Nematologia Brasileira, 2004, Vol. 28(2):125-130

Identificação de Marcadores Moleculares de Microssatélites paraSeleção de Genótipos de Soja Resistentes a Meloidogynejavanica

RENATA FUGANTP; MAGDA APARECIDA BENEVENTP; JOÃO FLÁVIO VELOSO SILVA2;CARLOS ALBERTO ARRABALARIAS2; SILVANA R. R. MARIN2; ELISEU BINNECK2 &

ALEXANDRE LIMA NEPOMUCEN02

'Mestrado em Genética e Melhoramento- Universidade Estadual de Londrina (UEL). e-mail: rfuganti@enpso.embrapa.br. CampusUniversitário, Rod. Celso Garcia Cid (PR 445) Km 380. CEP 86051-990. Londrina (PR). 'Embrapa Soja. Rod. Carlos João Strass. C.

Postal 231. CEP 86001-970. Londrina (PR).

Recebido para publicação em 28/06/2003. Aceito 12/12/2004.

Resumo- Fuganti, R.; M. A Beneventi; J. F. V. Silva; C. A. A. Arias; S. R. R. Marin; E. Binneck & A. L. Nepomuceno. 2004.Identificação de Marcadores Moleculares de Microssatélites para Seleção de Genótipos de Soja Resistentes a Meloidogynejavanica.

o nematóide de galhas Meloidogyne javanica é um dos principais patógenos da soja no Brasil. O melhoramento da sojapode ser acelerado, através da seleção de linhagens resistentes, utilizando-se marcadores moleculares associados a genes deresistência. O objetivo do estudo foi utilizar marcadores moleculares de microssatélites para identificar, em soja, QTL's(Locos de caracteres quantitati vos) relacionados à resistência ao M. javanica. Noventa e sete pares de primers foram utilizadospara amplificar linhagens de soja (25 resistentes e 26 suscetíveis), obtidas a partir de um cruzamento entre os genótipos BRS133 (suscetível) x PI595099 (resistente). De um total de 97 locos analisados, 21 foram polimórficos para os pais e setemarcadores foram significativos para a população resistente. No grupo de ligação F, onde já eram conhecidos outros QTL's deresistência ao nematóide, os locos SOYHSP 176, Satt 114 e Satt 423 apresentaram correlação significativa com o número degalhas na raiz.

Palavras-chave: nematóide de galhas, resistência, melhoramento genético.

Summary- Fuganti, R.; M. ABeneventi; J. F. V. Silva; C. A. A. Arias; S. R. R. Marin; E. Binneck &A. L. Nepomuceno. 2004.Identification of microsatellite markers for the selection of soybean genotypes resistant to Meloidogyne javanica.

Meloidogyne javanica is a major soybean nematode pathogen in Brazil. The development of resistant varieties is the maingoal of many breeding programs. Progress in selection for nematode-resistant lines can be speeded up by the use of molecularmarkers associated with genes of resistance. The objectives of this study were to use SSR markers to identify quantitative traitloci (QTL) conditioning soybean resistance against M. javanica and to determine their genomic location. Ninety-seven SSRmarkers were used to amplify the DNA of soybean lines (25 resistant and 26 susceptible) obtained from a cross between BRS133 (susceptible) and PI 595099 (resistant). Among 97 loci initially analyzed, 21 were polymorphic between the parents andseven were significantly different from the resistant population. In the F linkage group, where other quantitative trait loci(QTLs) conditioning resistance to nematodes have already been reported, the SSR loci SOYHSP 176, Satt 114 and Satt 423showed significant correlation with the number of galls observed on soybean roots.

Keywords: Root-knot nematode, resistance, breeding.

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ldentifiraçdo de mercadores moleculares de microssatélites para seleção de genôtipos de soja resistentes a Meloidogyne javanica

Introdução

Entre os fatores que contribuem para a queda do rendimen-to da cultura da soja, especialmente nas regiões tropical esubtropical, estão diversas doenças, destacando-se as causa-das por nematóides fitoparasitos. Estima-se que 10,6% dasperdas anuais da produção mundial de soja sejam causadaspelo parasitismo que esses organismos exercem (Barker, 1998).

