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IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS DE P.

FALCIPARUM EN LA VÍA ALTERNA DE SECRECIÓN

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

[2003]

DR. CÉSAR NÁQUIRA VELARDEBLG. GISELY HIJAR GUERRRABLG.. CARLOS PADILLA ROJAS

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº88

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS SECRETADAS DE P. FALCIPARUM EN LA VÍA ALTERNA DE SECRECIÓN

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INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. IDENTIFICACIÓN

Código del Proyecto de investigación: 2-01-05-03-074

Centro de referencia: Centro Nacional de Salud Publica

Título Identificación y caracterización de proteínas secretadas de P. falciparum en la vía alterna de secreción

Autores:

a. Blg. Gisely Hijar GuerrraLaboratorio de Biotecnología y Biología MolecularINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

b. Dr. César Náquira Velarde.División de parasitologíaINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

c. Blg.. Carlos Padilla RojasLaboratorio de Biotecnología y Biología MolecularINSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Categoría científica:

II. RESUMEN


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La malaria ocasiona una considerable morbilidad en las Américas,

principalmente en la región de la Cuenca Amazónica, donde el P. falciparum es el

principal responsable. En el Perú, sólo hasta la semana 37 del año 2003, se han

notificado 11636 casos confirmados de malaria por P. falciparum. Durante el

mismo periodo del año 2002, se notificaron 15088 casos (Oficina General de

Epidemiología. Boletin Epidemiológico Semanal 2003, Vol XII, N° 37). Por lo tanto

es una prioridad en nuestro país la investigación en métodos de diagnóstico que

sean rápidos, sensibles, sencillos y económicos.

La importancia del presente estudio era el conocer las características de los

antígenos secretados por P.falciparum por vía alterna de secreción, los cuales

podrían ser utilizados en un futuro para la elaboración de una prueba rápida

basadas en detección de estos antígenos.

Los datos generados por el presente estudio indican que antígenos de

P.falciparum son mayoritariamente secretados por la vía clásica de secreción y

algunos antígenos menos representados en la vía alterna.

INTRODUCCIÓN

La Malaria es la enfermedad parasitaria más importante que afecta al

hombre (Wensdorfer WH y McGregor I, 1988). Aproximadamente 41 % de la

población mundial se encuentra en riesgo de adquirirla y cada año se reportan

entre 300 a 500 millones de casos de malaria, siendo más del 90% de estos

reportados en el África. Aproximadamente 2 millones de muertes por año son

atribuidas a esta enfermedad, la mitad de ellas, en niños menores de 5 años de

edad (UNDP/World Bank/WHO 1996).

Durante la etapa eritrocitaria, Plasmodium falciparum sintetiza diversas

proteínas algunas de las cuales son exportadas dentro del citoplasma del eritrocito.

Estas proteínas son solubles y se las detecta circulando en la sangre de los

pacientes infectado, ejemplo de estas proteínas son la proteína que unen

glicoforina (GBP), la proteína rica en histidina (HPRII), y la lactato deshidrogenasa

(pLDH) de Plasmodium falciparum. En la actualidad estas proteínas son utilizadas

para el desarrollo de pruebas rápidas para le diagnóstico de esta enfermedad.

Estos antígenos son secretados por la vía clásica de secreción de proteínas de

P.falciparum. Sin embargo, últimos estudios demuestran varias proteínas de

Plasmodium falciparum no son secretadas por esta vía sino por una vía

independiente denominada vía alterna de secreción. Esta vía de alterna de

secreción y las proteínas que son secretadas por medio de ésta no han sido


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caracterizadas, dada la importancia de estos antígenos secretados es necesario su

estudio detallado.

Investigaciones realizadas en la vía clásica de secreción de proteínas de P.

falciparum, así como el secuenciamiento del genoma total de este parásito, han

permitido postular una vía alternativa de secreción de proteínas, denominada vía

alterna. El conocer más sobre esta vía de secreción podría ayudar a elucidar

algunos mecanismos patogénicos de este parásito, así como permitiría encontrar

nuevos antígenos que podrían ser utilizados en pruebas ó métodos diagnósticos.

Plasmodium falciparum, es un parásito protozoo que infecta eritrocitos

humanos causando algunas veces malaria severa durante la etapa intraeritrocitica,

durante esta etapa el parásito sintetiza y secreta proteínas, las cuales son

exportadas a las células del huésped. Algunas de estas proteínas son importantes

en la detección del parásito debido a que se encuentra circulando en sangre

durante la infección.

