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“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de

carbohidratos en maíz”

Trabajo de la estudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas:

Giovanna Paulina Aguilera Alvarado

Tutora: Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Para iniciar una investigación, hay que escoger un modelo de estudio…

Gran parte del estudio de la biología moderna se basa en el uso de ORGANISMOS MODELO.

En esencia se asume que a través del estudio detallado de un organismo en particular, se puede

obtener información suficiente que nos ayudará a entender como funcionan otros organismos.

Los organismos modelo deben:

• Ser de tamaño pequeño y fáciles de mantener en el laboratorio.

• Poseer un genoma pequeño.

• Tener un ciclo de vida relativamente corto.

doi:10.1038/nplants.2015.67, Nat Plants (2015).

Escherichia

coli

Saccharomyces

cerevisiae Caenorhabditis

elegans Arabidopsis

thaliana

¡¿Por qué las plantas?!

Las plantas son el esqueleto

de toda la vida en la tierra y

un recurso esencial para la

existencia del ser humano.

Plantas

Agua Alimento

Cambio climático

Hábitat

Aire Medicamentos

http://www.bgci.org/plantconservationday/whyplantsimportant/

Price et al., Plant Cell (1994).

Glucosa: el carbohidrato más estudiado.

HEXOCINASA (EC 2.7.1.1).

HXK

ATP(Mg2+) D-Hexosa ADP(Mg2+)

D-Hexosa 6-P

Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto PCP 2017

Pero ¿Qué es una proteína moonligthing?

1. Una PROTEÍNA

MOONLIGHTHING es aquella

que es capaz de llevar a cabo más

de una función.

2. Muchas de estas proteínas son

enzimas, receptores, canales

iónicos o chaperonas.

3. A través de la evolución estas

enzimas adquirieron funciones no

enzimáticas secundarias por

ejemplo, la transducción de

señales, la regulación

transcripcional, de la apoptosis y

estructural.

http://www.moonlightingproteins.org/results.php?search_text=hexokinase&searching=yes&search=search

La función de la hexocinasa impacta en el metabolismo y también en la señalización

Hexocinasa

G-6P

Metabolismo

Glucólisis

Vía Pentosas

Síntesis de nucleótidos

Biosíntesis de lípidos

Biosíntesis de almidón

Vía de señalización glucolítica

Inducción:

PR1 y PR5; Transportadores nitrato; factores

transcripcionales FTZ

Cambio conformacional independiente de catálisis

Vía de señalización dependiente de HXK

Represión:

1. GENES FOTOSINTÉTICOS

2. Ciclo del glioxilato

3. Algunos transportadores

Inducción:

Factores transcripcionales MYB34, MYB51, MYB122; De respuesta a ABA RAB18

HXKs contribute to regulate the plant development

Aguilera-Alvarado P

promoting germination preventing seedling supporting vegetative growth floriation and restoring transducing senescence

establishment at high male fertility signals

Glc concentration

Se necesita mayor investigación del papel fisiológico de cada HXK para: 1. Avanzar en el entendimiento de los mecanismos de señalización en plantas y 2. Relevante para una aplicación práctica en especies agronómicamente importantes como el maíz.

Lo que se sabía en maíz…

Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto PCP 2017

Predicción in silico. 1. El experimento o predicción in silico se hace con el análisis mediante un

programa de computo que puede buscar de manera específica: condiciones

experimentales, comparar secuencias, hacer predicciones como de:

localización subcelular, plegamiento de proteínas, unión de sustratos, entre

otros

2. Aunque también en la experimentación in silico se pueden realizar

simulaciones.

Functional characterization of the HXK family in maize

1. ¿los genes que se propone (putativos) codifican para

HXK de acuerdo al análisis in silico si codifican para las

HXKs?

CLONACIÓN MOLECULAR.

La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante

son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.

https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

Embrión

de maíz

Se necesitaba un

molde…

24h

RNA

Transcripción

reversa

cDNA

TRIzol

5’UTR ORF 3’UTR

Mucha similitud entre HXKs

Diseño de primers

¡PCR!