No Brasil, as espécies do gênero Meloidogyne, principal-mente M. javanica eM. incognita, representam sério proble-ma para a produção em diversas regiões, como no norte doRio Grande do Sul, no sudoeste e norte do Paraná, no sul enorte de São Paulo e no sul do Triângulo Mineiro. Na RegiãoCentral do país, vários focos têm sido detectados e o proble-ma é crescente. A baixa eficiência da rotação de culturas naredução populacional desses parasitos e a evidente deficiên-cia de cultivares resistentes, adaptadas às diferentes regiõesdo país, são as principais razões desta situação (Silva, 1998).

A seleção de plantas resistentes assistida por marcadoresmoleculares pode eliminar certos aspectos indesejáveis daseleção puramente fenotípica, melhorando a eficiência do pro-cesso, uma vez que os marcadores não são influenciados peloambiente e são transmitidos mendelianamente. Com o auxíliode marcadores rnoleculares, a seleção pode ser feita precoce-mente, diminuindo os custos com manutenção de populaçõesde nernatóides, multiplicação e inoculação de plantas.

A exploração do polimorfismo de comprimento de frag-mentos de DNA ("RFLP- Restriction Fragment LengthPolyrnorphism" - Polimorfismo de comprimento de fragmen-to de restrição) foi proposta pela primeira vez no início dosanos 80 (Botstein et al., 1980). Desde então, vários métodosque revelam a existência de polimorfismos moleculares têmsido descritos na literatura, com destaque aos RAPDs("Randomly Amplified Polymorphic DNA" - Polimorfismode DNA amplificado ao acaso), descritos pioneiramente emsoja por Williams et al., (1990). Esses marcadores.juntarnen-te com os RFLPs, têm sido amplamente utilizados para o es-tudo da diversidade genética em plantas.

No entanto, ressalte-se que o emprego de RFLP e RAPDesbarra em problemas técnicos intrínsecos à natureza dosmarcadores. Assim, o RFLP é tecnicamente trabalhoso e dedifícil automação e, no caso da soja, com um agravante que éo baixo conteúdo de informação (medido pela diversidadegenética), uma vez que em 90% dos locos analisados, somen-te dois alelos diferentes foram encontrados (Lorenzen et al.,1995). Já o RAPD pode apresentar sérios problemas dereprodutibilidade, o que dificulta sua aplicação em larga es-cala e, ademais, não representa grande avanço no conteúdode informação.

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Mais recentemente, dois outros tipos de marcadoresmoleculares vêm sendo utilizados como alternativas para con-tornar estes problemas: o AFLP ("Amplified Fragment LengthPolymorphisrn" - Polimorfismo de comprimento de fragmen-to amplificado) e principalmente, os microssatélites.

Microssatélites, também conhecidos como SSR ("SimpleSequence Repeats" - Seqüências simples repetidas)correspondern a seqüências de DNA com poucos pares debases de comprimento (2-6), repetidas "in tandem", tais como(AT)n, (ATT), etc. A variação no número (n) desses elemen-tos repetidos gera grande quantidade de polimorfismo (Ferreira& Grattapaglia, 1998).

Atualmente, muitas espécies de plantas já dispõem de umconjunto de marcadores microssatélites para utilização emestudos genéticos, entre elas a soja (Akkaya et al., 1992;Cregan et al., 1999; Wu et al., 2003; Lightfoot et al., 2003).

Marcadores de várias naturezas, associados a genes de re-sistência a nematóides do gênero Meloidogyne, em soja têmsido descritos na literatura. Tamulonis et ai. (1997a) traba-lhando com marcadores do tipo RFLP encontraram 8marcadores associados à resistência, sendo que dois deles,B212-1 eA725-A, pertencentes aos grupos de ligação F e DI,explicaram 51 % da variação no número de galhas. Em outrotrabalho, Tamulonis et ai. (1997b) obtiveram QTL's de resis-tência a M. arena ria no grupo de ligação F (marcador B212V-1) explicando 32% da variação no número de galhas, e aindaoutro QTL no grupo de ligação E, entre os marcadores B212D-2 e AllIH-2, responsável por 16 % da variação.