P.falciparum, al igual que las células eucariotas secreta proteínas a su entorno

mediante una vía de secreción denominada clásica, toda proteína secretada que

es sintetizada directamente al lumen del Reticulo Endolplasmatico Rugoso, donde

sufre una serie de modificaciones como glicosilación, posteriormente mediante un

sistema de vesículas estas proteínas son transportadas al Aparato de Golgi y luego

son exportadas por medio de vesículas al exterior (Lodish, H et al; 1999)

Sin embargo, P.falciparum presenta algunas perculiaridades en su vía de

secreción clásica que los diferencia de los demás eucariontes superiores como por

ejemplo en su Reticulo Endolplasmatico (RE) el cual ha perdido algunos sistemas

de vesículas (Langreth, S.G. y colab 1978) y su Aparato de Golgi es un

compartimiento pequeño con estructuras parecidas a vesículas (Meis, J.F.G.M y

colaboradores 1983; Slomianny, C. y Prensier, G.1990). Además en Plasmodium

el RE y el aparato de Golgi parecen estar más desarrollados en los estadios

tardíos del ciclo replicativo.

Así es importante mencionar que algunos componentes proteicos de la vía

secretoria intracelular clásica han sido identificadas en Plasmodium esto incluye a

la ATPasa de calcio del RE, la proteína Sec 61alfa, un componente de la

translocación del poro en el RE denominado BiP, una chaperona en el lumen del

RE, denominada reticulobalbina, y una proteína que une calcio del RE denominada

ERD2 (Elmendorf, H.G. and Haldar, K,1993).

Entre las proteínas que secreta Plasmodium falciparum por la vía clásica de

secreción destaca la proteína rica en histidina (HRPII), la cual es hidrosoluble, y la


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proteína lactato deshidrogenasa de P.falciparum (pLDH) ambas empleadas en el

diagnóstico rápido de la malaria.

Actualmente con el conocimiento del genoma, nuevos marcadores y nuevas

tecnologías se ha podido especular de la existencia de una vía alterna de

secreción. Benting J, y colaboradores han estudiado esta vía utilizado como

marcador a la proteína de Plasmodium falciparum que une glicoforina (GBP), esta

proteína es normalmente secretada al citoplasma del eritrocito por vía clásica de

secreción. (Helms y Rothman 1992). Estos investigadores encontraron que en

presencia de Brefeldina A (BFA), inhibe las proteínas de secreción en organismos

eucariontes superiores por ruptura de la integridad del aparato de Golgi, la GBP no

fue transportada dentro del eritrocito, pero permanece dentro de la célula del

parásito. Los efectos causados por BFA fueron reversibles, y la proteína puedo ser

expulsada al citoplasma del eritrocito.

El efecto de la Brefeldina A en la secreción de proteínas de P.falciparum y la

identificación de genes que codifican proteína auxiliares indican una vía secretoria

dentro del parásito involucra el trafico de vesículas. Sin embargo, las proteínas de

secreción de P.falciparum tienen un número de peculiaridades: (i) Muchas

proteínas del parásito que están transportados a través de la membrana vacuolar

dentro del eritrocito del hospedero no contiene la secuencia de señal clásica N-

terminal (Foley and Tilley, 1998); (ii) Varias proteínas han sido reportadas ser

secretadas en presencia de BFA (Elmendorf et al., 1992; Mattei et al., 1999ª).(iii) El

tratamiento con BFA causa la formación de compartimientos parecidos a RE

(Wiser et al., 1997; 1999). Así mismo, Cortes et al 2003, ha reportado que

proteinas son localizadas a un único compartimento subcelular usando anticuerpos

monoclonales. Estos anticuerpos monoclonales reconocen proteínas de 68, 45 y

22 kDa que son conservadas en especies de Plasmodium de roedores. Estudios

de colocalización indican que estas proteínas son localizadas en compartimientos

inducidos por Brefeldina A en la etapa temprana de exportación de proteínas al

eritrocito infectado. Estas proteínas se co-localizan parcialmente con las proteínas

tipo COPII, Sar1p y Sec31p y la proteína chaperona BiP (Elmendorf et al., 1992;

Wiser et al., 1999) (Cortes et al, 2003).

MATERIAL Y MÉTODO

Diseño de estudio :

Estudio Descriptivo


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Material Biológico :

Cultivo de P. falciparum

La cepa referencial que se empleará en este trabajo corresponde a Plasmodium

falciparum FCR3 obtenido de un aislamiento africano (Gambia), asi mismo las

cepas 3D7, 7G8, D10, D6,Dd2 y W2. Estas cepas referenciales seran mantenidas

en cultivo in vitro mediante el método de Trager (1976). Las cepas han sido

clasificadas por Taxonomy Browser del National Center for Biotechnology

Information (NCBI) como: Eucariota; Alveolata; Apicomplexa; Haemosporida;

Plasmodium; Plasmodium falciparum.

Con la finalidad de comparar los resultados obtenidos de las cepas referenciales

sé incluiran dos aislamientos peruanos (cepas masntenidas en cultivo in vitro) uno

proveniente de la Costa Norte y el otro de la Selva Peruana.