Adenilación

y ligación Miles copias

del cDNA de

las HXKs de

maíz

Transformación

y secuenciación HXKs

aisladas

Clonación mediante

tecnología Gateway. Esta tecnología usa el

sistema de recombinación del

fago lamba para facilitar la

transferencia de secuencias

de DNA heterólogo

(flanqueado por los sitios att)

entre diferentes vectores. Se

basa en dos reacciones de

recombinación.

Vectores de expresión para

producción de proteína

recombinante en:

1. E. coli (His y V5)

2. Levadura (sin tag)

3. Planta (GFP)

INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).

Inducción con IPTG

RNA pol E. coli

lacI

lacI

RNA pol T7 RNA pol T7

lacI

lacI

RNA pol T7

Gen de interés

Inducción con IPTG

pEXP42

Genoma de E. coli BL21 (DE3)

ptRNAR

ptRNAI

ptRNAL

Probar diferentes

condiciones:

o Temperatura

o Tiempo de inducción

o [IPTG]

o Cepa

o Tag

Purificación de proteínas con etiqueta de histidinas

Resina unida a Níquel Proteína con

etiqueta de Histidinas

Maize recombinant HXKs were produced in E. coli

Western Blot

Anti-V5

ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6

ZmHXK7 ZmHXK8

HXK-His tagged recombinant protein purification

Insoluble and non-active enzymes

Paulina Aguilera

Alvarado

AtHXK1

AtHXK2

OsHXK5

OsHXK6

OsHXK7

OsHXK8

ZmHXK4

ZmHXK5

ZmHXK6

ZmHXK7

ZmHXK8

ZmHXK9

MEM*

Citosol

*Membrana Externa Mitocondrial

Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol

(2009)

ZmHXK4, 5, 6 and 9 have an hydrophobic sequence at the N-terminal

Production and isolation of the truncated versions of recombinant maize HXKs.

ZmHXK430 ZmHXK530

ZmHXK630 ZmHXK930

Western blot

using the anti-

V5 antibody

PAGE-SDS

of His tagged

recombinant

protein

purification

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato o la

aparición del producto

Aquí fue mediante un ensayo acoplado a la aparición de un producto.

y = 0.1435x + 0.2075

R² = 0.9998

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3

Ab

s 3

40n

m

Tiempo (min)

Curva temporal de actividad de HXK

Fig. 1. Saturation curves for

HXK activity using glucose as

substrate.

HXK activity of maize isoenzymes was

measured for the recombinant versions.

A) ZmHXK4Δ30, B) ZmHXK5Δ30,

C) ZmHXK6Δ30, D) ZmHXK7,

E) ZmHXK8 and F) ZmHXK9Δ30.

The reaction medium contained 2.5 µg of

purified recombinant protein, a fixed

concentration of ATP (2 mM) and Glc

concentration varied from 0.01 to 100 mM. The

data was adjusted to Michaelis-Menten

equation. The graphics were obtained with the

Origin 8.0 software.

Figure S5. Saturation curves of

HXK activity of ZmHXKΔ4-Δ6

and ZmHXKΔ9 for Fru, Man

and ATP. The effect of Fru (A, D, G, J) and

Man (B, E, H, K) in the

hexokinase activity was

determined in an assay medium

containing 2 mM ATP. To

determining the Km for ATP (C,

F, I, L) 5 mM glucose was

included in the reaction medium.

A, B, C) ZmHXKΔ4 activity; D, E,

F) ZmHXKΔ5 activity; G, H, I)

ZmHXKΔ6 activity and J, K, L)

ZmHXKΔ9 activity.

Kinetic parameters of recombinant maize hexokinases

Soluble

proteins in

full

versions

Soluble

proteins

in

truncated

versions

Incorrect protein folding?

Preferencia de sustratos

Man Glu Fru

Gene Name ID number Putative

function

HXK

activity

ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND

ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND

ZmHXK4 GRMZM2G058745 HXK Yes





ZmHXK9 GRMZM2G171373 HXK No

ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND

ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and

activity demonstrated.