Silva et ai. (2001a) estudando populações resultantes deum cruzamento entre cultivares de soja resistente e suscetívela M. javanica, encontraram um marcador microssatélite,SOYHSP 176, que mostrou associação significativa com onúmero de galhas. Este marcador encontra-se no grupo deligação F, e está localizado entre os marcadores de RFLP,A186D eA757Y.

No contexto apresentado acredita-se que a identificação demarcadores ligados a genes de resistência em soja, permitiráuma maior rapidez no processo de obtenção de cultivares su-periores resistentes, em programas de melhoramento, atravésda incorporação de genes específicos de resistência às culti-vares mais adaptadas e produtivas, recomendadas para as di-ferentes regiões do país. Deste modo, o presente visou identi-ficar marcadores moleculares de microssatélite nos grupos deligação da soja, para seleção assistida de genótipos resisten-tes ao nematóide de galhas, M. javanica.

Material e Métodos

Para a realização do estudo, foram utilizados como parentais

Nematologia Brasileira

Renata Fuganti, Magda Aparecida Beneventi, João Flávio veloso Silva, Carlos Alberto Arrabal Arias, Silvana R. R. Marin, Eliseu Binneck & AlexandreLima Nepomureno

os genótipos de soja BRS 133 (suscetível) ePI 595099 (resis-tente). A partir desse cruzamento, foram obtidos 120 indiví-duos F2e 120 famílias F23que foram utilizados para estudo deefeitos genéticos envolvidos na resistência (Silva etal., 2001b).

A população resultante deste cruzamento foi avaliada emcasa-de-vegetação, quanto à resistência e suscetibilidade aonematóide. Os dois experimentos de avaliação foram condu-zidos sob delineamento inteiramente casualizado, com 4 re-petições. No primeiro experimento, as plantas foram cultiva-das em tubetes plásticos (4,5 x 19 em), contendo substratoesterilizado. Aos três ou quatro dias após a emergência, asplantas foram inoculadas individualmente com 3000 ovos deM. javanica. A avaliação foi feita 30 dias após a inoculação,contando o número de galhas por planta (Luzzi et al., 1987).

No segundo experimento, as mesmas plantas foramsemeadas individualmente em vasos de 5 L de capacidadecontendo solo esterilizado. Após 7 dias da emergência, cadaplanta foi inoculada com 5000 ovos de nematóide. Após 72dias, as raízes foram avaliadas através de escala descritivaque variou de O(ausência de galhas) a 10 (presença abundan-te de galhas).

A população de M. javanica utilizada foi originária do Cen-tro Nacional de Pesquisa de Soja (Embrapa Soja) e foi multi-plicada em plantas de soja cultivar Doko durante todo o perí-odo das inoculações, de modo a se dispor sempre de ovoscom boa viabilidade. A extração dos ovos das raízes foi feitasegundo o protocolo proposto por Hussey & Barker (1973).

Dentre estas plantas F3selecionadas, obtiveram-se 25 linha-gens altamente resistentes e 26 de elevada suscetibilidade aM. javanica, que foram utilizadas para a coleta de folhas eextração de DNA. A extração do DNA das populações resis-tente, suscetível e dos parentais seguiu o protocolo propostopor Keim et al. (1988) e a sua concentração e pureza foi esti-mada utilizando leituras espectrofotométricas a 260 nm e 280nm. Após a quantificação, todas as amostras de DNA foramdiluídas para a concentração final de lOng/{LL.

PCRs ("PCR- Polimerase chain reaction" -Reação depolimerização em cadeia) foram realizadas para cada amos-tra em termociclador Perkin Elmer 9600 e foram constituídasde 3,0{LLde DNA molde (10ng/{LL);2,0{LLde tampão de re-ação lOx (100mM de Tris-HCI pH 8,3; 500mM de KCI e400{LLde água MilliQ); 1,O{LLde MgCI2 (50mM); 1,O{LLdedNTP's (2,5mM); 0,2{LLde Taq DNA polimerase (5U/{LL)e1,O{LLdos primers F e R (5{LM) (Research Genetics Inc.- MapPairs''>'), completando-se com água MilliQ para o volume fi-nal de 20{LL.Esses passos foram repetidos para cada trata-mento (combinação genótipo x marcador microssatélite).

