, el volante de inercia que

controla la realización del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el

mecanismo de avance están situados dentro de la cámara fría (Leica, 2000). Pese a la

disposición horizontal de la cuchilla, la obtención de secciones seriadas es posible

gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a

deslizarse sobre la superficie de la cuchilla (Aimale y Gatti, 2008). En los modelos

más modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, así como enfriar

rápidamente la muestra a -60º C debido a la existencia de una placa de congelación

instantánea (Leica, 2000). Si se requieren cortes más delgados (ultrafinos), de

aproximadamente 25 a 100 nm de espesor, se utiliza el ultramicrótomo, que se

emplea principalmente en microscopía electrónica y para cortes extremadamente

duros y compactos, por ejemplo, huesos, dientes, especímenes minerales, fibra de

vidrio, cerámica, porcelana, entre otros (UAB, 2005).

Finalmente, la última etapa del proceso histológico consiste en la tinción de

los cortes, y este paso es fundamental, ya que permite la visualización de los tejidos y

sus componentes al microscopio. Existen colorantes generales y otros específicos, y

permiten poner de manifiesto tanto la topografía tisular, como tipos celulares

concretos, determinados orgánulos, estructuras intracelulares, celulares y

extracelulares (Junqueira y Carneiro, 1996). Las tinciones histológicas utilizan

colorantes que se eligen en función de su capacidad de interactuar con los diferentes

constituyentes de los tejidos (Leeson y Leeson, 1983). Todos los métodos de tinción

requieren siempre una adaptación o modificación para ser utilizados correctamente;

aunque conviene tener presente que la técnica de tinción en sí misma no es una

12

técnica aislada, sino que forma parte integral de todo el proceso histológico (Geneser,

2000).

En un corte de tejido, el esqueleto proteico y muchas otras macromoléculas

contienen grupos ionizables, capaces de formar uniones salinas con los colorantes; y

de acuerdo con este principio, los colorantes pueden clasificarse en iónicos y no-

iónicos, y a su vez, los colorantes iónicos se clasifican en ácidos, básicos y neutros

(Geneser, 2000). Un colorante iónico ácido (aniónico) tiñe grupos tisulares con carga

positiva (estructura tisular acidófila); por el contrario, un colorante iónico básico

(catiónico) tiñe grupos tisulares con carga negativa (estructura tisular basófila); y un

colorante iónico neutro es aquel que tiene un principio colorante aniónico y otro

principio colorante catiónico (UAB, 2005).

• Colorantes para tejido nervioso

Ciertos colorantes permiten la tinción de cortes de tejido nervioso, entre éstos

se pueden citar: El Azul de Metileno, que es un colorante catiónico, el cual tiñe, de

color azul-violeta, unos grumos muy basófilos en el citoplasma de las células

neuronales, denominados corpúsculos de Nissl (Beresford, 2000; Geneser, 2000). El

Cresyl Fast Violet tiñe de color azul oscuro-violeta los corpúsculos de Nissl y de

color morado/azul las neuronas y núcleos celulares (Aldana et al., 1996; Beresford,

2000). El Luxol Fast Blue tiñe la mielina de color azul y las neuronas color celeste

debido a su alta afinidad por los lípidos y bases de colina, y por tanto, de la mielina

(IHC World, 2007b). La Hematoxilina y Eosina, que son colorantes catiónico y

aniónico, respectivamente, y permiten observar los núcleos neuronales de color

morado, el citoplasma en color rosado y los glóbulos rojos en color naranja o rojo

(UAM, 2007). De estos colorantes, la Hematoxilina es el único de origen natural,

extraído de la madera del árbol Haematoxylon campechianum; y con el fin de

emplearse como colorante debe oxidarse a hemateína, mediante oxidación espontánea

con el oxígeno atmosférico (García, 1993). Además, entre estos, la Eosina y el Cresyl

Fast Violet son dos colorantes muy utilizados como contratinciones, es decir, que

debido a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares

que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se util

conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet

1993; Leeson y Leeson, 1983

El soporte químico de la mayor parte de los colorantes son

presentes entre los átomos de carbono de

benceno, los cuales no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los

derivados del benceno, y en consecuencia, los diversos colorantes

benceno es originariamente una sustancia incolora, aunque suscep

radiación dentro del espectro de la luz ultravioleta, pero si en un momento

determinado se produce la fijación de los dobles enlaces, dentro del anillo, por ocurrir

alguna reacción química sobre éste

absorber radiación luminosa dentro del espectro visible y mostrar color (Fig. 6)

(García, 1993).

Azul de Metileno

Eosina Y

Figura 6. Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).

13


a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares

que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se util

conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet

Leeson y Leeson, 1983).

El soporte químico de la mayor parte de los colorantes son los dobles enlaces

entre los átomos de carbono de los anillos aromáticos derivados del

no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los

derivados del benceno, y en consecuencia, los diversos colorantes (García, 1993)

benceno es originariamente una sustancia incolora, aunque susceptible de absorber



alguna reacción química sobre éste y el derivado bencénico que se obtiene


Cresyl Fast Violet Hemateína

Eosina Y Luxol Fast Blue

Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de estructuras del sistema nervioso (García, 1993).


a sus colores contrastantes se usan para teñir ciertos componentes tisulares

que no son visibles con el colorante principal; por ejemplo, cuando se utiliza en

conjunto la Hematoxilina y Eosina o el Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (García,

os dobles enlaces

romáticos derivados del

no son fijos y, por tanto, pueden ser reordenados y causar los

(García, 1993). El

tible de absorber



el derivado bencénico que se obtiene puede


Hemateína

Estructuras químicas de los colorantes empleados en este estudio para la tinción de

14

• Estudio experimental con cerebro de rata

Con el fin de aplicar las técnicas histológicas en tejido cerebral de rata, en este

trabajo se evalúa un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Los modelos

animales son una herramienta vital para estudiar el origen y la evolución de las

enfermedades neurodegenerativas. Uno de los modelos más utilizados en el estudio

de la enfermedad de Parkinson es el modelo de lesión unilateral de la vía

nigroestriatal con neurotoxinas, debido a que la evidencia neuropatológica más

consistente en los pacientes con Parkinson es la pérdida de las neuronas pigmentadas

de la sustancia nigra (Martin, 1999). En este modelo se inyecta una toxina

unilateralmente en la zona de la sustancia nigra compacta (SNC) y después de un

periodo determinado se analiza la conducta de los animales, que es muy

característica. Este modelo ha sido y es uno de los más utilizados en el estudio de los

procesos subyacentes a la enfermedad de Parkinson (Woodruff y Nonneman, 1994).

Por tanto, en el modelo a evaluar se utilizó una de las cuatro miotoxinas que

se han aislado y purificado del veneno de la serpiente Terciopelo (Bothrops asper), la

miotoxina III (MT-III). La MT-III estructuralmente se caracteriza como una

fosfolipasa A2 (PLA2) de la clase IIA, un tipo de enzima hidrolítica presente en el

desarrollo de muchos procesos celulares (Kaiser et al., 1990). Se espera que la MT-III

presente una actividad fisiopatológica, de tipo neurotóxica, y que produzca una lesión

neuronal; es por ello que se compara la acción de esta miotoxina, contra sí misma,

bloqueando su sitio catalítico por alquilación de los grupos hidroxilo de los

aminoácidos serina y tirosina de su secuencia.

15

Objetivos

• Objetivo General

Implementar diversas técnicas de corte y tinción de cerebro de rata para el

reconocimiento de regiones tanto sanas como disfuncionales.

• Objetivos Específicos

Los objetivos específicos de esta investigación son los siguientes:

− Estandarizar los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y grosor para

el corte de cerebros de rata en el criostato.

− Estandarizar los protocolos de tinción con los colorantes Azul de Metileno,

Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast

Violet, en los cortes de cerebro de rata.

− Reconocer y caracterizar al microscopio, mediante diferentes tinciones, tejido

cerebral sano y disfuncional.

− Determinar el punto exacto de llegada de una cánula, introducida

unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague Dawley, con

el fin de utilizarlo como control en el modelo conductual de la enfermedad de

Parkinson.

Materiales y métodos

• Localización del estudio

El estudio se realizó en el laboratorio de Histología del Programa de

Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica,

Campus Universitario Rodrigo Facio, San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa

Rica.

• Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y

grosor en los cortes

Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con

diferentes de “tratamiento previo” de las muestras de cerebro de rata. Unas muestras

se encontraban almacenadas

Eppendorf con una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo

fin era deshidratar y conservar a los tejidos

de la extracción cuidadosa de

un beaker con una solución salina al

de tal forma que permitiera deshidratar la

almacenaron a -30°C por un periodo de día y medio (Fig. 7).

Figura 7. Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados A) muestra almacenamuestra almacena

A

16

estudio


Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica, ubicado en el


Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y

s de cerebros de rata en el criostato

Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con


se encontraban almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos

solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo

fin era deshidratar y conservar a los tejidos. Las otras muestras se obtuvieron a partir

la extracción cuidadosa de los cerebros de ratas albinas, y éstas se deposit

solución salina al 0.9%, refrigerada, por un periodo de 5 minutos,

de tal forma que permitiera deshidratar las muestras; se secaron lo suficiente y se

30°C por un periodo de día y medio (Fig. 7).

