Iga Modulo

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias Agrarias, Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didáctico del curso Ingeniería Genética Agropecuaria

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS AGRARIAS Y PECUARIAS DEL MEDIO AMBIENTE

203027 - INGENIERÍA GENÉTICA AGROPECUARIA

LESLIE YANETH LEAL MEJÍA

Tutora ECAPMA

GUSTAVO FORERO

Acreditador

BOGOTÁ

Septiembre de 2009

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INDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCION. 7 UNIDAD 1: CONCEPTOS Y PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA TECNOLOGIA

DEL ADN RECOMBINANTE 16

CAPITULO 1: BIOTECNOLOGIA. 16 Lección 1: Introducción a la Biotecnología. 16 Lección 2: Conceptos. 17 Lección 3: Biotecnología en producción agrícola y animal. 19 Lección 4: Estructura del ADN. 24 Lección 5: Historia. 28 CAPITULO 2: TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE. 32 Lección 6: ADN recombinante y su historia. 32 Lección 7: Conceptos. 35 Lección 8: Principios de la Tecnología del ADN recombinante I. 38 Lección 9: Principios de la Tecnología del ADN recombinante II. 45 Lección 10: Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR). 47 CAPITULO 3: METODOS DE ANALISIS DEL ADN. 53 Lección 11: La técnica de “Southern Blot”. 53 Lección 12: La técnica de “Northern Blot” 56 Lección 13: La técnica de “Western Blot”. 56 Lección 14: Extracción de ADN. 64 Lección 15: Caracterización de los organismos transgénicos. 67

Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 1 69

Fuentes Documentales de la UNIDAD 1 70

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UNIDAD 2: ASPECTOS TECNOLÓGICOS EN LA OBTENCIÓN DE PLANTAS Y ANIMALES TRANSGÉNICOS. 73 CAPITULO 4: BIOTECNOLOGIA VEGETAL. 73 Lección 16. Métodos directos de transformación para introducir genes de interés en la célula vegetal. 73 Lección 17 Obtención de un vector en transgenesis vegetal. 74 Lección 18: ¿Cómo se hace una planta transgénica? 76 Lección 19: Electroporación de Protoplastos. 79 Lección 20: Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero genético por naturaleza. 81 CAPITULO 5: METODOS DE ANALISIS TRANSFORAMCIÓN. 88 Lección 21: Tecnología Antisentido. 88 Lección 22: Aplicación de la técnica. 90 Lección 23: Otros métodos de transformación. 91 Lección 24: Aplicaciones I. 94 Lección 25: Aplicaciones II. 97 CAPITULO 6: BIOTECNOLOGÍA ANIMAL. 103 Lección 26: Métodos de obtención de animales trangénicos I. 103 Lección 27: Métodos de obtención de animales trangénicos II. 107 Lección 28: Aplicaciones de la transgénesis anomal. 110 Lección 29. Algunos ejemplos de animales transgénicos. 113 Lección 30. Implicaciones biológicas, comerciales y de bioseguridad de los OGMs. 117

Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 2 136

Fuentes Documentales de la UNIDAD 2 137

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LISTADO DE GRÁFICOS Y FIGURAS

Estructura del ADN 25

Representación esquemática de la molécula de ADN.

Estructura tridimensional de la doble hélice. 26

Identidad genética 27

Ingenieria genética: modelos animales y vegetales 28

Enzimas de restricción y secuencias de corte 40

Geles de agaros teñidos con bromuro de etidio 44

Amplificación exponencial de la PCR 50

Electroforesis 52

Southern blot 55

Hidrólisis por Eco R1 58

ADN en la célula 59

Transgén 75

Transferencia de genes 76

Construcción de genes para transgénesis 77

Transgénesis 78

Protoplastos 79

Pelos radicales 81

Transformación genética de plantas 82

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Plásmido T1 84

Tranferencia de un vector por conjugación 87

Transformación de discos foliares del tabaco 92

Biobalística 93

Equipo de biobalística 94

Microinyección de ADN 107

Manipulación de células embrionarias 109

Ratón quimérico 110

Animales acuáticos transgénicos 111

Las ovejas Polly y Molly 115

Mono transgénico 116

Cerdos ricos en omega-3 116

Ratón transgénico 117

Primera generación de cultivos transgénicos 118

Algodón geneticamente modificado – China 119

Cultivos transgénicos liberados comercialmente 120

Producción de plantas transgénicas en Colombia 124

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didáctico del curso academico: Ingeniería Genética

Agropecuaria, fue diseñado inicialmente en el año 2007 por la doctora Luz Mery

Bernal Parra, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD José Celestino Mutis de

Bogotá. Es Bióloga de la Universidad de Curitiba (Brasil), Master en Biología de la

Pontificia Universidad Javeriana (Colombia) y PhD en biología de la Universidad

de Sao Paulo (brasil). Se ha desempeñado como miembro del grupo de

investigación y tutora de la UNAD desde el 2007 hasta el año la actualidad.

El contenido didáctico ha tenido una actualzaición realizada en el año 2009

por la bióloga Leslie Yaneth Leal Mejía, quien ha sido tutora de la UNAD en el

CEAD de José Celestino Mutis en Bogotá durante año 2009.

La version del contenido didáctico que actualmente se presenta tiene como

características: Incorpora nuevas lecciones en los capítulos y temas para el

proceso de acreditaión desarrollado en el mes de septiembre de 2009.

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INTRODUCCIÓN

Desde hace milenios el hombre ha domesticado diversas especies animales y vegetales

para beneficio propio y para mejorar el ambiente. De estas especies se obtiene una gran

cantidad de productos que contribuyen al sostenimiento de la población. La agricultura, la

ganadería y la pesca (todas ellas actividades de importancia en la economía de los

países) dependen de la explotación de organismos superiores, como también de una

gama muy variada de productos que son resultado de la actividad de microorganismos;

alimentos y bebidas fermentadas, solventes, antibióticos, vitaminas, enzimas, fármacos y

muchos otros más.

Todas las técnicas de aprovechamiento de los sistemas biológicos, se inscriben en el

ámbito de la biotecnología, a la cual se ha incorporado recientemente la ingeniería

genética que hace posible la manipulación del genoma de los seres vivos. Así, gracias a

la utilización de los conocimientos de biología y a las técnicas propias de bioquímica,

microbiología, genética, biología molecular e ingeniería química, la biotecnología permite

aprovechar en el plano tecnológico las propiedades y los productos de microorganismos,

células en cultivo y organismos superiores. Podemos considerar la biotecnología como un

ámbito de formación e integración vertical de capacidades científico-tecnológicas que

requiere una permanente actualización de diferentes conocimientos en disciplinas de base

como genética, bioquímica, ingeniería de procesos, así como un espacio de innovación

horizontal que cruza transversalmente diferentes sectores productivos, tales como el

agropecuario, agroindustrial y farmacéutico, de modo que ofrece amplias perspectivas

para desarrollar productos y servicios. Los avances de la biotecnología especialmente en

la ingeniería genética, están transformando los mercados y ampliando el horizonte de

oportunidades en diversos campos de la agroindustria y tiene un impacto decisivo en la

intensificación y diversificación de las cadenas y procesos productivos.

El crecimiento poblacional es muy importante en términos cuantitativos. En el año 2030 la

FAO ha señalado que habrá 10 mil millones de personas –o sea casi un 40% más de las

de hoy- y que la mitad de esta población vivirá en ciudades. Esto tiene componentes de

fuerte urbanización y de cambios rápidos de los valores culturales de los pueblos. Desafía

a los sistemas, ya que hay que proveer a los nuevos ciudadanos de educación, servicios y

alimentos. Se debe asegurar alimentación para todos –pobres y ricos- y por tanto se

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necesitan nuevas cadenas agroindustriales que aseguren la producción y la distribución

de los alimentos. En relación con el medio ambiente, se evidencia una variación de los

parámetros que caracterizan al clima a lo largo del planeta. Los efectos para la agricultura

se manifiestan en modificaciones en las temperaturas medias, los regímenes de

precipitación, la estacionalidad, los incrementos en pestes y ocurrencia de malezas entre

otros. Las nuevas condiciones ambientales establecen que los cultivos y los sistemas

deban poseer nuevas capacidades para la producción.

La ciencia y la tecnología están transformando la estructura económica y social de

muchas naciones y, por ser instrumento indispensable de progreso, necesita un impulso

sin precedentes.

La UNAD consciente de los avances biotecnológicos diseñó un curso de Ingeniería

Genética Agropecuaria orientado a profesionales en el área, que contribuya a la

investigación y desarrollo de productos y servicios relacionados con el sector

agropecuario y agroindustrial. También que proporcione información para viabilizar la

aplicación más efectiva de la tecnología disponible, para evaluar políticas y programas y

sugerir prioridades para nuevos direccionamientos en investigación.

El objetivo fundamental del curso consiste en preparar profesionales que tengan los

conocimientos para desarrollar tecnología de punta en esta área y que estén capacitados

para incorporar nuevas técnicas. Los alumnos serán incentivados a participar activamente

en los trabajos de laboratorio ya que de esta manera serán entendidas las técnicas del

ADN recombinante, aprenderán cómo y por qué son producidas las plantas y los animales

transgénicos y sus aplicaciones. De igual manera serán estimulados para participar en las

discusiones sobre este controvertido tema.

El curso Ingeniería Genética Agropecuaria está compuesto de dos créditos académicos,

se inscribe en el campo de postgraduación con un carácter electivo y pertenece al tipo

metodológico (teórico-práctico), por lo cual el estudiante además de los conocimientos

teóricos, tendrá la oportunidad de complementarlos con prácticas de observación en

campo, como visita a entidades que desarrollan esta tecnología. Además son designadas

prácticas complementarias en el laboratorio.

El curso académico se estructura en dos (2) Unidades:

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Unidad 1. Conceptos y perspectiva histórica de la tecnología del ADN recombinante

Unidad 2. Aspectos tecnológicos en la obtención de plantas y animales transgénicos

La Unidad 1. Comprende los temas principales que se reúnen bajo la denominación de

tecnología de ADN recombinante. En este campo se han verificado los progresos más

notables de los últimos años, sobre los cuales reside el futuro de la ingeniería genética.

Estos temas serán presentados bajo una perspectiva histórica en donde se conocerá

cómo y a quién se deben algunos de los progresos fundamentales.

Con el objeto de comprender la tecnología del ADN recombinante se debe comenzar por

conocer las principales moléculas constitutivas. Una introducción básica al estudio de la

molécula de ADN como unidad fundamental, se hará en uno de los capítulos de esta

unidad, donde se examinará la estructura y su función y se relacionará con las diferentes

enzimas de restricción claves para generar un Organismo Genéticamente Modificado

(OGM). Los principales métodos de estudio del ADN también serán enunciados y se hará

énfasis en la comprensión de estos por medio de ayudas audiovisuales y recursos

educativos en la Internet.

También en esta unidad se examinarán los principales métodos de transformación del

organismo huésped y se analizará en particular el papel de las principales técnicas que

nos llevan a detectar si el gen foráneo se ha integrado al genoma, y si se expresa.

Además se expondrá de manera sucinta las bases que nos llevan a determinar la

respuesta biológica de la planta o animal transformado y seleccionar cuál de los clones

obtenidos es de interés comercial o científico.

La Unidad 2. Abarca los aspectos fundamentales en la obtención de un OGM tanto animal

como vegetal. Esta unidad adquiere importancia especial, puesto que en ella se exponen

los fundamentos recientes sobre esta tecnología, los factores que intervienen en el uso de

una u otra técnica, además las continuas interrelaciones entre ellas. Así mismo, se tocan

tópicos relacionados con aplicaciones prácticas de la transgénesis vegetal y animal.

Cada uno de los capítulos cuenta con una introducción que permite que el alumno se

familiarice con conceptos que serán abordados más adelante.

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Cabe destacar de modo significativo la lección sobre: Implicaciones biológicas, éticas, económicas y comerciales de los OGMs, donde se expone de manera breve algunas de las controversias que ha generado en la sociedad la aplicación de esta tecnología. Son muchas las dudas generadas en la población, relativas a los OGMs: ¿Qué puede pasar si se ingiere un transgénico?, ¿Habrá transgénicos a la venta en los supermercados, sin qué los productos estén debidamente identificados y rotulados?, ¿Cuál es la legislación vigente y cual sería el efecto a mediano y largo plazo si algunos transgénicos se dispersan en el ambiente?. Estas y otras preguntas serán aclaradas parcialmente con la información suministrada en la lección, pero además se propone un foro abarcando estos temas que será abierto después de la lectura de artículos publicados en diversos sitios de Internet. Este foro esta encaminado a emitir juicios de valor, personales y fundamentados, sobre las implicaciones éticas de la manipulación genética.

La metodología que se emplea en el desarrollo del curso consiste en información teórica

suministrada al estudiante que le permite desenvolver la habilidad para comprender y

relacionar los conceptos y técnicas empleadas en la nueva tecnología que se le presenta.

La consulta de textos, artículos científicos y recursos educativos en la Internet pretende

servir de apoyo para un aprendizaje más amplio que garantice una mejor asimilación de

las temáticas estudiadas.

Es de gran importancia tanto el trabajo individual como la participación activa del

estudiante con el tutor y de los estudiantes entre sí. Por medio de actividades específicas

se promueve esta integración.

Se sugieren prácticas de campo en las que se contempla la visita a entidades que

desarrollan esta tecnología como el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), Universidad

Nacional de Colombia y Pontificia Universidad Javeriana. Además se ha designado una

práctica de laboratorio complementario donde se elabora el protocolo correspondiente a la

Construcción de un Mapa de restricción, con el manejo de enzimas de restricción,

herramientas básicas de la ingeniería genética y el uso de la reacción en cadena de la

polimerasa, técnica ampliamente utilizada.

Al final del curso el alumno esta capacitado para la elaboración de un trabajo escrito sobre

un modelo de investigación, en donde se emplearan algunas de las técnicas estudiadas,

teniendo como base los conocimientos teóricos, prácticos, las lecturas de textos, artículos

científicos y consultas en Internet. El modelo propuesto debe ser un sistema integrado por

un componente productivo y por un componente de desarrollo tecnológico. Se debe

elaborar un diseño conceptual del modelo y deben ser planteados los objetivos, marco

teórico, conclusiones y recomendaciones. La propuesta será analizada y discutida en

clase tutorial.

Los criterios de evaluación se guían por los parámetros propuestos en el Proyecto

Académico Pedagógico que presenta diferentes niveles de acuerdo a las circunstancias y

situaciones acordadas entre tutores y estudiantes.

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Autoevaluación: el propio estudiante evalúa su proceso de aprendizaje e identifica sus

alcances y limitaciones.

Coevaluación: proceso colaborativo de evaluación por medio del cual se valora el trabajo

personal, los progresos, inquietudes y aportes frente a sus compañeros.

Heteroevaluación: valoración del tutor de los resultados del aprendizaje donde se

determina los avances y logros de los estudiantes por medio de estrategias metodológicas

destinadas para este fin. Se incluye el uso del portafolio de desempeño personal en

donde se llevaran los registros del trabajo cognitivo como el informe de lecturas,

preguntas contextualizadas y talleres. Además se programa una evaluación final.

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UNIDAD 1

Nombre de la Unidad Conceptos y perspectiva histórica de la

tecnologia del adn recombinante

Introducción En esta Unidad se hará un acercamiento a los

conceptos más relevantes de la biología

molecular y su aplicación en la tecnología del

ADN recombinante, también se presentará una

reseña histórica sobre los comienzos de la

ingeniería genética que nos dará una mirada

mas amplia y un mejor entendimiento de como

llegamos al lugar en el que estamos en las

investigaciones.

Justificación La Ingeniería Genética tiene como arma

poderosa la manipulación del ADN para

identificar, seleccionar, aislar y transferir genes

específicos, seleccionados de un amplio pool

génico. Con el uso de esta tecnología se espera

alcanzar nuevos productos ecológicamente

sustentables, más productivos y de superior

calidad. Esta ciencia está revolucionando todas

las áreas del conocimiento incluyendo

la agricultura y la ganadería, campos que en

este momento ya son considerados blanco de

una gran transformación tecnológica. Los

analistas aseguran que el siglo XXI será el siglo

de la Ingeniería Genética. Por tanto se trata de

un área estratégica y de gran interés para las

Universidades que ofrecen las Carreras

Agropecuarias. El conocimiento de las técnicas

de ADN recombinante y su aplicación conducen

al avance de la productividad agropecuaria, al

mejoramiento en la calidad de los alimentos, al

desarrollo de estrategias que reduzcan el uso de

pesticidas y fertilizantes, con la consecuente

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protección del suelo.

Intencionalidades Formativas Proporcionar los conceptos que permitan

entender la Biotecnología como una ciencia que

está revolucionando la producción.

Definir los términos afines con la biotecnología

del ADN recombinante y conocer las bases

científicas de las metodologías moleculares

relacionadas.

Adquirir nociones, conceptos y resuelve situaciones relacionados con la tecnología del ADN recombinante. Capacitar al estudiante en el uso de las nuevas

tecnologías para viabilizar la aplicación más

efectiva de la tecnología disponible en el campo

agropecuario.

Denominación de capítulo 1 BIOTECNOLOGÍA

Denominación de Lección 1 Introducción a la Biotecnología 6

Denominación de Lección 2 Conceptos 7

Denominación de Lección 3 Biotecnología en producción agrícola y animal

Denominación de Lección 4 Estructura del ADN 13

Denominación de Lección 5 Historia

Denominación de capítulo 2 TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

Denominación de Lección 6 ADN recombinante y su historia 19

Denominación de Lección 7 Conceptos 22

Denominación de Lección 8 Principios de la Tecnología del ADN recombinante I

Denominación de Lección 9 Principios de la Tecnología del ADN recombinante II

Denominación de Lección 10 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Denominación de capítulo 3 METODOS DE ANALISIS DEL ADN

Denominación de Lección 11 La técnica de “Southern Blot”

Denominación de Lección 12 La técnica de “Northern Blot” 37

Denominación de Lección 13 La técnica de “Western Blot” 49

Denominación de Lección 14 Extracción de ADN 49

Denominación de Lección 15 Caracterización de los organismos transgénicos

UNIDAD 2

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Nombre de la Unidad ASPECTOS TECNOLÓGICOS EN LA OBTENCIÓN DE PLANTAS Y ANIMALES TRANSGÉNICOS

Introducción En esta Unidad se pretende definir el término de Organismo Genéticamente Modificado (OGM) y proporcionar los conocimientos básicos de los conceptos y técnicas que permiten obtener estos organismos, se enfatizará en las nuevas metodologías empleadas como auxilio en el mejoramiento convencional y serán dados ejemplos concretos de su uso. Además serán abordadas las implicaciones biológicas y comerciales de los OGMs, lo mismo que el estado actual de estos en la producción agrícola colombiana.

Justificación Cualquier tecnología compleja necesita para su

desarrollo de una infraestructura sustentada en

una comunidad que involucre la investigación, la

educación, la legislación. Se requiere una

comunidad para hacer que una tecnología pase

por etapas de prueba, de concepto, desarrollo,

maduración, extensión y finalmente termine con

su adopción. Muchos esfuerzos con distintas

modalidades se han aplicado en diversos países

para catalizar el crecimiento de estas nuevas

biotecnologías. En todos ellos la estrategia esta

dirigida a establecer una comunidad con visión

científica y competitiva.

Es importante entonces fomentar el

establecimiento de una capacidad científica en

biotecnología, especialmente en herramientas

como la ingeniería genética, en alumnos,

principalmente en aquellos que de alguna

manera tiene relación con las carreras

agropecuarias y afines, que puedan producir un

impacto favorable en el desarrollo

socioeconómico e impulsar la capacidad de

investigación.

Intencionalidades Formativas Adquirir conocimientos sobre la Ingeniería

Genética concretamente los encaminados a

entender y comprender los fundamentos de la

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transgénesis.

Identificar los métodos directos de

transformación de células vegetal y animales

para la obtención de un OGM.

Desarrollar habilidades prácticas en el manejo

de técnicas de biología molecular claves para la

aplicación de la tecnología del ADN

recombinante.

Valorar la importancia que actualmente tienen

estas técnicas y su proyección a futuro,

evaluando sus implicaciones en las distintas

áreas del conocimiento.

Denominación de capítulo 4 BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Denominación de Lección 16 Concepto y Modalidades 52

Denominación de Lección 17 Métodos directos de transformación para introducir genes de interés en la célula vegetal 53

Denominación de Lección 18 Obtención de un vector en transgenesis vegetal

Denominación de Lección 19 Electroporación de Protoplastos

Denominación de Lección 20 Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero genético por naturaleza

Denominación de capítulo 5 METODOS DE ANALISIS TRANSFORAMCIÓN II

Denominación de Lección 21 Tecnología Antisentido 6

Denominación de Lección 22 Aplicación de la técnica 68

Denominación de Lección 23 Otros métodos de transformación 70

Denominación de Lección 24 Aplicaciones I 73

Denominación de Lección 25 Aplicaciones II

Denominación de capítulo 6 BIOTECNOLOGÍA ANIMAL

Denominación de Lección 26 Introducción 78

Denominación de Lección 27 Métodos de obtención de animales trangénicos

Denominación de Lección 28 Técnica de trangénesis 82

Denominación de Lección 29 Aplicaciones de la Transgénesis Animal 84

Denominación de Lección 30 Implicaciones biológicas, éticas, económicas y comerciales de los OGMs.

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UNIDAD 1

CONCEPTOS Y PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA TECNOLOGIA DEL ADN

RECOMBINANTE

CAPITULO 1: BIOTECNOLOGÍA

Introducción

En este capitulo se pretende definir el término biotecnología, conocer su evolución y enfatizar en el aporte de esta ciencia a la producción agrícola y animal.

Lección 1. Introducción a la Biotecnología

El hombre desde hace milenios ha domesticado algunas especies animales y vegetales

para beneficio propio. La agricultura, la ganadería, la pesca y el aprovechamiento de los

bosques (todas estas actividades de importancia en la economía de los países) dependen

de la explotación de organismos superiores. Hay también una gama muy variada de

productos que son resultado de la actividad de microorganismos; alimentos y bebidas

fermentadas, solventes, antibióticos, vitaminas, enzimas, fármacos y muchos otros más.

Las técnicas de aprovechamiento de sistemas biológicos, de los productos o sus partes,

se incluyen en una ciencia denominada biotecnología, a la cual se ha incorporado

recientemente la ingeniería genética molecular que permite la manipulación del genoma

de los seres vivos. Así, gracias a la utilización de los conocimientos de biología y a las

técnicas propias de bioquímica, microbiología, genética, biología molecular e ingeniería

química, la biotecnología permite aprovechar en el plano tecnológico las propiedades y los

productos de microorganismos, células en cultivo y organismos superiores.

Podemos considerar la biotecnología como una ciencia que requiere una preparación

científico-tecnológica permanente y que demanda una continua actualización de

conocimientos en disciplinas como genética, bioquímica, ingeniería de procesos; así como

un espacio de innovación que cruza diferentes sectores productivos, tales como el

agropecuario, agroindustrial y farmacéutico, de modo que ofrece amplias perspectivas

para desarrollar productos y servicios. Los avances de la biotecnología especialmente en

la Ingeniería genética, están transformando los mercados y ampliando el horizonte de

oportunidades en diversos campos de la agroindustria y tiene un impacto decisivo en la

intensificación y diversificación de las cadenas y procesos productivos.

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El crecimiento poblacional es muy importante en términos cuantitativos. La FAO ha

señalado que en el año 2030 habrá 10 mil millones de personas y que la mitad de esta

población vivirá en ciudades. Esto desafía a los sistemas, ya que se requiere proveer a

los nuevos ciudadanos de educación, servicios y alimentos. Se debe asegurar

alimentación para todos y por tanto se necesitan nuevas cadenas agroindustriales que

aseguren la producción y la distribución de los alimentos. En relación con el medio

ambiente, se evidencia una variación de los parámetros que caracterizan al clima a lo

largo del planeta. Los efectos para la agricultura se manifiestan en modificaciones en las

temperaturas medias, los regímenes de precipitación, la estacionalidad, los incrementos

en pestes y ocurrencia de malezas entre otros. Las nuevas condiciones ambientales

establecen que los cultivos y los sistemas de producción deben poseer nuevas

capacidades para la producción.

Lección 2 Conceptos

El Hombre ha venido haciendo uso de animales y plantas para el suministro de alimentos

desde la Edad de Piedra. Los registros históricos indican que desde hace 6.000 años se

utilizan microorganismos para la elaboración de alimentos como pan y lácteos. El avance

del conocimiento en biología entre los años 1960 y 1980 fue cualitativamente muy

importante, se pudo ingresar al interior de las células y comprender en detalle el

funcionamiento de estas. Las biomoléculas fueron mostrando sus capacidades y se llegó

al nuevo término: biotecnología. El conocimiento biológico tiene hoy un nuevo valor.

Puede cambiar radicalmente la producción de bienes y servicios, por lo que se plantean

retos no sólo para la biología, sino para la economía y la sociedad.

La biotecnología es una ciencia que permite, gracias a la aplicación integrada de los

conocimientos de bioquímica, microbiología, ingeniería química e ingeniería

genética aprovechar en el plano tecnológico las propiedades de los

microorganismos y los cultivos celulares. Permite producir a partir de recursos

renovables y disponibles en abundancia gran número de sustancias y compuestos.

Desde el punto de vista industrial, la biotecnología (bioindustria) comprende las

actividades de la industria química: síntesis de sustancias aromáticas saborizantes,

materias plásticas, productos para la industria textil; en el campo energético la producción

de etanol, metanol, biogas; en la biomineralurgia la extracción de minerales. Además, en

algunas actividades cumple una función motriz esencial: la industria alimentaria

(producción masiva de levaduras, algas y bacterias con miras al suministro de proteínas,

aminoácidos, vitaminas y enzimas); producción agrícola (clonación y selección de

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variedades a partir de cultivos de células y tejidos, especies vegetales y animales

trangénicos, producción de bioinsecticidas); industria farmacéutica (vacunas, síntesis de

hormonas, interferones y antibióticos); protección del medio ambiente (tratamiento de

aguas, transformación de deshechos domésticos, degradación de residuos peligrosos y

fabricación de compuestos biodegradables).

En un principio, la aplicación de la biotecnología en los sistemas de producción se

manejaba casi exclusivamente en un plano de posibilidades, potencialidades y

expectativas. Actualmente, esas aplicaciones son ya una realidad. Esto se materializa

por ejemplo en los avances realizados en el manejo de materiales in vitro, la

caracterización y evaluación del germoplasma, el diagnóstico molecular de agentes

infecciosos en producción animal, la introducción de los transgénicos en el mercado.

Todas estas técnicas tienen un gran impacto en la producción y es claro que el desarrollo

de nuevas aplicaciones seguirá incrementándose. Son básicamente nuevas semillas,

plantas o animales con nuevas características genéticas que confieren caracteres

sanitarios, de calidad o adaptativos, los que llevan un valor agregado biotecnológico.

Entonces, la inserción de la biotecnología a varios niveles de las cadenas

agroalimentarias es esencial para favorecer la capacidad total de la cadena.

A modo de ejemplo, si consideramos el sector lácteo, las demandas comenzarían con

pastos y especies forrajeras de alta productividad, con una genética animal que aporte la

mejor capacidad de una producción de calidad, y con una industria que elabore productos

diferenciados.

Existe una demanda genérica por innovación dirigida a todo el sistema de Investigación y desarrollo agropecuario. Esta demanda tiene diferentes componentes según el rubro, por ejemplo calidad o productividad.

La demanda genérica por innovación es la que ha inducido en primer lugar a la

adopción de biotecnologías genéricas como:

• Cultivo in vitro de células y tejidos vegetales.

• Reproducción animal: semen, embriones.

• Genética molecular: amplificación, secuenciación y análisis de polimorfismos al nivel de

ácidos nucleicos, utilización de mapas genéticos, RFLPs, AFLPs, STRs y SNPs.

• Ingeniería genética

• Diagnóstico de patógenos usando métodos moleculares.