Os 97 pares de primers utilizados foram previamente esco-

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Ihidos a partir de banco de dados de DNA de soja (Cregan etal., 1994; 1999). Eles estão localizados nos 20 grupos de liga-ção da soja, quatro em cada grupo, com exceção dos gruposDrb-W eF, onde foram escolhidos oito e 17 pares de primers,respectivamente. Atenção especial foi dada ao grupo de liga-ção F, onde já foram detectados QTL's de resistência anematóides (Tamulonis et al., 1997; Silva et al., 2001a). Es-ses primers foram utilizados para identificar os marcadorespolimórficos entre os genótipos parentais.

O programa de termociclagem para amplificação foi com-posto de desnaturação inicial a 94°C por sete minutos; segui-do de 30 ciclos de desnaturação a 94°C por um minuto,anelamento a 50°C por um minuto e extensão a 72°C por doisminutos. Um ciclo de 72°C por sete minutos foi feito no final.Os produtos da amplificação foram separados em gel deO,7%de agarose (GibcoBRL) e 1,15% de aditivo clarificador deagarose (Synergel), preparado com TBE lx (108g tris base,55g ácido bórico, 40mL EDTA 0,5M pH 8,0 e água destiladaaté o volume de 1L) e corado com brometo de etídio (lOmg/mL). A aquisição das imagens foi feita utilizando o SistemaKodak Digital DC 290.

O efeito de cada marcador molecular polimórfico sobre aresistência foi considerado significativo quando a probabili-dade fosse menor que 1% (p<O,O1) pelo teste de Qui-quadra-do. Marcadores com probabilidades entre 1% e 10%(O,Ol<p<O,lO) também foram selecionados para verificaçãode seus efeitos sobre a população de plantas suscetíveis. Fo-ram feitas análises de variância para todas as combinações demarcadores polimórficos e número de galhas, usando a médiadas famílias F3da população resistente como efeito principal.Todas as análises estatísticas foram feitas com auxílio do pro-grama de computador SAS (1985).

Resultados e Discussão

Entre os 9710cos analisados, os marcadores de microssatéliteSatt155, Satt236, Satt509, Satt202, Satt266, Satt290, Satt543,Satt423, Satt554, Satt192, Satt418, Satt584, Satt041, Satt434,Satt571, Satt419, Satt367, SaC128, SaU32, SOYHSPI7,6e Sattl14 foram polimórficos para os parentais BRS 133 e PI595099 e todos os 21 pares de primers foram utilizados paraamplificar o DNA da população resistente.

O teste de qui-quadrado (x ') dos 21 marcadorespolimórficos, realizado sobre a população resistente, indicoudois marcadores significativos (P<O,OI) para esta população(Tabela I), SOYHSP 176 e Satt114, pertencentes ao grupo deligação F e ainda, os marcadores Satt57 1, Satt419, Satt367,

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Identificação de marcadores moleculares de mirrossatélites para seleção de genotipos de soja resistentes a Meloidogyne javanica

do grupo de ligação I e os Sac128, SaC132, pertencentesrespectivamente aos grupos de ligação B1 e O, com baixasprobabilidades (O,Ol<P<O,lO). Os demais marcadores foramnão significativos (P>O,lO) e considerados não ligados ao(s)gene(s) que controlam o caráter resistência a Meloidogynejavanica.