Fotografías de cerebros de ratas albinas utilizados durante el trabajo experimentalalmacenada a temperatura ambiente en una solución

muestra almacenada a -30°C sin solución fijadora.

B


ubicado en el


Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y

Es importante resaltar que en este trabajo se experimentó con dos tipos


a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos

solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, cuyo

. Las otras muestras se obtuvieron a partir

se depositaron en

por un periodo de 5 minutos,

lo suficiente y se

durante el trabajo experimental. a temperatura ambiente en una solución fijadora. B)

Los cerebros de rata en estudio,

se cortaron en los planos

Leica, modelo CM3050 S

seguidamente.

Figura 8. Fotografía del crata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.

Se aplicó una cantidad suficiente de

Cryocompound) sobre una “platina porta

Seguidamente, se montó una muestra de cerebro, y se orientó

cuidado de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina

porta-muestras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio

de montaje mencionado anteriormente. Finalmente, se colocó la platina con la

muestra en uno de los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato

y se dejó reposar diez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de

la muestra alcanzara la temperatura

17

Los cerebros de rata en estudio, independientemente de su tratamiento previo,

en los planos coronal, sagital y horizontal, utilizando un criostato marca

Leica, modelo CM3050 S (Fig. 8), y de acuerdo con el procedimiento que se describe

el criostato Leica CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en Neurociencias de la Universidad de Costa Rica.

Se aplicó una cantidad suficiente de “medio de montaje

sobre una “platina porta-muestras”, a temperatura ambiente.

montó una muestra de cerebro, y se orientó esta muestra t

de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina

ras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio



iez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de

la muestra alcanzara la temperatura prefijada de la cámara (Fig. 9).

independientemente de su tratamiento previo,

un criostato marca

(Fig. 8), y de acuerdo con el procedimiento que se describe

CM3050 S utilizado para el corte de los cerebros de rata en el Laboratorio de Histología del Programa de Investigación en

de montaje” (Leica

, a temperatura ambiente.

esta muestra teniendo el

de posicionar la parte superior del cerebro en donde se señala en la “platina

ras”. A continuación, se recubrió el tejido superficialmente con el medio



iez minutos, aproximadamente, con el fin de que la temperatura de

Figura 9. Fotografía de una muestra de cerebro de rata albinacriostato Leica, modelo CM3050 Smuestras”. B) “

Seguidamente, se montó la platina con la muestra en el “termobloque” y

utilizando el “panel de mandos” del criostato (

cuchilla, mediante los comandos de “avance macro rápido hacia adelante”

(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajust

de corte” y se procedió a desbastar la muestra (5

la cuchilla la capa de medio de montaje que envolvía la muestra, hasta que se

obtuvieron secciones completas de la superficie total de esta

2000). Seguidamente, y con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic

Coordinates” (Paxinos y Watson, 1998)

orientándola en sus ejes

observados en el Atlas. Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,

se hizo referencia a las suturas craneales Bregma, Lambda e Interaural

A

18

Fotografía de una muestra de cerebro de rata albina dentro de la cámara del Leica, modelo CM3050 S. A) muestra montada en la “

“bloque de congelación rápida”. C) “termobloque”.


l de mandos” del criostato (Anexo 1) se acercó la muestra a la


(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajust

de corte” y se procedió a desbastar la muestra (5-150 µm/s), es decir, a di


obtuvieron secciones completas de la superficie total de esta muestra (Fig.


(Paxinos y Watson, 1998), se ajustó el ángulo de corte de la muestra,

en sus ejes x-, y-, z- hasta obtener secciones paralelas a los planos

Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,

erencia a las suturas craneales Bregma, Lambda e Interaural.

B C

dentro de la cámara del montada en la “platina porta-


se acercó la muestra a la


(1000µm/s) y “avance macro lento hacia adelante” (500 µm/s), se ajustó la “ventana

150 µm/s), es decir, a disminuir con


muestra (Fig. 10) (Leica,


, se ajustó el ángulo de corte de la muestra,

hasta obtener secciones paralelas a los planos

Para definir aproximadamente las coordenadas de cada plano,

Figura 10. Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloquecriostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.

Posteriormente, se estandarizaron los parámetros de

grosor de los cortes, en

aquellas muestras almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada

de formalina 10%, sacarosa y fosfatos

almacenamiento a -30°C y sin solución fijadora

19

Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloquecriostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del tejido en su plano horizontal.

, se estandarizaron los parámetros de temperatura, velocidad y

las muestras de cerebro de rata. Inicialmente se trabajó con

almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada

de formalina 10%, sacarosa y fosfatos; luego, con aquellas correspondientes a un

30°C y sin solución fijadora.

Fotografía de una muestra de cerebro de rata montada en el “termobloque” del criostato Leica, modelo CM3050 S, desbastada y lista para iniciar los cortes del

temperatura, velocidad y

se trabajó con

almacenadas a temperatura ambiente, con una solución tamponada

aquellas correspondientes a un

20

− Evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata

Se trabajó con un rango de temperatura entre -15°C y -25°C, de acuerdo con

lo recomendado por la compañía Leica para el criostato Leica CM3050 S, al usar un

tipo de tejido como lo es el cerebro (Leica, 2000). Se empezó por la temperatura más

alta del rango (-15°C) y hasta los -25°C.

− Evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata

Para definir la velocidad de los cortes se utilizó la opción “potenciómetro de

deslizamiento” localizado en el “panel de mandos” (Anexo 1); se midió un rango de

velocidad desde el 0% (0 mm/s) y hasta el 100% (210 mm/s) que es la velocidad

máxima permitida por el criostato Leica CM3050 S en su modo automático (Leica,

2000).

− Evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata

Para definir el grosor de los cortes se usaron las teclas localizadas en

el “panel de mandos” (Anexo 1); se midió un valor de espesor de corte de 0.5 µm (lo

mínimo permisible por el criostato Leica CM3050 S) a 30 µm, considerándose este

último valor como “grueso” para su observación posterior al microscopio (Leica,

2000).

Al principio del estudio, los cortes del tejido se recogieron en portaobjetos

recubiertos con una solución de 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, #A3648)

(Anexo 2); posteriormente, se cambió a un revestimiento con gelatina (Food Grade-

Merck, #1.04078.0500), siguiendo el protocolo adaptado de Fornaguera y

colaboradores (Anexo 3) (Comunicación oral, 2005).

21

• Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata

Los procedimientos utilizados para la coloración de secciones de tejido

nervioso se adaptaron y optimizaron a partir de las metodologías descritas por Carl

Rüdeberg (1967), en la tinción con Azul de Metileno; Aldana et al. (1996) para teñir

con Cresyl Fast Violet; Carl Busch (1877), en la tinción con Hematoxilina y Eosina, y

finalmente, Heinrich Klüver y Elizabeth Barrera (1954) para teñir con Luxol Fast

Blue.

− Azul de Metileno

Es importante rescatar que esta tinción, modificada a partir de la de Carl

Rüdeberg (1967), se utilizó para una localización rápida de la zona de interés y

decidir así si se toman esos cortes o si se tiene que seguir desbastando la muestra. Se

preparó una Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25% de la siguiente forma:

se añadió 0.5g de Azul de Metileno (Biolab - BDH Chemicals, #VW6276-2) a 200ml

de agua destilada; se disolvió el polvo mediante agitación y se añadieron diez gotas

de alcohol 95%. Esta Solución de Trabajo se añadió, con un gotero, a un portaobjetos

con un corte de tejido de cerebro de rata, y se dejó reposando por un tiempo de 30

segundos. Finalmente, se lavó el portaobjetos tres veces en agua destilada y se

observó la muestra al microscopio.

− Cresyl Fast Violet

Se preparó una Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al 0.1% de la

siguiente forma: se añadieron 0.2g de Cresyl Fast Violet (Gurr’s, #340244K) a 200ml

de agua destilada; se disolvió el polvo agitando la solución con un agitador magnético

a una temperatura entre 50-60 °C durante 30 minutos e inmediatamente se filtró la

solución con un papel filtro y un embudo (Aldana et al., 1996). Esta Solución de

Trabajo se aplicó con un gotero a un portaobjetos con el corte de tejido de cerebro de

http://www.nap.edu/readingroom/books/bio73h/kluver.html

22

rata y se dejó reposando por un tiempo de 5 minutos. Se lavó dos veces en agua

destilada y se dejó reposando 30 segundos en alcohol 70%. Luego de decantar el

líquido, se dejó 30 segundos en alcohol 95%, y luego 30 segundos en alcohol

absoluto. Por último, en una campana de extracción de aire, se aplicó, con un gotero,

xileno (J. T. Baker, #3410) a la muestra y se añadió el medio de montaje Shandon

Xylene Substitute Mountant (Thermo Scientific, #9999122) al cubreobjetos para

fijarlo al portaobjetos. Se dejó reposando el portaobjetos, mínimo una hora, y

finalmente se observó la muestra al microscopio (Aldana et al., 1996).