Functional complementation assay

A mutation that confers

growth defects

Successful

complementation

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN:

Es decir se usa un fragmento de DNA (que se sospecha tiene una función específica)

que se usa para transformar un mutante (para la función deseada) para revertir el

fenotipo silvestre. Se utiliza para identificar la función del gen específico.

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 complement the function of the yeast mutant

The truncated versions grow better than the full versions, even ZmHXK9

Análisis in silico de la secuencia de aminoácidos de la proteína: Alineamientos

Adenosina(425-461) G44

1 AtHXK1

AtHXK2

AtHXK3

AtHKL1

AtHKL2

AtHKL3

OsHXK1

OsHXK2

OsHXK3

OsHXK4

OsHXK5

OsHXK6

OsHXK7

OsHXK8

OsHXK9

OsHXK10

ZmHXK3a

ZmHXK3b

ZmHXK4

ZmHXK5

ZmHXK6

ZmHXK7

ZmHXK8

ZmHXK9

ZmHXK10

Gouy et al., Mol Biol Evol (2010).

Maíz

Arroz

Arabidopsis

Maíz

Arroz

Arabidopsis

AtHXK1

AtHXK2

AtHXK3

AtHKL1

AtHKL2

AtHKL3

OsHXK1

OsHXK2

OsHXK3

OsHXK4

OsHXK5

OsHXK6

OsHXK7

OsHXK8

OsHXK9

OsHXK10

ZmHXK3a

ZmHXK3b

ZmHXK4

ZmHXK5

ZmHXK6

ZmHXK7

ZmHXK8

ZmHXK9

ZmHXK10

Gene Name ID number Putative

function

HXK

activity

ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND

ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND







ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND

ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and

activity demonstrated.

2. ¿Maize also has a sensor HXK?

¿Cómo determinar que una HXK también es sensora?

ENSAYOS FARMACOLÓGICOS (análogos de Glu)

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN ARABIDOPSIS

Ensayo de complementación en A. thaliana.

¿Cómo se obtiene una mutante de A. thaliana?

MUTAGÉNESIS AL AZAR

Etil metano sulfonato (EMS): Muy mutagénico y poco letal; alquila las bases de G

provocando desapareamiento. Por otro lado, la G alquilada puede aparearse con las T

provocando una transición G/C a A/T.

Maple & Moller, Methods Mol Biol (2007); http://file.scirp.org/Html/8-3000817_48085.htm

Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).

gin2-1

A. tumefaciens

p35:ZmHXK:3HA HygR suspension

T1 Selection

medium (Hyg)

Complementation assay with the maize HXKs using A. thaliana HXK1 mutant, gin 2-1

T4

Genotype:

hxk1 deletion mutant

Phenotype:

Glu insensitive plants

Develop Green

cotyledons in the

presence of Glu

Phenotype:

Glu sensitive plants

Develop purple

cotyledons,

anthocyanin

accumulation in the

presence of Glu

Ensayo de complementación en A. thaliana.

Glu 6%

Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).

ZmHXK

5 Ler - 1 2 1 2

ZmHXK

4

gin2-1

2% Glc

2%

Mannitol

ZmHXK

9 Ler - 1 2 1 2

gin2-1

ZmHXK

8 Ler - 1 2 1 2

ZmHXK

7

gin2-1

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 restored the Glu sensitivity

ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 seem to be a dual function

proteins

We need to have the repression of the photosynthetic genes

to probe that the HXKs are sensor proteins

ZmHX

K6

Las HXK se pueden encontrar en diferentes compartimentos subcelulares

HEXOCINASA EN PLANTAS

Citosol

Núcleo

Plastidio

Mitocondri

a

RE

Filamento

s de actina

Tipo

A

Tipo

B

Tipo

C

Tipo

D

Cho et al., Planta (2006); Cheng et al., Biol. Plantarum (2011); Claeyssen y Rivoal, Phytochemistry (2007); Frommer et al., Science (2003); Nilsson et al., BMC

Plant Biol. (2011)

Síntesis de almidón y

ácidos grasos. Tipo A

Metabolón glucolítico.