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Lección 3: Biotecnología en producción agrícola y animal

Desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel, el mejoramiento de las plantas de

cultivo dejó de ser empírico y se convirtió en científico. Las variedades se comenzaron a

seleccionar por ciclos de polinización cruzada (hibridación), se crearon variedades

selectas que han terminado desplazando a las antiguas.

La Revolución Verde (años 60), con la introducción de la mecanización en la agricultura,

la obtención de nuevas variedades híbridas y el uso intensivo de abonos y pesticidas, hizo

posible el aumento en la producción agrícola en muchos países que antes tenían graves

problemas de suministros de alimentos (China, India, parte de Latinoamérica).

De la mano de las nuevas biotecnologías, estamos entrando en una nueva era de la

agricultura con un papel central de la genética molecular. Ello se ha debido a un auge

espectacular de los conocimientos básicos de biología vegetal y a la aplicación de las

técnicas de Ingeniería Genética.

A partir de ahora, la "revolución" agrícola va a estar fundamentada en un uso

intensivo de saber científico y de técnicas moleculares y celulares.

Considerando los elementos de exigencias actuales y futuras de mercados, hay una

demanda fundamental por cierta disponibilidad de genotipos de buena calidad

genético/sanitaria, que cumplan determinadas características esperadas desde el punto

de vista agronómico:

• Calidad en la producción para un nivel más amplio de productos finales, incluyendo

nuevos usos industriales que permitan incrementar el valor de los productos en el

mercado.

• Mayor rendimiento.

• Consistencia de los rendimientos y/o factores de calidad a través de un amplio rango de

ambientes.

• Resistencia genética a enfermedades y plagas que permitan reducir el uso de

agroquímicos así como costos de producción.

• Habilidad para resistir factores de estrés (sequía, heladas, altas temperaturas).

• Aumento en la eficiencia de la utilización de nutrientes, especialmente nitrógeno.

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• Aumento en la habilidad competitiva de los cultivos frente a las malezas, disminuyendo

el uso de agroquímicos.

Las biotecnologías vinculadas al mejoramiento vegetal son:

1. Obtención rápida de líneas puras mediante las técnicas de dobles haploides o

rescate de embriones que pueden reducir en varias generaciones los programas de

mejoramiento. Es especialmente aplicable en autógamas. El avance generacional es una

de las bases del progreso genético. Se trata de acelerar las generaciones dentro de un

programa de mejoramiento. Acortar el ciclo desde que se hace un cruzamiento o desde

que se hace cualquier tipo de creación de variabilidad, hasta que se obtiene un cultivo.

Estos procedimientos de aceleración o adelanto generacional pueden favorecer la

obtención de los productos finales.

2. Técnicas de clonación por micropropagación para acelerar los procesos de

producción de semillas. En situaciones que requieren ampliar el tamaño de la población

inicial para la producción de semilla.

3. Genómica con técnicas de genética molecular asociadas a mapeo de

características mediante marcadores moleculares, extensamente incorporadas en el

ámbito mundial en determinados niveles de los programas de mejoramiento.

4. Ingeniería genética de nuevas variedades, que permitan la expresión de proteínas de

alto valor agronómico o industrial. Ya están disponibles en el mercado mundial materiales

de maíz, algodón y soya con características incorporadas por transgénesis, y la

perspectiva es que la presencia de este tipo de materiales sea cada vez más común.

El área sembrada con cultivos transgénicos ha aumentado en forma notoria,

alcanzando en la actualidad en el ámbito mundial alrededor de 80 millones de

hectáreas, representando la tecnología de mayor rapidez en incorporación al sector

productivo.

Biotecnología en producción animal

La capacidad de contar con animales sanos, capaces de una producción de calidad en

forma eficiente, constituye una parte importante de lo que el sector productivo necesita

para ser competitivo.

En el área de la reproducción, las biotecnologías más relevantes son:

1. Transferencia de embriones: se utiliza con embriones frescos o congelados.

2. Fecundación in vitro

3. Clonación: obtención de gemelos idénticos a través de la disgregación de las células

embrionarias o transferencia nuclear.

21


4. Sexado de semen

http://72.14.209.104/search?q=cache:6_87kqnT8HgJ:www.onudi.org.uy/xnwslite/xnws_go.php%

3Fm%3Dnw%26nw%3DMTE2%26PHPSESSID%3D3a9ec29945daec5abe89a1c82df41860+genomica

+y+bioinformatica+%2Buruguay&hl=es&gl=co&ct=clnk&cd=57 - 14y embriones: Consiste en la

separación (a través de la citometría de flujo), de espermatozoides portadores del

cromosoma X o Y para poder controlar el sexo a través de la inseminación artificial.

Recientes avances en el método de separación por citometría de flujo permiten obtener

muestras de semen enriquecidas hasta en un 85% de espermatozoides portadores de

cromosoma X. En la literatura se han reportado varias decenas de nacimientos obtenidos

con semen sexado, tanto en conejos como en vacunos y cerdos. Esta tecnología tiene

una demanda potencial fuerte en producción de leche.

5. Caracterización molecular de genotipos. Genotipos específicos que pueden ser

modificados para la obtención de un mejor producto. Ejemplo, tipificación de la Kappa-

caseína que es una proteína de la leche.

En la actualidad se prevé un aumento de la demanda por las técnicas moleculares para el

mejoramiento de especies, así como también de mecanismos que permitan apoyar el

desarrollo de los sistemas de mejoramiento clásico ya implementados.

Algunas técnicas biotecnológicas también pueden contribuir tanto a la caracterización

como a la conservación de recursos genéticos animales. La colección y el stock de ADN

de animales criollos, es un instrumento de bajo costo y de gran utilidad futura. La

búsqueda sistematizada de variantes génicas de interés productivo, se desarrolla en

paralelo con el crecimiento del mapeo y aislamiento de genes.

El aporte de la biotecnología a la optimización del uso de los recursos nutricionales en el

proceso productivo se puede efectuar (además de la vía del mejoramiento genético) a

través del mejoramiento de pastos, del mejoramiento del proceso digestivo en el animal y

de la optimización de procesos utilizados para obtener el forraje.

Ejemplo: en los procesos de fermentación llevados a cabo en el aparato digestivo de los

rumiantes, algunos componentes del forraje pierden valor biológico. Esto es

especialmente importante en lo que respecta a los aminoácidos esenciales como la lisina,

cisteína y triptófano. La biotecnología ofrece dos estrategias para combatir la pérdida del

valor biológico del alimento a este nivel. Inicialmente, es posible (mediante ingeniería

genética) introducir en la planta genes que codifiquen para proteínas de alto

contenido en aminoácidos esenciales. La estructura física de estas proteínas

determina que no puedan ser digeridas a nivel del rumen, sino que este proceso se lleve a

cabo en el abomaso, sorteando de esta manera la degradación de la flora ruminal. La

misma metodología ha sido utilizada para la obtención de forrajeras resistentes a

herbicidas y para la obtención de leguminosas con alto contenido en taninos que

disminuyan su riesgo de producir meteorismo. Una segunda opción es la manipulación

de la flora ruminal. Mediante técnicas de transformación bacteriana ampliamente

http://72.14.209.104/search?q=cache:6_87kqnT8HgJ:www.onudi.org.uy/xnwslite/xnws_go.php%3Fm%3Dnw%26nw%3DMTE2%26PHPSESSID%3D3a9ec29945daec5abe89a1c82df41860+genomica+y+bioinformatica+%2Buruguay&hl=es&gl=co&ct=clnk&cd=57#14



22


utilizadas en biología molecular, es posible introducir genes que codifiquen para proteínas

ricas en aminoácidos esenciales o que sean capaces de aumentar la digestibilidad de la

fibra a través de una mayor capacidad de degradación de celulosa y de lignina. En este

sentido, la Meat Research Corporation de Australia desarrolló cepas de Bacillus

fibrionosolvens con un gen de celulosa obtenido de un hongo ruminal. Una vez que se

cuente con flora ruminal mejorada genéticamente, esta podrá ser transferida fácilmente a

los productores, ya que consiste exclusivamente en la inoculación ruminal a través de una

toma.

¿Dónde estamos y hacia donde vamos en agrobiotecnología?

En la actualidad podemos insertar un gen nuevo en un organismo animal o vegetal, ya

están completos los mapas genéticos de algunas especies, la primera generación de

productos modificados genéticamente está en producción en varios países. Una nueva

generación de productos aparecerá en breve y está dirigida a los consumidores y

productores. Esta nueva generación incluye a los alimentos funcionales, la unión de la

nutrición y la farmacéutica en lo que se ha comenzado a denominar ―nutracéutica‖, la

producción de sustancias de alto valor industrial, la aparición de nuevas fibras naturales y

la utilización de la biomasa para producción de energía entre otras aplicaciones. Es así

entonces, que una nueva era surge denominada BioEconomía en donde la agricultura se

expande hacia la salud, la química, los materiales y la energía.

El campo de la robótica está influenciando a la biología estructural para abrir paso a la

genómica estructural. La genómica estructural abre nuevos campos de desarrollo para las

proteínas. El impacto potencial de la predicción de cómo una proteína es conformada, su

capacidad biológica y las posibilidades de su ingeniería para un determinado proceso,

generan posibilidades enormes para la medicina y la agropecuaria. Los procesos

automatizados de identificación de funciones génicas y sus relaciones con el genoma

entero están acelerando las capacidades para entender como funciona la vida. La

genómica funcional para estudio de los procesos fisiológicos es una realidad que se

acelera con los chips de ADN.

Todos estos avances implican retos para los países, que deben introducir y desarrollar

biotecnologías con estrategias que cumplan objetivos de competitividad, mejora en la

producción, lo que deriva en servicios con un mejor nivel en el área de la salud, medio

ambiente y calidad de los alimentos, entre otros. Esta es la visión que genera una

importante respuesta de inversión a la investigación, desarrollo y aplicación de este grupo

de tecnologías.

Cualquier tecnología compleja necesita para su desarrollo de una infraestructura

sustentada en una comunidad que involucre la investigación, los negocios, el gobierno, la

educación, las finanzas, la legislación y otros. Se requiere una comunidad para hacer que

una tecnología pase por etapas de prueba de concepto, desarrollo, maduración, extensión

y finalmente termine con su adopción.

23


En América Latina, muchos esfuerzos con distintas modalidades se han aplicado para

catalizar el crecimiento de estas nuevas bioindustrias. Se considera importante fomentar

el establecimiento de una capacidad nacional en biotecnología, requerida para

seleccionar, desarrollar, adecuar, aprovechar e implementar aquellas tecnologías que

respondan a las condiciones específicas de cada región y que produzcan un impacto

favorable en el desarrollo socioeconómico, con criterios éticos, de sostenibilidad,

competitividad y de protección al medio ambiente.

Según publicación del Dr. Rafael Aramendis, Ms. Sc. ―Colombia lanza un plan estratégico

de biotecnología que pretende facilitar la inserción de esta tecnología como componente

del desarrollo socioeconómico del país‖.

Apartes de esta publicación indican la evolución del establecimiento de la biotecnología

en Colombia, comenzando por los años 90 cuando se concentraba en los centros de

investigación, Institutos y Universidades, presentado un bajo nivel de competitividad, ya

que no era incorporada al sector productivo. A partir de 1997 y con la ayuda de aportes

otorgados por Colciencias, se evidenció una transformación especialmente en las

investigaciones en el campo agropecuario (pérdidas agrícolas ocasionadas por el ataque

de patógenos a cultivos de importancia económica en el país: café, flores, plátano,

banano, maracuyá, entre otros) y en el campo de la salud donde las pesquisas fueron

dirigidas al estudio de patologías propias del país (malaria, leshmaniasis, chagas). Los

otros campos como el industrial y del medio ambiente comenzaban a emerger.

En 1999 y debido a la baja vinculación con el sector productivo y por ende la falta de

competitividad, requisitos fundamentales que ya hemos mencionado, se lanzo por parte

del gobierno un plan Nacional de Desarrollo, 1999-2002 con el objetivo de "dar prioridad al

incremento y la diversificación de la oferta exportable, no solamente a través del

crecimiento de los actuales sectores exportadores, sino también mediante el apoyo a

sectores considerados como dinámicos y estratégicos y con claras ventajas comparativas

como lo son los de recursos naturales y la biotecnología",

Los objetivos estratégicos de este plan estuvieron dirigidos a ―promover la transferencia

tecnológica exitosa en empresas de base biotecnológica y la generación de políticas

industriales y económicas que fomenten la inversión de capital de riesgo en biotecnología,

así como a apoyar la formación de recursos humanos en todas las áreas del proceso

innovativo de la biotecnología considerando también aspectos como mercadeo,

comercialización, transferencia tecnológica y propiedad intelectual, y promover la

conformación de unidades de vinculación y transferencia tecnológica en todas aquellas

instituciones que desarrollen labores en este campo‖.

24


En cuanto a las áreas específicas que se beneficiarían con este plan serían:

Salud humana: Sistemas de diagnóstico, prevención, y tratamiento en problemas de salud

de relevancia crítica nacional.

Sector agrícola: Estudios genómicos y de aplicación de herramientas de fitome-joramiento

así como la capacidad de innovación en biopesticidas y biofertilizantes.

Sector Industrial: Proyectos destinados a aplicar la biotecnología para mejorar productos

y/o procesos.

Sector pecuario: Áreas biotecnológicas aplicadas al mejoramiento animal que permitan

conocer el potencial genético y productivo de las razas criollas, así como la aplicación de

métodos de diagnóstico, tratamiento y prevención de patologías de interés para el sector

ganadero del país

En la actualidad y específicamente en investigación en Ingeniería genética, existen grupos

establecidos, que ―intentan colocar la tecnología de ADN recombinante al servicio de la

agricultura nacional‖ como lo expresa el Dr. Alejandro Chaparro en el libro Introducción a

la Ingeniería Genética de Plantas, donde hace referencia a la limitada financiación y el

pequeño número de especialistas en el área, debido no solamente a la ―ausencia de una

verdadera política en ciencia y tecnología, sino a una cultura alejada del conocimiento‖.

Lección 4. Estructura del ADN

Para entender la ingeniería genética y la tecnología del ADN recombinante,

debemos recordar los conceptos básicos de biología molecular.

Todo organismo, aún el más simple, contiene una enorme cantidad de información. Esta

información se encuentra almacenada en una macromolécula que se halla en todas las

células: el ADN (ácido desoxirribonucleico). Este ADN está dividido en sub-unidades (la

cantidad varía de acuerdo con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la

información necesaria para que la célula sintetice una proteína. Así, el genoma (y por

consecuencia el proteoma), va a ser el responsable de las características del individuo

(altura, color, resistencia a enfermedades o a plagas, número de frutos, presencia o

ausencia de estructuras, etc.).

La estructura de la doble hélice del ADN fue descrita por James Watson y Francis Crick en 1953. Dicho descubrimiento es un hito en la historia de la biología y su modelo propuesto ha sido ampliamente confirmado.

25


Según este modelo, la molécula de ADN está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por un azúcar: la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) y un grupo fosfato.

Imagen tomada del curso: “PCR una herramienta en el diagnóstico”. ATGen. Salto, Uruguay

Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando largas cadenas. La estructura fosfato-pentosa recorre el esqueleto de la hélice, mientras que las bases se disponen formando un ángulo recto con el eje de la misma.

Las dos cadenas de polinucleótidos que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas (dos puentes de hidrógeno entre A y T, y tres puentes de hidrógeno entre G y C)

La estructura de un determinado ADN está definida por la ordenación o "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucleótidos, ocupando precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN.

La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; G-C),

implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina

26


automáticamente el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son

complementarias.

Representación esquemática de la molécula de ADN. Estructura tridimensional de la

doble hélice. Tomada del curso: “PCR una herramienta en el diagnóstico”. ATGen.

Salto, Uruguay

Detrás de cualquier carácter de un organismo, existe un gen o un grupo de genes

responsables por su expresión. La estructura que gobierna la expresión de los genes es

esencialmente la misma en todos los organismos y se localiza en el mismo ADN, esta

estructura se denomina operón y fue postulada por Jacob y Monod en 1961, como

resultado de las investigaciones en Escherichia coli. Existe una región promotora, una

región secuenciadora y una región terminadora, que en conjunto actúan dentro del

proceso de la expresión génica.

La región promotora establece el momento, la manera y el lugar de acción del gen. La

región secuenciadora es el gen propiamente dicho, o sea, el responsable de la síntesis

de proteínas que cumplirá una función específica determinando una característica física

en un organismo. Esta región se transcribe en ARN mensajero (ARNm) y se traduce en

una secuencia de aminoácidos que constituirán una proteína. La región terminadora

especifica el final del gen y determina algunas propiedades del ARNm así como los

niveles de expresión del gen.

La carga genética de un determinado organismo no puede ser idéntica a la de otro,

aunque se trate de la misma especie. Sin embargo, debe ser similar para que la

reproducción se pueda concretar. Una de las propiedades más importantes del ADN, y

27


gracias a la cual fue posible la evolución, es la de dividirse y fusionarse con el ADN de

otro individuo de la misma especie para lograr descendencia diversificada.

Otra particularidad de esta molécula es su universalidad. No importa cuán diferente sean

dos especies: el ADN que contengan será de la misma naturaleza: ácido nucleico.

Humanos

30,000

genes

Chimpancé

30,000

genes

A. thaliana

25,000

genes

Ratón

30,000

genes

C. elegans

19,000

genes

D. melanogaster

13,000

genes

95% idéntico

70%

20%

De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente

similares a los genes de Drosophila.

Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

Todos los seres vivos tienen su información hereditaria codificada en la molécula

de ADN. El juego completo de ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma

humano cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes,

que son un 3% del genoma. El tamaño del genoma es independiente de la

complejidad del organismo. El Genoma de mayor tamaño es el del pez pulmonado

africano Protopterus aethiopicus con 139 mil millones de pb; una planta con

flores Fritillaria assyriaca tiene 124,900 millones de pb.

IDENTIDAD GENÉTICA

60%

28


Siguiendo este razonamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen, surgen

algunas cuestiones: ¿Son compatibles las cargas genéticas de especies distintas?

¿Puede el gen de una especie funcionar y manifestarse en otra completamente

distinta? ¿Se puede aislar y manipular el ADN?

La respuesta a todas estas preguntas se resume en dos palabras: Ingeniería

Genética.

La Ingeniería Genética es una rama de la genética que se concentra en el estudio del

ADN, pero con el fin de su manipulación. En otras palabras, es la manipulación genética

de organismos con un propósito predeterminado.

Lección 5. Historia

El ADN había sido identificado en 1869 como un constituyente del núcleo por el científico

suizo Frederick Miescher. No fue sino hasta 1946 cuando Edward Tatum y Joshua

Lederberg, de la Universidad de Yale, demostraron que el ADN era el material de la

herencia en bacterias. Cruzaron cepas de Escherichia coli mutantes, cada una de las

29


cuales era portadora de una deficiencia nutricional diferente, y obtuvieron una prole

bacteriana deficitaria en los requisitos nutricionales de cada progenitor. Las deficiencias

se complementaban mutuamente. Esto demostró que el ADN era una molécula capaz de

alterar la herencia y, por tanto, la genética bacteriana. Más tarde se probó que la misma

molécula era el material hereditario de todas las células vivas.

En 1953 James Watson y Francis Crick postularon la estructura helicoidal complementaria

del ADN en los laboratorios Cavendish de Cambridge. Construyeron un modelo

tridimensional del ADN basado en las configuraciones energéticamente más favorables

que eran compatibles con los parámetros helicoidales proporcionados por los datos de la

cristalografía de rayos X producidos por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King's

College de Londres. En 1962 Crick, Watson y Wilkins fueron galardonados con el Premio

Nobel por este trabajo. Crick y Watson demostraron cómo se interrelacionan las tres

subunidades importantes de la molécula de ADN. Establecieron que el ADN es un

polímero macromolecular compuesto de tres tipos de unidades: desoxirribosas (azúcares

de cinco carbonos), fosfatos y bases que contienen nitrógeno. Existen dos tipos de bases,

las purinas (adenina y guanina) y las pirimidinas (timina y citosina). Las bases se unen en

pares específicos mediante puentes de hidrógeno: adenina (A) con timina (T) y guanina

(G) con citosina (C). El número de puentes de hidrógeno determina el apareamiento de

las bases de una manera fija, con tres puentes de hidrógeno entre G y C y dos entre A y

T. Los nucleótidos, compuesto cada uno de ellos por un azúcar, un fosfato y una base,

polimerizan en largas cadenas polinucleótidas mediante enlaces fosfodiéster entre 5' y 3'.

En 1958 Frank Stahl y Matthew Meselson, del California Institute of Technology,

demostraron que la replicación del ADN implica la separación de las cadenas

complementarias de la doble hélice y la obtención de idénticas dobles hélices hermanas

mediante la replicación semiconservativa del ADN. Utilizaron diferencias de densidad para

separar las moléculas de ADN parentales de sus moléculas hijas. Primero cultivaron

Escherichia coli en un medio muy rico en isótopos pesados: LC y N. Debido a su densidad

y una vez incorporados los isótopos, el ADN más pesado puede ser claramente separado

del ADN más ligero mediante centrifugación a gran velocidad en cloruro de cesio. Cuando

las células portadoras del ADN pesado fueron transferidas a un medio normal, «ligero»,

permitiendo que se multiplicaran en una generación, todo el ADN pesado fue

reemplazado por ADN que pesaba la mitad que el anterior. Esto indicó la presencia de un

proceso de replicación semi-conservativo, por el cual cada molécula hija poseía una

cadena pesada procedente de su progenitor y una nueva cadena, más ligera.

La «molécula de ADN en doble hélice de Watson y Crick» posee en su estructura

bioquímica la información genética que permite la transmisión exacta de la información

genética de una generación a otra, al mismo tiempo que especifica la secuencia de

30


aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de todas las proteínas necesarias para la

célula. La replicación del ADN aporta propiedades especiales. La totalidad de su

información puede ser copiada de forma muy precisa mediante la separación de sus

cadenas, seguida de la síntesis de dos cadenas completamente nuevas. Este mecanismo

de replicación del ADN implica la existencia de diversos sistemas enzimáticos que poseen

la habilidad de reparar una cadena rota o dañada.

El trabajo de investigación sobre los sistemas enzimáticos de la replicación del ADN fue

iniciado por Arthur Kornberg en la Universidad de Stanford. En 1958 la ADN-polimerasa I

fue aislada y utilizada para sintetizar ADN en un tubo de ensayo. Usando una cadena de

ADN como molde, la ADN -polimerasa I es capaz de sintetizar una cadena

complementaria mediante la formación de enlaces fosfodiéster entre bases apropiadas.

Este trabajo tuvo su continuación en 1960 con el descubrimiento de la ARN-polimerasa,

una enzima capaz de sintetizar cadenas de RNA (ácido ribonucleico) usando el ADN

monocatenario como molde. Se observó que las células eucariotas contienen tres ARN-

polimerasas diferentes, cada una con un papel funcional distinto. El ARN ribosómico

(rARN) se transcribe a partir de genes del ADN-ribosómico (rADN) mediante la enzima

ARN-polimerasa I. La síntesis del ARN mensajero (mARN) está catalizada por la ARN-

polimerasa II y la subsiguiente adición de la cola poli-adenina es llevada a cabo por la

enzima poli-A-sintetasa. Aproximadamente al mismo tiempo se descubrió el ARN

mensajero y se demostró que organiza los aminoácidos en proteínas.

En 1956 experimentos realizados por Francis Crick confirmaron la hipótesis de que los

mensajes genéticos del ADN son transmitidos por su secuencia de pares de bases. Se

observó que tres bases adyacentes (un triplete) codifican para cada aminoácido,

constituyendo un codón. Mediante el uso de una molécula de ARN mensajero sintético

que consistía únicamente en uracilo (poli-U) se encontró el primer fragmento del código

genético.

En 1961 se localizaron los genes responsables de proporcionar resistencia antibiótica a

las bacterias en cromosomas supernumerarios llamados plásmidos. Estos últimos son

muy importantes, pues pueden ser utilizados como vehículos o vectores para transportar

moléculas de DNA extrañas y clonadas. En 1967 se descubrió la enzima ADN-ligasa que

es capaz de unir (ligar) cadenas de ADN entre sí. Tres años más tarde se purificaba la

primera endonucleasa de restricción a partir de bacterias, estas enzimas cortan el ADN

únicamente en sitios específicos. En 1978 el Premio Nobel de Medicina fue otorgado

conjuntamente a Warner Arber, Ramillón Smith y Daniel Mathans por el descubrimiento

de dichas enzimas y su aplicación en biología molecular.

31


El conocimiento y el uso de las ligasas y las endonucleasas de restricción permitieron la

unión entre sí de fragmentos de ADN creados por una enzima de restricción. La primera

molécula de ADN recombinante fue generada en 1972 en la Universidad de Stanford por

Paul Berg. Un año más tarde se insertaban fragmentos de ADN extraños en ADN

plasmídico, creando así plásmídos quiméricos. Estos plásmidos pudieron ser insertados

funcionalmente en Escherichia coli, y el ADN extraño pudo replicarse y clonarse junto con

el ADN plasmídico y bacteriano. Este gran progreso hizo posible que se pueda clonar

cualquier gen o fragmento de ADN en células bacterianas.

En 1975, en la Universidad de Edimburgo, E. M. Southern desarrolló la técnica que

permite blotar ADN en filtros de nitrocelulosa partiendo de geles de agarosa. Esta técnica

se conoce con el nombre de Southern blot y permite hibridar ADN digerido con enzimas

de restricción, con sondas de ADN o ARN marcadas radiactivamente. La técnica de

Southern blot ha facilitado enormemente la capacidad de localizar moléculas de DNA.

32


CAPITULO 2: TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

Introducción

La tecnología de ADN recombinante como ciencia implica el conocimiento de sus bases bioquímicas y moleculares que serán abordadas en este capítulo, haciendo énfasis en la metodología apropiada para obtener y analizar los organismos transgénicos.

Lección 6. El ADN recombinante y su historia

La tecnología que permite la combinación de genes de especies diferentes es

denominada Tecnología del ADN recombinante, el organismo resultante es denominado

organismo transgénico u organismo genéticamente modificado (OGM). La transferencia

de genes es posible porque todos los organismos vivos poseen el mismo sistema de

codificación y de expresión de la información genética.

En 1976, Herber Boyer y Robert Swanson fundaron la empresa Genentech, dedicada al

desarrollo y venta de productos obtenidos por medio de la tecnología del ADN

recombinante y comunicaron la producción de la primera proteína humana producida en

bacterias, la somatostatina. En 1978, Genentech y el City of National Medical Center

anunciaron la producción en bacterias de la insulina humana.

En 1980, el Supremo Tribunal de los EUA autorizó a que organismos genéticamente

modificados podían ser patentados y así la Exxon patentó un microorganismo capaz de

digerir petróleo. Esta disposición abrió la posibilidad para la explotación comercial de la

Ingeniería Genética.

En 1982, la Food and Drug Administration (FDA), reguladora de la comercialización de

alimentos y nuevos productos químicos, aprobó la comercialización del primer

medicamento genéticamente modificado, la insulina humana producida en bacterias.

33


También en 1982, fue publicado en la revista Nature por el Dr. Palmiter, el trabajo sobre la

obtención del primer ratón transgénico (el "superratón"), insertando el gen de la hormona

del crecimiento de la rata en óvulos de ratona fecundados.

En 1983, se dieron a conocer los resultados de la primera transformación genética de una

célula vegetal a través del plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens y la

primera planta transgénica fue obtenida, una planta de tabaco resistente a un antibiótico.

En abril de 1984, Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular, que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccionó la PCR como el principal desarrollo científico, y la Taq polimerasa como la molécula del año. En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el Premio Nobel de Química. Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitación en la investigación en Biología Molecular, ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del ADN. El número de aplicaciones de esta técnica parecen infinitas, y continúan creciendo sin parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la secuenciación del ADN de muestras biológicas. La Asociación Cetus patentó este proceso y en 1991 vendió la patente a la Empresa Hoffman-LA Roche.

En 1987, se lanza la propuesta comercial para establecer la secuencia completa del

genoma humano (proyecto Genoma), compuesto aproximadamente por 100.000 genes.

También en este año se comercializa el primer anticuerpo monoclonal de uso terapéutico.