Os sete marcadores selecionados foram testados sobre apopulação suscetível, com exceção do primer SaC128 quenão amplificou para esta população, provavelmente por arte-fato da técnica. Os resultados mostraram que os marcadoresSOYHSP 176 e Satt 114, do mesmo grupo de ligação (F),confirmaram sua significância sobre o caráter (P<0,01) tam-bém para a população suscetível (Tabela 2). O marcador Satt571, do grupo I, apresentou probabilidade relativamente bai-xa (P=O,l1), porém o mesmo não OCOITeu para os demaismarcadores analisados, Satt 419, Satt 367 e Sac132 que apre-sentaram probabilidades altas para a população suscetível,46%,37% e 43% respectivamente.

Estes resultados indicaram a existência de uma região

genômica no grupo de ligação F da soja que apresenta genesde resistência a nematóides, confirmando os resultados obti-dos em outros estudos com diferentes tipos de marcadores(Tamulonis et al., 1997a.; Silva et al., 2001a).

Foram realizadas ainda, análises de variância para o núme-ro de galhas e nota atribuída ao nível de infestação, para cincomarcadores selecionados a partir da população resistente (Ta-bela 3).

Os resultados indicaram que os marcadores que melhorexplicam a variação fenotípica, tanto do número de galhascomo para média de nota atribuída ao nível de infestação sãoos marcadores Satt 114 e SOYHSP 176, ambos pertencentesao grupo de ligação F. Para número de galhas, estes marcadoresexplicam 46% e 43% respecti vamente da variação fenotípica;e para média de nota, ambos explicam 70% da variaçãofenotípica.

Apenas para o marcador Satt 114 foram observados indiví-duos heterozigotos. Observa-se que para número de galhas,os indivíduos heterozigotos para Satt 114 apresentaram mé-

Tabela 1. Resultado do teste do qui-quadrado para os 21 marcadores moleculares de microssatélite polimórficos para ocruzamento PI 595099 X BRS 133, realizado sobre a população resultante resistente ao nematóide de galhas, Meloidogynejavanica.

Padrão de marcasMarcador

Grupo de ligação Observado Esperado X2 p (X2) SigmicrossatéliteRI S2 R S

Sall 155 AI 5 8 6.5 6.5 0.69 0.40 nsSatt 236 AI 8 10 9 9 0.22 0.63 ns

Satt 509 BI 12 8 10 10 0.80 0.37 nsSatt 202 C2 II 9 9.5 9.5 0.47 0.49 nsSatt 266 nie-w 10 10 10 10 O I nsSatt 290 ois-w 7 II 9 9 0.88 0.34 nsSatt 543 D2 II 9 10 10 0.20 0.65 nsSatt 423 F 7 10 8.5 8.5 0.52 0.46 nsSatt 554 F II 6 8.5 8.5 1.47 0.22 nsSatt 192 H 9 7 8 8 0.25 0.61 nsSatt 418 L 8 10 9 9 0.22 0.63 nsSatt 584 N 8 12 10 10 0.80 0.37 nsSatt 041 Dlb+W 9 II 10 10 0.20 0.65 nsSatt 434 H II 7 9 9 0.88 0.34 nsSatt 571 I 14 6 10 10 3.20 0.07 *Satt 419 I 5 16 10.5 10.5 5.76 0.01 *Satt 367 I 7 16 I 1.5 I 1.5 3.52 006 *Sal 128 BI 5 12 8.5 8.5 2.88 0.08 *-Sat 132 O 15 5 10 10 5.0 0.02 *-Satt 114 F 19 O 9.5 9.5 190 1.30x 10-5 **

SOYHSP 176 F 20 O 10 10 20 7.74xI0-6 *** e **- significativos respectivamente ao nível de I% e 10% de probabilidade pelo teste de qui-quadradons- não-significativo a 10% pelo teste qui-quadrado. 1- Resistente. 2- Suscetível

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Renata Fuganti, Magda Aparecida Beneventi, João Flávio Veloso Silva, Carlos Alberto Arrabal Arias, Silvana R, N, Marin, Eliseu Binneck & AlexandreLima Nrpomureno

Tabela 2, Resultado do teste de qui-quadrado para os seis marcadores moleculares de microssatéliteselecionados a partir da população resistente, sobre a população suscetível ao nematóide de galhas,Mcjavanica. resultante do cruzamento BRS 133 x PI 595099,