− Hematoxilina y Eosina

Se preparó una Solución de Trabajo de Eosina al 30% de la siguiente forma:

se añadieron 50mL de Eosina Y (Fisher Scientific, #E-511) a 150ml de alcohol 95% y

se removió. Además, se preparó una solución al 1% de Bicarbonato de Sodio, de la

siguiente manera: se añadió 1g de Bicarbonato de Sodio (Laboratorios Quiflo, #03-

0327) a 100mL de agua destilada y se disolvió el polvo mediante agitación. En la

tinción, se sumergió un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una

batería o cubeta para tinción con cestillo de vidrio (Fig. 11) con la solución lista para

usar de Hematoxilina 1% (Science Products Division, #E-106), se dejó reposando en

la solución por un tiempo de 3 minutos y se lavó dos veces en agua destilada. Luego,

se aplicaron unas gotas de HCl 1N, de tal forma que cubrieran la muestra y se

decolorara el tejido (aproximadamente 4 segundos); se decantó la solución y se

aplicó, seguidamente, la solución de Bicarbonato de Sodio 1% hasta que se

oscureciera el tejido (tornándose nuevamente color morado-azul); por último, se lavó

el portaobjetos en agua destilada. Seguidamente, se sumergió el portaobjetos en la

Solución de Trabajo de Eosina al 30%, se dejó reposando en esta por un tiempo de 3

minutos y en seguida se lavó dos veces en agua destilada. Se dejó reposando 30

segundos en alcohol 70%; luego de decantar el líquido, se dejó 30 segundos en

alcohol 95%, y luego 30 segundos en alcohol absoluto. Por último, en una campana

de extracción de aire, se aplicó xileno a la muestra y se añadió el medio de montaje

23

Shandon Xylene Substitute Mountant (Thermo Scientific, #9999122) al cubreobjetos

para fijarlo al portaobjetos. Se dejó reposando el portaobjetos, mínimo una hora, y

finalmente se observó la muestra al microscopio (Busch, 1877; IHC World, 2007a).

− Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet

Se preparó una Solución de Trabajo de Luxol Fast Blue 0.1% de la siguiente

forma: se añadieron 0.2g de Luxol Fast Blue (Fisher Scientific, #201238) a 200ml de

alcohol 95%; se disolvió el polvo mediante agitación y seguidamente se añadieron

0.5mL de Ácido Acético 10%. Además, se preparó una solución de Carbonato de

Litio 0.05% de la siguiente forma: se añadieron 0.05g de Carbonato de Litio (Baker

Analyzed, #0155) a 100ml de agua destilada y se agitó la solución hasta disolver

(Sheehan y Hrapchak, 1980). En la tinción, se sumergió un portaobjetos, con muestra

de tejido de cerebro de rata, en una cubeta tipo Coplin (Fig. 11) con la solución de

Luxol Fast Blue 0.1%, durante la noche (aproximadamente 12 horas), a 60°C. Se lavó

el exceso de colorante en alcohol 95% y luego en agua destilada, contando 5

segundos en cada líquido. Seguidamente, se sumergió el portaobjetos en la solución

de Carbonato de Litio 0.05%, agitándolo levemente durante 5 segundos; luego, se

sumergió el portaobjetos, por un tiempo de 30 segundos, en alcohol 70%; finalmente,

se lavó en agua destilada. En el proceso de la contratinción, se siguió el protocolo con

Cresyl Fast Violet al 0.1%, anteriormente mencionado (Sheehan y Hrapchak, 1980).

Figura 11. Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.

• Evaluación histológica de

Parkinson

Se evaluó histológicamente un

enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar

microscopio óptico, el punto exacto de llegada de una

previamente introducida

adultas de la cepa Sprague Dawley

animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas

administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al

control, miotoxina III (MT

alquilada en su sitio activo catalítico

Es importante destacar que las cánulas

cerebral denominada sustancia nigra

Interaural 3.40 mm, según el

(Paxinos y Watson, 1998)

A

24

Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o cubeta con cestillo de vidrio. B) cubeta tipo Coplin.

ción histológica de un modelo conductual de la enfermedad de

Se evaluó histológicamente un estudio sobre un modelo animal de la

enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar

el punto exacto de llegada de una cánula, que había sido

previamente introducida estereotáxicamente en el cerebro de cuarenta

Sprague Dawley, con un rango de peso entre 218

animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas

administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al

III (MT-III) de Bothrops asper a otro grupo, y la

en su sitio activo catalítico.

Es importante destacar que las cánulas habían sido dirigidas hacia la zona

cerebral denominada sustancia nigra (en las coordenadas Bregma

según el Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”

(Paxinos y Watson, 1998)), y que la totalidad de las muestras se enc

B

Fotografía de los tipos de contenedores utilizados en este estudio para transporte, manejo simultáneo y tinción de múltiples secciones histológicas. A) batería o

al de la enfermedad de

modelo animal de la

enfermedad de Parkinson, el cual consistió en observar y determinar, con el

cánula, que había sido

uarenta ratas macho

, con un rango de peso entre 218-332 g. Los

animales se habían dividido en tres grupos y por medio de estas cánulas se les había

administrado un tratamiento diferente a cada uno: solución salina al 1% al grupo

, y la misma toxina

habían sido dirigidas hacia la zona

(en las coordenadas Bregma -5.60 mm e

Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”

y que la totalidad de las muestras se encontraban

almacenadas a temperatura ambiente, desde su extracción, en tubos Eppendorf con

una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos.

Cada muestra cerebral se preparó para su segmentación del modo como se

describió previamente en este es

porta-muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y

con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”

1998), se ajustó el ángulo de corte de

a los planos observados en el Atlas

partir de la aparición de la cicatriz de la cánula en cada muestra (Fig. 12). Se

colocaron seis cortes por portaobjeto y estos se tiñeron con los colorantes

Hematoxilina y Eosina, Cresyl Fast Violet y Lu

obtenidos se observaron al microscopio.

Figura 12. Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio de un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se flecha la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.

25


una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos.


describió previamente en este estudio. Además, cada tejido se montó en la “platina

muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y

con apoyo del Atlas “The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates” (Paxinos y Watson,

, se ajustó el ángulo de corte de cada muestra hasta obtener secciones paral

observados en el Atlas. Asimismo, se inició la recolección de los cortes a



Hematoxilina y Eosina, Cresyl Fast Violet y Luxol Fast Blue. Finalmente,

observaron al microscopio.

Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se

la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.



tudio. Además, cada tejido se montó en la “platina

muestras” de tal forma que los cortes obtenidos fueran de su plano coronal; y

(Paxinos y Watson,

hasta obtener secciones paralelas

. Asimismo, se inició la recolección de los cortes a



xol Fast Blue. Finalmente, los cortes

Fotografía de una muestra de cerebro de rata, utilizada para el estudio histológico un modelo animal de la enfermedad de Parkinson, en la cual se señala con una

la cicatriz de la cánula en el cerebro, al lado derecho de la figura.

26

Resultados

• Estandarización de los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y

grosor en los cortes de cerebros de rata en el criostato

La temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a

temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y

fosfatos está en un rango comprendido entre -24°C y -26°C; y para aquellos cerebros

de rata sin fijador está entre -23°C y -26°C (Las flechas señalan estos resultados)

(Cuadro 1).

Cuadro 1. Resultados de la evaluación de la temperatura más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C. (*)

Valores de temperatura (°C) del

criostato Leica SM3050 S

Observaciones de cerebros de rata albina

A temperatura ambiente, con solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y

fosfatos

A -30°C, sin fijador

De -15 a -18 Muestra no estaba

suficientemente sólida. Cortes de consistencia pegajosa

Muestra no estaba suficientemente sólida. Corte de

consistencia pegajosa

-19 Cortes de consistencia pegajosa Cortes rotos o divididos en dos

-20 Cortes rotos o divididos en dos Los cortes no se estiraron bien en

la placa anti-roll

-21 Cortes rotos o divididos en dos Cortes bien estirados se

enrollaron al quitar la placa anti-roll

-22 Los cortes no se estiraron bien en

la placa anti-roll

Cortes bien estirados se enrollaron al quitar la placa anti-

roll

-23 Cortes bien estirados se

enrollaron al quitar la placa anti-roll

La muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó sin

problemas.

-24 y -26 La muestra se congeló lo

suficiente y por tanto se cortó sin problemas.

La muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó sin

problemas.

(*) Nota: El grosor de corte utilizado en esta evaluación fue de 20 µm.

27

La velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a


fosfatos está en un rango comprendido entre 20% (42 mm/s) y 10% (21 mm/s); y para

aquellos cerebros de rata sin fijador está entre 40% (84 mm/s) y 10% (21 mm/s) (Las

flechas señalan estos resultados) (Cuadro 2).