En 1990, la empresa Calgene dio a conocer el primer ensayo de campo con resultados

positivos de plantas de algodón genéticamente modificadas para resistir al herbicida

Bromoxynil.

El 18 de Mayo de 1994, fue aprobado para la comercialización por la FDA, el primer

alimento producido por la biotecnología vegetal, un tomate transgénico Flavr SavrTM. El

tomate fue modificado para no ablandarse durante la maduración. La primera planta

transgénica resistente a un herbicida fue desarrollada también en este año por la firma

Monsanto, Esta planta fue una variedad de soya llamada Roundup Ready TM, resistente al

glifosato.

También en 1994, se autoriza en Holanda la reproducción del primer toro transgénico.

34


En marzo del año 1994, se publicó un mapa del genoma bovino que permitió explorar más

del 90% del ADN de esta especie. El trabajo fue llevado a cabo por un grupo de 23

investigadores de diversas instituciones de todo el mundo. En la XXIV Conferencia

Internacional de Genética Animal realizada en Praga en julio de 1994, se presentaron

resultados de grupos de investigación dedicados a buscar correlaciones entre marcadores

de ADN y producción de leche, resistencia a parásitos, ganancia de peso, resistencia a

meteorismo y varias otras características de interés productivo. También se publicó un

mapa ovino con más de 100 marcadores polimórficos, y en la actualidad existen grupos

buscando ligamiento con producción de lana, resistencia a foot-rot y a parásitos

gastrointestinales.

En 1995, se completan las primeras secuencias de genomas de las bacterias Hemophilus

influenzae y Mycoplasma genitalium.

En febrero de 1997, el embriólogo Ian Wilmut, del Roslin Institute Therapeutics (Escocia),

anuncio el nacimiento de un clon de oveja (Dolly) que fue concebido a partir de una célula

de glándula mamaria de una oveja adulta, cuyo núcleo fue implantado en un ovocito

enucleado de otra oveja. El embrión resultante fue implantado en el útero de una tercera

oveja. Así, Dolly nació y el 13 de abril de 1998 tuvo una hija (Bonnie) por vía natural,

probando que el clon es capaz de reproducirse. Sin embrago, Dolly murió en febrero de

2003 debido a envejecimiento precoz.

En 1997, científicos del mismo Instituto, clonaron dos ovejas genéticamente modificadas

(Polly y Molly). Estas ovejas poseían un gen humano responsable por la síntesis del factor

IX de la coagulación sanguínea, Esta proteína es segregada en la leche de estas ovejas y

después es purificada para ser utilizada en pacientes hemofílicos.

En el año 2000, el equipo conducido por Ingo Potrykus del Swiss Federal Institute of

Technology en Zurich y Peter Beyer de la University of Freiburg en Alemania, anuncian la

producción del ―arroz dorado‖, genéticamente modificado, enriquecido con beta-caroteno

que es transformado en el cuerpo humano en vitamina A.

En el mismo año la PPL Therapeutics (la empresa que ayudó a clonar a Dolly) anuncia la

clonación de 5 cerditos genéticamente modificados y con un gen ―knocked out‖, que hace

con que los órganos de estos cerdos no sean rechazados en el caso de trasplantes en

humanos.

35


Lección 7. Conceptos

Un Organismo Genéticamente Modificado (OGM) es un organismo (microorganismo,

planta o animal) cuyo genoma fue manipulado por técnicas de biología molecular,

transfiriéndose uno o varios genes de otra especie (microorganismo, planta o animal) con

el objetivo de conferirle determinadas propiedades. Esta manipulación se realiza mediante

técnicas que permiten la introducción de genes en el genoma de un individuo. Se

realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en

puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se forma por intercalar un

segmento de ADN extraño a un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN

vírico en un ADN celular.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que

destacan:

La tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

La secuenciación del ADN: Técnica que permite conocer el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir la cantidad necesaria para un determinado estudio.

La tecnología del ADN recombinante permite obtener fragmentos de ADN en

cantidades ilimitadas, en donde se localizan el gen o los genes que se desee. Este ADN

se puede incorporar a las células de otros organismos (vegetales, animales,

microrganismos) y allí se "expresará" la información de dichos genes. De una manera muy

simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una

bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al

ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina.

Introducción a la secuenciación del ADN

A finales de los años 70 se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y rápida, determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN. Estos primeros intentos de secuenciar ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en

36


pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta relativamente sencillo para proteínas donde estas resultan de la combinación de hasta 20 aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.

En 1995 los científicos del TIGR (The Institute for Genomic Research) obtuvieron la primera secuencia total del genoma de un organismo la bacteria, Haemophilus influenzae. A partir de ahí, muchos otros genomas han sido secuenciados, incluyendo los primeros eucariotas: Saccharomyces cerevisiae en 1997 y Caenorhabditis elegans en 1999. En éste campo, los hechos más importantes se refieren a la obtención del genoma de Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, la primera planta y el genoma humano.

Existen dos maneras de secuenciar ADN, o sea, obtener el orden correcto de las bases nitrogenadas (A, T, G, C) componentes de un fragmento escogido. Los dos métodos utilizados actualmente son: Secuenciación manual y secuenciación automática.

Pasos generales para secuenciar ADN:

1. El ADN del núcleo de las células es extraído por técnicas especiales. El

ADN puro es entonces cortado en varios pedazos utilizando enzimas de restricción. Estas enzimas son muy específicas y cortan el ADN en lugares conocidos.

2. Los extremos de estos segmentos de ADN son conocidos pues fueron

cortados con enzimas conocidas. Las mismas enzimas son utilizadas para cortar los plásmidos que son ADN en forma circular. Son fáciles de manipular porque además de pequeños, poseen una secuencia ya determinada previamente. Así, con el uso de otras enzimas, llamadas ligasas, las puntas son unidas: punta ―A‖ se une con punta ―A‖ y punta ―B‖ se une con punta ―B‖. Este ADN ―empaquetado‖ de esta manera es usado como molde en una reacción química para obtener diversos fragmentos que serán pasados en un gel para separarlos por tamaño. El secuenciador y el gel son tan precisos que separan segmentos que solo se diferencian en el tamaño por apenas una base.

Métodos clásicos de secuenciación Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático) comparten etapas comunes.

Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o

fluorescentemente

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Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN

marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de

distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles de acrilamida-

bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud

varía en un único nucleótido.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos fundamentales:

Método químico de Maxam y Gilbert (1977)

Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforésis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.

Método enzimático de Sanger (1977)

Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi.

Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Secuenciación Automática

El uso de secuenciadores automáticos es esencial cuando se desea realizar secuenciaciones en larga escala, como en el proyecto Genoma Humano. El desarrollo y utilización de secuenciadores automáticos hacen más eficiente y rápido el trabajo, ya que las etapas de lectura del gel y procesamiento de secuencias son realizadas a través de programas de computador. La reacción de secuencia es realizada a través del método de Sanger. En la mezcla de reacción son utilizados nucleótidos normales y modificados. Estos últimos no poseen el grupo hidroxilo 3´, solamente presentan un H (hidrógeno). Esto imposibilita la unión del nucleótido siguiente, pues no hay posibilidad de que se establezca la ligación fosfodiester. La cantidad de los dos tipos de nucleótidos colocados en la reacción es suficiente para sean obtenidos fragmentos de todos los tamaños posibles de un determinado segmento de ADN. Estos fragmentos serán separados uno a uno en el gel de secuencia. Cuatro diferentes sustancias ligadas a los nucleótidos modificados son empleadas y, una vez excitadas por un eje de láser, emiten luz en diferentes longitudes de onda, o sea, emiten cuatro colores diferentes. Así, ya que en cada una de las diferentes reacciones (A, T, C, G) fue

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empleado un fluorocromo diferente, es posible juntar estos productos y realizar la electroforesis en un único gel de secuencia. Los productos de la reacción marcados con los fluorocromos, al ser sometidos a electroforesis pasan por el eje de láser, que promueve la excitación de los fluorocromos. La luz emitida por estos es detectada por un fotomultiplicador y la información es procesada a través de un computador.

Teniendo la secuencia de las bases de un determinado gen, es posible aislarlo y

obtener las proteínas codificadas por este. El gran sueño de los científicos es

conocer procesos vitales cuyos mecanismos existen debido a las proteínas. La

investigación se mueve ahora hacia un gran proyecto denominado “Proteoma”.

Lección 8. Principios de la Tecnología de ADN Recombinante I

Hasta la década del 70, el ADN era el componente celular más difícil de ser estudiado. La

secuencia de nucleótidos de enorme tamaño y monotonía química era generalmente

analizada a través de medios indirectos como estudio de proteínas. A partir de la década

del 70 nuevas tecnologías fueron desarrolladas permitiendo el aislamiento y la purificación

de genes específicos en un proceso denominado clonación génica. El ADN se tornó

entonces la molécula más fácil de ser analizada, siendo posible aislar regiones

específicos, obtener estas regiones en grandes cantidades y determinar su secuencia a

una velocidad de millones de nucleótidos por día.

La tecnología del ADN recombinante se puede agrupar en dos áreas principales, las

técnicas de clonación del ADN y los métodos de análisis del ADN.

Clonación del ADN

El término clonación deriva de la genética bacteriana que considera una colonia de

bacterias como un clon porque todos los individuos son genéticamente idénticos a la

bacteria inicial.

La clonación del ADN consiste en una amplificación selectiva de una secuencia o

fragmento específico. Comprende dos etapas principales, primero el fragmento de interés

de ADN llamado inserto es ligado a otra molécula de ADN llamada vector para formar lo

que se conoce como ADN recombinante. Segundo la molécula de ADN recombinante es

introducida en una célula hospedera compatible, en un proceso conocido como

transformación. La célula que adquirió la molécula de ADN recombinante es llamada de

célula transformada. Una única célula transformada en condiciones ideales, realiza

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muchos ciclos de división celular produciendo una colonia que contiene millones de

copias de ADN recombinante.

Esta tecnología puede agruparse en dos tipos principales, las técnicas de clonado que

utilizan los mecanismos de replicación del ADN naturales de las células in vivo y la técnica

que emplea la reacción en cadena de la polimerasa in vitro en un sistema libre de células.

Generación de Fragmentos de ADN:

Corte específico del ADN en fragmentos pequeños mediante la utilización de enzimas

conocidas como enzimas de restricción que se consideran las "tijeras moleculares".

Estas enzimas también son conocidas como endonucleasas y cortan los enlaces

fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas

(secuencias que se leen igual en ambas direcciones). Son extraídas de organismos

procarióticos (bacterias), en donde actúan como un mecanismo de defensa, para

degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la

capacidad de metilar su DNA, que sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA

propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo

afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta

en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Los extremos libres que quedan se

llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que

hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.

Las zonas de restricción son con frecuencia palíndromas. Por ejemplo, la enzima EcoRI

reconoce la secuencia GAATTC de 5‘ a 3‘; esta secuencia tiene la secuencia

complementaria CTTAAG de 3‘ a 5‘ palindrómica. La mayoría de las enzimas de

restricción que suelen usarse en biología molecular cortan el ADN en el interior de su

zona de reconocimiento, aunque algunas cortan varios pares de bases fuera del lugar de

reconocimiento.

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El siguiente esquema indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se

aprecia la actuación en ambas hebras.

Además se ve el resultado de la actuación de la enzima de restricción.

Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde

puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente. Tomado de

www.porquebiotecnologia.com.ar

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su

nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por

primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las

próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final

indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.

Ejemplo:

Eco RI E = género Escherichia

co = especie coli

R = cepa RV 13

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I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III:

Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).

Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la

secuencia de reconocimiento. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la

secuencia que reconocen.

Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de

reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo II:

Sólo tienen actividad de restricción.

Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.

Sólo requieren Mg++ como cofactor.

No necesitan ATP.

Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el

ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas.

Se han identificado más de 2300 endonucleasas de restricción de tipo II. Se denominan Isoschizomeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de DNA.

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Ejemplos de algunas enzimas de restricción y sus secuencias de reconocimiento y corte en el ADN. Tomado de www.uned.es

Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes:

A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I

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Tomado de: www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Enzimas/enzima-

10.jpg

B. Cortes simétricos, dejando productos con extremos ciegos Ej: Pvu II

Tomado de: www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Enzimas/enzima-

10.jpg

Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos

http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/Enzimas/enzima-10.jpg




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complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal.

Producto amplificado Corte de la enzima

Geles de Agarosa teñidos con bromuro de etidio donde se observa la acción de dos enzimas de restricción (Alu I y Dde I). Tomada de CECOLFES. Centro Colombiano

de Fertilidad y Esterilidad. Dra. Luz Mery Bernal.

Otras enzimas utilizadas en biología molecular

Transcriptasa inversa

Cataliza la transcripción de ARN a ADN. Tiene una actividad polimerasa de 5‘ a 3‘. Es un producto de expresión génica de retrovirus. Su función es copiar ARNm y fabricar ADN complementario (ADNc).

ARN-polimerasa dependiente de ADN

Cataliza la transcripción de ADN bicatenario en ARN complementario. Reconoce una secuencia de ADN específica, llamada secuencia promotora y la transcripción se inicia inmediatamente a partir de la secuencia promotora en sentido descendente (3‘). Pueden usarse in vitro para conseguir los productos de ARN de

moléculas de ADN clonadas, utilizando vectores especiales de clonación.

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ADN-ligasa

Esta enzima promueve la ligación de los fragmentos de ADN en vectores previamente

cortados por endonucleasas de restricción. La ADN-ligasa requiere un grupo OH libre en

la extremidad 3‘ de una de las cadenas de ADN y un grupo fosfato en la extremidad 5‘ de

la otra cadena.

Lección 9. Principios de la Tecnología de ADN Recombinante II

Vectores

En el proceso de manipulación también son importantes los vectores o replicones que son

partes de ADN que se pueden autorreplicar con independencia del ADN de la célula

huésped donde crecen. Estos vectores permiten obtener múltiples copias de un trozo

específico de ADN, lo que proporciona una gran cantidad de material fiable con el que se

puede trabajar. El proceso de transformación de una porción de ADN en un vector se

denomina clonación.

Resumiendo Vector es el término que se utiliza para designar a la molécula de ADN

“transportadora” empleada en el proceso de clonación que, mediante su replicación

independiente dentro de un organismo huésped, permite la producción de múltiples

copias de si misma. La incorporación del ADN extraño o “diana” a un vector

permite la producción en grandes cantidades de copias de tal secuencia.

Tipos de Vectores

Existen cinco tipos fundamentales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos, los

cósmidos, los cromosomas artificiales bacterianos y los cromosomas artificiales de

levaduras. La elección del vector de clonado depende de cierto número de factores, tales

como las enzimas de restricción utilizadas y el tamaño del inserto del ADN.

Los Plásmidos, existen de forma natural en las bacterias, en las cuales confieren

resistencia a varios antibióticos y metales pesados. Se heredan de forma estable como

elementos extracromosómicos y constan de una molécula doble de ADN. Dos de los

primeros plásmidos construidos fueron el pSC101 y el pBR322, así designados por las

iniciales de los investigadores que los desarrollaron, Stanley Cohen y Bolivar y Rodríguez.

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Los Bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan bacterias, estando generalmente el

ADN en forma de dúplex lineal con extremos cohesivos, las denominadas secuencias

cos. El fago lambda () es el más estudiado y utilizado para experimentación. Este fago

es capaz de incorporar más de 10 kb de ADN exógeno. Algunos bacteriófagos tales

como el P1, tienen genomas relativamente grandes lo cual permite insertos de ADN por

encima de 100 kb.

Un Cósmido, esencialmente consiste en un plásmido al que se ha eliminado

prácticamente todo salvo las secuencias mínimas necesarias para su propagación como

vector, es decir las secuencias cos, que capacitan para la inserción de fragmentos

grandes de ADN extraño, a pesar de lo cual se mantiene la replicación del plásmido. En

consecuencia, los cósmidos pueden llevar insertos de más de 50 kb.

Los insertos de ADN eucarionte a menudo contiene secuencias repetitivas que son

inestables durante la replicación en los vectores de clonado convencionales, dando lugar

a alteraciones del ADN diana clonado. El plásmido de fertilidad de E. coli, el factor F, es

capaz de incorporar fragmentos de ADN exógeno de más de 30 kb, constituyendo lo que

se denomina cromosomas artificiales bacterianos o BACs (siglas en inglés).

Comparados con otros vectores, los BACs producen un número de copias relativamente

bajo, que en principio puede parecer una desventaja pero que tiene el beneficio de que el

inserto del ADN clonado tiene una menor probabilidad de sufrir reordenamientos.

Un cromosoma artificial de levadura o YAC consta de un plásmido que contiene las

secuencias mínimas de ADN necesarias para la formación del centrómero y el telómero,

más las secuencias de ADN conocidas como secuencias de replicación autónoma, todas

ellas necesarias para asegurar la replicación dentro de la levadura. Los YACs tienen la

ventaja que pueden incorporar fragmentos de más de 1.000 kb, así como permitir la

replicación de ADN eucarionte con secuencias repetidas que a menudo no se pueden

mantener en bacterias.

Transformación del Organismo Huésped

Después de la introducción del fragmento de ADN extraño en un vector, el vector

recombinante se introduce en células bacterianas huéspedes especialmente modificadas.

La membrana celular bacteriana no es permeable de forma natural al ADN pero puede

hacerse permeable mediante diferentes métodos incluyendo la exposición a sales o

voltajes elevados. Una molécula de ADN conseguirá introducirse únicamente en una

pequeña fracción de células bacterianas que sufrirán la denominada transformación. Si el

proceso implica a un vector molecular único, el replicón extraño puede experimentar ciclos

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de replicación independientes del ciclo celular bacteriano dando lugar a copias del ADN

diana llamadas clones.

Búsqueda (screening) de los vectores recombinantes

Después de que las células transformadas se han multiplicado en el medio de cultivo, se

colocan en placas de Petri sobre un medio nutritivo de agar. Los vectores recombinantes

se pueden seleccionar si se han diseñado de tal forma que contengan genes que se

inactivan con el inserto del ADN extraño en la molécula del vector. Por ejemplo, en el caso

del vector pBR322, si la enzima de restricción utilizada para digerir el vector de ADN corta

dentro de uno de los genes de resistencia a antibióticos, la inserción del ADN extraño en

este punto dará lugar a una pérdida de la resistencia en los clones recombinantes en la

célula huésped; por tanto, si se usara la enzima Pstl para generar fragmentos y para

cortar el pBR322, cualquier plásmido recombinante producido hará a la célula huésped

sensible a la ampicilina, puesto que este gen quedaría interrumpido.

Selección de clones específicos:

Se han desarrollado numerosas técnicas que detectan la presencia de clones con insertos

de ADN específicos. El método más utilizado es la hibridación de ácidos nucleicos. Las

colonias de bacterias huéspedes transformadas con clones recombinantes se utilizan para

hacer replicas que son transferidas a filtros de nitrocelulosa al que se unen los ácidos

nucleicos. El ADN transferido se desnaturaliza para obtener hebras simples de ADN que

se podrán hibridar con sondas de ADN o ARN marcadas radiactivamente y que se pueden

detectar por exposición en una placa de rayos X (autorradiografía). De esta forma, una

colonia bacteriana transformada que contenga una secuencia complementaria a la sonda

puede ser detectada y a partir de su localización la colonia original que portaba el clon

puede ser identificada en la placa original, aislada y cultivada por separado.

Lección 10. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Uno de los avances más revolucionarios del ADN recombinante es la técnica que

originalmente fue denominada amplificación de secuencias de ADN, pero que la

actualidad se conoce como reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

Esta técnica presenta numerosas aplicaciones en el campo de las ciencias biológicas.

Permite generar cien billones de copias de una única molécula de ADN en un solo

experimento. Puede ser considerado como un método in vitro para producir grandes

cantidades de un fragmento específico de ADN, de tamaño y secuencia definido, a partir

de una pequeña cantidad de ácido nucleico. El número de fragmentos amplificados se

duplica en cada ciclo de reacción, siendo por lo tanto un proceso exponencial

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Las bases teóricas de la reacción de PCR son simples. En la reacción intervienen tres segmentos de ADN: el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeños fragmentos de cadena sencilla, los oligonucleótidos (primers u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ADN molde. Además, participan en la reacción la enzima Taq polimerasa (Taq), deoxinucleótidos-trifosfato (dNTPs), sales, y un tampón.

Los oligos se añaden a la reacción en exceso con respecto al ADN que desea amplificarse. Los oligos hibridarán con las regiones complementarias del ADN, quedando orientados con sus extremos 3´ enfrentados, de modo que la síntesis

mediante la ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5´ 3´) se extiende a lo largo del segmento de ADN que queda entre ellas.

El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se irá acumulando de forma geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la reacción.

Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrán aparecido 270 millones de estas moléculas, por cada una de ADN original que hubiese.

El primer paso necesario en este proceso de la síntesis es la desnaturalización del ADN. Puesto que el molde es una molécula de ADN de doble cadena, será necesaria la separación de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la acción de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ADN complementarias, en el proceso de elongación. Estos tres pasos consecutivos (desnaturalización, alineamiento y elongación) constituyen un ciclo de síntesis.

Inicialmente, la enzima utilizada en la PCR era ADN polimerasa de E. coli, que por

ser termolábil, debía ser adicionada en cada ciclo de reacción, pues era destruida

durante la etapa de desnaturalización. Actualmente se utiliza la ADN polimerasa

aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, llamada comúnmente Taq

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polimerasa. Esta enzima permite la realización de múltiples ciclos de reacción, lo

que posibilitó la automatización de la reacción. La Taq polimerasa soporta la

temperatura de 95ºC, y es más activa entre los 70 y 75ºC, temperatura a la cual el

apareamiento entre los primers y el ADN es más específico.

La PCR posee la ventaja de requerir pequeñas cantidades del ADN a ser

amplificado. Es tan sensible que el ADN aislado de una única célula (por ejemplo

protoplastos vegetales) es suficiente para la detección de secuencias específicas

de genes. La PCR también puede ser empleada para la clonación del ADN,

secuenciación, cuantificación de secuencias específicas, análisis de la expresión

génica por la amplificación a partir de ARNm, análisis de la estructura del genoma,

análisis de la interacción del ADN – proteína, evolución molecular, identificación de

mutaciones, diagnóstico de patógenos y enfermedades hereditarias, identificación

de anormalidades cromosómicas y mutaciones somáticas específicas.

El resultado de la amplificación del ácido nucleico por PCR, puede ser fácilmente

visualizado por electroforesis en geles de agarosa. El éxito de la amplificación

depende de las condiciones de la reacción, de la pureza de las compuestos

utilizados, y de los diferentes parámetros de la reacción (cantidad de enzima,

concentración de nucleótidos, concentración de cebadores, temperatura de

desnaturalización, tiempo de desnaturalización, número de ciclos, tamaño de los

fragmentos del ADN a ser amplificado, etc).

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Representación esquemática de la técnica de PCR: adaptado de:

http://www.ffyb.uba.ar

Electroforesis.

Una vez que el ADN, ya sea genómico, bacteriano o de plásmido, ha sido digerido en

fragmentos, utilizando una enzima de restricción, los fragmentos pueden ser separados

mediante electroforesis. Es decir se pueden separar por tamaños, según el número de

pares de nucleótidos que llevan y así estudiar los distintos segmentos. Según donde se

hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado

en varios pedazos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay

que confirmar.

Se dispone de varios medios para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos, siendo

los más utilizados aquellos que emplean agarosa o poliacrilamida.

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La agarosa es un polisacárido de galactosa y derivados de galactosa que se entrecruzan

por puentes de hidrógeno. Se puede variar el tamaño de los poros del gel ajustando la

concentración de agarosa. Para hacer un gel, la agarosa se disuelve hirviéndola en una

solución electrolítica y posteriormente se vierte en un molde. Una vez polimerizado el gel

se puede utilizar para separar fragmentos de ADN de 50.000 a 200 pares de bases. El

nivel de migración del ADN a través del gel depende de su tamaño molecular y de la

concentración de agarosa. Para fragmentos de ADN entre 1 y 10 kb de tamaño se utilizan

geles al 0.8%. Para fragmentos de menor tamaño, se utilizan geles al 2% y para los de

más de 10 kb pueden usarse geles al 0.4%. Los geles son colocados en una cámara de

electroforesis donde se aplicará un voltaje que determinará el índice de separación de los

fragmentos de ADN. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los

fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen

muy lentamente.

El movimiento de los fragmentos de ADN produce un patrón de bandas, donde cada

banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular. El tamaño de cada fragmento

puede ser determinado utilizando un marcador o una escalera de ADN cuyos fragmentos

tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve de control y migrará paralelo a

las bandas de ADN que deseamos analizar.

La adición de un colorante de tamaño molecular conocido, normalmente azul de

bromofenol, permite apreciar el progreso del gel. Tras haber separado el ADN, este puede

observarse bajo una luz ultravioleta tiñéndolo previamente con bromuro de etidio. El

bromuro de etidio se adhiere al ADN y todo ello fluoresce en una banda visible cuando se

ilumina con luz ultravioleta.

Los geles de poliacrilamida poseen poros más pequeños que los de agarosa, lo que

permiten separar fragmentos de tamaños muy pequeños e incluso de sólo unos cuantos

pares de base. Estos geles se obtienen al mezclarse polímeros de acrilamida y

bisacrilamida en una reacción catalizada por persulfato de amonio y TEMED

(Tetrametiletilendiamina). El tamaño de los poros depende de la concentración de

acrilamida y bisacrilamida. Estos geles se utilizan en cámara de electroforesis verticales y

se revelan generalmente con Nitrato de plata, también puede utilizarse el bromuro de

etidio pero este procedimiento es muy extenso.

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Esquematización del procedimiento de Electroforesis. Tomado de

www.dialogica.com.ar

A B

Electroforesis (A) en gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio y (B) en gel de poliacrilamida coloreado con nitrato de plata. CECOLFES. Centro Colombiano de

Fertilidad y Esterilidad. Dra. Luz Mery Bernal.

http://www.dialogica.com.ar/

53


CAPITULO 3: METODOS DE ANALISIS DEL ADN

Introducción

Los métodos de análisis de ADN implican el uso de sondas de ácidos nucleicos y el

proceso de hibridación. Las sondas de ácidos nucleicos son secuencias de ADN o de

ARN que se han marcado, radiactivamente o no, y que se pueden utilizar para detectar

fragmentos de ADN o de ARN con homología de secuencia. La marcación puede ser

realizada en nucleótidos con 32P (fósforo radiactivo) o nucleótidos biotinilados (no

radiactivo) que se introducen en las moléculas de ADN. Los sitios donde las sondas de

ADN marcadas radiactivamente hibridan con las secuencias de ADN complementario

sobre un filtro de celulosa se pueden localizar mediante autorradiografías mientras que el

marcado con biotina se puede detectar por su elevada afinidad a la estreptavidina.

Hibridación de los Ácidos Nucleicos

La Hibridación con los ácidos nucleicos implica la mezcla de ADN de diferentes orígenes

que han sido desnaturalizados por calor o tratamiento con álcalis para separarlos en

hebras únicas y permitir el emparejamiento de las bases complementarias de las

secuencias homólogas en las condiciones adecuadas. Los métodos principales de

hibridación de los ácidos nucleicos son:

Lección 11: La técnica de “Southern Blot”

La técnica de Southern Blot desarrollada en Edimburgo por E.M. Southerm, permite

identificar regiones específicas de ADN que han sido fragmentadas por una enzima de

restricción. El ADN se separa mediante electroforesis en gel de agarosa. Tras teñirlo con

bromuro de etidio, el gel se fotografía bajo luz ultravioleta. Posteriormente se trata con

hidróxido sódico o a altas temperaturas para desnaturaliza el ADN y romper la unión entre

sus dos cadenas. Entonces el gel se neutraliza con un buffer adecuado. En una cubeta se

extiende una pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte elevado, con los extremos

del papel de filtro sumergidos en una solución altamente salina. Se sitúa el gel sobre la

pieza de papel de filtro y sobre el gel se coloca una membrana de nylon especial. Encima

de todo ello se pone una pila de toallas de papel. Por último se presionan todas las capas

con un peso. La solución altamente salina asciende a través de la pieza de papel y

atraviesa el gel por acción capilar, llevando consigo el ADN desnaturalizado. El ADN es

transportado hasta la membrana de nitrocelulosa, a la cual se adhiere. De este modo el

filtro se convierte en una réplica del gel original. Cuando se ha completado la

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transferencia, el ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro mediante calor o

exposición a luz ultra violeta. El producto del Southern puede ser hibridado con una sonda

de ADN marcada radiactivamente específica para el gen o región del ADN objeto de

estudio. Después de varias horas en contacto con el filtro se elimina la sonda. La

localización de la unión de la sonda con el filtro se identifica mediante una

autorradiografía. Para determinar el tamaño del fragmento de restricción que contiene la

secuencia de interés, se puede hacer una comparación con marcadores de peso

molecular en un gel de agarosa.