MarcadorPadrão de bandas

Grupo de ligação Observado Esperado X2 P (X2) Sigrnicrossatélite RI S2 R SSall 571 I 9 17 13 13 2.46 0,11 nsSatt 419 I 10 7 8,5 8,5 0,52 0.46 nsSatt 367 I 12 8 10 10 0,8 0,37 nsSat-132 O 15 II 13 13 0,61 0.43 nsSatt 114 F 4 22 13 13 12.46 <0,0004 **

SOYHSP 176 F ° 26 13 13 26 3,14xI0-7 ****Significativo a P<0,05 pelo teste qui-quadrado, ns- não-significativo a 10% pelo teste qui-quadrado, 1- Resistente, 2 - Suscetível

Tabela 3, Resultado da análise de variância para os locos marcadores de microssatélitesignificativamente associados ao número de galhas e média da nota atribuída ao nível deinfestação de plantas das populações resistente (25 linhagens) e suscetível (26 linhagens)ao nematóide de galhas, Mijavanica, obtidas a partir do cruzamento BRS 133 x PI 595099,

Médias do número de galhas * Parâmetros estatísticosLocos demicrossatélite RR1 SR2 SS3 R2** C.V:" P (F)

Satt 571 78,IOa 57,55b 10,82% 45,21% 0,04Sacl28 47,24a 43,94a 3,96% 18,25% 0.47Sat_132 71,85a 63,84a 1.46% 47_52% 0.47Satt 114 45,75b 66,73ab 89,85a 46,02% 35,57% <0_000 I

SOYHSP 176 45,57b 86,20a 43,06% 36,12% <0,0001Médias ~ara nota' Parârnetros estatísticos

RR1 SR SS3 R2" C.V:" P (F)Satt 571 4,64a 2,93b 12,74% 61.49% 0,02SaU28 1.9 Ia 1,75a 0,38% 66_34% 0,81SaCI32 4,60a 3,34a 6,02% 63,82% 0,13Satt 114 1,74b 5,53a 5,78a 70,00% 36,56% <0_0001

SOYHSP 176 1.73b 5,74a 69,93% 36,09% <0,0001I, Número de galhas das linhagens homozigotas para os alelos do progenitor resistente2 Número de galhas das linhagens heterozigotas" Número de galhas das linhagens homozigotas para os alelos do progenitor suscetível*Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<O,05)**Coeficiente de determinação, ***Coeficiente de variação

dia intermediária em relação aos dois homozigotos, não sen-do possível discriminá-Ios fenotipicamente, pelo teste deTukey, das classes resistente e suscetível. Isso só foi possívelcom o uso dos marcadores, servindo como exemplo das van-tagens da técnica molecular sobre a avaliação fenotípica. Omesmo não ocorreu para o caráter nota, que consegue discri-minar apenas as linhagens resistentes (RR), demonstrando amesma eficiência prática do uso de marcadores, Entretanto,essa eficiência da avaliação fenotípica só é alcançada quando

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as progênies de plantas estão disponíveis, enquanto plantasindividuais da geração F2 seriam suficientes para seleção comuso de marcadores, reduzindo o tempo necessário para obterpopulações de plantas resistentes,

O marcador Satt 571, do grupo de ligação I, apresentouefeito significativo (P<0,05) sobre os caracteres número degalhas e nota e pode estar ligado a um segundo gene ou QTLde resistência à M javanica, em conformidade com a hipóte-se levantada por Silva et ai. (2001b) para este cruzamento,

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and models. Van den Bosch K. and G Stacey (Eds.). PlantPhysiology, 131: 840-865.

Identificação de inarcadores moleculares de tnicrossatélites para seleção de genotipos de soja resistentes a Meloiclogyne javanica

Todos os resultados indicam que os marcadores SOYHSP176 e Satt 114, do grupo de ligação F da soja, podem serconsiderados potenciais marcadores moleculares a serem uti-lizados no processo de seleção assistida de genótipos de sojaresistentes ao nematóide de galhas, M. javanica.

Literatura Citada

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Nematologia Brasileira