Cuadro 2. Resultados de la evaluación de la velocidad más apta para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C. (*)

Valores de velocidad de corte del criostato Leica

SM3050 S en modo automático



fosfatos


De 100% (210 mm/s) a 50% (105 mm/s)

Cortes estirados se enrollaron al quitar la placa anti-roll

Cortes estirados se enrollaron al quitar la placa anti-roll y no fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se adhirieron a

este

40% (84 mm/s)

No fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se

adhirieron a este

Cortes estirados no se adhirieron al pincel

30% (63 mm/s) No fue posible acomodar los cortes con el pincel ya que se

adhirieron a este


20% (42 mm/s) Cortes estirados no se adhirieron al pincel


10% (21 mm/s) Cortes estirados no se adhirieron al pincel


(*) Nota: El grosor de corte utilizado en esta evaluación fue de 20 µm.

28

El espesor de corte más apto para los cerebros de rata almacenados a


fosfatos es de 25 µm y para aquellos cerebros de rata sin fijar está en un rango

comprendido entre 10 µm y 25 µm (Las flechas señalan estos resultados) (Cuadro 3).

Cuadro 3. Resultados de la evaluación del espesor más apto para el corte de cerebros de rata almacenados a temperatura ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y cerebros de rata sin fijador a -30°C.

Valores de espesor de corte en el criostato Leica SM3050 S (µm)



fosfatos


De 0.5 a 9 Los cortes se arrugaron y se enrollaron y fue difícil su

recolección

Al observar los cortes con el microscopio, estos se visualizan

arrugados

De 10 a 20 Al observar los cortes con el

microscopio, estos se visualizan arrugados


lisos y sin arrugas

25 Al observar los cortes con el

microscopio, estos se visualizan lisos y sin arrugas


lisos y sin arrugas

30


muy gruesos


muy gruesos

Con los resultados obtenidos de las evaluaciones realizadas, se estableció un

protocolo para el corte de de los cortes de cerebros de rata utilizando el criostato

Leica CM3050 S (Apéndice 1).

29

• Estandarización de los protocolos de tinción de los cortes de cerebro de rata

- Azul de Metileno

El Azul de Metileno es un colorante catiónico, por lo que se resaltan de color

azul las estructuras ácidas de los núcleos celulares de las células presentes en el corte;

a su vez, en color celeste se evidencia el citoplasma celular (Fig. 13, 14, 15 y 16)

(Beresford, 2000; Ham, 1975).

En la parte superior izquierda, se muestra el plano de corte (coronal, sagital u

horizontal) de las coordenadas correspondientes a cada fotografía (Fig. 13, 14 y 15).

Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta

(SNC), sustancia nigra lateral (SNL), sustancia nigra medial (SNM) y sustancia nigra

reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml: lemnisco medial (Paxinos y Watson,

1998) (Fig. 13) (Paxinos y Watson, 1998). Además, se muestran las zonas CA1, CA2

y CA3 del hipocampo, la fisura hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro

dentado (DG), y la capa polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; cc:

cuerpo calloso; fi: fimbria del hipocampo; S: subículo (Fig. 14 y 15) (Paxinos y

Watson, 1998).

Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en el corte,

producto del procesamiento histológico de la muestra (Fig. 14).

Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos y núcleos de

células de neuroglia encerrados en cuadrados (Fig. 16). En el SNC estas últimas

difieren de las primeras en que son de menor tamaño y de diferente morfología; las

células de la neuroglia sí presentan prolongaciones, aunque no se asemejan al axón y

a las dendritas de la neurona (Leeson y Leeson, 1983). Nótese además, que la

30

proporción de células de neuroglia es mayor en comparación con las neuronas (Fig.

16).

Los resultados obtenidos con la tinción con Azul de Metileno permitieron

establecer un protocolo con este colorante para la tinción de los cortes de cerebros de

rata de 25 µm de grosor (Apéndice 2).

Figura 13. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenaMetileno (Aumento 40X).

Figura 14. Fotografía tomada al un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).

PP

DD

Lateral: 3.40 mm

Interaural: 3.20 mm Bregma: -5.80 mm

31

. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de

(Aumento 40X).

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de

(Aumento 40X).

CCAA11 CCAA22

CCAA33 hhff

HHiill

PPooDDGG

DDGG

ff

aallvv

SSNNRR

SSNNCC

mmll

ccpp SSNNMM

SSNNLL

. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en

, y teñido con Azul de

, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Azul de

ffii

cccc

32

Figura 15. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 40X).

Figura 16. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata, almacenado a -30°C, y teñido con Azul de Metileno (Aumento 400X).

CCAA33

CCAA22

CCAA11

SS DDGG

CCAA11


33

- Cresyl Fast Violet

El Cresyl Fast Violet es un colorante catiónico, el cual tiñe de color morado

oscuro los corpúsculos de Nissl presentes en el soma neuronal y las estructuras ácidas

de los núcleos celulares de las células presentes en el corte; en color lila se evidencia

el citoplasma celular (Fig. 17, 18, 19 y 20) (Aldana et al., 1996; Beresford, 2000).



Las principales zonas señaladas corresponden a la sustancia nigra compacta porción

dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml:

lemnisco medial; Aq: acueducto de Silvio; PAG: sustancia gris periacueductal (Fig.

17). Asimismo, se muestran las zonas CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura

hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro dentado (DG), y la capa

polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; cc: cuerpo calloso; fi: fimbria

del hipocampo; S: subículo (Fig. 18 y 19) (Paxinos y Watson, 1998).

Independientemente del plano de corte de la muestra cerebral, la tinción con

Cresyl Fast Violet permite diferenciar las zonas cerebrales del hipocampo. La

evidente distribución en capas se debe al agrupamiento que realizan las células de una

misma morfología con el fin de desempeñar una función determinada (Fig. 18 y 19).

(Junqueira, 1988).

Se observan núcleos de células neuronales encerrados en círculos, éstas son de

tipo multipolar, ya que se observan más de dos prolongaciones celulares desde el

soma de cada una (Milikowski y Berman, 2001); además, se visualizan núcleos

esféricos de astrocitos encerrados en cuadrados, y núcleos alargados encerrados en el

triángulo, denominados microglia (Fig. 20) (Junqueira y Carneiro, 1996)

Los resultados obtenidos con la tinción con Cresyl Fast Violet permitieron


rata, de 25 µm de grosor (Apéndice 3).

34

Figura 17. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en

un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).


un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

CCAA11 CCAA22

CCAA33 hhff

HHiill

PPooDDGG

DDGG

ffii

cccc

aallvv

Lateral: 3.40 mm

ccpp

SSNNRR SSNNCCDD

DDGG

mmll

PPAAGG

AAqq


35


un corte horizontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

Figura 20. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular

presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).

SS

CCAA22

CCAA33

DDGG

CCAA11

PPooDDGG ffii


36

- Hematoxilina/Eosina

La Hematoxilina es un colorante catiónico y la Eosina es aniónico, por lo que

se observan de color rosado oscuro las estructuras ácidas (basófilas) de los núcleos de

las células presentes en el corte; a su vez, en color rosado claro se evidencia el

citoplasma celular, que es acidófilo (Fig. 21, 22, 23 y 24) (Beresford, 2000; UAM,

2007).




porción dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral;

ml: lemnisco medial; DG: giro dentado (Fig. 21). Asimismo, se muestran las zonas

CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura hipocampal (hf), el hilo del giro dentado

(Hil), el giro dentado (DG), y la capa polimórfica de éste (PoDG); cc: cuerpo calloso;

S: subículo (Fig. 22 y 23) (Paxinos y Watson, 1998).

Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en los cortes,

producto del procesamiento histológico de la muestra (Fig. 22 y 24).




esféricos de astrocitos encerrados en cuadrados y núcleos alargados encerrados en el

triángulo, denominados microglia (Fig. 24) (Junqueira y Carneiro, 1996)

Los resultados obtenidos con la tinción con Cresyl Fast Violet permitieron


rata de 25 µm de grosor (Apéndice 4).

37

Figura 21. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

Figura 22. Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

CCAA11

CCAA22

CCAA33 hhff

HHiill

PPooDDGG

DDGG

SS

cccc

Lateral: 2.90 mm

ccpp

SSNNRR SSNNCCDD

DDGG

mmll


Figura 23. Fotografía tomada al un corte horizonHematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

Figura 24. Microfotografía tomada al presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).


38

Fotografía tomada al microscopio óptico, que muestra diferentes zonas presentes en zontal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C

Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a con Hematoxilina y Eosina (Aumento 400X).

DDGG

CCAA22

CCAA33 HHiill

PPooDDGG

CCAA11

CCAA11

CC

, que muestra diferentes zonas presentes en

30°C, y teñido con

que muestra la diversidad celular

a -30°C, y teñido

CCAA33

39

- Luxol Fast Blue/Cresyl Fast Violet

El colorante Luxol Fast Blue, al tener una alta afinidad por los lípidos y bases

de colina, presentes en la mielina, tiñe esta sustancia de color azul (Beresford, 2000;

Sheehan y Hrapchak, 1980). La mielina se presenta en los axones de las neuronas y

en los oligodendrocitos, que son células de la glia con varias ramificaciones o

dendritas y que se enrollan alrededor de los axones de varias neuronas (Fig. 25, 26,

27 y 28) (Ross et al., 2005).