Como ejemplo, esta técnica se utiliza para analizar secuencias de ADNs foráneos,

introducidos en el genoma vegetal. El método consta básicamente de las siguientes

etapas:

- El ADN vegetal es extraído de las células y digerido con una ó más enzimas de

restricción.

- Los productos de la digestión del ADN son separados de acuerdo a su tamaño,

mediante electroforesis en geles de agarosa.

- El ADN, que ahora se encuentra en el gel, es desnaturalizado, y transferido a una

membrana de nitrocelulosa. Las posiciones relativas de los fragmentos de ADN en el gel

se mantienen cuando el ADN es transferido a la membrana.

- El ADN es fijado a la membrana mediante la exposición a la luz ultravioleta, o por medio

de altas temperaturas (80ºC).

- El ADN ligado a la membrana es hibridado con una sonda de ADN ó ARN, que posee

homología con la secuencia de interés. La posición de los fragmentos homólogos a la

sonda puede ser detectada mediante autorradiografía o colorimetría, dependiendo del tipo

de sonda utilizada.

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Representación esquemática de la técnica de Southern blotting: adaptado

de: http://www.science2discover.com/Southernblot.htm

Esta técnica suministra la prueba molecular de la integración del gen exógeno en el

genoma de la planta. La PCR también puede ser empleada para tal fin, pero su

confiabilidad es menor, ya que por causa de su alta sensibilidad, puede detectar ―falsos

positivos‖, mediante la amplificación de pequeñas cantidades de ADN contaminante.

http://www.science2discover.com/Southernblot.htm

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Lección 12: La técnica de “Northern Blot”

La técnica de Northern Blot fue desarrollada por Alwine y colaboradores, en 1977, y es

análoga al Southern Blot. Permite determinar la cantidad y tamaño de ARNs específicos

presentes en preparaciones de ARN total, mensajero, o ribosómico. El método se basa en

la hibridación de secuencias complementarias de ácidos nucleicos de cadena simple.

Permite estudiar la expresión de secuencias específicas de ADN, y posteriormente

correlacionarla con las características morfológicas y fisiológicas de la planta. De este

modo, se emplea frecuentemente en estudios de expresión génica, en los cuales se

pueden detectar los genes transcriptos en los diferentes tejidos (expresión espacial) y/o

en las diferentes etapas del desarrollo (expresión temporal). También es empleada para

monitorear la expresión génica del ADN exógeno en plantas transgénicas. En esta técnica

se aísla el ARN total, luego se separan los diferentes tipos de ARN por medio de una

electroforesis en gel, el ARN separado es transferido desde el gel, hacia un soporte sólido

(membrana), y luego hibridado con una sonda específica de ADN ó ARN, marcada

mediante radiactividad ó por métodos no radiactivos. Se produce un híbrido ADN:ARN,

dado que son moléculas complementarias y allí donde esta el RNAm complementario a la

secuencia del gen foráneo, se detectará la señal en el papel fotográfico sensible a la

radiación. En las muestras derivadas de la planta control no debe presentarse la señal de

hibridación.

Lección 13: La técnica de “Western Blot”.

Hasta aquí se han expuesto las técnicas que evicencian la presencia física del gen

foráneo y de su transcrito. También se puede determinar si ese transcrito se traduce

correctamente en una proteína.

Western Blot, ó immunoblot es un método que permite la detección de proteínas, luego de

su separación a través de electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia a una

membrana de nitrocelulosa. La detección se hace mediante anticuerpos, que reaccionan

específicamente con la proteína de interés, seguido por reacciones colorimétricas ó

radiográficas. De este modo, la técnica combina la resolución de la electroforesis con la

especificidad de la detección inmunológica.

Ésta técnica es una poderosa herramienta para el análisis de plantas transgénicas, ya que

permite evaluar la expresión de un transgén. Permite, por ejemplo, determinar la

presencia y cantidad de una determinada proteína, y si ella mantiene sus características

de peso molecular, o identificar el lugar donde se expresa en la planta (por ejemplo, en la

raíz, tallo, semilla, etc.). La técnica se usa también para identificar y caracterizar proteínas

de interés agronómico.

57


Actividad 1: Construcción de un Mapa de restricción

Un patrón de ADN generado mediante electroforésis que se produce después de cortar con una enzima de restricción.

Veamos un ejemplo de esto:

1. Colocar una muestra de ADN en un tubo de microcentrifuga: 30µL de ADN bicatenario con concentración de 0,1 µg/µL y la longitud de 10.000 bp.

2. Agregar a un tubo de microcentrífuga 10 µl de ADN, 7 µl de agua, 1 µl de enzima de

restricción Eco RI y 2 µl de la solución tampón 10X para enzimas de restricción EcoRI.

Mezclar y centrifugar.

Colocar a baño Maria (37°C) por 1 hora

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3. Con la ayuda de una pipeta, pasar los hidrolizados a un pozo de un gel de

electroforésis de agarosa. En uno de los tubos adyacentes, depositar una muestra de

ADN no hidrolizado y en otros dos, una mezcla de moléculas de ADN de tamaño conocido

(marcadores), que servirán para calcular los pesos de los fragmentos obtenidos.

59


4. Gracias a un transiluminador UV, las moléculas de ADN pueden visualizarse. El

marcador de peso permite analizar que la Eco RI ha cortado la molécula original de

10.000 bp en dos fragmentos, de 7.500 y 2.500 bp respectivamente.

Actividad 2: Haciendo un recuento de lo que se ha explicado hasta el momento, la

siguiente lección debe ir encaminada a un refuerzo: Presentación de Power Point.

60


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63


64


Lección 14: Extracción de ADN

La última etapa del proceso de obtención de organismos transgénicos consiste en

detectar si el gen foráneo se ha integrado al genoma, y si se expresa. Esto exige la

extracción del material genético, y el empleo de técnicas de biología molecular, para su

identificación que ya han sido mencionadas. Cabe también hacer referencia a la manera

como es obtenido el ADN de los diferentes organismos.

Puede obtenerse ADN de cualquier célula viva, a excepción de los eritrocitos humanos

que son anucleados. La técnica es básicamente la misma para todo tipo de célula. En

primer lugar se rompen las células ya sea por métodos mecánicos o químicos, y se

extraen las proteínas mediante incubación con una proteinasa. A continuación se separan

el ADN y el ARN del resto de constituyentes de la célula utilizando una mezcla con fenol.

Los ácidos nucleicos se distinguen de las restantes sustancias bioquímicas en que no se

disuelven en fenol. Tras la centrifugación, el fenol se separa de la fase acuosa. Las

proteínas y las grasas permanecen en el fenol, pero el ADN y el ARN se encuentran en la

fase acuosa. Los restos de fenol pueden eliminarse con cloroformo. El fenol se disuelve

en el cloroformo, mientras que los ácidos nucleicos permanecen en la fase acuosa.

Posteriormente la adición de etanol hará que el ADN se vuelva insoluble y forme un

precipitado visible, semejante a un trozo de algodón, el cual puede ser fácilmente extraído

y disuelto en una solución de agua y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), listo para su

65


análisis. El ADN de un peso molecular inferior, como el de plásmidos bacterianos, no

puede ser extraído de la misma manera y debe recuperarse por centrifugación. El ARN

contaminante puede entonces eliminarse mediante tratamiento con una ARNasa.

La concentración de ADN en una solución puede determinarse mediante

espectrofotometría. El ADN absorbe la luz a una longitud máxima de onda de 256 nm.

Una solución de ADN de 1 mg/ml tiene una densidad óptica a 256 nm. Las proteínas

absorben la luz a una longitud máxima de onda de 280 nm. El índice de densidades

ópticas a 256 y a 280 nm es un indicador de la pureza de la solución.

Extracción del ADN en tejidos vegetales.

Los agregados vegetales como polisacáridos, fenoles y compuestos secundarios son el

principal problema encontrado en la extracción y purificación del ADN vegetal, estos

pueden deteriorar el ADN e inhibir la acción de la enzima Taq polimerasa. Las hojas de

diversas especies de plantas poseen niveles variados de alcaloides, esteroides,

flavonoides, glucósidos cianogénicos, gomas, taninos, resinas y algunos ácidos que

pueden comprometer la extracción del ADN.

De modo general, el protocolo de extracción más utilizado para las diferentes especies

vegetales es el CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), que normalmente integra un buffer

para estabilizar el pH en torno de 8, una sal para disociar las proteínas del ADN, un

detergente para solubilizar las membranas y auxiliar en la inactivación de algunas

enzimas. Los detergentes deben romper las membranas celulares para que ocurra la

liberación del ADN. Algunos protocolos usan SDS (dodecil sulfato de sodio) como

detergente, otros usan CTAB y otros usan sarcosil.

Actualmente existen numerosos protocolos que permiten extraer el ADN de diferentes

especies y tejidos vegetales. La diversidad de técnicas manifiesta la variabilidad en la

composición química de los vegetales, que impide el desarrollo de un protocolo universal.

Sin embargo, los fundamentos de cada etapa son comunes a todos los métodos.

El siguiente método de extracción fue tomado del artículo Producción e identificación

de cultivos transgénicos. Diego Ariel Meloni; Julia Andrea Lescano. Universidad

Nacional de Santiago del Estero. Argentina.

Primero, el material vegetal es congelado mediante la adición de nitrógeno líquido, y

macerado para producir la ruptura de las membranas y paredes celulares. El polvo así

obtenido es resuspendido en un buffer de extracción, a pH 8 - 9, que no es óptimo para la

actividad de las enzimas hidrolíticas (el pH óptimo para las enzimas lipolíticas y

lipoxigenasas es de 5 - 6, y el de las ADNasas es de 7). También se adiciona EDTA, un

quelante de iones divalentes, como el Mg+2 y el Ca+2, y por lo tanto un poderoso inhibidor

de las ADNasas que usan estos iones como cofactores.

66


Para evitar los efectos no deseados de la oxidación de diferentes productos se suele

incluir en los tampones de extracción, compuestos como el PVP (polivinilpirrolidona) y

albúmina sérica bovina (BSA) en concentraciones de 1 a 2%. El primero, es un

antioxidante que inhibe la acción de compuestos fenólicos, y la BSA actúa absorbiendo

los polifenoles, evitando la acción de estos compuestos que oxidan al ADN e impiden la

acción de las enzimas de restricción. Para evitar la oxidación de los compuestos fenólicos,

también se suele adicionar ß-mercaptoetanol, un agente reductor que desnaturaliza

peroxidasas y polifenoloxidasas, impidiendo la acción de estas enzimas sobre el ADN.

Después que se ha resuspendido el contenido celular, se realiza una desproteinización,

mediante una ó más extracciones con solventes orgánicos (fenol ó cloranfenicol

isoamílico), seguido por centrifugación, para separar la fase orgánica de la acuosa. Estos

solventes desnaturalizan a las proteínas, que quedan en la interfase, y actúan sobre

contaminantes como los ARNs y carbohidratos, que se mantienen en la fase acuosa.

Algunos protocolos incorporan proteasas antes de la extracción con solventes orgánicos,

lo que facilita la separación del ADN de las proteínas de la cromatina. Luego de terminada

la etapa de desproteinización, el ADN puede ser precipitado o ser sometido a diversos

tratamientos que lo separan de otros contaminantes.

Extracción del ADN en tejidos animales.

Cualquier muestra biológica que contenga ADN del animal es susceptible de ser usada,

las preferencias se inclinan hacia las muestras de pelo (folículo piloso) y en menor medida

la sangre y tejido (músculo o piel). Existen varias técnicas una de ellas utiliza lisis alcalina

usando NaOH 25 mM a 95°C. Esta técnica se aplica en fragmentos de tejidos que son

colocados en un tubo eppendorf al cual se le agregan 75 µL de solución alcalina de NaOH

25 mM, pH 12; este tubo se coloca a 95°C durante 15 minutos, posteriormente a 4°C, y se

le agregan 75 µL de solución Tris-HCl 40 mM pH 5, se homogeniza la mezcla y se deja

sedimentar para luego tomar el sobrenadante que contiene el ADN. Por otro lado, para la

extracción del ADN de células nucleadas de la sangre, se utiliza un método de extracción

a partir de la capa de leucocitos utilizando proteinasa K y Dodecil Sulfato de Sodio (SDS),

seguido de precipitación con acetato de amonio y etanol. Se toma una muestra de 300 µL

de sangre, luego se realiza tratamiento con la solución lisante 1 (Tris-HCl 10 mM pH 7,5,

MgCl2 2,5 mM, NaCl 9,9 mM, EDTANa2 2 mM pH 8,0), se centrifuga a 2200 rpm por 10

minutos y el sobrenadante se descarta; el pellet es resuspendido con 1 mL de la solución

lisante 2 (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl2 2,5 mM, Nonidet P40 0,1%, EDTANa2 2 mM pH

8,0), se centrifuga a 2200 rpm por 10 minutos a 20°C, luego se descarta el sobrenadante

dejando sólo lo suficiente para cubrir el pellet. Posteriormente se resuspende en 225 µL

de TE (Tris EDTA) 20:5; se agregan 14 µL de Dodecil Sulfato de Sodio 10% (SDS), se

agita suavemente, se colocan 4 µL de proteinasa K (10 mg/mL). Se incuba toda la noche

a 41°C con agitación. Una vez transcurrido el tiempo, se retiran las muestras de la

incubadora, se dejan a temperatura ambiente y se le agregan 13,5 µL de acetato de

amonio 7M y 750 µL de isopropanol 95%. Se agita por inversión hasta lograr precipitar el

67


ADN, el cual se observa en forma de mota de algodón. Se centrifuga a 4000 rpm por 15

minutos a 4°C. Se descarta el sobrenadante y el pellet es lavado dos veces con

isopropanol 70%, luego de retirar el alcohol se seca al vacío en el concentrador de ADN y

se disuelve en 300 µL de buffer Tris-EDTA 10:1 pH 7,5. Se verifica la cantidad y calidad

del ADN, mediante espectrofotometría, para lo cual, se realizan como se mencionó

anteriormente, las medidas de Absorbancia a 260 nm. y 280 nm. en un espectrofotómetro.

Se calcula la relación A260/A280, la cual debe tener un valor que oscile entre 1,6 a 1,9; de

esta forma se garantiza una desproteinización aceptable de la muestra. La calidad del

ADN también puede ser verificada mediante una electroforesis en gel de agarosa a 0,9%

durante 1 hora a 70 voltios. La observación de una banda neta, de aproximadamente 23

Kb., garantiza la integridad del ADN.

Lección 15: Caracterización de los organismos transgénicos.

Una vez la caracterización molecular sea realizada por las técnicas clásicas ya descritas,

se procede a determinar la respuesta biológica de la planta o animal transformado y

seleccionar cuál de los clones obtenidos es de interés comercial o científico. Por ejemplo

en la transgénesis vegetal las técnicas de investigación agrícola tradicionales nos ayudan

a conseguir este objetivo. Una planta que ha sido transferida con genes para inducir

resistencia a insectos (genes cry derivados de Bacillus thuringiensis) se debe estudiar

para establecer si esta planta es o no resistente, cuál es el nivel de esa resistencia y a

cuáles insectos es resistente. Estos experimentos se hacen en condiciones controladas,

en invernadero de bioseguridad, donde la planta es enfrentada a los insectos, allí se

miden los efectos de la planta sobre el insecto y del insecto sobre la planta. Si se

consigue una respuesta positiva, se pasa a la fase de ensayo de campo. En todos los

países este tipo de ensayos están estrictamente reglamentados y se realiza una liberación

controlada al medio ambiente de este tipo de organismo.

Cuando el uso de la planta es para la alimentación humana o animal se debe adicionar un

estudio de potenciales efectos alérgicos o tóxicos.

Para ello en la legislación internacional se han establecido ensayos que establecen la

comparación de secuencias de genes y proteínas con bases de datos sobre alergias y

toxicidad en especies vegetales hasta llegar al ensayo con organismos vivos. Todo ello

para garantizar altos grados de seguridad biológica a los productos derivados de los

cultivos biotecnológicos.

Actividad 3: En este punto es importante que cada estudiante investigue y prepare

cada una de las etapas de la extracción del ADN vegetal y especialmente del ADN

animal técnica que es muy difundida en los laboratorios de biología molecular.

68


Existe un Web site http://agbiosafety.unl.edu que contiene información específica y de

interés sobre el tema que se esta tratando. En el menú “Education Center” se encuentra

material disponible sobre conceptos básicos de biotecnología y seguridad alimenticia. Se

puede hacer download de este material. Siguiendo este menú se encuentran una serie de

categorías diferenciadas, una de ellas “Lab Exercises” incluye dos temas 1. “Plant

Breeding and Predicting offspring traits” que consiste en la planificación de una clase

de laboratorio que tiene por finalidad demostrar la expresión de las características y el

modo como estas características son pasadas de una generación a otra. 2. “DNA

Extraction” esta actividad consiste en un procedimiento de laboratorio muy sencillo en

donde se extrae ADN. Esta clase tiene por objetivo capacitar a los alumnos para que

conozcan las técnicas básicas disponibles en cualquier laboratorio. Estos menús

deben ser consultados para reforzar las clases teóricas y tendrán un informe escrito.

http://agbiosafety.unl.edu/

69


Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 1

Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en la lección No. ____, así como el trabajo y desempeño realizado tanto por el tutor – director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluación, el cual consta de los siguientes ítems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que serán desarrolladas en las lecciones siguientes. Los ítems a tener en cuenta son:

1) Autoevaluación de su trabajo individual. Usted describirá de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeño en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo induvidual y colaborativo en el desarrollo de esta lección.

2) Evaluación del desempeño de los compañeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participación de sus compañeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciación

3) Evaluación del material usado en la actividad de la lección: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

4) Desempeño del rol del tutor. Debe dar su autoevaluación del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atención al estudiante, retroalimentación de trabajos y relaciones interpersonales.

70


Fuentes Documentales de la Unidad 1

BIBLIOGRAFIA

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Nature Biotechnology. http://www.nature.com/nbt/

Molecular Reproduction and Development. http://www.wileyinterscience.com

SITIOS WEB DE INTERÉS:

http://www.biotech-info.net/ Ag BioTech InfoNet cover alls aspects of the applications of

biotechnology and genetic engineering in agricultural production and food processing and

marketing. Ag BioTech InfoNet is designed and manged by Ecologic, Inc, a Sandpoint, Idaho based

company specializing in analyses of agriculture‘s impact on the enviroment and food safety.

http://agbiosafety.unl.edu/education.shtml University of Nebraska-Lincoln. The Education Center

has educational materials with the goal of teaching the science of crop biotechnology.

http://cls.casa.colostate.edu/TransgenicCrops/ Transgenic Crops An Introduction and Resource

Guide. Cultivos transgénicos. Excelente página elaboradas por la Universidad de Colorado. En

ingles y en español. Explicaciones sobre la obtención de plantas transgénicas, sobre los productos

actualmente en el mercado, y información actualizada sobre ventajas y posibles riesgos de los

mismos.

http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/index.php Sitio del Consejo Argentino para la información

y el desarrollo de la biotecnología. Índice de contenidos de biotecnología. Incluye texto, imágenes,

animaciones, glosario.

http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/ Técnicas y Simulaciones de

electroforesis de geles de agarosa (un laboratorio virtual) donde se pueden ver fotografías de una

corrida electroforética.

http://web.mit.edu/esgbio/www/rdna/rdna.html Sitio web del Instituto de Tecnología de

Massachusetts que trata los temas de Southerns, Northerns, Westerns.

http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm Animación de varias técnicas cuyos

archivos pueden descargarse para usar en un computador sin estar conectados a Internet.

http://www.sciencedirect.com/



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http://web.mit.edu/esgbio/www/rdna/rdna.html

http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm

73


http://www.dnai.org/b/index.html Mediante animaciones recoge distintos procesos de la

manipulación de genes.

http://www.ppl-therapeutics.com/ PPL Therapeutics: es la compañía fundada por los

investigadores que lograron la clonación de Dolly, centrada en la obtención de animales

transgénicos diseñados para la producción de sustancias de interés terapéutico. Estas páginas

explican la tecnología de transgénesis y las estrategias en la producción de fármacos.

http://www.roslin.ac.uk/public/cloning.html Roslin Institute on line: páginas del Instituto Roslin de

Escocia organismo de investigación pionero en transgénesis de animales de granja, con

explicaciones, fotografías y enlaces de interés en el campo.

http://www.cnb.uam.es/~transimp Transgénesis en mamíferos: Web del grupo de trabajo de

transgénesis en mamíferos del Centro Nacional de Biotecnología (CNB-UAM) dentro de la

Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular.

http://www.eibe.info/ European Initiative for Biotechnology Education. Tiene un tema, el 9,

dedicado a plantas transgénicas que es accesible en español.

http://www.safe-food.org Comida transgénica. Paginas donde se debaten los beneficios y posibles

riesgos de estas tecnologías aplicadas a los productos de alimentación.

http://www.monsanto.com Monsanto: páginas en español de una de las grandes multinacionales

agrícolas implicadas en la investigación y comercialización de semillas transgénicas. Contiene

información actualizada sobre nuevos productos, legislación y debates e informaciones

relacionadas con el tema de plantas transgénicas agrícolas.

http://www.fao.org/biotech/forum.asp FAO. Foro electrónico para Biotecnología auspiciado por la

Food and Agriculture Organization de las Naciones Unidas. Conferencias, noticias y glosario sobre

Biotecnología e Ingeniería Genética.

UNIDAD 2

ASPECTOS TECNOLÓGICOS EN LA OBTENCIÓN DE PLANTAS Y ANIMALES

TRANSGÉNICOS

CAPITULO 4 BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Introducción

En este capítulo los alumnos se iniciarán en un conjunto de tecnologías que permiten aprovechar o modificar el potencial de las células vegetales para la obtención de plantas genéticamente modificadas.

http://www.dnai.org/b/index.html

http://www.ppl-therapeutics.com/

http://www.roslin.ac.uk/public/cloning.html

http://www.cnb.uam.es/~transimp/

http://www.eibe.info/

http://www.safe-food.org/

http://www.monsanto.com/


http://www.fao.org/biotech/forum.asp

74


Lección 16. Métodos directos de transformación para introducir genes de interés en

la célula vegetal

Desde hace millones de años las plantas son manipuladas genéticamente por el hombre.

La domesticación de las plantas ocurrió hace cerca de 20000 años y desde entonces la

mano humana selecciona, cruza y selecciona nuevamente en una actividad incesante de

mejoramiento genético que dio origen a las variedades de cultivos actuales, los cuales se

volvieron prácticamente irreconocibles en relación a las plantas ancestrales.

Estas técnicas de mejoramiento conocidas como tradicionales donde el hombre manipula

genéticamente los cultivos, transfiriéndose mediante cruzamientos a la progenie las

características genéticas de interés, poseen algunos inconvenientes, como la reducción

del ―pool de genes‖, la incompatibilidad sexual, y especialmente el tiempo necesario para

la transferencia de las características deseadas (que en especies perennes o altamente

heterocigotas, puede demandar décadas).

Las técnicas del ADN recombinante están ayudando no sólo a entender los mecanismos

fisiológicos básicos de las plantas a escala molecular sino también a aumentar la

variabilidad disponible para el mejoramiento genético, ya tenemos una metodología para

aislar un gen de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano o incluso sintético) para

luego reinsertarlo en la planta que interese mejorar o modificar. La herramienta básica en

el mejoramiento de plantas, la hibridación sexual, puede ser ahora complementada con la

transferencia de pequeños fragmentos de ADN conteniendo uno o varios genes, sin

precisar de retrocruzamientos largos y costosos. Para lograrlo, se necesitan además de la

caracterización molecular de los genes a introducir, vectores adecuados y métodos

eficientes para transformar y seleccionar las células vegetales transformadas, así como

para regenerar plantas completas a partir de ellas.

Aplicando los conceptos de las técnicas del ADN recombinante ya estudiadas

anteriormente y con la ayuda de métodos específicos de cultivo de tejidos se pueden

introducir nuevas características en una determinada planta, evitando los inconvenientes

ya mencionados. Los genes propios de diferentes especies vegetales, animales, o

microorganismos, pueden ser introducidos de forma controlada en un genoma vegetal

receptor.

La transformación genética de plantas consiste en la transferencia de material genético

proveniente del mismo u otro organismo. En general, implica el cultivo de células o tejidos

in vitro, dado que la transferencia de genes se realiza a algunas células del organismo

que se quiere transformar. A partir de estas células se regeneran plantas completas, que

llevan los genes transferidos, los expresan y los transmiten a la descendencia. Las

plantas transgénicas así obtenidas son incluidas luego en planes de mejoramiento

tradicional a través de cruzamientos (reproducción sexual) para transferir los genes de

interés a variedades de alto rendimiento.

75


Mientras una gran variedad de estrategias de regeneración y transformación son

aplicables a muchos cultivos, algunas veces se requieren protocolos muy particulares y

específicos. Por lo tanto, antes de elegir un sistema de transformación vegetal, se

requiere establecer una metodología rápida y eficiente de cultivo in vitro que permita

regenerar plantas completas y fértiles de la especie de interés.

Existen métodos físicos para transferir ADN a cualquier célula o tejido vegetal para

proteger al vector de degradación mecánica o ataque de nucleasas. Algunos de ellos

están limitados al uso en células sin pared celular (protoplastos) y otros se han diseñado

para transformar células que se encuentran formando un tejido.

Estos métodos son:

1. Electroporación de protoplastos.

2. Infección con Agrobacterium.

3. Biobalística.

Lección 17. Obtención de un vector en transgénesis vegetal

Es importante primero determinar los pasos necesarios para la obtención de un vector.

El vector generalmente es un plásmido al que se le inserta el gen de interés y para luego

ser transferido al tejido que se quiere transformar.

Un punto esencial es el establecimiento de un sistema que permita identificar las células o

tejidos transformados. Para esto, en el segmento de ADN que se va a transferir se agrega

junto al gen de interés un gen auxiliar llamado gen de selección.

Es decir, el gen que va a ser transferido (transgén) está compuesto por una secuencia

codificante, el gen de interés, y por secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras

son los promotores (P) que determinan el momento, lugar y nivel de expresión de cada

gen y los terminadores (T), que indican la terminación de la transcripción (proceso que

interviene en la expresión del gen). Todo este esquema sigue el modelo del operón ya

mencionado anteriormente.

El gen de selección, confiere a las células transgénicas que lo expresan una ventaja con

respecto a las células no transgénicas, como por ejemplo resistencia a un antibiótico o

76


herbicida. De esta forma aquellas células o tejidos que hayan recibido el gen de

selección sobrevivirán en un medio de cultivo que contenga además de los nutrientes

necesarios el agente selector (antibiótico o herbicida), mientras que las no transgénicas

no sobrevivirán. Al seleccionar células resistentes al agente selector (por ejemplo

herbicida) se tiene una evidencia indirecta de que el gen de interés ha sido transferido.

Esto es importante ya que mediante el uso de un sistema de selección en las primeras

etapas es posible evidenciar tempranamente la eficiencia de la metodología de

transformación y delimitar el trabajo de cultivo de tejidos a las células que sean

seleccionadas como transgénicas, con un importante ahorro en costo y mano de obra.

En etapas más avanzadas, es posible comprobar la integración al genoma vegetal y la

expresión del gen de interés mediante las diferentes técnicas moleculares ya

mencionadas.