Protección contra ROS. Tipo B

Síntesis de almidón y

ácidos grasos.

Energía en hipoxia.

Tipo C

Podrían tener las mismas

funciones que las tipo B. Tipo D

Two groups of HXKs are identified: Low and high sensitivity to ADP and G6P

Low or null

sensitivity

PREDICCIÓN DE LA LOCALIZACIÓN CELULAR.

http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html

Se basa en la

hidrofobicidad de los

aminoácidos.

Se basa en la presencia de

presecuencias en el N-

terminal.

Cruce transmembranal

ZmHXK4 ZmHXK7

Protoplastos

Vector pEarlyGate

HXK-GFP

Transformación

GFP RFP Superposición

CFP YFP Superposición

Those HXK soluble in full version, with low sensitivity to ADP and G6P are

localized at the cytosol

Bright field GFP Mitotracker Merged

A

B

ZmHXK7

ZmHXK8

GFP

alone

C

HXKs-GFP

The insoluble in full versions of ZmHXK4, 5, 6 and 9, which also are sensitive to ADP and G6P are

mitocondrial proteins

ZmHXK4

ZmHXK5

ZmHXK6

ZmHXK9

AtHXK1


A

B

C

D

E

The localization of ZmHXK4-6 and 9 greatly relies on the first 30 amino acids of the N-terminal domain

ZmHXK4Δ30

ZmHXK5Δ30

ZmHXK6Δ30

ZmHXK9Δ30


A

B

C

D

OsHXK5

OsHXK6

ZmHXK4

ZmHXK5

ZmHXK6

ZmHXK7

ZmHXK8

ZmHXK9

Nuclear localization

signal

Mitochodrial target peptide

Aki & Yanagisawa, J. Proteome Res. (2009); Cho et al., Planta (2006); Cho et al., Plant Physiol. (2009); Yanagisawa et al., Nature (2003).

Two localization sequences were identified in several plant HXKs

Nuclear localization is related to their sensor function

ZmHXK6

Δ30-GFP

ZmHXK6

Δ30-GFP

Bright field GFP Hoescht Merged

Alejandro

Hernández

Loyola

Colaborators Dr. Arturo Guevara Instituto de Biotecnología, Cuernavaca Morelos Dr. José Luis Hernández Mendoza Instituto de Ciencias Genómicas IPN, Tamaulipas. Dr. Javier Plasencia de la Parra, Dra. Marina Gavilanes Ruíz, Dra. Karina Durán (USAI-Microscopía confocal) Q. Laurel Fabila Ibarra Facultad de Química, UNAM Dra Sara L. Morales-Lázaro Dra. Tamara Rosenbaum Instituto de Fisiología Celular

Colaborators

M. en C. Paulina Aguilera Alvarado

Dr. Fernando Guzmán Chávez

M. en C. Roberto Carvente García

M. en C. Montserrat López Coria

pQA Alejandro Hernández Loyola

QA Itzel Palacios Vargas

QFB Mireya Flores Barrera

QFB Néstor E. Delgado Rubio

pQFB Nancy Hernández Chávez

pQA Méndez Ramírez Moisés

pQA Muñoz Chapul Daniela

M. en C. Beatriz King Díaz

Funding

ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.

La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado,

investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser

puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.

Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa

¿Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae?

Deleción

Ronda 1

PCR

Homología

con el gen

de interés

Homología

con el gen

de interés Primer de homología

Primer de homología

Templado

2

Ronda 2

PCR

Cassette de deleción

La levadura perdió un

gen pero adquirió otro,

en este caso uno que le

permite crecer en

presencia de Kan

Confirmació

n por PCR

Primer UPTAG

Homología

con el gen

de interés

Templado

Resistencia

o

prototrofía

Primer DNTAG

Homología

con el gen

de interés

Inserción del cassete

por recombinación

homóloga

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