Además, se resaltan de color morado las estructuras ácidas de los núcleos de

las células presentes en los cortes, y en color lila se evidencia el citoplasma celular; y

esto se debe a que el Cresyl Fast Violet, utilizado para la contratinción, es un

colorante catiónico que tiñe de color morado oscuro los corpúsculos de Nissl

presentes en el soma neuronal (Fig. 25, 26, 27 y 28) (Aldana et al., 1996; Beresford,

2000).




porción dorsal (SNCD) y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral;

ml: lemnisco medial; mp: pedúnculo mamilar; MT: núcleo terminal medial del

sistema óptico accesorio; IPF: fosa interpeduncular; MM: núcleo mamilar medial,

Aq: acueducto de Silvio (Fig. 25) (Paxinos y Watson, 1998).

Asimismo, se muestran las zonas CA1, CA2 y CA3 del hipocampo, la fisura

hipocampal (hf), el hilo del giro dentado (Hil), el giro dentado (DG) y la capa

polimórfica de éste (PoDG); alv: alveo del hipocampo; bsc: brazo del colículo

superior; cc: cuerpo calloso; dcw: materia blanca cerebral profunda; DLG: núcleo

40

genicular lateral dorsal ; LV: ventrículo lateral ; S: subículo (Fig. 26 y 27) (Paxinos y

Watson, 1998).

Las flechas color negro señalan “artefactos” o alteraciones en los cortes (Fig.

26 y 27).




esféricos encerrados en cuadrados, que corresponden a astrocitos; núcleos alargados

encerrados en el triángulo, denominados microglia; y oligodendrocitos dentro del

rombo, que pueden ser observados solamente con este colorante (Fig. 28) (Junqueira

y Carneiro, 1996; Ross et al., 2005).

Los resultados obtenidos con la tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast

Violet permitieron establecer un protocolo con estos colorantes para la tinción de los

cortes de cerebros de rata de 25 µm de grosor (Apéndice 5).

Es importante resaltar las grandes diferencias presentes entre aquellos tejidos

almacenados en una solución fijadora y aquellos que no, independientemente del tipo

de colorante utilizado para su tinción. En los cortes procedentes de un

almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos se

observan tejidos con mayor cantidad de artefactos, retracciones y anomalías; y lo

contrario ocurre con aquellos cortes que no provienen de un almacenamiento a -30°C,

los cuales sí presentan artefactos, pero en una menor cantidad.

41


un corte coronal de cerebro de rata albina, almacenado a -30°C, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).


un corte sagital de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).

DDGG

HHiill

CCAA33

CCAA22

CCAA11 hhff

bbsscc

cccc

SS

IIPPFF ccpp MMTT

AAqq

MMMM

SSNNRR

SSNNCCDD

mmll

mmpp

Lateral: 1.90mm


42


un corte horizontal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

Figura 28. Microfotografía tomada al microscopio óptico que muestra la diversidad celular

presente en un corte coronal de cerebro de rata albina, procedente de un almacenamiento en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos, y teñido con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 400X).

PPooDDGG

DDGG

DDLLGG

CCAA33

LLVV

CCAA22

CCAA11

SS

aallvv ddccww

hhff


43

• Evaluación histológica de un modelo conductual de la enfermedad de

Parkinson

A continuación se muestran los resultados referentes a la aplicación de las

técnicas histológicas, que consistió en observar y determinar, el punto exacto de

llegada de una cánula, que había sido previamente introducida estereotáxicamente en

el cerebro de cuarenta ratas macho adultas de la cepa Sprague Dawley.

Aplicando el protocolo de tinción con Cresyl Fast Violet (Apéndice 3) se

logra observar claramente la cicatriz de la cánula introducida en una de las muestras

del estudio (flecha roja) (Fig. 29).


porción dorsal (SNCD), sustancia nigra lateral (SNL), sustancia nigra medial (SNM)

y sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml: lemnisco medial; Aq:

acueducto de Silvio; CL: núcleo talámico centrolateral; DpMe: núcleo mesencefálico

profundo; LPAG: sustancia gris periacueductal; RMC: núcleo rojo (Fig. 29) (Paxinos

y Watson, 1998).

Con un lente objetivo de mayor aumento se logran observar núcleos de células

neuronales (encerrados en círculos), núcleos de neuroglia (encerrados en cuadrados) y

núcleos de microglia y astrocitos (dentro del triángulo), que se originaron como

consecuencia de la lesión (Fig. 30) (Milikowski y Berman, 2001). Esta lesión es

evidente en los cortes cerebrales puesto que, al ser una lesión unilateral, se comparan

ambos hemisferios cerebrales y, por tanto, se determina el daño provocado por la

introducción de la cánula y las sustancias en las muestras.

44

Figura 29. Corte coronal de un cerebro de rata macho de la cepa Sprague Dawley, que fue

utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Cresyl Fast Violet (Aumento 40X).

Figura 30. Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la

figura 29 (100X).

ccpp

SSNNRR

SSNNCCDD

SSNNMM

SSNNLL

mmll

AAqq LLPPAAGG

RRMMCC CCLL

DDppMMee


45

Igualmente, al aplicar el protocolo de tinción con Hematoxilina y Eosina

(Apéndice 4) se logra observar claramente la cicatriz de la cánula introducida en las

muestras (flecha roja) (Fig. 31).


porción dorsal (SNCD), sustancia nigra reticulada (SNR); cp: pedúnculo cerebral; ml:

lemnisco medial; DG: giro dentado; LM: Núcleo mamilar lateral; mfb: fascículo

medial del prosencéfalo; mp: pedúnculo mamilar; ns: fascículo nigroestriado (Fig. 31)

(Paxinos y Watson, 1998).


utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Hematoxilina y Eosina (Aumento 40X).

mmffbb ccpp

DDGG mmpp

LLMM

SSNNRR SSNNCCDD

mmll

nnss


46

Con un lente objetivo de mayor aumento se observa un soma neuronal

(encerrado en un círculo), núcleos de astrocitos (encerrados en cuadrados) y células

de microglia y astrocitos (encerrados en el triángulo), que se originaron como

consecuencia de la lesión de la cánula. La flecha roja señala depósitos de

hemosiderina (Fig. 32) (Milikowski y Berman, 2001).

Figura 32. Microfotografía que muestra una ampliación de la cicatriz de la cánula de la figura 29 (400X).

47

El protocolo de tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Apéndice 5)

permitió mostrar la cicatriz de la cánula introducida en la muestra, núcleos neuronales

encerrados en círculos y núcleos de microglia y astrocitos encerrados en el triángulo

(Fig. 33) (Milikowski y Berman, 2001).


utilizado para evaluar un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Tinción con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Aumento 100X).

Seguidamente, se muestra el resultado de la llegada de la totalidad de las

cánulas del estudio (Fig. 34 y 35; apéndice 6). Los puntos color rojo, verde y azul

corresponden, respectivamente, al punto de llegada de las cánulas de los tratamientos

control (solución salina al 1%), miotoxina III (MT-III) de Bothrops asper, y la misma

toxina alquilada en su sitio activo catalítico.

48

Figura 34. Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 3.40mm y

Bregma -5.60mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

Figura 35. Plano de corte coronal correspondiente a las coordenadas Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm (Paxinos y Watson, 1998), en el que se muestran los resultados de la llegada de las cánulas en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

49

Discusión

Para garantizar el proceso histotecnológico de corte de las muestras de cerebro

de rata fue necesario definir los parámetros óptimos de temperatura, velocidad y

grosor para el corte de estas muestras en el criostato. Los resultados obtenidos

permitieron la estandarización de estos parámetros y el desarrollo del protocolo para

el corte de de los cortes de cerebros de rata utilizando el criostato Leica CM3050 S

(Apéndice 1).

De acuerdo con los resultados obtenidos, se determinó que la temperatura del

criostato para el corte de cerebros de rata está en un rango comprendido entre -24°C y

-26°C, ya que en este rango la muestra se congeló lo suficiente y por tanto se cortó

sin problemas; sin embargo, en el protocolo se establece una temperatura estándar de

-26ºC para el trabajo con estos tejidos en el criostato, debido a que, por trabajar con la

ventana deslizante del equipo abierta, aumenta la temperatura (1ºC) por corrientes de

aire que pueden entrar en la cámara.

La temperatura fue el primer factor a considerar al trabajar con este equipo, ya

que es la principal característica que lo diferencia de los demás modelos de

micrótomos existentes (García, 1993). La compañía Leica recomienda dos aspectos

importantes en relación con la temperatura a utilizar en el criostato: (1) trabajar a un

rango de -15°C y -25°C para/con tejido cerebral y (2) utilizar un medio líquido,

sintético, de montaje e imbibición hidrosoluble para cortes por congelación (Leica,

2000). El medio líquido utilizado fue el “Leica Cryocompound”, el cual facilitó el

enfriamiento del tejido, lo fijó a “la platina portamuestras”, le confirió a la muestra

una dureza que impidió su fragmentación durante el corte, y aseguró la obtención de

cortes finos y lo suficientemente delgados, regulares y homogéneos.