Resumiendo, una vez identificados los genes y las respectivas secuencias reguladoras,

ellos son agrupados, formando una construcción que consta de un promotor, una

secuencia codificadora, y una señal de terminación. Esas construcciones son luego

introducidas en un vector adecuado, un plásmido bacteriano.

Para la selección de las células transformadas se utilizan genes que confieren resistencia

a antibióticos. Los más utilizados son el gen neo (npt II), que confiere resistencia a la

canamicina, geneticina o paromomicina y el gen hpt, que confiere resistencia a la

higromicina. También se puede recurrir a genes que confieren resistencia a herbicidas,

como el bar, que codifica a la enzima fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), confiriendo

resistencia a la fosfinotricina.

Lección 18. ¿Cómo se hace una planta transgénica?

En resumen podemos esquematizar como se hace una planta transgénica:

77


www.sistemasgenomicos.com

1.3. ¿Cómo se hace una planta

transgénica? ¿Cómo se hace una planta transgénica?

La técnica más comúnmente utilizada para la creación de plantas

transgénicas se basa en la acción de un microorganismo, Agrobacterium

tumefaciens, que es capaz de transferir parte de su material genético al

genoma de las plantas

El ADN que transfiere la bacteria se utiliza como vector, incorporando la

secuencia o gen de interés mediante técnicas de ingeniería genética

Plásmido

Ti

Secuencia

de interés

Agrobacterium

tumefaciens

78


La construcción que se introduce en el genoma de la planta lleva un

marcador de resistencia para la selección y el gen de interés, ambos

controlados por secuencias reguladoras de la transcripción

Gen de resistencia a

herbicida o antibiótico Gen de Interés

Promotor (P35S) Terminador – (TNos)

El 95% de las variedades transgénicas aprobadas hasta hoy utilizan las

mismas secuencias reguladoras procedentes del virus del mosaico de la coliflor

(P35S Y TNOS) www.sistemasgenomicos.com

79


La inoculación se lleva a cabo directamente

sobre fragmentos de hoja



En contacto con la

superficie de la

célula,

Agrobacterium

puede transferir su

ADN a la célula

vegetal

El ADN con el gen de

interés se incorpora de

forma estable a los

cromosomas de la célula

vegetal, de modo que se

transmitirá a las

siguientes generaciones

80


Lección 19. Electroporación de protoplastos:

La información referente a electroporación fue tomada del artículo Producción e

identificación de cultivos transgénicos. Diego Ariel Meloni; Julia Andrea Lescano.

Universidad Nacional de Santiago del Estero. Argentina.

La electroporación, es una técnica utilizada para introducir macromoléculas en células

vegetales. Los protoplastos son células vegetales desprovistas de su pared celular.

Cuando los protoplastos son cultivados in vitro, pueden reconstituir su pared, dividirse por

mitosis y regenerar una planta entera.

Protoplastos de Oryza sativa (izquierda) y Dahlia pinnata (derecha).

Tomado de: http://www.yakult.co.jp/ypi/english/enzyme/labo/funcelase


Los fragmentos de hoja cuyas células han incorporado la

construcción pueden crecer en medio selectivo, conteniendo una

nueva planta por crecimiento vegetativo

81


Para obtener protoplastos, el tejido vegetal debe ser incubado en un medio de digestión

con enzimas pectocelulolíticas, como las que digieren la celulosa, las hemicelulosas, y las

pectinas, que son los principales constituyentes de las paredes celulares, el pH del medio

debe favorecer la actividad de estas enzimas, sin comprometer la viabilidad de las células.

Luego de la digestión de la pared celular, se procede a la purificación y determinación del

número de protoplastos intactos.

La electroporación consiste en la inducción de poros reversibles en las membranas

celulares, que permiten el pasaje de iones y moléculas. Se realiza inmediatamente

después de su purificación. Para ello, una suspensión de protoplastos se incuba con los

plásmidos en los que están clonados los genes de interés, y los genes de selección.

La mayoría de los aparatos de electroporación (electroporadores) utilizan descargas de

alto voltaje. La intensidad del pulso está determinada por el voltaje aplicado y la

conductividad del medio. El grado de permeabilidad de la membrana, por su parte,

depende del campo eléctrico aplicado y del tipo celular. Altos niveles de permeabilidad

facilitan la entrada del ADN, pero disminuye la viabilidad de las células.

La eficiencia de la transformación puede estimarse mediante dos parámetros:

* Frecuencia absoluta de transformación: nº de colonias transformadas

nº inicial de protoplastos

* Frecuencia relativa de transformación: nº de colonias transformadas x 100

nº total de colonias obtenidas

La eficiencia de la transformación varía considerablemente entre especies, y entre cultivos

de la misma especie. Se han reportado frecuencias absolutas de transformación en el

rango de 10-6 a 10-3.

82


Pelos radicales de Medicago sativa; B, protoplastos obtenidos a partir de esos

pelos radicales luego de 3 minutos de incubación con enzimas para digerir la pared

celular. La barra blanca, en ambas fotos corresponde a 10 μm.

Tomado de: http://web.ccr.jussieu.fr/lem/Nod.htm

Video Electroporación.

Lección 20. Agrobacterium tumefaciens: un ingeniero genético por naturaleza

La información referente a Agrobacterium tumefaciens fue tomada de la página de

Internet: www.ugr.es/biotecnologiavegetal y del artículo: Aspectos tecnológicos de la

obtención de plantas transgénicas. Pilar Carbonero. Laboratorio de Bioquímica y

Biología Molecular. Universidad Politécnica de Madrid.

Como se mencionó anteriormente, el método más difundido para la transformación

genética de plantas se basa en un proceso mediado por Agrobacterium tumefaciens, una

bacteria aeróbica Gram- negativa que no forma esporas, posee forma de bacilo y se

mueven por medio de 1 a 6 flagelos; vive comúnmente en el suelo e infecta a un amplio

rango de plantas (la mayoría de las dicotiledóneas y algunas monocotiledóneas). Esta

bacteria tiene como blanco de infección las heridas en el tallo o raíces de la planta

inmediatamente sobre el nivel del suelo, donde ataca a las células, causando su

http://www.ugr.es/biotecnologiavegetal

83


proliferación y formando tumores. Agrobacterium tumefaciens, es el agente etiológico de

la ―agalla de la corona‖ y Agrobacterium rhizogenes el de la ―raíz en cabellera‖, ambas

diseminadas en casi todos los tipos de suelos, cultivados o no.

Esquematización del proceso natural de infección por Agrobacterium. Tomado de

www.porquebiotecnologia.com.ar

El desarrollo de los tumores se debe a que Agrobacterium tiene la capacidad de transferir

parte de su propio material genético a la planta hospedante. La capacidad patogénica de

esta bacteria se asocia a la presencia de plásmidos Ti (Tumor inducing o inductores de

tumores). Se ha demostrado que un fragmento de estos plásmidos, llamado ADN-T (ADN

de transferencia), es transferido a la célula vegetal donde se integra al ADN cromosómico

de la planta.

La transferencia de ADN es inducida por la expresión de unos genes llamados vir (genes

de virulencia) que se encuentran en el plásmido Ti por fuera de la secuencia que se

transfiere. Dentro del ADN-T se encuentran genes bacterianos que intervienen en la

síntesis de fitohormonas (hormonas vegetales) que causan la proliferación celular.

También genes que participan de la síntesis de una serie de compuestos denominados

opinas, los que son secretados y utilizados como nutrientes por Agrobacterium. De esta

84


forma la bacteria redirige genéticamente el metabolismo de la planta para su propio

beneficio.

En resumen, la infección de una planta con Agrobacterium, comienza con la penetración

de la bacteria en el tejido vegetal, a través de una lesión producida por insectos,

tratamientos de cultivo, heladas, etc. Las bacterias son atraídas por sustancias liberadas

por las células lesionadas, tales como aminoácidos, azúcares y fenoles. Una vez en

contacto con las células vegetales, las bacterias sintetizan microfibrillas de celulosa,

propiciando una mejor fijación.

Las moléculas liberadas a través de las heridas también son responsables por la

activación de genes localizados en la región vir del plásmido Ti. La región vir contiene

aproximadamente 25 genes, que codifican proteínas que promueven la transferencia de

otra región del plásmido Ti de la bacteria, hacia la célula infectada. Esa región se

denomina T-ADN, y se integra en forma estable, al genoma vegetal.

Estos plásmidos presentan dos regiones esenciales para la movilización e integración del

T-DNA en las células vegetales, una corresponde a ambos extremos del T-DNA (LB:

borde izquierdo y RB: borde derecho) que consisten en una repetición directa casi

perfecta de 25 pb (5‘TGACAGGATA-TATTGGCGGGTAAAC3‘) y la otra es la llamada

región Vir que se requiere para que la escisión, transferencia e integración del T-DNA

sean efectivas.

85


Características generales del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. LB =

borde izquierdo; RB = borde derecho. T-DNA, DNA transferido a la planta. Vir =

región de virulencia (genes necesarios en trans para que el T-DNA sea transferido a

la planta). B) Estructura de T-DNA en la cepa silvestre y en el vector de clonación

(cepa desarmada). P1 y P2 promotores, npt = neomicina fosfotransferasa, bar =

fosfinotricina acetiltransferasa. Tomado de ASPECTOS TECNOLÓGICOS DE LA

OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS. Pilar Carbonero. Universidad Politécnica de

Madrid.

Nótese que en la naturaleza se producen plantas transgénicas, sin la intervención del

hombre, cuando el T-ADN bacteriano es ―inyectado‖ a la célula vegetal, para luego

integrarse y expresarse en el genoma hospedante.

Además de los genes del plásmido Ti, existen varios genes en el cromosoma de

Agrobacterium que afectan la virulencia, relacionados con síntesis de proteínas de pared,

de glucanos, de fibrillas de celulosa, etc., que pudieran tener un papel más general en

interacciones bacteria-planta. Este tipo de genes también se encuentra en otras bacterias

del suelo.

Los vectores a partir del plásmido Ti suelen ser de dos tipos: vectores binarios y vectores

recombinativos (cointegrativos).

86


Hoy en día, la estrategia más empleada, para transferir genes de Agrobacterium a

plantas, es la conocida, como ―estrategia de vectores binarios‖ que aprovecha el hecho de

que las funciones de la región vir pueden actuar en ―trans‖, es decir, no unidos

físicamente al T-DNA. Esto permite que vir pueda ir en un plásmido distinto al que

contiene el T-DNA, con los genes que se desean introducir en la planta receptora. De este

modo, los genes foráneos se pueden introducir e integrar en la planta mediante cocultivo

de la bacteria con fragmentos de hoja u otros tejidos. Posteriormente, los genes de

selección ayudarán al reconocimiento de las células transformadas durante el proceso de

regeneración hasta planta completa.

Video Agrobacterium tumefaciens.

Transformación de células de Agrobacterium con los genes de interés.

Veamos ahora como podemos introducir los plásmidos que contienen los genes de

interés, en las células de Agrobacterium (transformación).

Pese a que los oncogenes son los responsables de la producción de tumores, las únicas

regiones del T- ADN esenciales para su transferencia son las secuencias de

aproximadamente 25 pb localizadas en sus extremidades. De este modo, los genes

presentes en el T- ADN pueden ser eliminados y sustituidos, sin alterar el proceso de

transferencia. Además de las extremidades del T- ADN, la región vir también es esencial

para la transferencia.

La preparación de un linaje de Agrobacterium para ser utilizado como vector para la

transformación de plantas transgénicas, incluye dos etapas:

En la primera etapa, se debe obtener un ―linaje desarmado‖, en el cual el T-ADN original,

con sus oncogenes fue eliminado por un proceso de doble recombinación. Actualmente

se dispone de linajes desarmados, obtenidos a partir de linajes salvajes de diferentes

orígenes.

La segunda etapa, implica la preparación de un vector conteniendo el T-ADN con los

genes de interés. Debido a su gran tamaño (aproximadamente 200 kb), el plásmido Ti no

puede ser manipulado directamente, por lo que se emplean plásmidos más pequeños

(vectores), que resultan fáciles de manipular. Estos vectores contienen las extremidades

del T-ADN, entre las cuales se clonan los genes de interés.

Una vez obtenido el vector, este debe ser transferido al Agrobacterium mediante un

proceso que se conoce con el nombre de transformación. Se han desarrollado tres

métodos de transformación: conjugación, electroporación y shock térmico:

87


Conjugación: se trata de un método simple y eficiente que no requiere de equipamiento

específico. En el protocolo más común, se realiza un cocultivo de dos linajes de

Escherichia coli, una denominada ―helper‖ y otra denominada ―donante‖ y un linaje de

Agrobacterium (receptora). El linaje ―helper‖ suministra las funciones de movilización

(mob) y transferencia (tra) de plásmidos, entre bacterias compatibles, mientras que el

linaje ―donante‖, contiene el vector que será transferido.

Durante la conjugación, el plásmido ―helper‖ es transferido al linaje ―donante‖,

promoviendo posteriormente su movilización hacia Agrobacterium, junto con el vector. El

plásmido ―helper‖ no se replica en Agrobacterium, y por lo tanto es eliminado. Luego de la

transferencia, se seleccionan los linajes recombinantes de Agrobacterium mediante el uso

de antibióticos apropiados. La principal desventaja de la conjugación es la posibilidad de

que ocurran alteraciones en el plásmido introducido, debido a la recombinación con el

plásmido ‗helper‖.

Electroporación: Consiste en someter a las células del linaje receptor de Agrobacterium a

un pulso de alto voltaje, generado por un capacitor, en presencia del vector. Como

consecuencia del campo eléctrico generado, la membrana plasmática se desestabiliza,

produciendo poros por los que se produce el pasaje de macromoléculas. Se trata de un

método muy eficiente y relativamente simple, que se utiliza con mucha frecuencia. Su

principal limitante es la necesidad de contar con el equipamiento de laboratorio:

electroporador y una fuente de alta tensión.

88


Transferencia de un vector hacia Agrobacterium mediante conjugación. El plásmido

“helper” pasa a E. coli donante (a y b), y luego a Agrobacterium, promoviendo la

transferencia del vector binario (c). El plásmido “helper” no se replica en bacterias

y es eliminado (d). El vector binario se mantiene independientemente del plásmido

Ti desarmado. Figura tomada de: Producción e identificación de cultivos

transgénicos. Diego Ariel Meloni; Julia Andrea Lescano. Universidad Nacional de

Santiago del Estero. Argentina.

89


Shock térmico (“freeze – thaw”): este método se basa en la permeabilización de la

membrana en condiciones extremas de temperatura (de –186 a 37ºC), permitiendo el

pasaje del vector hacia el Agrobacterium receptor.

En los métodos directos de transformación (electroporación y shock térmico), en los

cuales el vector es transferido directamente hacia la célula receptora, la probabilidad de

que el ADN se altere es mínima, en comparación con el método de conjugación.

En esencia, hemos "vaciado" el interior del ADN-T, dejando de él sólo los bordes

(imprescindibles), y lo hemos sustituido por dos genes: uno es un marcador para localizar

o seleccionar las células que se hayan transformado; el otro es el gen que queremos

poner a trabajar en la planta.

Ahora introducimos nuestro vector (con la correspondiente construcción genética) en una

cepa de Agrobacterium a la que hemos "desarmado" su plásmido Ti (con objeto de

aprovechar sus funciones de transferencia del ADN-T, pero inactivándole sus funciones

patógenas).

En cuanto al tipo de manipulaciones se pueden enumerar como aditivas cuando el gen

introducido codifica una nueva función, sustractivas cuando el ADN introducido bloquea a

un gen de la planta, interruptor a distancia (transwitch) y antisentido.

Durante los primeros años, la manipulación de plantas era aditiva: añadía uno o dos

genes concretos. Tiene la limitación de que existen pocos genes individuales que logren

mejoras por sí solos (resistencia a virus, a larvas de insectos, a ciertos herbicidas).

Desde mediados de los 80 se comenzó la estrategia sustractiva: el ADN que se

introduce inhibe o bloquea de alguna manera la expresión de un gen de la planta (anular

algún gen de algún rasgo no deseado).

90


CAPITULO 6. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

Introducción

Las tecnologías para la obtención de vegetales trangénicos, son importantes porque han sido comercializados y son distribuidos mundialmente. Otros métodos de transformación serán abordados en este capítulo especialmente la técnica antisentido la cual es ampliamente utilizada en el tema tratado.

Lección 21. Tecnología antisentido

En la Tecnología antisentido, insertamos un gen en orientación opuesta a la normal, lo

que determina un ARN (antisentido) que se empareja con el ARN del gen homólogo

normal de la planta. Ello parece que dificulta la traducción de este ARNm por los

ribosomas, y favorece su degradación. De esta manera se puede anular o inhibir el

fenotipo dependiente del gen que se quiere controlar.

Ejemplo: Inhibición gen de la poligalacturonasa en tomate: retrasa la maduración.

En cuanto a la Tecnología del interruptor a distancia (transwitch) permite introducir

trozos del gen a bloquear, pero en su orientación normal, lo cual interfiere con el

procesamiento del ARN del gen homólogo completo de la planta. Ejemplo: supresión del

gen CHS en petunia, lo que produce flores blancas.

Estas técnicas de silenciamiento génico permiten obtener gamas desde casi total

anulación de la expresión hasta valores intermedios, dependiendo de la posición del

transgén.

Veamos un ejemplo de estas manipulaciones sustractivas para retrasar la maduración

excesiva de los frutos.

El problema: frutos que se maltratan y hay que tirarlos porque no aguantan lo suficiente

hasta llegar al consumidor (en el tercer mundo esto supone 50% pérdidas). Se puede

resolver cortándolos de la planta cuando aún están verdes, pero con ello se pierde sabor

y otras cualidades valiosas.

En el tomate se ha logrado retrasar la maduración regulando dos procesos:

Inhibiendo la poligalacturonasa (PG) y la celulasa que degradan las paredes de las

células y provoca el ablandamiento del fruto. El gen antisentido bloquea al gen endógeno

de la PG. En ausencia de PG no hay degradación de las cadenas de poligalacturónico de

la piel del tomate, por lo que sigue conservando su aspecto fresco varias semanas

después de cosecharlo. Los demás aspectos de la maduración (los positivos) no se

91


modifican. Se puede dejar el tomate en la planta más tiempo sin miedo a que se estropee

luego, y ello permite que pasen más sustancias que confieren sabor y hacen el fruto más

apetecible. Esta estrategia ha sido utilizada por la empresa Calgene para su Tomate

FlavrSavr ™, que se vende en los EEUU.

Controlando la ruta biosintética del etileno. El etileno es una hormona vegetal gaseosa

que controla muchos procesos (germinación, senescencia y caída de hojas y flores,

respuesta al estrés, entre otros). En cierto tipo de frutos (climatéricos) controla, además

su maduración. Al inicio de ésta, el aumento de etileno induce cambios en color, textura,

aroma y sabor, que hacen que el fruto sea apetecible. Control por bloqueo del gen de la

ACCS (aminociclopropano, 1-carboxi sintetasa) o de la ACC oxidasa. Cuando se inhibe el

95% de la ACC oxidasa, el fruto madura sólo sus cualidades positivas, pero se evita el

reblandecimiento. Este procedimiento se ha utilizado para la obtención de tomates

transgénicos que tienen una inhibición del 90% en la producción de etileno y cuya

maduración se retrasa hasta tres meses. De este modo los tomates se recogen de la

planta y se maduran por tratamiento externo con etileno, conservando el mismo color,

textura, aroma y sabor que los madurados en la propia planta.

Link Universidad de Nebraska: Antisense RNA Technology

En conclusión, el conocimiento de las bases moleculares del mecanismo de infección por

Agrobacterium, y el desarrollo de técnicas de biología molecular, permitieron desarrollar

protocolos para introducir en las plantas genes exógenos, utilizando esta bacteria como

vector. Como se ha mencionado en los ítems anteriores, esto fue posible gracias a la

obtención de vectores derivados del plásmido Ti, y su introducción en linajes de

Agrobacterium ―desarmados‖, en los cuales los oncogenes fueron eliminados. Desde

entonces, este sistema de transformación fue ampliamente utilizado, en un gran número

de especies. Algunas de las razones que justifican su universalidad, son la alta eficiencia

de transformación, el bajo costo operacional y la simplicidad de las técnicas.

92


Lección 22. Aplicación de la técnica

Horsch en 1985 propuso un protocolo para transformar discos foliares de tabaco (Nicotina

tabacum), en la actualidad la mayoría de los protocolos desarrollados son una modificación de esta

técnica que consta de las siguientes etapas:

Infección: Consiste en el cultivo del explante vegetal en un medio líquido ó sólido, junto

con el linaje desarmado de Agrobacterium que contiene el ó los genes a ser introducido/s

en la planta. El tiempo de cultivo puede variar desde algunas horas, hasta varios días. En

la elección del explante debe tenerse en cuenta la facilidad de reproducción in vitro. De

este modo, dependiendo de las especie y del cultivo, se han utilizado como explantes

discos foliares, segmentos de tallos o raíces, tubérculos, cotiledones, protoplastos y

embriones somáticos.

Generalmente se realiza una herida en el explante, antes o durante el contacto con la

bacteria, ya que a través de ella se liberan las sustancias que inducen a los genes de

virulencia del Agrobacterium. Durante esta etapa, se produce la unión de la bacteria a la

región donde se encuentra la herida, la inducción de los genes de la región vir, y la

transferencia del T-ADN hacia el genoma vegetal.

Selección: En una segunda etapa el explante es transferido a un medio de regeneración

apropiado conteniendo uno ó más antibióticos descontaminantes, que permiten eliminar a

las células de Agrobacterium, que a partir de ese momento ya no son requeridas.

Normalmente se adiciona al medio de cultivo un agente de selección, que es responsable

de la inhibición del crecimiento de las células no transformadas. El efecto nocivo de este

agente, en las células transformadas, es anulado por el producto de expresión del gen

marcador de selección (generalmente una enzima).

De este modo, sólo las células transformadas serán capaces de desarrollarse en este

medio de cultivo selectivo.

Debemos tener en cuenta que ningún sistema de selección es totalmente eficiente, de

modo que pueden producirse algunos ―escapes‖ (plantas no transformadas, que a pesar

de no expresar el gen marcador, consiguen regenerarse en presencia del agente de

selección).

Enraizamiento: Durante las semanas siguientes, los brotes resistentes al agente de

selección son aislados a medida que regeneran, y transferidos a un medio de

enraizamiento, rico en auxinas (hormonas vegetales, como el ácido 3-indol acético, 3-

indol – butírico, que se caracterizan por inducir la diferenciación de raíces).

Rustificación: Una vez enraizados, los brotes potencialmente transformados son

aclimatados y llevados a invernáculo.

93


Análisis molecular: Para comprobar la integración y expresión del gen foráneo en el

genoma de la planta, es necesario un exhaustivo análisis molecular, mediante técnicas

como Northern Blot, Southern Blot, Western Blot, entre otras.

Posteriormente, también deben realizarse estudios genéticos de segregación.

Etapas de la transformación con Agrobacterium. Adaptado de:

http://www.cipotato.org/Market/Belgtech/breakthr.htm

Lección 23. Otros Métodos de Transformación

Son métodos físicos capaces de transferir ADN a cualquier célula o tejido vegetal con el

único requerimiento de proteger al vector de degradación mecánica o ataque de

nucleasas. Algunos de estos métodos están limitados al uso en células sin pared celular

(protoplastos) y otros se han diseñado para transformar células que se encuentran

formando un tejido.

94


Método biobalístico (Pistola de genes)

Esta técnica fue propuesta por John Sanford, Theodore Klein, Edward Wolf, y Nelson

Allen de la Universidad de Cornell en Estados Unidos en 1987, para introducir material

genético en el genoma nuclear de plantas superiores, especialmente en especies

monocotiledóneas (como cereales) donde Agrobacterium era incapaz de funcionar. Con

esta tecnología en los últimos años se han obtenido cereales transgénicos como trigo,

cebada, arroz, maíz, centeno, avena y sorgo. En los últimos años también se ha usado

para transformar bacterias, protozoos, hongos, algas, insectos y tejidos animales.

La biobalística, utiliza microproyectiles a alta velocidad, para introducir ácidos nucleicos y

otras moléculas en células y tejidos. Este proceso también se conoce con los nombres de

―bombardeo con microproyectiles‖, ―gen gun‖ (pistola génica),―aceleración de partículas‖,

etc.

Micropartículas de oro de 2 a 4 μm de diámetro, recubierta con el ADN que va a ser introducido en la célula vegetal. TRANSGÊNICOS. Daniel Gustavo Braz Rocha.

Autor: Daniel Gustavo Braz Rocha



TRANSGNICOS

Representación esquemática

de la pistola de genes

95


El desarrollo del plásmido que contiene el gen de interés y el gen de selección es el

primer paso de este procedimiento, con el plásmido se transforman bacterias con el

propósito de conseguir un alto número de copias, es decir, con el objetivo de clonarlo, a

partir del cultivo de estos clones bacterianos transformados se aísla de nuevo el plásmido

recombinante. Entonces se preparan los microproyectiles, se utilizan micropartículas de

0,2 a 4 μm de diámetro, construidas de un material denso oro o tungsteno, estas

micropartículas se cargan positivamente y al ponerse en contacto con la construcción que

tiene ADN cargado negativamente, se fijan uno al otro por cargas opuestas. Los

microproyectiles con su carga de genes son impulsados y acelerados a velocidades

superiores a los 1500 km/h. Estas partículas penetran la pared y la membrana plasmática,

alojándose aleatoriamente en los organoides celulares. Posteriormente, el ADN se libera

de las partículas y se integra en el genoma nuclear del organismo receptor. El mecanismo

por el cual se produce la incorporación de este ADN foráneo al genoma vegetal, no es

claro aún, pero se presume que interviene el sistema de reparación de ADN.

Se han desarrollado varios mecanismos para lograr la aceleración de las micropartículas

hacia las células vegetales. Los microproyectiles cubiertos con ADN se impulsan a

grandes velocidades por una onda de choque derivada de una explosión química, la

explosión eléctrica de una gota de agua o la descarga de un gas inerte comprimido.

Equipo de biobalística utilizado en el proceso de introducción de genes en

meristemas apicales de fríjol. Centro Nacional de Investigación de Recursos

Genéticos y Biotecnología (EMBRAPA/CENARGEN) Brasil. Profesor Elibio Rech.

EMBRAPA. Brasil.

Video Biobalística.

96


Actividad 4. En el site www.biorad.com existe información sobre el uso de presión

de gas helio y otros procedimientos, lo mismo que los tipos de tejidos y células que

se pueden someter a la transformación por biobalistica. Se debe presentar un

resumen sobre estos temas como refuerzo de esta lección. Se proporcionan

archivos en PDF.

Lección 24. Aplicaciones I

Desde que se inició el uso comercial de plantas transgénicas en los Estados Unidos a

mitad de la década del 90, se ha observado un crecimiento de aproximadamente 20% al

año en la oferta de los nuevos productos provenientes de la ingeniería genética. Por

medio de la ingeniería genética se pueden alterar importantes rutas metabólicas y con

esto promover cambios en el tipo y composición por ejemplo de proteínas, vitaminas,

aceites, etc. Con esas modificaciones se pretende elevar el valor nutricional, desarrollar

plantas que funcionen como biorreactores capaces de producir polipéptidos de valor

farmacéutico, producir gran cantidad de proteínas para fines industriales etc.

El principal objetivo de la transgénesis vegetal es la introducción de nuevas

características no existentes en el organismo en su estado original para aumentar la

producción de alimentos con reducción en los costos de producción, aumentar la

resistencia inducida disminuyendo la necesidad del uso de herbicidas, una producción de

alimentos de mayor calidad nutricional, y especialmente conseguir un material biológico

capaz de dar respuesta a los problemas tradicionales de la agricultura como la pérdida de

cosechas por agentes patógenos y plagas que tradicionalmente han sido combatidos por

el agricultor con armas químicas.

Resistencia a insectos

La resistencia de los cultivos agrícolas a insectos dañinos es una característica de gran

importancia económica, por el elevado costo en productos y mano de obra que implica

la administración periódica de insecticidas. El costo mundial estimado del control químico

de los insectos plagas es de 3-5 billones de dólares por año. Se debe considerar también

la trascendencia ecológica debido a la contaminación ambiental que se produce con el

uso masivo de insecticidas químicos. Estas cifras asombrosas justifican el desarrollo de

plantas transgénicas con resistencia a insectos para reducir no solo los costos de la

producción, sino también el deterioro del medio ambiente.

La primera proteína que se expresó transgénicamente en plantas con el objetivo de

hacerlas más resistentes al ataque de insectos fitófagos fue el producto de un gen cry que

http://www.biorad.com/

97


codifica para los cristales proteicos de Bacillus thuringiensis (Bt). Ciertas cepas producen

una proteína tóxica activa frente a lepidópteros, otras frente a coleópteros y otras frente a

dípteros.

La posibilidad de hacer que las plantas expresen su propio insecticida tiene ventajas

como confinamiento del insecticida dentro de la planta, protección dónde y cuándo se

necesita variando el promotor empleado, no lavado por lluvias o por agua de riego, sólo

afecta a los insectos que se alimenten de la planta y no afecta a los demás insectos, por

ejemplo, los polinizadores, mejoría para el medio ambiente, aumento de la variabilidad

potencialmente disponible, al poder expresar transgénicamente proteínas insecticidas de

las más diversas procedencias.

En 1987 las empresas Plant Genetic Systems (Bélgica) y Monsanto (USA) patentaron el

uso transgénico de la proteína Bt, que determina la toxina antiinsecticida de la bacteria

Bacillus thuringiensis en tabaco y tomate En la actualidad el número de compañías que

realizan investigación, y que comercializan semillas expresando la proteína Bt son

numerosas. El maíz Bt, resistente al taladro europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), es un

ejemplo de ello.

A pesar del amplio uso de los genes cry para el control de muchas plagas en cultivos

comerciales, aún existen plagas de importancia económica que no han podido controlarse

con las tóxinas de Bt, por esto también se han caracterizado otras proteínas insecticidas

de origen vegetal que posiblemente forman parte del mecanismo natural de defensa.

Estos podrían usarse transgénicamente junto con Bt para potenciar sinergísticamente la

resistencia de las plantas cultivadas frente a plagas. Entre otras se han estudiado:

1. Inhibidores de serín-proteasas digestivas para controlar larvas de lepidópteros

2. Inhibidores de cisteín-proteasas para controlar larvas de coleópteros y nemátodos.

3. Inhibidores de a-amilasas para controlar plagas de almacén

También se están investigando genes que codifican enzimas de la biosíntesis de

metabolitos secundarios que transforman ciertos precursores menos activos o inactivos

en productos insecticidas activos, además de los que codifican lectinas, lipoxigenasas y

polifenoloxidasas.

Resistencia a virus

Las infecciones por virus es otro de los problemas que llevan a grandes pérdidas

económicas en las cosechas especialmente de granos. La propiedad de obtener plantas

resistentes a virus tiene perspectivas cada vez más amplias a medida que nuevos

conocimientos son logrados. En la actualidad se trabaja intensamente en este campo y se

siguen diferentes estrategias. Uno de los procesos empleados es el denominado

98


―silenciamiento del gen‖ o protección mediada por el RNA. Un ejemplo sería la papaya

transgénica con resistencia al virus de la mancha en anillo desarrollada por el Centro

Nacional de Investigación de Recursos Genéticos y Biotecnología del Brasil (EMBRAPA-

CNPMF) y la Universidad de Cornell en los Estados Unidos. Otro ejemplo sería la papa

transgénica resistente al virus del mosaico de la papa también desarrollada por

EMBRAPA-CNPH/CENARGEN Brasil.

Por medio de técnicas de biobalística o Agrobacterium el gen de la capa proteica o

capside del propio virus es introducido en la planta, la planta expresa la proteína de la

cubierta vírica que posibilita que la misma se vuelva resistente al virus funcionando así

como una inmunización de la planta, una especie de ―vacuna‖ que le confiere resistencia.

Este proceso se ha denominado Protección Mediada por la Proteína de la Cubierta y

aunque no se conocen bien los mecanismos moleculares de esta resistencia, se sabe que

la súper producción, de forma constitutiva, de esta proteína de la cápside reduce

significativamente la infección posterior por virus.

Hoy día se dispone ya de plantas de cultivo extensivo resistentes a más de un virus por

este procedimiento, ya que la expresión de la proteína de la cubierta de un virus protege a

la planta contra la infección de un amplio espectro de virus no relacionados.

Mediante este método también se ha conseguido resistencia significativa al virus del mosaico del tabaco (VMT) Este abordaje produce resultados similares en tomate, y en un amplio espectro de patógenos como el virus del mosaico de la alfalfa y el virus del mosaico del pepino. El mecanismo de protección parece implicar la interferencia del producto del gen con las partículas virales desnudas antes de la traducción y replicación del virus. Plantas transgénicas que portan el gen de la proteína de la cubierta del VMT han sido evaluadas en invernaderos y campos de pruebas, mostrando una alta resistencia a la infección vírica. Otro método de protección es la introducción de copias de ADN-c del llamado ARN satélite en plantas cultivadas. Este ARN satélite esta presente en los cultivos de virus y determina un baja importante en el desarrollo de estos. En las plantas transgénicas el ARN satélite se replica cuando el virus infecta, aminorando los efectos del virus. Abordajes similares se basan en la interferencia en la replicación del virus por parte de moléculas defectuosas de ARN que provienen de formas del propio virus que han sufrido deleciones, o empleando la tecnología del ARN antisentido con genes de la cápside del virus. A partir del ARNm se obtiene el ADN-c correspondiente, cuya trascripción produce copias de mensajero complementarias al ARNm de partida. Estas moléculas complementarias se aparean base a base formando una doble hélice de ARN, lo que impide la traducción del ARNm. Plantas de tabaco transformadas con la secuencia de un gen no-estructural del VMT (posiblemente un componente del complejo de la replicasa) muestran una resistencia total al virus, incluso a concentraciones de viriones muy altas. No se ha detectado el producto génico y se desconoce si la resistencia es debida a la proteína o a su ácido nucleico.

99


Infección por hongos

Las infecciones por hongos son muy frecuentes en las plantas y provocan grandes

pérdidas de las cosechas en todo el mundo. Por ejemplo, un hongo que ataca al arroz en

la zona del sudeste asiático puede causar pérdidas de más de 5000 millones de dólares al

año. Para luchar contra estos hongos fitopatógenos se emplean productos químicos

peligrosos para la salud humana y animal y debido a que se acumulan, son muy dañinos

para el medio ambiente. Algunas plantas disponen de defensas contra estos agentes

patógenos mediante la producción de unas proteínas conocidas genéricamente como

proteínas relacionadas con patogénesis (PR), que son enzimas del tipo de glucanasas,

quitinasas e inhibidores de proteasas. Por ingeniería genética se han logrado introducir

los genes y expresar algunas de estas proteínas en arroz y tabaco transgénicos,

consiguiendo cultivos resistentes.

Desde que se comprobó que la expresión de genes que codifican una quitinasa y una proteína inactivadora de ribosomas confería protección parcial contra ataques de hongos, un largo repertorio de genes ha sido identificado para su posterior manipulación. Además, están apareciendo estrategias para la manipulación de defensas multigénicas, tales como la degradación de lignina y la síntesis de antibióticos del tipo de las fitoalexinas.

Lección 25. Aplicaciones II Infección por bacterias

Las infecciones por bacterias son también muy dañinas para los cultivos, y la situación es

más problemática ya que no se han identificado genes de resistencia a bacterias que

puedan ser incorporados a los cultivos. Solo la bacteria del suelo Erwinia carotovora que

es patógena para la papa provoca pérdidas anuales de más de 100 millones de dólares.

Se han logrado algunos resultados prometedores con la patata trasgénica que incorpora

el gen de la lisozima del virus bacteriófago T4, puesto que la lisozima puede actuar tanto

en bacterias gram positivas como gram negativas se intenta extrapolar esta estrategia a

otros caso.

Resistencia a estrés abiótico

Las plantas están sometidas a cambios drásticos de temperatura, de niveles de agua y de salinidad en el suelo. Debido a su inmovilidad no pueden escapar de estas situaciones de estrés que provocan la pérdida de importantes cosechas. Para resistir a estas condiciones extremas determinadas plantas han desarrollado

100


diferentes mecanismos que pueden ser aprovechados. Se ha trabajado intensivamente para tratar de transferir la resistencia al estrés presente en especies silvestres a las cultivadas, tanto por técnicas tradicionales como por ingeniería genética. Sin embargo, se requiere mayor conocimiento de las bases fisiológicas, bioquímicas y genéticas de las respuestas de las plantas al ambiente para progresar significativamente en esta área.

Se han caracterizado algunos genes implicados en la tolerancia de determinadas plantas

a situaciones extremas de temperatura, aridez y salinidad. La salinización de los suelos

es uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola a nivel mundial, y es

un problema derivado fundamentalmente de la práctica del regadío. Se calcula que una

superficie de más de 80 millones de hectáreas está afectada por severos problemas de

salinidad, y que cada año se añaden 5 millones de hectáreas más. Algunas de estas

tierras han quedado fuera del uso agrícola o solo pueden utilizarse para el cultivo de

especies tolerantes. Algunas plantas viven en ambientes sometidos a periodos de largas

sequías y alta salinidad. Para sobrevivir, estas plantas sintetizan unas moléculas

denominadas genéricamente osmoprotectores, que facilitan la retención de agua y

protegen y estabilizan a las macromoléculas celulares frente a concentraciones iónicas

elevadas. Estos osmoprotectores son pequeñas moléculas de determinados azúcares,

alcoholes, y sales de amonio cuaternario como la betaína. La betaína es sintetizada por

las plantas y también por algunas bacterias. El gen betA de Escherichia coli ha sido

utilizado para obtener plantas transgénicas de tabaco que resultan ser hasta un 80% más

resistentes a altas concentraciones salinas que la planta no transgénica.

El grupo dirigido por el Prof. Blumwald de la Universidad de Toronto con la empresa

Seaphire, ha conseguido plantas transgénicas de tomate que producen cosechas

normales en condiciones de riego con agua con una salinidad del 33%, mientras que la

mayoría de las especies agrícolas no soportan riegos por encima del 8% de salinidad. La

tecnología está basada en la inserción de un gen que codifica para una proteína llamada

antiportadora de sodio, que es capaz de transportar y almacenar la sal en las vacuolas de

las células, mientras que los frutos y las semillas no contienen vacuolas salinas.

Se han obtenido también plantas transgénicas de nabo y tabaco, portadoras de un gen que codifica una proteína pequeña capaz de unirse a metales pesados, la metalotioneína, reteniéndolos y disminuyendo su toxicidad. Estas proteínas están presentes en vertebrados y en hongos.

De otra parte, ya existen plantas transgénicas que muestran tolerancia a niveles tóxicos de cadmio. Otros intentos de producir plantas tolerantes a los metales a través de selección de cultivos in vitro no han tenido gran éxito. Aunque se han obtenido líneas celulares resistentes a aluminio, mercurio, zinc y otros metales,

101


solo en unos pocos casos el nuevo carácter se ha expresado de forma estable en plantas regeneradas de tales células. Por otra parte, los ecotipos tolerantes a altas concentraciones de iones tóxicos, encontrados en zonas mineras y susceptibles de ser utilizadas en programas de mejora, muestran una tasa de crecimiento muy baja. Por ello, la ingeniería genética puede ser la técnica mas adecuada para conseguir plantas con este tipo de resistencias.

Producción de formas androestériles

Se han encontrado dos genes de ribonucleasa que selectivamente destruyen el linaje de células que tapizan las anteras durante su desarrollo. Una ribonucleasa procede de Aspergillus oryzae y la otra de Bacillus amyloliquefaciens (llamada Barnasa). Tras la construcción de genes quiméricos de ambas ribonucleasas, que son expresados específicamente en las anteras, se han obtenido plantas transgénicas de tabaco y colza. La expresión de estos genes afecta la producción de polen funcional y viable, obteniéndose plantas androestériles. Este gen nuclear es dominante y su expresión en la antera destruye selectivamente la capa de células que rodea al saco de polen. La capacidad de los genes de ribonucleasas como inductores de esterilidad masculina proporciona una nueva estrategia para la producción de híbridos. Acoplando el gen quimérico a un gen dominante de resistencia a herbicida pueden diseñarse sistemas de mejora encaminados a seleccionar poblaciones uniformes de plantas androestériles. En plantas cultivadas en las que el fruto no es la parte almacenada (por ejemplo, lechuga, zanahoria, col), la plantas androestériles pueden cruzarse con cualquier línea polinizadora para producir semillas híbridas. Por el contrario, en otros cultivos como el tomate, trigo, arroz o maíz, será necesario restaurar completamente la fertilidad masculina en la descendencia. La tecnología del ARN antisentido y la existencia del barstar, una proteína inhibidora de la barnasa, pueden hacer posible el desarrollo de estrategias para la restauración de la fertilidad masculina.

Tolerancia a herbicidas

Otro de los campos que tiene una gran importancia económica en la agricultura es el

empleo de herbicidas, que a su vez tienen un grave impacto ambiental. Alrededor de un

10% de la producción agrícola mundial se pierde a causa de las malas hierbas, a pesar

del uso extensivo de nuevos y cada vez más potentes herbicidas; hoy se emplean más de

100 diferentes, generalmente dañinos para el medio ambiente. La utilización de

herbicidas, tan extendida en la actualidad, tiene además el grave inconveniente de que no

son selectivos, por lo que su acción es generalizada eliminando malas hierbas pero

afectando también al rendimiento de los cultivos. Los herbicidas más utilizados son de

amplio espectro, como el glifosato y el fosfinotricin. La producción de plantas transgénicas

resistentes a herbicidas es relativamente sencilla debido a que se conocen las dianas de

acción de los herbicidas y, generalmente, corresponden a una única enzima, con lo cuál

un único gen es responsable de conferir resistencia.

102


Un herbicida muy conocido es el glifosato (N-fosfonometil glicina), el cual bloquea la vía

de la biosíntesis de aminoácidos aromáticos por inhibición de la actividad de la enzima 5-

enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintetasa. Para que el herbicida pueda ser usado sin

afectar el cultivo es necesario modificar el genoma de la planta, esto se consigue por

medio de la introducción del gen EPSP sintetasa bacteriano (Aerobacter aerogenes) que

codifica para una enzima que inhibe la acción del herbicida. También por introducción en

la planta de un gen Aro de Salmonella typhimurium que codifica para la enzima EPSP

sintetasa bajo el control del promotor CaMV35S, la inhibición del efecto del herbicida se

debe a una sobreproducción de la enzima.

Incremento del valor nutricional de los alimentos

Se debe considerar también que por medio de las técnicas de transgénesis se pueden

abordar aspectos diferentes, como el aumento del valor nutricional modificando el

contenido de determinados elementos como por ejemplo aminoácidos esenciales o

vitaminas. Los ácidos grasos son el componente mayoritario de los aceites vegetales,

aproximadamente un 75% procede de las semillas de soya, palma y girasol y la gran

mayoría se destina al consumo humano. Uno de los objetivos es modificar el grado de

insaturación de estos aceites para hacerlos más saludables. La empresa Calgene ya tiene

patentadas plantas trangénicas que producen aceites ricos en ácido esteárico, un ácido

graso saturado.

Las vitaminas también representan una de las carencias nutricionales más graves en los países subdesarrollados. Un ejemplo reciente ha sido la obtención de ―arroz

dorado‖ (golden rice) que expresa -caroteno, un precursor de la vitamina A que se acumula en el endospermo del grano. Esta variedad fue desarrollada por Ingo Potrykus del Instituto de Biotecnología de Suiza, con la colaboración de Peter Beyer y Salin Al-Babili de la Universidad de Freifurg. Este grupo introdujo en el endospermo del arroz tres genes que codifican para enzimas que intervienen en la

biosíntesis de -caroteno. Esta variedad transgénica puede contribuir a disminuir de forma notable las enfermedades relacionadas con la carencia de vitamina A en los países donde este problema es endémico debido a la dieta pobre y poco variada. También se han obtenido plantas transgénicas como la papa con modificaciones en la composición de carbohidratos con miras a la producción de tubérculos con un elevado contenido de almidón y reducción de la amilosis.

Otros metabolitos de interés alimentario, químico y farmacéutico.

El incremento de la cantidad de azucares, presentes en ciertos órganos o tejidos, es un

objetivo deseable en la mejora de la calidad de frutas, hortalizas y cereales. Se están

realizando esfuerzos para aumentar la cantidad de sacarosa de la patata, de fructanos en

la achicoria y de amilopectina en el trigo mediante tecnología antisentido. También se

103


están desarrollando variedades de tomate con alto contenido en sólidos y alta viscosidad

en el fruto, consecuencia de la acumulación de pectina. La introducción del gen de una

proteína de sabor dulce, llamada monelina, es útil en la obtención de nuevas variedades

de tomate y lechuga con mejor sabor.

Las plantas son una fuente tradicional de materiales monoméricos y poliméricos, por

ejemplo azucares, ácidos grasos, almidones, celulosas, caucho y ceras. En la búsqueda

de nuevos materiales biológicos renovables la ingeniería genética de plantas puede jugar

un importante papel.

La composición del almidón en patatas, maíz y trigo también esta siendo modificada con

el fin de que pueda ser utilizado en la industria papelera o en la fabricación de plásticos

biodegradables. La presencia y expresión del gen de manitol- deshidrogenasa de

Escherichia coli incrementa la concentración de manitol en plantas transgénicas de

tabaco. La introducción del gen bacteriano de la clodextrin-glucosil transferasa en la

patata produce niveles bajos, pero detectables, de ciclodextrinas en tubérculos.

Recientemente se han obtenido plantas transgénicas que expresan acetoacetil-CoA

sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa que cataliza dos pasos en la producción de poli-

beta-hidroxibutirato, un polímetro termoplástico biodegradable.

También se esta ensayando la expresión de esterasas de plantas tropicales en cultivos de

zonas templadas como soya y colza, los cuales podrían producir ácidos grasos de 12

carbonos.

Se ha conseguido la producción correcta de inmunoglobulinas gamma y kappa, y el

ensamblaje de anticuerpos funcionales de forma muy eficiente en hojas de plantas de

tabaco, obtenidas a partir del cruce entre plantas transgenicas que expresaban el gen de

una sola cadena de inmunoglubina.

La producción de compuestos farmacéuticos como encefalinas en soya y seroalbumina

humana en patata, permite prever que otras proteínas como neuropeptidos, factores de

coagulación sanguínea y hormonas del crecimiento puedan ser producidas en semillas y

en otros órganos de la planta de forma rentable.

104


105


CAPITULO 6 BIOTECNOLOGÍA ANIMAL

Introducción

En este capítulo los alumnos se iniciarán en un conjunto de tecnologías que permiten aprovechar o modificar el potencial de las células animales para la obtención de OGMs.

Lección 26. Métodos de obtención de animales trangénicos I

Actualmente la biotecnología es utilizada en la obtención de diferentes modelos animales:

1. Animales knockout, donde ocurre la retirada integral o parcial de un gen. 2. Animales knockin, en los cuales ocurre la introducción integral o parcial de un gen

perteneciente al organismo. 3. Animales transgénicos, donde ocurre la introducción integral o parcial de un gen

no existente en el organismo.

Un animal transgénico es aquel al que se ha introducido un gen exógeno a fin de mejorar o cambiar caracteres existentes o introducir nuevos y que es capaz de transmitirlos a su descendencia.

Igual que en las plantas el hombre por métodos tradicionales de selección ha producido

nuevas combinaciones de genes en los animales. No en tanto este numero de nuevas

combinaciones es limitado pues solamente envuelve genes de la misma especie o de

especies muy próximas.

Desde que en 1982 el Dr. Palmiter en la revista Nature, ofreció la imagen del primer ratón

transgénico que conmocionó al mundo científico los estudios sobre este tema han sido

muy numerosos. Los resultados exitosos han sido logrados en una frecuencia mucho

menor en comparación con las plantas, posiblemente debido a la mayor complejidad de

las funciones biológicas y al manejo de células animales in vitro o in vivo, así como a la

identificación de genes candidatos a ser transferidos.

Las aplicaciones de los animales transgénicos comprenden principalmente dos áreas, la investigación básica y médica (donde el animal de elección debido al costo económico y tiempo es el ratón) y la producción y sanidad animal (especies domésticas).

106


El conocimiento de la localización exacta de un gen y sus efectos fisiológicos, permite

aislarlo y transferirlo a animales de otra especie o de la misma, para mejorar su respuesta

productiva. Como ejemplo podemos citar los salmones ―coho‖, producido por AF Protein

Inc, donde se aisló y transfirió el gen responsable de la síntesis de la hormona del

crecimiento. Cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie

de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% de

mejoramiento en la eficiencia de conversión del alimento.

Cabe señalar no obstante, que la identificación de genes mediante marcadores genéticos

es un trabajo laborioso y muy lento, por lo que el uso de esta técnica progresa lentamente

en el campo del mejoramiento genético. Por otra parte, debe ser considerada como una

estrategia complementaria a los métodos de reproducción y mejoramiento genético

aplicados tradicionalmente, ya que estos logran progresos constantes en el tiempo.

Los métodos de obtención de animales transgénicos son muy variados. Podemos definir

las etapas comunes entre ellos. Comenzamos por elegir el gen de interés para luego

aislarlo de células normales y clonarlo, debemos tener un conocimiento completo del

mismo, tanto de su parte estructural, el producto que expresará, como de su parte

reguladora, cómo, dónde y cuando se expresará. A pesar de los grandes avances

científicos, todavía hoy son necesarios más estudios a nivel básico para poder llegar a

entender como funcionan los diferentes genes y sus reguladores.

Posteriormente, purificar el fragmento deseado o insertarlo en un vector para introducirlo en el interior de las células receptivas. Una vez en el interior, hay que conseguir que el gen actúe correctamente, es decir, en puntos no dañinos de inserción y que se exprese y de lugar al producto génico deseado. Por último, estos genes introducidos deben transmitirse en cada generación celular y por supuesto a la descendencia.

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

107


Construcción del transgén

Como ya ha sido mencionado, el transgén es compuesto por el gen de interés y por una

secuencia de ADN que regula correctamente la función del gen en el nuevo organismo.

Este transgén ya puede ser inserido. Sin embargo, hay numerosos genes que solo se

expresan en determinados tejidos y que son regulados por una secuencia específica de

ADN (el promotor). Cuando se construye un transgén, generalmente se sustituye el

promotor del donador por una secuencia especialmente concebida para que el gen

funcione en los tejidos del organismo que lo recibe. Además del promotor y del gen de

interés es necesaria la inserción de una secuencia poly A para que el gen funcione

correctamente.

Generalmente, en animales, el transgén, se introduce en el cigoto, los embriones que lo hayan integrado en su genoma, antes de la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos).

Inserción del transgén

Espermatozoides vectores: La utilización de espermatozoides en solución de ADN como vehículo de genes al interior de los óvulos ha permitido obtener animales transgénicos. Se han realizado varias experiencias, que han sido evaluadas en pollos, peces, bovinos y porcinos, con resultados pobres traducidos en tasas de transgénesis bajas y donde los transgénes han sufrido modificaciones severas en su estructura (secuencia de bases específica para la síntesis de la proteína). No obstante, esta técnica ha dado buenos resultados en ovinos, con mayores rendimientos en la cantidad de embriones transgénicos obtenidos y sin modificaciones aparentes en la estructura de los genes.

Experiencias recientes sugieren nuevas estrategias en el uso de espermios y sus

precursores (espermátidas). Se ha demostrado que las células precursoras de

espermatozoides aisladas desde testículos de ratón pueden finalizar su maduración en

testículos de otros individuos de la misma especie y lograr funcionalidad completa. Por

otra parte, ha sido posible realizar una fecundación exitosa in vitro inyectando

espermátidas en el citoplasma de ovocitos (óvulos). Estas experiencias apuntan a nuevas

estrategias en el uso de espermatozoides y sus precursores para la creación de animales

transgénicos,

Microinyección de ADN: La técnica de transferencia de genes más utilizada en mamíferos y que ha sido más exitosa es la microinyección directa de "ADN desnudo" en los pronúcleos del óvulo recién fecundado, o en el citoplasma en el caso de vertebrados inferiores e invertebrados. Primero se induce en las hembras

108


una superovulación. Luego de fecundados los óvulos por fertilización in vitro se recogen para inyectar pequeñas cantidades de ADN en el pronúcleo masculino, para la realización de la técnica se coloca el embrión en caja de petri con medio especial, bajo microscopio invertido y con la ayuda de dos micropipetas (una con extremos redondeados para sujetar el embrión y otra con el extremo afilado) se podrá inyectar una pequeña solución que contiene múltiples copias del transgén.

Tomado de: Animales Transgénicos. Dra. Rosario Osta Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos. Facultad de Veterinariamailto:[email protected]

Universidad de Zaragoza

Los embriones pueden tolerar la microinyección de genes, posteriormente ser cultivados in vitro hasta un estado de desarrollo más avanzado (blastocisto) y ser transferidos en las hembras adoptivas. Con esta técnica solo se puede adicionar genes y no suprimir la acción de uno de ellos. Los animales transgénicos obtenidos son designados de fundadores, estos pueden ser cruzados con animales no transgénicos y generar heterocigotos. Los heterocigotos pueden ser cruzados entre si y generar animales homocigotos para el gen en estudio.

Los primeros individuos transgénicos obtenidos mediante este método fueron

ratones. La eficiencia inicial obtenida fue de 2 % de integración génica obtenida en

el total de embriones tratados, la que posteriormente ha aumentado a niveles

sobre el 30%. Sin embargo la eficiencia es menor en vacunos, ovinos, conejos y

cerdos. Esta situación debe ser mejorada con el tiempo mediante el

perfeccionamiento de la técnica.

mailto:[email protected]

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Vectores virales: Utilizando el alto poder de infección de algunos virus (por

ejemplo, los adenovirus), éstos pueden actuar como vectores al introducir genes

dentro de embriones. Esta estrategia ha sido probada con resultados interesantes

principalmente en ratón y aves. En el futuro podría constituir una alternativa

interesante en animales domésticos. Sin embrago como en el caso anterior el gen

es insertado aleatoriamente en el genoma, produciendo descendientes mosaicos,

y para obtener una línea pura sería necesaria una selección.

Lección 27. Métodos de obtención de animales trangénicos II

Transgénesis por manipulación de células embrionarias: A pesar de que hasta el momento la mayoría de los animales transgénicos han sido desarrollados mediante la tecnología en la que el gen exógeno es introducido en el genoma al azar, esto deriva en numerosos inconvenientes por el escaso control sobre la inserción del mismo. Así, pueden insertarse más de una copia y/o en zonas del genoma que no permitan la expresión del mismo y/o en genes que sean cruciales para la vida del embrión. Ante estos problemas resulta de gran interés el adquirir una metodología que permita controlar con mayor exactitud el lugar de integración del transgén.

Esta estrategia esta siendo utilizada cuando es introducido el ADN en células embrionarias totipotentes (células ES) o células embrionarias madres (células EM). Las células ES son derivadas de la masa celular interna o botón embrionario del blastocisto en el día 5 post-fertilización, de allí son seleccionadas, y colocadas en un medio que permitirá que las células no se diferencien, manteniéndose su estado embrionario.

Cuando las células están en cultivo es posible utilizando vectores apropiados realizar modificaciones genéticas específicas como retirar o sustituir un determinado gen o modificar solamente una base del código genético. El ADN se introduce en las células ES, posteriormente estas células transfectadas son reintroducidas en una blástula y ésta es reimplantada en una hembra. Con esta técnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de éstas se consiguen animales transgénicos con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su línea germinal.

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Tomado de: Animales Transgénicos. Dra. Rosario Osta Laboratorio de Genética Bioquímica y Grupos Sanguíneos. Facultad de Veterinariamailto:[email protected]

Universidad de Zaragoza.