También, con los resultados obtenidos, se determinó que la velocidad de corte

del criostato para el corte de cerebros de rata resultó ser óptima en un rango

50

comprendido entre el 20% (42 mm/s) y el 10% (21 mm/s), ya que se obtuvieron

cortes estirados, que no se enrollaron al quitar la placa anti-roll, ni se adhirieron al

pincel, porque entre menor sea la velocidad del corte, menor serán las fuerzas

presentes entre las superficies. Sin embargo, en el protocolo se establece una

velocidad estándar de 20% (42 mm/s) para el corte de cerebros de rata en estas

condiciones.

Este resultado se refuerza con lo estipulado por Kiernan (1999), quien

establece que la velocidad del corte se ve influenciada, principalmente, por las

fuerzas no iónicas, de van der Waals y puente de hidrógeno, que aunque son fuerzas

débiles, permiten la atracción entre el tejido, el vidrio y el portacuchillas (donde se

colecta la muestra); por lo que si se trabaja con una alta velocidad de corte (mayor a

42mm/s), se provoca el roce entre las superficies y su posterior adherencia; por tanto,

entre menor sea la velocidad del corte, menor serán las fuerzas presentes entre las

superficies.

El tercer parámetro a evaluar fue el grosor del corte y con los resultados

obtenidos, se determinó que el espesor óptimo fue aquel con el cual los cortes al

microscopio se visualizaron lisos, sin arrugas y no muy gruesos.

El grosor del corte se relaciona con su observación directa al microscopio. Los

cortes demasiado gruesos permiten observar más estructuras, pero con menos

definición, ya que se superponen unas a otras (UAB, 2005). Raimundo García (1993),

en su libro “Anatomía Patológica”, establece que para el estudio del tejido nervioso

central se emplean secciones de tejido entre 10 y 30 micras. Es la densidad óptica de

cada estructura atravesada por la luz la que disminuye la amplitud de luz que la

atraviesa. Si la muestra rebasa cierto espesor, la luz, simplemente, no es capaz de

atravesarla (Ham, 1975). No obstante, lo ideal es observar con el microscopio cortes

lisos y sin arrugas, y para esto también se recomienda el uso de un revestimiento con

una solución de gelatina al 0.5% para los portaobjetos con que se recolectan los

51

cortes. Este revestimiento no solo ayuda a evitar arrugas al recolectar los cortes, sino

que permite la adherencia adecuada de la totalidad del corte, y se mantiene aún

durante el proceso de tinción. Kiernan (1999) menciona que esta adherencia se debe a

la formación de enlaces covalentes entre las proteínas del corte y los átomos de

nitrógeno de la gelatina, que son más fuertes que las fuerzas no iónicas, como las de

van der Waals y los puentes de hidrógeno, formados entre el corte y el vidrio.

Los resultados muestran diferencias entre los rangos de temperatura,

velocidad y espesor en los cortes de cerebros de rata almacenados a temperatura

ambiente en la solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos y aquellos

cerebros de rata no fijados, y se deben principalmente, al agente fijador presente en

unas muestras y ausente en las otras.

La fijación es una operación destinada a conservar las células, cuanto sea

posible, en el estado final en que estuvieron durante la vida; permite producir una

coagulación o una precipitación lo más completa posible de todas las sustancias

celulares, conservando la configuración correspondiente a su naturaleza amorfa

(citoplasma), granulosa (gránulos de secreción), filamentosa (condrioma), etc. Por

tanto, Alzola (2001) explica que si las células no son congeladas o fijadas, las

sustancias celulares pueden perderse por solución simple, por diálisis o por

ingurgitación osmótica de las células en el proceso que debe preceder al corte y a la

tinción.

Ahora bien, el formaldehído es el fijador más utilizado, debido a su alto poder

de penetración en el tejido, su bajo costo y facilidad de empleo. Cuando se utiliza

puro es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las células,

por lo que generalmente se usa en mezclas fijadoras y es uno de los mejores fijadores

para el sistema nervioso (Alzola, 2001; Beresford, 2000). En el caso del criostato

CM3050 S, la compañía Leica recomienda trabajar con tejidos sin fijar; no obstante,

dado que las cuarenta muestras de cerebro se encontraban, previo al desarrollo de este

52

trabajo práctico, embebidas en una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y

fosfatos, se tuvo que realizar la estandarización del protocolo tanto en muestras

fijadas, como en muestras sin fijador.

En relación con la interpretación de los cortes histológicos obtenidos, Geneser

(2000) destaca que la imagen microscópica, su intensidad y grado de color, dependen

de la calidad de la coloración empleada, de la solución de trabajo (pH, concentración,

estabilidad, etc.) y del procedimiento técnico utilizado. Los colorantes son

fundamentales para permitir la visualización de los tejidos y sus componentes al

microscopio y deben cumplir con una condición esencial en este proceso y es su

constancia en todas las preparaciones histológicas obtenidas de distintos individuos

de una misma especie animal (Geneser, 2000). El fundamento de cualquier método de

tinción radica en la propiedad que poseen todos los tejidos para incorporar y fijar de

modo variable los colorantes (García, 1993).

Los resultados obtenidos con los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast

Violet, Hematoxilina y Eosina, y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, se

correlacionan con los obtenidos por Carl Rüdeberg (1967), Aldana et al. (1996), Carl

Busch (1877), y Heinrich Klüver y Elizabeth Barrera (1954), respectivamente. La

escogencia de los colorantes utilizados en este estudio radica en la especificidad de

cada uno para teñir elementos presentes en el tejido nervioso.

El Azul de Metileno es un colorante catiónico, es decir, tiñe grupos tisulares

con carga negativa (basófilos); por tanto, lo que tiñó de color azul fueron núcleos

celulares y en celeste el citoplasma celular (Beresford, 2000; Ham, 1975). Esta

tinción se utilizó con éxito para una localización rápida (se dejó reposando por un

tiempo de 30 segundos en el corte), y observar al microscopio la región en la que se

estaba y determinar si se tomaban esos cortes o si se seguía desbastando la muestra.

En este estudio se determinó que, por cada neurona hay entre diez a cincuenta células

de la glía, y Junqueira y Carneiro (1996) refuerzan esta idea y estipulan además que,

http://www.nap.edu/readingroom/books/bio73h/kluver.html

53

en virtud del menor tamaño de las células de la neuroglia, éstas ocupan

aproximadamente la mitad del volumen del tejido.

El Cresyl Fast Violet es un colorante básico, es decir, que al igual que el Azul

de Metileno tiñe grupos tisulares ácidos (basófilos); por tanto, tiñó de color violeta

los núcleos celulares y los corpúsculos de Nissl presentes en el soma neuronal, y en

lila el citoplasma celular. Entre las tinciones utilizadas en este estudio, ésta presenta

la ventaja que permite definir mejor los elementos del sistema nervioso. Ham (1975)

menciona al respecto que, al tratar el corte con un solo colorante, aumenta el

contraste entre los componentes celulares y extracelulares, ya que captan de manera

diferencial el colorante.

La Hematoxilina es un colorante catiónico y la Eosina es aniónico, por lo que

permiten observar los núcleos neuronales de color rosado oscuro – morado y el

citoplasma celular en color rosado claro (Beresford, 2000; UAM, 2007). La Eosina es

un colorante muy utilizado como contratinción para la Hematoxilina; se usa para teñir

ciertos componentes tisulares que no son visibles con el colorante principal. Estas

tinciones presentan un mecanismo físicoquímico de coloración tisular, que está

vinculado a la formación de uniones intermoleculares por atracción electrostática; es

decir, que se basan en la propiedad de ligarse entre sí, que poseen las moléculas de

carga eléctrica contraria, de manera que la Hematoxilina, al ser un colorante básico

tiñe las estructuras ácidas, y viceversa en el caso de la Eosina (García, 1993). En el

proceso de coloración con estas tinciones hay un paso que se denomina

“azulamiento” y consiste en el uso de un ácido (HCl) seguido de una base

(Bicarbonato de Sodio) con el fin de reforzar la tinción de la Hematoxilina y

prepararla para la contratinción con la Eosina (IHC World, 2007a).

La tinción con Luxol Fast Blue tiñe la mielina de color azul y las neuronas

color violeta-azul, debido a que el colorante tiene una alta afinidad por los lípidos y

bases de colina, presentes en la mielina; por tanto, se establece que este colorante es

54

selectivo para estos componentes celulares. La mielina rodea al axón de las neuronas

y lo aísla con el fin de que se lleve a cabo la conducción del impulso nervioso y que

no se pierda corriente eléctrica (Alberts et al., 2004). La técnica de coloración se

fundamenta en una reacción ácido-base con formación de sal; el Luxol Fast Blue

forma precipitados insolubles con las lipoproteínas presentes en la mielina, por lo que

queda retenido tras la diferenciación (García, 1993; Sheehan y Hrapchak, 1980).