Estos ratones presentarán dos tipos diferentes de células; aquellas que corresponden al genoma del ratón original microinyectado, así como las células derivadas de las células stem embrionarias manipuladas, que llevan el gen modificado integrado en su genoma. El esperma u óvulo presente en los ratones quiméricos, si provienen de las células microinyectadas en el blastocisto, portará los genes alterados. Cuando estos animales se cruzan con animales sanos, heredarán una copia del cromosoma que lleva la mutación y que proviene de la célula stem embrionaria microinyectada, formando así animales mutados heterocigotos. Es necesario que estos animales heterocigotos se crucen entre sí para obtener ratones que tengan dos copias del gen mutado, formando así, animales homocigotos knock-out. Estos animales presentan una ausencia completa del gen normal.

mailto:[email protected]

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Foto del primer ratón quimérico producido en la Universidad de Sao Paulo. Tomado

de www.geneticaplicada.com.br/transgénicos.html

La posibilidad de modificar el genoma a partir de la introducción, inactivación, retiro o

reemplazo de genes en un animal, ofrece posibilidades sin precedente tanto a nivel de

investigación como a nivel productivo.

Los animales transgénicos se han vuelto instrumentos muy útiles para estudiar el

funcionamiento de los genes y los mecanismos que gobiernan o controlan las funciones

biológicas. Los institutos de investigación hoy en día están siendo fuertemente requeridos

por la industria farmacéutica para obtener modelos animales destinados a realizar

estudios biomédicos, fabricar "proteínas recombinantes" para distintos usos, y para

intentar modificar órganos especialmente de cerdo destinados a trasplantes o injertos en

el hombre.

En la actualidad la investigación en transgénesis aplicada a la producción animal esta

siendo abordada en tres temas principales: a) modificación de la calidad de la leche a

través de incorporación de proteínas foráneas, b) mejoramiento de respuesta inmunitaria

a ciertas enfermedades, y c) el mejoramiento de ciertas funciones biológicas de

importancia (por ejemplo, la reproducción y el crecimiento muscular). Sin embargo, cabe

señalar que muchas de estas investigaciones están en su fase inicial, donde los

resultados obtenidos se han probado esencialmente con animales en condiciones de

laboratorio.

Cabe señalar que hay un gran interés por los animales acuáticos y existen varios grupos

en diferentes países desarrollando investigaciones con estos organismos.

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Lección 28. Aplicaciones de los animales transgénicos

Aplicaciones en control de enfermedades

El control de enfermedades en producción animal se ha realizado tradicionalmente

mediante erradicación, vacunación y selección genética. El uso de algunas técnicas de

ingeniería genética aplicada, tales como las vacunaciones tradicionales y la vacunación

directa con ADN desnudo, parecen ser alternativas interesantes.

Vacunación con ADN desnudo: La microinyección de ADN en solución a tejidos

animales tiene como objetivo inducir la formación directa de anticuerpos específicos para

cierto patógeno. Algunas experiencias se han realizado sólo en animales de laboratorio, y

deben solucionarse algunos problemas tales como la estandarización de la técnica y la

localización precisa del ADN en los tejidos de interés, ya que la contaminación de tejidos

destinados al consumo humano podría causar efectos negativos no controlados en el

consumidor y disminuir, por lo tanto la calidad y valor del producto comercializado.

Producción de proteínas terapéuticas: El desarrollo de animales genéticamente

modificados es crucial en este campo ya que muchas proteínas requieren modificaciones

complejas que solo ocurre en las células de un animal más complejo (no ocurre en

JOSÉ ROBERTO ALEGRÍA COTO. CONACYT

113


bacterias, levaduras o plantas). La producción de proteínas de interés farmacéutico a

partir de individuos transgénicos, es una alternativa interesante para esta industria, ya que

se requieren sólo unos pocos animales para tales efectos y cuyo costo de producción se

estima es cerca de cincuenta veces menor que los métodos clásicos de producción de

tales compuestos. Cerca de 50 proteínas foráneas para uso humano, tales como del tipo

caseína, lactoalbúminas y de proteínas que participan en la coagulación sanguínea, entre

otras, se han producido a partir de la leche de conejos, cerdas y cabras transgénicas. Sin

embargo, aun no han sido comercializadas porque no son completamente funcionales y

se espera que el mayor perfeccionamiento de las técnicas de transgénesis

aplicadas a distintas especies permita que esta estrategia de producción sea una

realidad para la industria farmacéutica.

Los animales transgénicos que se emplean para producir proteínas terapéuticas, debe contener en el ADN extraño de sus células, además del gen codificante de la proteína, una secuencia o promotor que haga que se exprese dicho gen en unas determinadas células solamente. Por ejemplo, si se quiere que la proteína se produzca junto con la leche, el transgén se fusiona con una secuencia reguladora de una proteína de la leche, con lo que la proteína sólo se formará en las células de glándulas mamarias.

Xenotrasplantes: Las técnicas de transgénesis se están usando para alterar la

composición genética de cerdos de forma a que las proteínas de superficie de sus

órganos, sean menos susceptibles de provocar reacciones inmunológicas en los

humanos. Ya se crearon cerdos con estas modificaciones en su genoma y se han

trasplantado sus órganos a monos, sin ser registrado el rechazo de estos órganos. Un

linaje de cerdos transgénicos, cerdos P33, fue desarrollado con suceso observándose una

alta tasa de compatibilidad con seres humanos. Fue introducido el gen que permite la

síntesis de una enzima que inhibe la acción de la galactosa proteína clave en el proceso

de rechazo.

En enfermedades degenerativas del sistema nervioso, el trasplante de neuronas fetales

de cerdos representa una terapia en potencia. Cerdos transgénicos que expresan una

molécula humana que inhibe las células T inmunosupresoras fueron creados. Neuronas

de embriones que secretan la molécula in vitro fueron trasplantadas en ratones y hubo

reducción del 50% en la respuesta proliferativa, estos datos muestran que neuronas de

cerdos pueden ser usadas para ensayos pre-clínicos en xenotrasplantes.

A pesar de las buenas perspectivas del xenotrasplante, la utilización del método todavía

necesita ser evaluada con cautela. Existe la posibilidad de que los tejidos trasplantados

lleven algún tipo de microorganismo latente que, una vez introducido en el organismo

receptor, origine una infección. La técnica también suscita innumerosos aspectos éticos

que deben ser todavía discutidos.

114


Pecuaria e Industria

Hasta hace poco los pecuaristas disponían de pocos métodos para producir animales con

características físicas deseadas. Para aumentar la producción de leche o acelerar el

crecimiento, se utilizaba el cruzamiento selectivo o las hormonas del crecimiento. Sin

embrago, el cruzamiento selectivo es extremadamente lento y dispendioso, además de

ser un proceso que no garantiza los resultados deseados, y el uso de hormonas de

crecimiento es altamente criticado, una vez que deja residuos en el producto animal

consumido por el hombre. Las nuevas técnicas de biología molecular han hecho posible la

introducción de características deseadas en el animal, en menos tiempo y con más

precisión. Como ejemplo podemos citar el desarrollo de vacas transgénicas que producen

mas leche, o leche con menos lactosa, o con menos colesterol; cerdos y bovinos que

producen mas carne; ovejas con más lana. También se están desarrollando experimentos

que intentan obtener cerdos y otras especies resistentes a enfermedades como la

influenza, sin embrago se conocen pocos genes que confieren resistencia a

enfermedades en animales domésticos.

Otra importante aplicación de la transgénesis animal es la producción de animales conocidos como bio-reactores. Estos son generalmente animales domésticos de grande y mediano porte, utilizados para la producción de proteínas recombinantes humanas de interés biológico y comercial, como enzimas, hormonas y factores de crecimiento. En general la proteína de interés se expresa en la leche del animal.

Modificación de la leche para consumo humano.

La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los países. Por esta razón,

la lactancia ha sido desde largo tiempo objeto de diversos estudios en el campo de

genética, fisiología, nutrición y aspectos de patología, que en su conjunto tienden a

aumentar la producción y calidad de la leche. En los últimos años el perfeccionamiento de

las técnicas de ingeniería genética ha permitido aislar los genes de las principales

proteínas de la leche de animales domésticos, lo que abre perspectivas importantes en

producción de leche. El conocimiento detallado de los genes de las proteínas lácteas

permitirá de hoy en adelante una selección precisa y relativamente simple de los alelos

que sean más interesantes. La posibilidad de reproducir una proteína foránea en la leche

ha conducido ya a la generación de proyectos que están en marcha en temas tales como

la modificación de los compuestos naturales de la leche, adición de nuevos compuestos

en la leche destinada a consumo humano o animal, y producción de proteínas de interés

farmacéutico.

La supresión de la síntesis de lactosa de la leche es de gran interés para un segmento

importante de la población que es intolerante a este monosacárido, sin embargo, hasta la

fecha sólo se ha logrado en ratones. Un aumento en la secreción de proteínas del tipo de

115


las caseínas sería una condición deseable en la leche para mejorar la elaboración y

rendimiento de quesos a nivel industrial. En este sentido, ya ha sido posible aumentar su

producción en leche de conejo y reproducir las caseínas de vaca y cabras en ratones.

La lactoferrina es una proteína capaz de captar hierro. Por tal condición constituye una

fuente importante de este metal para los lactantes, como también realiza un control

bacteriano importante a nivel de la glándula mamaria. La incorporación de la proteína

lactoferrina humana ya ha sido obtenida en leche de vacas transgénicas, y también ha

sido posible clonarla exitosamente en conejos. Su inclusión en la leche de vacunos y

cerdos podría bajar los aportes de hierro en la dieta como de reducir la incidencia de

mastitis.

Hay también investigaciones en curso para obtener leche transgénica que contenga las

proteínas necesarias para tratamientos de enfermedades como fenilcetonuria, enfisema

hereditario y fibrosis quística.

Lección 29. Algunos ejemplos de animales transgénicos

La oveja Tracy: Fue la primera oveja que en 1992, produjo una proteína humana, la alfa-antitripsina bajo la dirección del promotor ovino de la beta-lactoglobulina. Dicha proteína se produce en una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.

La famosa cerda Genie: Fabricaba en su leche la proteina C humana que controla la coagulación sanguínea y es necesaria para los pacientes con hemofilia.

La vaca Rosie: El primer bovino transgénico (1997) producía leche enriquecida con la proteína humana lactoalbumina. Esta leche transgénica es mas nutritiva para humanos que la leche natural y puede ser introducida en la alimentación de niños con carencia de nutrientes específicos.

Las ovejas Polly y Molly: Anteriormente las habíamos citado, fueron clonadas a partir de

fibroblastos embrionarios modificados por ingeniería genética. Estas ovejas poseen un

gen humano responsable por la síntesis del factor IX de la coagulación sanguínea, Esta

proteína es segregada en la leche de estas ovejas y después es purificada para ser

utilizada en pacientes hemofílicos.

116


Imagen de Polly. Tomado de: www.geneticaplicada.com.br/transgenicos.html

El cerdo dietético (espinacas en el cerdo): Investigadores de la Universidad de Kinki

(Japón) después de haber insertado el gen de la espinaca denominado FAD2 en un

cerdo, constataron que este tenía 20% menos de grasa saturada comparada con los

cerdos tradicionales. Las grasas saturadas están relacionadas con la producción de

colesterol y enfermedades cardiovasculares.

La supergallina: Esta gallina fue desarrollada por un grupo de investigadores de la

empresa americana MetaMorphix de Baltimore. Es una nueva variedad que fue

genéticamente modificada para ganar más masa muscular. Aunque parezca igual a las

otras es 45% más pesada.

Mono transgénico: El primer primate genéticamente modificado tiene por nombre ANDi

(inserted DNA, al contrario) y fue creado por un grupo de investigadores del Centro

Regional de investigación sobre primates de Oregon en los Estados Unidos, en enero de

2001, posee un gen (GFP green fluorescent protein) de un animal marino (medusa)

insertado en su ADN. El gen codifica una proteína verde fluorescente. Aunque ANDi

posee el gen GFP, cuando es observado con luz especial no presenta fluorescencia. Los

científicos piensan que el gen todavía no esta activado o la proteína no es producida en

cantidades suficientes. El gran impacto que tuvo este experimento fue el de demostrar

que es posible realizar estos procedimientos en animales próximos a la especie humana.

http://www.geneticaplicada.com.br/transgenicos.html

117


Tomado de: www.portalplanetasedna.com.ar

Ratón Fluorescente: Otro grupo de científicos de la Universidad de Hawai en Honolulu

obtuvo ratones que exhiben un brillo verde cuando son colocados bajo luz ultravioleta. El

trabajo publicado en la Revista Science provocó una irresistible pregunta ¿Cuál es la

utilidad de una investigación de estas? Por increíble que parezca la técnica podrá

colaborar para la producción en animales de órganos humanos para trasplante. En este

caso el grupo de investigación desarrolló una técnica para generar mamíferos

transgénicos por medio de alteraciones en los espermatozoides, antes de la fecundación.

Con tratamientos químicos se produjo lesiones en la membrana que reviste la cabeza de

los espermatozoides de los ratones y colocaron dentro de ellos ADN retirado de una

medusa (agua-viva). El gen es responsable por la producción de la proteína fluorescente

que brilla cuando recibe luz ultravioleta. Los espermatozoides alterados fueron

introducidos con una pipeta en los óvulos extraídos de las ratas dando origen a los

embriones; como se puede observar esta transformación se hace antes de la fecundación

y no como en el método tradicional que la inyección se hace en los pronúcleos del óvulo

recién fecundado.

Tomado de: www.unesco.org

118


Cerdos ricos en Omega-3: Un equipo de científicos de la Universidad de Pittsburg, crea

cerdos transgénicos que producen ácidos grasos insaturados considerados como

benéficos para la salud, los llamados Omega-3. Los autores del estudio publicado en la

revista Nature Biotechnology, concluyen que si la carne de estos cerdos fuese autorizada

para el consumo humano, podría ser una fuente de Omega-3, más saludable que el

salmón y el atún que tienen el inconveniente de contener altas tasas de mercurio. Para

obtener estos animales, los investigadores transfirieron para el núcleo de células fetales

un gen llamado FAT-L, responsable por la producción de una enzima que transforma en

Omega-3 los ácidos grasos menos benéficos. El núcleo de aquellas células fetales fue

después sustituido por el de óvulos fecundados, según el método clásico de clonación de

animales iniciado en 1966 con la oveja Dolly.

Cerdos ricos en Omega-3. Tomado de www.terra.com.br/istoe/1902/fotos/genetica

Ratones transgénicos para el estudio del Síndrome de Marfan : Investigadores del Instituto de Biociencias y de la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Sao Paulo en Brasil, desarrollaron ratones con mutaciones en un gen relacionado con el Síndrome de Marfan. El equipo produjo una mutación en células madre embrionarias de ratón. Estas células fueron cultivadas en el laboratorio del Instituto de Biociencias. Dentro de ellas y a través de choque eléctrico fue introducido el gen mutado de la fibrilina. La célula modificada fue introducida en el embrión, que posteriormente fue implantado en el útero de una hembra. Esta hembra genero varios hijos (quimeras). Los espermatozoides de las quimeras presentaban la mutación del gen de la fibrilina y el ratón al reproducirse transmitió la mutación para sus hijos. El Síndrome de Marfan, provoca problemas en las áreas esqueléticas (crecimiento excesivo de los miembros, escoliosis, deformidades en la región del tórax), oculares y cardiovasculares (prolapso de la válvula mitral). Los ratones transgénicos presentan la misma mutación de quien es portador del síndrome, con esto, ahora es posible acompañar el progreso de la enfermedad e intentar nuevas terapias y drogas.

http://www.terra.com.br/istoe/1902/fotos/genetica

119


Ratón transgénico para el estudio del Síndrome de Marfan. Tomado de www.terra.com.br/istoe/1902/fotos/genetica

Lección 30. Implicaciones biológicas, comerciales y de bioseguridad de los OGMs.

Cuando la ingeniería genética comenzó en los Estados Unidos a finales de la década del

70, había un grupo pequeño de investigación dominando esta tecnología y apenas nueve

compañías que trabajaban en esta área. Veinte años después en los Estados Unidos se

desarrollaba una industria que ultrapasaba mil empresas con un movimiento financiero

anual del orden de diez billones de dólares principalmente en el área de la salud humana.

Cerca del 70% de estas empresas se establecieron próximas a los principales centros

científicos del país: California (costa oeste), Boston, New York, Washington. Las primeras

plantas transgénicas comenzaron a ser liberadas en el campo a finales de la década del

80. En la actualidad ya fueron autorizados más de 25000 ensayos de campo con plantas

transgénicas en los Estados Unidos, Canadá y Europa. En América Latina, Argentina y

México están a la vanguardia de esta tecnología, seguidos por Brasil, donde ya se han

realizado más de 800 ensayos de campo. La comercialización de las plantas transgénicas

comenzó a mediados de la década del 90 con el tomate genéticamente modificado para

maduración lenta del que ya nos hemos referido, producido por la empresa Calgene y la

soya resistente al herbicida Round-Up de la empresa Monsanto. Actualmente algunas

especies de plantas transgénicas como soya, maíz y algodón ya tienen una participación

relevante en la agricultura de los Estados Unidos, Canadá y Argentina. La soya

transgénica tolerante al glifosato ya ocupa 54% y 100% del área cultivada con soya en

Estados Unidos y Argentina respectivamente. El área cultivada con plantas transgénicas

aumentó a nivel mundial de 12.8 millones de hectáreas en 1997 para cerca de 40 millones

en 1999. La mayoría de las plantas transgénicas fueron obtenidas por empresas privadas

120


que ya operan en América Latina como Monsanto, Novartis, Aventis, Dupont, Cargill,

entre otras.


121


El desarrollo de la ingeniería genética y su aplicación en la agropecuaria creó conflictos

de interés que sitúan de un lado países donde esta tecnología se desarrolló rápidamente

como en los Estados Unidos y de otro lado países donde no se desarrolló y que han

creado obstáculos para su uso comercial, como varios países europeos.

Preocupaciones referentes a bioseguridad y bioética, con respecto tanto al ejercicio de

esta actividad en el laboratorio, cuanto a los potenciales daños ecológicos resultantes de

la liberación en el ambiente de organismos transgénicos, han estado presentes desde la

introducción de esta tecnología. En 1973, la comunidad científica propuso al gobierno

americano una moratoria en cuanto al uso por la ingeniería genética de organismos

altamente patógenos al hombre y plateó la creación de un grupo de notables científicos

para analizar y asesorar al gobierno americano sobre las posibles consecuencias de la

denominada tecnología del ADN recombinante. Esta situación solamente fue superada en

1975 cuando en la conferencia de Asilomar, en San Diego California, el ―Nacional Institute

of Health/NIH‖, atendiendo a la solicitud de la Academia Nacional de Ciencias de los

Estados unidos elaboró e hizo aprobar unas guías de bioseguridad para la utilización de la

ingeniería genética en el laboratorio.


122


Estas directrices fueron rápidamente adoptadas en todo el mundo, garantizando la

seguridad en el laboratorio. Paralelamente otras entidades en diversos países

establecieron mecanismos que permiten evaluar satisfactoriamente el riesgo potencial

que estos organismos pueden tener al ser liberados en el ambiente. Con base en estas

guidelines, varios países establecieron normas de bioseguridad, a través de legislaciones

e infraestructura institucional específicas, para regular el uso de la ingeniería genética y la

liberación en el medio ambiente de OGM.

Existe una fuerte reacción de la sociedad, principalmente en Europa, a respecto del uso

para consumo humano de los OGMs y sus derivados y también de sus efectos

potenciales y a largo plazo en el ambiente. Esta reacción resulta de fuertes campañas

desarrolladas en contra, que podrían beneficiar de alguna manera a las empresas

fabricantes de agroquímicos que buscan defender mercados ya establecidos y

consolidados desde la década del 50, auque en algunos casos las compañías productoras

de agroquímicos son también las dueñas de las patentes de los OGMs. Por esto es

necesario diferenciar preocupaciones genuinas por los efectos de estas plantas en el

ambiente, de iniciativas que a través de esta fachada ecológica pretenden defender

posiciones de mercado.

Una de las preocupaciones más relevantes es la transferencia de genes de plantas

transgénicas para otras especies relacionadas desde el punto de vista evolutivo, dando

origen a lo que se denomina super weed (de súper-mala hierba resistente a los

herbicidas). Aunque esto nunca ha ocurrido, no significa que se debe ignorar esta

posibilidad. La transferencia horizontal de genes, que puede ocurrir naturalmente entre

especies no asociadas, es posible, pero es preciso que sea analizada con probabilidades

estadísticas y con evidencia científica de buena calidad. Las especies tienen mecanismos

desarrollados a lo largo de centenas de millones de años que ―vigilan‖ su genoma a nivel

molecular de modo a minimizar la posibilidad de que genes extraños sean introducidos en

su patrimonio genético. La simple transferencia de un gen de un transgénico para una

especie silvestre no significa, necesariamente, que el resultado será un super weed.

Sobre las consecuencias que los transgénicos pueden causar al medio ambiente, es

prematuro hacer afirmaciones sobre este tema, una vez que todavía no existen datos

consistentes sobre el impacto que pueden causar. Se dice que entre las posibilidades del

uso irresponsable de estos organismos, esta el empobrecimiento de la biodiversidad, en

la medida en que plantas modificadas genéticamente pueden interactuar en el medio

ambiente con las variedades naturales, la eliminación de insectos y microorganismos

benéficos al equilibrio ecológico, el aumento de la contaminación de los suelos y los ríos,

debido al uso intensificado de agrotóxicos y el desarrollo de plantas y animales resistentes

a una amplia gama de antibióticos y agrotóxicos. En el caso de que algunas de estas

consecuencias negativas de la ingeniería genética ocurran, será talvez imposible

controlarlas, pues a diferencia de otros contaminantes químicos, los OGMs por ser

formas vivas, son capaces de sufrir mutaciones, multiplicarse y diseminarse en el medio

ambiente.

123


Dos casos han tenido un gran impacto en la opinión pública y merecen especial análisis.

El primero corresponde a la patata transgénica del Dr. Pusztai que expresa el gen que

codifica una lectina, proteína de las leguminosas,

(www.cabipublishing.org/Bookshop/ReadingRoom/0851996078.asp); el segundo caso es

el relativo al efecto de la toxina de Bt en lepidopteros (mariposa monarca)

(http://cls.casa.colostate.edu/CultivosTransgenicos/sp_hotmonarch.html). El primer caso

tuvo una repercusión en los medios de comunicación absolutamente incompatible, según

algunos detractores, con la calidad de la experiencia científica que después fue

desmentida por la Academia de Ciencias de Inglaterra. El segundo caso, relata una

experiencia preliminar delineada en condiciones de laboratorio que no corresponden a las

condiciones naturales de una plantación de maíz y demuestra, que una toxina letal para

lepidopteros, cuya expresión ocurre en el polen por que es comandada por un promotor

constitutivo, fue letal para las mariposas. La calidad científica de estos experimentos es

cuestionable por muchos científicos, pero el efecto en la sociedad provocado por el

tratamiento dado por los medios de comunicación fue una masacre para la biotecnología

en varios países particularmente en Europa y en América Latina principalmente en Brasil.

Las consecuencias fueron funestas en Europa, las cadenas de supermercado anunciaron

que no comercializarían más productos transgénicos, después de la experiencia del Dr.

Pusztai con la patata. Experimentos con transgénicos fueron literalmente destruidos en

Bélgica y en Inglaterra. Países como Francia, Austria y Luxemburgo, pidieron moratoria

de productos transgénicos y pasaron a rechazar los OGMs ya aprobados para la

comercialización por la Unión Europea.

Los riesgos a la salud animal y humana de la alimentación con productos genéticamente

modificados, son imprevisibles, aunque se señala que ya se han detectado algunos casos

de alergia por su consumo. Sin embrago, todavía no existe un grupo de monitoreo para

este tipo de procedimiento. Es necesario adoptar una política de precaución e investigar

mucho más para conocer los riesgos y posibles beneficios de estos alimentos.

El desarrollo de los transgénicos y sus consecuencias en la salud humana, animal y en el

medio ambiente esta todavía en su fase que podríamos llamar inicial, lo que hace difícil

cualquier conclusión definitiva en el momento.

Organismos Genéticamente Modificados en Colombia

En Colombia se cuenta con una regulación de los OGMs de interés agropecuario, la

Resolución No. 3492 del 22 de diciembre de 1998, del Instituto Colombiano Agropecuario,

ICA, "por la cual se reglamenta y se establece el procedimiento para la introducción,

producción, liberación y comercialización de organismos modificados genéticamente

(OMG) y se dictan otras disposiciones".

También existe una entidad asesora, representada por el poder ejecutivo nacional, la

comunidad científica, el sector empresarial, las entidades de salud y los usuarios

campesinos, denominada Consejo Técnico Nacional (CTN) de Bioseguridad Agrícola

http://www.cabipublishing.org/Bookshop/ReadingRoom/0851996078.asp

http://cls.casa.colostate.edu/CultivosTransgenicos/sp_hotmonarch.html

124


creada por medio del Acuerdo 013 de 1998 y del Acuerdo 02 de 2002 expedidos por el

Consejo Directivo del ICA.

En el sector pecuario, se cuenta con el "Marco conceptual de bioseguridad pecuaria";

además, el ICA expidió la Resolución 2935 del 22 de octubre de 2001, "por la cual se

reglamenta y establece el procedimiento de bioseguridad para la introducción, producción,

liberación, comercialización, investigación, desarrollo biológico y control de calidad de los

Organismos Modificados Genéticamente (OMG) de interés en salud y producción

pecuaria, sus derivados y productos que los contengan".

También existe una entidad asesora que fue creada por medio del Acuerdo 04 del Con-

sejo Directivo del ICA, expedido en abril 22 de 2002, el Consejo Técnico Nacional (CTN

— Pecuario) donde están representados el poder ejecutivo nacional, la comunidad

científica, el sector empresarial, las entidades de salud y de defensa del consumidor,

igualmente incluye la representación de los gremios del sector; a manera de Ejemplo,

están Aprovet, Fenavi, Fedegan y la Asociación Colombiana de Porcicultores.

En el país, estas tecnologías están en fase de desarrollo y no existe una entidad que

centralice la información sobre estas investigaciones. El CTN no posee una base de datos

ni ejerce control sobre ellas, ya que la norma de Bioseguridad del ICA no lo contempla.

Sólo existen dos autorizaciones de siembra comercial de cultivos transgénicos: el clavel

azul (Florigene) y el algodón Bt (Monsanto). Actualmente están en trámite varias

solicitudes para liberar variedades transgénicas de algodón RR, maiz Bt Yieldgard, maíz

RR (propiedad de Monsanto) y de caña de azúcar resistente al virus del síndrome de la

hoja amarilla (Cenicaña).

125


Tomado de: Organismos Transgénicos. Hermes Salcedo R. Unitropico. 2005

http://www.unitropico.edu.co/estudiantes/documentos_electr/ORGANISMOSTRANSG%C9NICOS.ppt.

Cultivos transgénicos liberados comercialmente y solicitudes en curso en el CTN del ICA

El clavel azul transgénico pudo entrar al país de forma muy fácil, este cultivo fue

modificado genéticamente a través de la tecnología denominada ―Blue gene tecnology‖

(tecnología del gen azul) por la empresa Florigene (consorcio autraliano-holandes). La

solicitud para su liberación fue tramitada por Flores Colombianas Ltda. y la autorización

del ICA fue dada en mayo de 2000. Según el ICA, la aprobación se hizo teniendo en

cuenta que esta planta no tiene parientes silvestres en Colombia, ya que es originaria de

Europa, no es una planta alimenticia y toda su producción se destina a la exportación.

En el 2002 el CTN del ICA mediante el Acta 013, autorizó la liberación del algodón

transgénico Nucont 33B (Monsanto) que resiste a plagas de Lepidópteros por poseer el

gen Bollgard.