Se pueden apreciar con detalle ciertas estructuras celulares del tejido nervioso

al utilizar los lentes objetivos cuyo aumento microscópico permite observar los cortes

a 400X. Se observa que de los elementos de la glía solo se visualizan con claridad sus

núcleos, esparcidos entre los núcleos de las neuronas, que son de dimensiones

mayores. Además, el citoplasma y las prolongaciones de las células de la neuroglia no

son visibles, ya que se confunden con las prolongaciones de las células nerviosas.

Junqueira y Carneiro (1996) mencionan que la forma del núcleo, denso y alargado, de

las células de la microglia facilita su identificación, pues el núcleo de las otras células

de la neuroglia es esférico.

Con el fin de realizar los cortes coronales del cerebro de las cuarenta muestras

almacenadas en una solución tamponada de formalina 10%, sacarosa y fosfatos era

necesario ubicar la zona específica de la sustancia nigra para poder determinar el

punto exacto de llegada de las cánulas en los cerebros; para ello se usó el Atlas “The

Rat Brain in Stereotaxic Coordinates”, que permitió el ajuste del ángulo de corte de

las muestras en sus ejes x-, y-, z- hasta obtener secciones paralelas a los planos

observados en el Atlas.

En relación con los cortes histológicos del estudio del modelo animal de la

enfermedad de Parkinson, en los que se aprecia la cicatriz dejada por las cánulas

introducidas a los cerebros de rata, se puede establecer que debido a la destrucción

celular provocada por la cánula, se observa un aumento de las células de la neuroglia,

que funcionan como un sistema de reparación. Junqueira y Carneiro (1996)

55

establecen que, como las neuronas no se dividen, su destrucción representa una

pérdida permanente, y que en contraste, las células de la neuroglia están dotadas de

gran capacidad de reproducción. Su número y su fisiología dependen de los diversos

estados del desarrollo y de las condiciones fisiológicas, por lo que las células gliales

aumentan en número e incrementan su actividad metabólica ante una reacción a la

degeneración neuronal, ó también, ante una reacción secundaria a los procesos

patológicos que producen la degeneración neuronal (Junqueira y Carneiro, 1996).

Los astrocitos participan con la microglia en actividades fagocíticas,

eliminando restos de tejido nervioso (Spranger y Fontana, 1996). Luego de la muerte

neuronal por procesos patológicos, los astrocitos proliferan y llenan los espacios

previamente ocupados por las neuronas, fenómeno conocido como gliosis de

reemplazo (Junqueira y Carneiro, 1996). Las células de la microglia, actúan como

macrófagos, es decir, células representantes del sistema inmunológico en el SNC.

Estas células pueden permanecer en estado quiescente durante largos periodos de

tiempo y pueden modificar su comportamiento en respuesta a diversas señales

provenientes del entorno celular y llegar a actuar como macrófagos fagocíticos

cerebrales (Junqueira y Carneiro, 1996; Spranger y Fontana, 1996).

En uno de los cortes obtenidos del estudio del modelo animal de la

enfermedad de Parkinson se observaron restos de hemosiderina, debido a una

hemorragia provocada por la cánula. Walter (1963) menciona que la hemosiderina es

un pigmento de color amarillo y aspecto cristalino que deriva de la hemoglobina

cuando hay más hierro del necesario en el cuerpo. Su depósito patológico en las

células se denomina hemosiderosis y se forma por descomposición del grupo hemo

de la hemoglobina (UMSNH, 2007). Los restos de hemosiderina se evidencian y

distinguen de los demás componentes tisulares puesto que la hemoglobina se tiñe de

color rojo con el colorante Eosina Y (García, 1993).

56

Es importante recordar que al ser un modelo de lesión unilateral se pueden

comparar ambos hemisferios cerebrales en un mismo animal; por tanto, en cada corte

obtenido, al estar solamente un hemisferio lesionado, se tiene un control del daño

provocado por la introducción de la cánula y las sustancias y se puede entonces

relacionar el daño observado con los resultados obtenidos con los estudios en

neuroquímica y en conducta.

Conviene apreciar también que lo que se desea es llevar al microscopio una

preparación en la cual los tejidos estén perfectamente conservados, presentando la

misma estructura y composición química. Sin embargo, por las técnicas que se

emplean en la preparación, los cortes pueden no ser representaciones exactas, y

surgen alteraciones conocidas como artefactos, producto del procesamiento y la

manipulación humana. Según Ham (1975), en la preparación de un corte, en cualquier

etapa puede ocurrir algo que haga menos perfecto el producto final. Con base en ese

principio, los artefactos señalados en los cortes, en este estudio, pueden derivar de las

sustancias químicas empleadas en la técnica histológica, como el xileno, que provoca

retracción del tejido; o por errores de corte causados por una cuchilla imperfecta; o

que ocurra un plegamiento del corte al recolectarlo; o por el fijador, en este caso la

formalina, que puede causar precipitaciones de cristales; o bien, una manipulación

poco cuidadosa del tejido fresco, cuando se extrajo del animal.

Finalmente, se puede manifestar que la presente investigación permitió, de

una forma exitosa, la implementación y estandarización de las técnicas propuestas, de

corte y tinción, para el reconocimiento de regiones cerebrales de rata, para así poder

utilizarse en diferentes proyectos involucrados con el estudio del sistema nervioso.

57

Conclusiones

De la presente investigación se concluye que:

− Es necesario reducir las piezas a delgadas secciones histológicas y

posteriormente teñirlas con colorantes afines para visualizar las características

microscópicas de los tejidos cerebrales de rata.

− Los cerebros de rata se deben trabajar a una temperatura de -26ºC, una

velocidad de corte de 20% (42 mm/s) y un grosor de 25 µm, en el criostato

Leica CM3050 S.

− Los colorantes Azul de Metileno, Cresyl Fast Violet, Hematoxilina y Eosina,

y Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet, permiten la visualización

microscópica de las estructuras presentes en los cortes de cerebro de rata.

− Los colorantes permiten una identificación de tejido cerebral sano y

disfuncional en los cortes cerebrales de rata.

− La evaluación histológica del modelo conductual de la enfermedad de

Parkinson logró determinar el punto exacto de llegada de la cánula,

introducida unilateralmente en el cerebro de ratas macho de la cepa Sprague

Dawley.

− La Histología es una herramienta que permite entender los cambios

funcionales ocurridos en el individuo y relacionarlos con aquellos

estructurales.

58

Recomendaciones

Se recomienda hacer uso de mascarilla (tapa boca) durante el trabajo en el criostato y

mantener cerrada la ventana deslizante del mismo cuando no se esté trabajando

dentro de la cámara, esto con el fin de evitar la formación de escarcha en las paredes

de la cámara y en el micrótomo, y la contaminación de los cortes cerebrales.

Se recomienda guardar piezas importantes, como los pinceles, dentro de la cámara,

con el fin de facilitar el trabajo con los cortes cerebrales.

Se recomienda realizar el proceso de desbaste de la muestra en los extremos de la

cuchilla y el proceso de corte de la muestra, propiamente, en el centro de la misma.

Utilizar guantes en todo momento y especialmente durante el desarrollo del protocolo

de revestimiento de los portaobjetos con gelatina, con el fin de evitar contaminar y

manchar la superficie de estos. Se recomienda el uso de guantes de nitrilo para

trabajar con sustancias químico-tóxicas, como el xileno y las soluciones de tinción.

Además, utilizar el equipo de protección adecuado al manipular sustancias irritantes,

como la formalina y el xileno.

La Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25% puede conservarse en un

gotero, a temperatura ambiente, ya que basta una gota para teñir el corte; y el

excedente del uso de esta solución puede decantarse en una cubeta para reciclar.

Los excedentes de los demás colorantes se pueden recolectar en un frasco ámbar y

llevarlo a la Facultad de Química de la Universidad de Costa Rica, donde se le da un

tratamiento adecuado a este tipo de desechos.

En cuanto a la visualización de las láminas ya listas de los cortes de cerebro de rata,

se recomienda limpiar tanto los oculares como la muestra con el papel adecuado o

59

con algún tejido suave, tipo franela, ya que pueden observarse manchas irregulares y

que no corresponden a artefactos del corte per sé.

Se recomienda la búsqueda de otra solución fijadora, diferente a la formalina, para los

cerebros de rata. Esto debido a que los trabajos experimentales en el Programa de

Investigación en Neurociencias involucran una numerosa cantidad de muestras

cerebrales, y estas deben ser extraídas de las ratas el mismo día, y por tanto

almacenarse en una solución adecuada que preserve las muestras.

60

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Disorders. Plenum Press. New York. 344p.

64

Anexo 1. Panel de mandos del Criostato Leica CM3050 S (Leica, 2000).