Como se observa en la tabla a seguir, en Colombia varias instituciones públicas y

privadas están dedicadas a la investigación con cultivos transgénicos. Las investigaciones

en algunos casos se encuentran en una etapa preliminar de caracterización y de

evaluación de la expresión de los genes utilizados, otras todavía no han logrado expresar

la transformación genética y varios casos son ensayos preliminares de laboratorio.

http://www.unitropico.edu.co/estudiantes/documentos_electr/ORGANISMOSTRANSG%C9NICOS.ppt

126


Tomado de: Organismos Transgénicos. Hermes Salcedo R. Unitropico. 2005

http://www.unitropico.edu.co/estudiantes/documentos_electr/ORGANISMOSTRANSG%C9NICOS.ppt.

http://www.unitropico.edu.co/estudiantes/documentos_electr/ORGANISMOSTRANSG%C9NICOS.ppt

127


Actividad 5. La siguiente lectura es presentada al alumno en archivo PDF. El alumno

interpretará y analizará las dudas y preocupaciones sobre el establecimiento de los

Organismos y Alimentos Genéticamente Modificados.

20 PREGUNTAS SOBRE LOS ALIMENTOS GENÉTICAMENTE

MODIFICADOS (GM)

Estas preguntas y respuestas han sido preparadas por la Organización Mundial de la

Salud (OMS) en respuesta a preguntas y preocupaciones de una cantidad de Gobiernos

de Estados Miembro de la OMS con respecto a la naturaleza y la inocuidad de los

alimentos genéticamente modificados.

Este texto es fiel copia del original.

P1. ¿Qué son los organismos genéticamente modificados (GM) y los alimentos GM?

Los organismos genéticamente modificados (OGM) pueden definirse como organismos en

los cuales el material genético (ADN) ha sido alterado de un modo artificial. La tecnología

generalmente se denomina ―biotecnología moderna‖ o ―tecnología genética‖, en ocasiones

también ―tecnología de ADN recombinante‖ o ―ingeniería genética‖. Ésta permite transferir

genes seleccionados individuales de un organismo a otro, también entre especies no

relacionadas. Dichos métodos se utilizan para crear vegetales GM – que luego se utilizan

para desarrollar cultivos de alimentos GM.

P2. ¿Por qué se producen alimentos GM?

Los alimentos GM se desarrollan –y comercializan- porque se percibe cierta ventaja tanto

para los productores como para los consumidores de estos alimentos. Esto tiene como

objetivo traducirse en un producto con un menor precio, mayores beneficios (en términos

de durabilidad o valor nutricional) o ambos. En un principio, los individuos que

desarrollaban semillas GM deseaban que sus productos fueran aceptados por los

productores, por lo tanto, se concentraron en innovaciones que los agricultores (y la

industria alimenticia en general) pudieran apreciar.

El objetivo inicial del desarrollo de vegetales sobre la base de organismos GM fue

aumentar la protección de los cultivos. Los cultivos GM actualmente en el mercado tienen

como objetivo principal aumentar el nivel de protección de los cultivos mediante la

introducción de resistencia a enfermedades causadas por insectos o virus a los vegetales

o mediante una mayor tolerancia a los herbicidas.

128


La resistencia a los insectos se logra incorporando a la planta alimenticia el gen productor

de toxinas de la bacteria Bacillus thuringiensis (BT). Esta toxina se usa actualmente como

un insecticida convencional en la agricultura y es inocua para el consumo humano. Se ha

demostrado que los cultivos GM que producen esta toxina en forma permanente requieren

menores cantidades de insecticidas en situaciones específicas, por ejemplo, donde la

presión de plagas es elevada.

La resistencia viral se logra mediante la introducción de un gen de ciertos virus que

causan enfermedad en los vegetales. La resistencia viral reduce la susceptibilidad de los

vegetales a enfermedades causadas por dichos virus, lo que da como resultado un

rendimiento mayor de los cultivos.

La tolerancia a herbicidas se logra mediante la introducción de un gen de una bacteria

que le confiere resistencia a ciertos herbicidas. En situaciones donde la presión de la

maleza es elevada, el uso de dichos cultivos ha producido una reducción en la cantidad

de herbicidas utilizados.

P3. ¿Se evalúan los alimentos GM en forma diferente de los alimentos

tradicionales?

En general, los consumidores consideran que los alimentos tradicionales (que usualmente

se han consumido por miles de años) son inocuos.

Cuando se desarrollan alimentos nuevos por métodos naturales, se pueden alterar

algunas de las características existentes en los alimentos, tanto en forma positiva como

negativa. Se podría convocar a las autoridades nacionales de alimentos a examinar los

alimentos tradicionales, pero esto no siempre ocurre. En realidad, puede ocurrir que los

vegetales nuevos desarrollados mediante técnicas tradicionales de reproducción no se

evalúen rigurosamente usando técnicas de evaluación de riesgos.

Con los alimentos GM, la mayoría de las autoridades nacionales consideran que son

necesarias evaluaciones específicas. Se han establecido sistemas específicos para una

evaluación rigurosa de organismos GM y alimentos GM relativos tanto a la salud humana

como al medio ambiente. Por lo general, no se realizan evaluaciones similares para los

alimentos tradicionales. Por lo tanto, hay una diferencia significativa en el proceso de

evaluación antes de la comercialización para estos dos grupos de alimentos.

Uno de los objetivos del Programa de Inocuidad Alimenticia de la OMS es colaborar con

las autoridades nacionales en la identificación de los alimentos que deben someterse a

evaluaciones de riesgos, incluyendo alimentos GM, y recomendar las evaluaciones

correctas

129


P4. ¿Cómo se determinan los riesgos potenciales para la salud humana?

La evaluación de inocuidad de los alimentos GM generalmente investiga: (a) los efectos

directos sobre la salud (toxicidad), (b) las tendencias a provocar una reacción alérgica

(alergenicidad); (c) los componentes específicos con sospecha de tener propiedades

nutricionales o tóxicas; (d) la estabilidad del gen insertado; (e) los efectos nutricionales

asociados con la modificación genética; y (f) cualquier efecto no deseado que podría

producirse por la inserción genética.

P5. ¿Cuáles son los principales temas de preocupación para la salud humana?

Si bien las discusiones teóricas han abarcado una amplia gama de aspectos, los tres

temas principales debatidos son las tendencias a provocar una reacción alérgica

(alergenicidad), la transferencia de genes y el cruzamiento lejano (outcrossing).

Alergenicidad. Por una cuestión de principios, se desalienta la transferencia de genes de

alimentos comúnmente alergénicos a menos que pueda demostrarse que el producto

proteico del gen transferido no es alergénico. Si bien los alimentos desarrollados en forma

tradicional no se evalúan generalmente en cuanto a alergenicidad, los protocolos para

pruebas de alimentos GM han sido evaluados por la Organización de las Naciones Unidas

para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la OMS. No se han hallado efectos alérgicos

en relación con los alimentos GM que se encuentran actualmente en el mercado.

Transferencia genética. La transferencia genética de alimentos GM a células del

organismo o a bacterias del tracto gastrointestinal causarían preocupación si el material

genético transferido afectara en forma adversa a la salud humana. Esto sería

particularmente relevante si fueran a transferirse genes de resistencia a antibióticos

usados para crear OGM. Si bien la probabilidad de transferencia es baja, un panel de

expertos reciente de FAO/OMS ha incentivado el uso de tecnología sin genes de

resistencia a antibióticos.

Outcrossing. El desplazamiento de genes de vegetales GM a cultivos convencionales o

especies silvestres relacionadas (llamado ―outcrossing‖), así como la combinación de

cultivos provenientes de semillas convencionales con aquellos desarrollados usando

cultivos GM, puede tener un efecto indirecto sobre la inocuidad y la seguridad de los

alimentos. Este riesgo es real, como se demostró cuando aparecieron rastros de un tipo

de maíz que sólo fue aprobado para alimentación animal en productos del maíz para

consumo humano en los Estados Unidos de América. Muchos países han adoptado

estrategias para reducir la combinación, incluyendo una clara separación de los campos

dentro de los cuales se desarrollan cultivos GM y cultivos convencionales.

Se está discutiendo la factibilidad y los métodos para monitorear los productos

alimentarios GM después de la comercialización, para la vigilancia continua de la

inocuidad de los productos alimentarios GM.

130


P6. ¿Cómo se realiza una evaluación de riesgos para el medio ambiente?

Las evaluaciones de riesgos del medio ambiente abarcan tanto los OGM involucrados

como el potencial medio ambiente receptor. El proceso de evaluación incluye una

evaluación de las características del OGM y sus efectos y estabilidad en el medio

ambiente, combinado con las características ecológicas del medio ambiente en el cual

tendrá lugar la introducción. La evaluación también incluye los efectos no deseados que

podrían surgir por la inserción del nuevo gen.

P7. ¿Cuáles son los temas de preocupación en cuanto al medio ambiente?

Los temas de preocupación incluyen: la capacidad de los OGM para dispersarse e

introducir potencialmente los genes de ingeniería genética dentro de poblaciones

silvestres; la persistencia del gen una vez que el OGM ha sido cosechado; la

susceptibilidad de los organismos no objetivo (por ej, los insectos que no son plaga) al

producto genético; la estabilidad del gen; la reducción del espectro de otros vegetales

incluyendo pérdida de biodiversidad; y un mayor uso de sustancias químicas en la

agricultura. Los aspectos de inocuidad del medio ambiente de los cultivos GM varían

considerablemente de acuerdo con las condiciones locales.

Las investigaciones actuales se concentran en: el efecto potencialmente perjudicial sobre

los insectos beneficiosos o una inducción más rápida de insectos resistentes; la

generación potencial de nuevos patógenos vegetales; las potenciales consecuencias

perjudiciales para la biodiversidad vegetal y la vida silvestre, y un menor uso de la práctica

importante de rotación de cultivos en ciertas situaciones locales; y el desplazamiento de

genes de resistencia a los herbicidas a otros vegetales.

P8. ¿Son inocuos los alimentos GM?

Los diferentes organismos GM incluyen genes diferentes insertados en formas diferentes.

Esto significa que cada alimento GM y su inocuidad deben ser evaluados individualmente,

y que no es posible hacer afirmaciones generales sobre la inocuidad de todos los

alimentos GM.

Los alimentos GM actualmente disponibles en el mercado internacional han pasado las

evaluaciones de riesgo y no es probable que presenten riesgos para la salud humana.

Además, no se han demostrados efectos sobre la salud humana como resultado del

consumo de dichos alimentos por la población general en los países donde fueron

aprobados. El uso continuo de evaluaciones de riesgo en base a los principios del Codex

y, donde corresponda, incluyendo el monitoreo post comercialización, debe formar la base

para evaluar la inocuidad de los alimentos GM.

131


P9. ¿Cómo se reglamentan los alimentos GM a nivel nacional?

La forma en que los países han reglamentado los alimentos GM es variada. En algunos

países, los alimentos GM no están reglamentados todavía. Los países que cuentan con

legislación, se concentran principalmente en evaluaciones de riesgos para la salud de los

consumidores. Los países que tienen disposiciones para los alimentos GM, usualmente

también reglamentan los OGM en general, teniendo en cuenta los riesgos para la salud y

el medio ambiente así como los temas relacionados con control y comercio (como los

regímenes potenciales de prueba y etiquetado). Dada la dinámica del debate sobre

alimentos GM, es probable que la legislación continúe evolucionando.

P10. ¿Qué tipos de alimentos GM se encuentran en el mercado internacional?

Todos los cultivos GM disponibles en el mercado internacional en la actualidad han sido

diseñados usando una de tres características básicas: resistencia al daño causado por

insectos, resistencia a las infecciones virales; y tolerancia a ciertos herbicidas. Todos los

genes usados para modificar cultivos provienen de microorganismos.

Cultivo Característica Áreas/países con aprobación

Maíz Resistencia a insectos Argentina, Canadá, Sudáfrica, Estados

Unidos, UE

Tolerancia a herbicidas Argentina, Canadá, Estados Unidos, UE

Soya Tolerancia a herbicidas Argentina, Canadá, Sudáfrica, Estados

Unidos, UE (sólo para procesamiento)

Colza Tolerancia a herbicidas Canadá, Estados Unidos

Achicoria Tolerancia a herbicidas UE (sólo para reproducción)

Calabazas Resistencia a virus Canadá, Estados Unidos

Papa Resistencia a insectos/ Canadá, Estados Unidos

Tolerancia a herbicidas

132


P11. ¿Qué ocurre cuando se comercializan internacionalmente alimentos GM?

No hay en la actualidad sistemas reglamentarios internacionales específicos. Sin

embargo, muchas organizaciones internacionales están involucradas en el desarrollo de

protocolos para OGM.

La Comisión del Codex Alimentarius (Codex) es el organismo conjunto de FAO/OMS

responsable de compilar los estándares, los códigos de práctica, los lineamientos y las

recomendaciones que componen el Codex Alimentarius: el código alimentario

internacional. El Codex está desarrollando principios para el análisis de riesgos para la

salud humana de los alimentos GM. La premisa de estos principios dicta una evaluación

previa a la comercialización, realizada en forma individual y que incluya una evaluación

tanto de los efectos directos (del gen insertado) como de los efectos no deseados (que

pueden surgir como consecuencia de la inserción del nuevo gen). Los principios están en

una etapa avanzada de desarrollo y se espera que sean adoptados para julio de 2003.

Los principios del Codex no tienen un efecto de obligatoriedad sobre la legislación

nacional, pero son mencionados específicamente en el Acuerdo Sanitario y Fitosanitario

(Acuerdo SPS) de la Organización Mundial de Comercio, y pueden usarse como

referencia en el caso de disputas comerciales.

El Protocolo de Cartagena sobre Bioinocuidad (CPB, siglas en inglés), un tratado

ambiental legalmente obligatorio para sus Partes, regula los movimientos transfronterizos

de los organismos vivientes modificados (LMO, siglas en inglés). Los alimentos GM entran

en el ámbito del Protocolo sólo si contienen LMO capaces de transferir o replicar el

material genético. La piedra angular del CPB es un requisito de que los exportadores

soliciten el consentimiento de los importadores antes del primer envío de LMO con

intenciones de ser liberados al medio ambiente. El Protocolo entrará en vigencia 90 días

después de que el 50º país lo haya ratificado, lo que puede ocurrir a principios de 2003 en

vista de las aceleradas declaraciones registradas desde junio de 2002.

P12. ¿Han pasado una evaluación de riesgos los productos GM en el mercado

internacional?

Todos los productos GM actualmente en el mercado internacional han pasado las

evaluaciones de riesgos desarrolladas por las autoridades nacionales. Estas evaluaciones

diferentes por lo general siguen los mismos principios básicos, incluyendo una evaluación

del riesgo para el medio ambiente y la salud humana. Estas evaluaciones son minuciosas

- no han indicado ningún riesgo para la salud humana.

133


P13. ¿Por qué hubo preocupación entre algunos políticos, grupos de interés y

consumidores, especialmente en Europa, sobre los alimentos GM?

Desde la primera introducción en el mercado a mediados de los ‗90 de un alimento GM

importante (soyas resistentes a herbicidas), hubo cada vez más preocupación sobre

dichos alimentos entre políticos, activistas y consumidores, especialmente en Europa. Hay

muchos factores involucrados. A fines de los ‗80, principios de los ‗90, los resultados de

décadas de investigación molecular alcanzaron dominio público. Hasta ese momento, los

consumidores por lo general no estaban muy informados del potencial de esta

investigación. En el caso de alimentos, los consumidores comenzaron a preguntarse

sobre inocuidad porque perciben que la biotecnología moderna está originando la

creación de nuevas especies.

Los consumidores se preguntan con frecuencia: ―¿Cuál es la ventaja para mí?‖. En el

campo de los medicamentos, muchos consumidores han aceptado más rápidamente la

biotecnología como beneficiosa para su salud (por ej., los medicamentos con un mejor

potencial de tratamiento). En el caso de los primeros alimentos GM introducidos en el

mercado europeo, los productos no tenían un beneficio directo aparente para los

consumidores (no eran más económicos, no aumentaban su fecha de vencimiento, no

tenían mejor sabor). El potencial de las semillas GM para brindar mayor producción por

área cultivada debería resultar en precios más bajos. Sin embargo, la atención del público

se ha concentrado en el aspecto de los riesgos de la ecuación riesgo-beneficio.

La confianza de los consumidores en la inocuidad de los suministros de alimentos en

Europa ha disminuido significativamente como resultado de una cantidad de sobresaltos

alimentarios que tuvieron lugar en la segunda mitad de los ‘90 que no están relacionados

con los alimentos GM. Esto también tuvo un impacto sobre las discusiones sobre la

aceptación de los alimentos GM. Los consumidores han cuestionado la validez de las

evaluaciones de riesgos, tanto en relación los riegos para la salud de los consumidores

como para el medio ambiente, concentrándose principalmente en los efectos a largo

plazo. Otros temas de debate de las organizaciones de consumidores incluyeron

alergenicidad y resistencia antimicrobiana. Las preocupaciones de los consumidores

desencadenaron una discusión sobre la conveniencia del etiquetado de los alimentos GM

que permite una elección consciente. Al mismo tiempo, ha sido difícil detectar rastros de

OGM en los alimentos: esto significa que las concentraciones muy bajas por lo general no

pueden detectarse.

P14. ¿De qué forma ha afectado esta preocupación a la comercialización de

alimentos GM en la Unión Europea?

Las preocupaciones de la población sobre los alimentos GM y los OGM en general han

tenido un impacto significativo en la comercialización de los productos GM en la Unión

Europea (UE). De hecho, han dado como resultado que se colocara en el mercado la

denominada moratoria sobre aprobación de productos GM. Por lo general, la

134


comercialización de alimentos GM y OGM es objeto de extensiva legislación. La

legislación comunitaria ha existido desde principios de los ‗90.

El procedimiento de aprobación para la liberación de OMG al medio ambiente es un tanto

complejo y básicamente requiere del acuerdo entre los Estados Miembro y la Comisión

Europea. Entre 1991 y 1998, la comercialización de 18 OMG fue autorizada por una

decisión de la Comisión en la UE.

A partir de octubre de 1998, no se concedieron más autorizaciones y en la actualidad hay

12 aplicaciones pendientes. Algunos Estados Miembro han invocado una cláusula de

salvaguardia para prohibir temporariamente la colocación de maíz y productos de colza

GM en el mercado de su país. Hay en la actualidad nueve casos en curso. Ocho de ellos

han sido examinados por un Comité Científico sobre Vegetales, el cual en todos los casos

consideró que la información presentada por los Estados Miembro no justificaba estas

prohibiciones.

Durante la década de los ‘90, el marco regulador se extendió y perfeccionó más en

respuesta a las preocupaciones legítimas de los ciudadanos, las organizaciones de

consumidores y los operadores económicos (descripto en la Pregunta 13). En octubre de

2002 entra en vigencia una directiva revisada. La misma actualiza y refuerza las normas

existentes respecto del proceso de evaluación de riesgos, gestión de riesgos, y toma de

decisiones respecto de la liberación de OGM al medio ambiente. La nueva directiva

también prevé el monitoreo obligatorio de los efectos prolongados asociados con la

interacción entre OGM y el medio ambiente.

En la UE, el etiquetado es obligatorio para los productos derivados de la biotecnología

moderna o productos que contengan organismos GM. La legislación también considera el

problema de la contaminación accidental de los alimentos convencionales con material

GM. Introduce un umbral mínimo de un 1% para ADN o proteína proveniente de

modificación genética, debajo del cual no se requiere etiquetado.

En el año 2001, la Comisión Europea adoptó dos nuevas propuestas legislativas sobre

OGM respecto de la rastreabilidad, reforzando las normas actuales sobre etiquetado y

racionalizando el procedimiento de autorización para los OGM en alimentos para

humanos y animales y para su liberación deliberada al medio ambiente.

La Comisión Europea opina que estas nuevas propuestas, basadas en la legislación

existente, tienen como objetivo encarar las preocupaciones de los Estados Miembro y

crear la confianza de los consumidores en la autorización de productos GM. La Comisión

espera que la adopción de estas propuestas allane el camino para reanudar la

autorización de nuevos productos GM en la UE.

135


P15. ¿Cuál es el estado del debate público sobre alimentos GM en otras regiones

del mundo?

La liberación de OGM al medio ambiente y la comercialización de alimentos GM han

ocasionado un debate público en muchas partes del mundo. Es posible que este debate

continúe, probablemente en el contexto más amplio de otros usos de la biotecnología (por

ejemplo, en medicina humana) y sus consecuencias para las sociedades humanas. A

pesar de que los temas que se están debatiendo son por lo general muy similares (costos

y beneficios, temas de inocuidad), el resultado del debate difiere de país en país. En

temas como etiquetado y rastreabilidad de alimentos GM como una forma de encarar las

preocupaciones de los consumidores, no hay hasta la fecha ningún consenso. Esto quedó

claro durante las discusiones dentro de la Comisión del Codex Alimentarius durante los

últimos años. A pesar de la falta de consenso sobre estos temas, se han hecho progresos

significativos en la harmonización de opiniones concernientes a la evaluación de riesgos.

La Comisión del Codex Alimentarius está a punto de adoptar principios sobre evaluación

de riesgos antes de la comercialización, y las disposiciones del Protocolo de Cartagena

sobre Bioinocuidad también revelan un mayor entendimiento a nivel internacional.

Más recientemente, la crisis humanitaria en del sur de África ha atraído la atención sobre

el uso de alimentos GM como ayuda alimentaria en situaciones de emergencia. Una

cantidad de gobiernos de la región expresaron su preocupación en torno de las alarmas

sobre medio ambiente e inocuidad alimentaria. Si bien se han encontrado soluciones

factibles para la distribución de grano molido en algunos países, otros han restringido el

uso de alimentos GM y han obtenido productos que no contienen OGM.

P16. ¿Hay una relación entre la reacción de la gente y las diferentes actitudes hacia

los alimentos en diversas regiones del mundo?

Dependiendo de la región del mundo, las personas con frecuencia tienen actitudes

diferentes hacia los alimentos. Además del valor nutricional, los alimentos frecuentemente

tienen connotaciones sociales e históricas, y en algunos casos pueden tener importancia

religiosa. La modificación tecnológica de los alimentos y la producción alimentaria puede

provocar una respuesta negativa entre los consumidores, especialmente en ausencia de

buena comunicación sobre los esfuerzos de evaluación de riesgos y las evaluaciones de

costo-beneficio.

P17. ¿Hay implicancias para los derechos de los agricultores a ser dueños de sus

cultivos?

Sí, es probable que los derechos de propiedad intelectual sean un elemento de debate

sobre alimentos GM con un impacto sobre los derechos de los agricultores. Se han

discutido los derechos de propiedad intelectual (IPR, siglas en inglés), especialmente las

136


obligaciones de patentamiento del Acuerdo TRIPS (un acuerdo de la Organización

Mundial de Comercio sobre los aspectos de los derechos de propiedad intelectual

relacionados con el comercio) a la luz de sus consecuencias sobre la mayor disponibilidad

de una diversidad de cultivos. En el contexto de los temas relacionados con el uso de

tecnología genética en medicina, la OMS ha revisado el conflicto entre los IPR y el acceso

igualitario a los recursos genéticos y la coparticipación de beneficios. Esta revisión ha

considerado los problemas potenciales de la monopolización y las dudas sobre las nuevas

reglamentaciones de patentes en el campo de las secuencias genéticas en medicina

humana. Es probable que dichas consideraciones también afecten el debate sobre

alimentos GM.

P18. ¿Por qué están preocupados ciertos grupos por la creciente influencia de la

industria química en la agricultura?

Ciertos grupos están preocupados sobre lo que ellos consideran un nivel no deseado de

control de los mercados de semillas por parte de unas pocas compañías químicas. La

biodiversidad y la agricultura sustentable se benefician más por el uso de una rica

variedad de cultivos, tanto en términos de buenas prácticas de protección de cultivos

como por la perspectiva de la sociedad en general y los valores asociados con los

alimentos. Estos grupos temen que como resultado del interés de la industria química en

los mercados de semillas, la gama de variedades utilizada por los agricultores pueda

reducirse principalmente a cultivos GM. Esto impactaría en la canasta de alimentos de

una sociedad así como en la protección de cultivos a largo plazo (por ejemplo, con el

desarrollo de resistencia contra plagas de insectos y tolerancia a ciertos herbicidas). El

uso exclusivo de cultivos GM resistentes a herbicidas también haría al agricultor

dependiente de estas sustancias químicas. Estos grupos temen una posición dominante

de la industria química en el desarrollo agropecuario, una tendencia que no consideran

sostenible.

P19. ¿Qué otros desarrollos pueden esperarse en el área de los OGM?

Es probable que los organismos GM futuros incluyan vegetales con una mayor resistencia

a enfermedades o sequías, cultivos con mayores niveles de nutrientes, especies de peces

con mejores características de desarrollo y vegetales o animales que produzcan proteínas

farmacéuticamente importantes como las vacunas.

A nivel internacional, la respuesta a los nuevos desarrollos puede hallarse en las

consultas de expertos organizadas por FAO y OMS en los años 2000 y 2001, y la labor

posterior de la Fuerza de Trabajo ad hoc del Codex sobre Alimentos Derivados de

Biotecnología. Este trabajo ha dado como resultado un marco mejorado y armonizado

para la evaluación de riesgos de alimentos GM en general. Se han tratado cuestiones

específicas como la evaluación de la alergenicidad de alimentos GM o la inocuidad de

137


alimentos derivados de microorganismos GM, y una consulta de expertos organizada por

FAO y OMS en el año 2003 se concentrará en alimentos derivados de animalesGM.

P20. ¿Qué acciones está implementando la OMS para mejorar la evaluación de los

alimentos GM?

La OMS tomará un papel activo en relación con los alimentos GM, principalmente por dos

razones: (1) debido a que la salud pública podría beneficiarse enormemente por el

potencial de la biotecnología, por ejemplo por un aumento en el contenido de nutrientes

de los alimentos, menor alergenicidad y producción alimentaria más eficiente; y (2) en

base a las necesidades de examinar los efectos negativos potenciales para la salud

humana del consumo de alimentos producidos mediante modificación genética, también a

nivel mundial. Es claro que se deben evaluar minuciosamente las tecnologías modernas si

van a constituir una mejoría real en la forma de producción de los alimentos. Dichas

evaluaciones deben ser holísticas y abarcativas, y no pueden detenerse en los sistemas

de evaluación anteriormente separados, no coherentes, que sólo enfocaban los efectos

sobre el medio ambiente o la salud humana en forma aislada.

Por lo tanto, la OMS está trabajando para presentar un punto de vista más amplio de la

evaluación de alimentos GM para permitir la consideración de otros factores importantes.

Esta evaluación más holística de organismos GM y productos GM considerará no sólo la

inocuidad sino también la seguridad alimentaria, los aspectos sociales y éticos, el acceso

y la creación de capacidades. El trabajo internacional en esta nueva dirección presupone

el compromiso de otras organizaciones internacionales claves en esta área. Como primer

paso, la Junta Ejecutiva de la OMS debatirá en enero de 2003 el contenido de un informe

de la OMS que abarca este tema. El informe está siendo desarrollado en colaboración con

otras organizaciones claves, principalmente la FAO y el Programa de las Naciones Unidas

para el Medio Ambiente (UNEP, siglas en inglés). Se espera que este informe pueda

sentar las bases para una iniciativa futura hacia una evaluación más sistemática,

coordinada, multi-organizativa e internacional de ciertos alimentos GM.

138


Actividades de Autoevaluación de la UNIDAD 2

Respetado estudiante, esta actividad tiene como objeto autoevaluar los contenidos vistos y desarrollados en la lección No. ____, así como el trabajo y desempeño realizado tanto por el tutor – director, como el desarrollado por usted mismo; por lo anterior, lo invito a que de manera individual, personal, honesta, responsable y profesional, realice el siguiente ejercicio de autoevaluación, el cual consta de los siguientes ítems; los cuales ayudaran en el mejoramiento de las estrategias, actividades de aprendizaje y compromiso tanto del tutor como el suyo en mejorar aspectos relacionados con actividades evaluativas que serán desarrolladas en las lecciones siguientes. Los ítems a tener en cuenta son:

1) Autoevaluación de su trabajo individual. Usted describirá de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeño en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo induvidual y colaborativo en el desarrollo de esta lección.

2) Evaluación del desempeño de los compañeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participación de sus compañeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciación

3) Evaluación del material usado en la actividad de la lección: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

4) Desempeño del rol del tutor. Debe dar su autoevaluación del tutor respecto al compromiso, responsabilidad, calidad, pertinencia, atención al estudiante, retroalimentación de trabajos y relaciones interpersonales.

139


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