65

Anexo 2. Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con (3-Aminopropyl)-

triethoxysilane (Sigma, A3648)

Previo al revestimiento, se realizó un proceso de lavado de los portaobjetos; se

embebieron las láminas en HCl 2M durante cinco minutos, luego se le dieron dos

baños en alcohol 95%, de cinco minutos cada uno, y se dejaron secando por diez

minutos a 40°C en un horno DELTA A Series.

Seguidamente, se procedió a sumergir los portaobjetos en una solución al 4% de (3-

Aminopropyl)triethoxysilane en acetona, y se mantuvieron por un periodo de dos

minutos. Se lavaron tres veces en agua destilada y se dejaron secando una hora a

40°C en el horno DELTA A Series. Por último, se almacenaron en cajas, a

temperatura ambiente.

Nota importante: Utilizar guantes durante el desarrollo del protocolo y para la

manipulación de los portaobjetos, y sobretodo no tocar con los dedos la superficie de

estos.

66

Anexo 3. Protocolo para el revestimiento de portaobjetos con gelatina (Food Grade-

Merck, #1.04078.0500)

Previo al revestimiento, se realizó un proceso de lavado de los portaobjetos, con el fin

de eliminar sustancias oleicas y otras que pudieran interferir en el proceso de tinción

posterior; se embebieron las láminas en HCl 2M durante cinco minutos,

seguidamente se le dieron dos baños en alcohol 95%, de cinco minutos cada uno, y se

dejaron secando por diez minutos a 40°C en un horno DELTA A Series.

Posteriormente, se sumergieron tres veces en una solución de gelatina al 0.5%,

previamente filtrada, y se dejaron secando a 40°C en el horno DELTA A Series,

durante 48 horas. Finalmente, se almacenaron en cajas, a temperatura ambiente, hasta

su utilización.

Nota importante: Utilizar guantes durante el desarrollo del protocolo y para la

manipulación de los portaobjetos, y sobretodo no tocar con los dedos la superficie de

estos.

67

Apéndice 1. Protocolo para el corte de los cerebros de rata utilizando el criostato

Leica CM3050 S.

1. Ajustar la temperatura del criostato a –26°C, y esperar a que el equipo se

estabilice a dicha temperatura antes de iniciar el trabajo.

2. Aplicar una cantidad suficiente de “medio de montaje” (Leica

Cryocompound) sobre una “platina porta-muestras”, a temperatura ambiente.

3. Montar la muestra de cerebro, sobre la “platina porta-muestras” y orientar el

tejido teniendo el cuidado de posicionar la parte superior del cerebro en donde

se señala en la platina.

4. Recubrir el tejido superficialmente con el “medio de montaje” (Leica

Cryocompound) e inmediatamente colocar la platina con la muestra en uno de

los diez orificios del “bloque de congelación rápida” del criostato. Dejar

reposando diez minutos con el fin de que disminuya la temperatura de la

muestra y alcance la temperatura de la cámara.

5. Montar la platina con la muestra en el “termobloque” del criostato, acercar la

muestra a la cuchilla y ajustar la “ventana de corte” de la muestra.

6. Desbastar la muestra hasta obtener secciones completas de la superficie total

del tejido.

7. Ajustar el ángulo de corte de la muestra, orientándola en sus ejes x-, y-, z-.

8. Ajustar el grosor del corte a 25µm y utilizar una velocidad de corte del 20%

(42mm/s).

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Apéndice 2. Protocolo para la tinción de cortes de cerebro de rata, de 25µm de

grosor, con Azul de Metileno (Modificado a partir del protocolo de Rüdeberg

(1967)).

1. Preparar una Solución de Trabajo de Azul de Metileno al 0.25%, en agua

destilada, y añadir diez gotas de alcohol 95%.

2. Añadir la Solución de Trabajo, con un gotero, sobre un portaobjetos con un

corte de tejido de cerebro de rata.

3. Esperar 30 segundos y lavar tres veces en agua destilada.

69


grosor, con Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo de Aldana et al.

(1996)).

1. Preparar una Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al 0.1%, en agua

destilada; disolver el colorante removiendo la solución con un agitador

magnético a una temperatura entre 50-60 °C durante 30 minutos e

inmediatamente filtrar la solución para evitar grumos.

2. Añadir la Solución de Trabajo, con un gotero, sobre un portaobjetos con

muestra de tejido de cerebro de rata.

3. Esperar 5 minutos y lavar dos veces en agua destilada.

4. Añadir alcohol 70%, durante 30 segundos, sobre el portaobjetos con la

muestra de tejido, y decantar el líquido. Repetir este paso con alcohol 95% y

luego con alcohol absoluto.

5. Aplicar una gota de xileno, a cada corte de cerebro de rata del portaobjetos, y

añadir el medio de montaje al cubreobjetos para fijarlo al portaobjetos.

6. Reposar el portaobjetos, mínimo una hora, antes de observar la muestra al

microscopio.

70


grosor, con Hematoxilina y Eosina (Modificado a partir del protocolo de Bush

(1877)).

1. Preparar una Solución de Trabajo de Eosina al 30%, en alcohol 95%; y una

solución de Bicarbonato de Sodio al 1%, en agua destilada.

2. Sumergir un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una

batería con la solución lista para usar de Hematoxilina al 1%.


4. Cubrir la muestra con unas gotas de HCl 1N, hasta decolorar el tejido

(aproximadamente 4 segundos), decantar la solución y aplicar, seguidamente,

la solución de Bicarbonato de Sodio al 1% hasta oscurecer el tejido

(tornándose nuevamente color morado-azul); por último, lavar la muestra en

agua destilada.

5. Sumergir la muestra en una batería con la Solución de Trabajo de Eosina al

30%.


7. Añadir alcohol 70%, durante 30 segundos, sobre el portaobjetos con la

muestra de tejido, y decantar el líquido. Repetir este paso con alcohol 95% y

luego con alcohol absoluto.

8. Aplicar una gota de xileno, a cada corte de cerebro de rata del portaobjetos, y

añadir el medio de montaje al cubreobjetos para fijarlo al portaobjetos.

9. Reposar el portaobjetos, mínimo una hora, antes de observar la muestra al

microscopio.

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grosor, con Luxol Fast Blue y Cresyl Fast Violet (Modificado a partir del protocolo

de Klüver y Barrera (1954)).

1. Preparar una Solución de Trabajo de Luxol Fast Blue 0.1%, en agua destilada,

y añadir 0.5mL de Ácido Acético 10%. Preparar, además, una solución de

Carbonato de Litio 0.05%, en agua destilada.

2. Sumergir un portaobjetos, con muestra de tejido de cerebro de rata, en una

cubeta tipo Coplin con la solución de Luxol Fast Blue 0.1%, durante la noche

(aproximadamente 12 horas), a 60°C.

3. Lavar el exceso de colorante en alcohol 95% y luego en agua destilada,

contando 5 segundos en cada líquido.

4. Sumergir el portaobjetos en la solución de Carbonato de Litio 0.05%, durante

5 segundos.

5. Seguidamente, sumergir el portaobjetos, por un tiempo de 30 segundos, en

alcohol 70% y luego lavar en agua destilada.

6. Realizar un contratinción con la Solución de Trabajo de Cresyl Fast Violet al

0.1%, siguiendo el protocolo anteriormente mencionado.

72

Apéndice 6. Resultados y características del tratamiento histológico realizado a los cuarenta cerebros de rata en el estudio de la enfermedad de Parkinson.

MUESTRA TRATAMIENTO OBSERVACIONES

MTE4R01 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con HyE

Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm







MTE4R05 Miotoxina Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE












MTE4R11 Miotoxina Total de portaobjetos: 7. Tinción con HyE realizada por

Juan José Ramírez Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm













-continúa en la siguiente página-

73

Continuación del Apéndice 6




MTE4R19 Miotoxina Hematoma en el cerebro. Tinción con HyE


MTE4R20 Miotoxina Total de portaobj: 5. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm

MTE4R21 Control Total de portaobjetos: 5. Tinción con Cresyl Violeta


MTE4R22 Control Total de portaobj: 6. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm

MTE4R23 Control Total de portaobjetos: 12. Tinción con HyE, Cresyl

Violeta y Luxol Fast Blue Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm

MTE4R24 Control Total de portaobjetos: 12. Tinción con HyE, Cresyl

Violeta y Luxol Fast Blue Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm


Fin de la cánula: Interaural 3.40mm y Bregma -5.60mm Se observaron restos de hemosiderina en la cicatriz



MTE4R27 T+alquil Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE










MTE4R32 T+alquil

Total de portaobjetos: 4. Tinción con HyE Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm El fin de la cánula se observó en la zona del pedúnculo

cerebral

-continúa en la siguiente página-

74

Continuación del Apéndice 6




MTE4R34 T+alquil Individuo murió antes de terminar experimento



MTE4R36 T+alquil Total de portaobj: 12. Tinción con HyE y Cresyl Violeta Fin de la cánula: Interaural 2.96mm y Bregma -6.04mm





Implementacion y Estandarizacion de Diversas Tecnicas as Para Su Aplicacion en Estudios Experiment...

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