Para la inhibición de la vía clásica de secreción se utilizará BFA a una

concentración de 0.5 mg/ml.

a.- Purificación de proteínas secretadas al citoplasma del eritrocito

Las fracciones citosólicas de eritrocitos infectados por P. falciparum cepa FCR3

serán obtenidas en presencia de inhibidores de proteasas (Bottius E y colab.,

1998). La fracción citosólica será extraída según lo reportado (Clavijo CA y colab.,

1998). Las membranas seràn colectadas usando Percoll, lavadas con PBS

conteniendo inhibidores de proteasas. El pellet será resuspendido en PBS

conteniendo inhibidores de proteasas y 0.05% de saponina seguido de

centrifugación a 10000 g por 10 minutos, seguidamente el pellet será resuspendido

en 1% de Triton X-100 a 4°C y centrifugado nuevamente a 10000 g. La cantidad

de proteínas será cuantificada por el método de Lowry (Lowry O, et al , 1951).

RESULTADOS

a.- Establecimiento del Cultivo de P.falciparum

La cepa referencial que se empleó en este trabajo corresponde a Plasmodium

falciparum PSS1 (Brasil), FCR3 obtenido de un aislamiento africano (Gambia), así

mismo las cepas D6,7G8 y W2. Estas cepas referenciales seran mantenidas en

cultivo in vitro mediante el método de Trager (1976). Las cepas han sido

clasificadas por Taxonomy Browser del National Center for Biotechnology


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Information (NCBI) como: Eucariota; Alveolata; Apicomplexa; Haemosporida;

Plasmodium; Plasmodium falciparum.

Las cepas 7G8 , D6, W2,PSSI, HB3 y FCR3, fueron cultivadas in vitro con medio

RPMI 1640 suplementado con Glutamina, plasma humano y eritrocitos grupo O

positivo.

Mezcla de gases de 5% O 2, 10% CO2 y Nitrógeno 85%. Los cultivos fueron

incubados a 37°C y el medio de cultivo fue renovado diariamente.

Ver Figura N°1 a—d Mantenimiento y obtención de antígenos a gran escala.


8

b. Proteínas secretadas al citoplasma del eritrocito

Las fracciones citosólicas de eritrocitos infectados por P. falciparum cepa FCR3

fueron obtenidas mediante cetrifugación y mediante lavados con el Buffer PSS 1X.

La cantidad de proteínas fue cuantificada por el método de Lowry (Lowry O, et al,

1951).

c. Inmunogenisidad de las proteínas citosolicas de P.falciparum

Las proteínas secretadas al medio han sido obtenidas y analizadas por

electroforesis en geles de poliacrilamida, a demás fueron transferidos a membrana

de nitrocelulosa, para evaluar su reactividad.

Proteínas totales a partir de cultivo PSSI fueron utilizadas para el ensayo de

inmunoblot , empleando un pool de sueros de pacientes positivos a P.falciparum.

Las proteínas fueron de bajo peso molecular de 5, 20 y 30 KDa. Ver Figura.

N°2.

d. Detección de HRPII (proteína secretada por la vía clásica de P. falciparum.)

Las proteínas citosólicas fueron evaluadas mediante ELISA para ver determinar

si estas proteínas eran secretadas. Así mismo se probó con diferentes fracciones

de las muestras sanguíneas de pacientes infectados con malaria falciparum.

Ver Tabla N° 1.

e. Extracción de ADN y Polimorfismo Genético.

Se extrajo ADN de las cepas utilizando columnas de purificación y se realizó el

análisis de polimorfismo. Ver Figura N° 3.

f. Genotipificación de la resistencia

El patrón molecular de resistencia para Cloroquina fue ADN fue analizado

resistencia a CQ empleando el marcador molecular de P.falciparum (pfCRT). Ver

Tabla N° 2.


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CONCLUSIONES

El cultivo continuo de cepas de P.falciparum Referenciales fue implementado mediante el método de Trager and Jensen.

La tasa mayor tasa de crecimiento de las cepas de P.falciparum PSS1 y FCR3 (cepas no clonadas) a diferencia de las cepas clonadas

Las proteínas secretadas al medio presentan un peso molecular bajo.

Las cepas presentan bandas únicas para marcadores polimorfismos MSA, GLURP, las cuales confirman que las cepas son puras y no presentan mezclas entre ellas.

Las cepas presentan las mutaciones asociadas a resistencia a antimaláricos pfCRT.

Lamentablemente por la falta compra de insumos no se pudo cumplir con los otros objetivos específicos del proyecto original.

Estrategias de divulgación

Estos resultados serán publicados en la revista de la Institución


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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Clavijo CA, Mora CA, Winograd E. Identification of novel membrane structures in Plasmodium falciparum infected erythrocytes. Mem Inst Oswaldo Cruz 1998;93:115–20.

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Elmendorf, H.G. and Haldar, K. 1993. Identication and localization of ERD2 in the malaria parasite Plasmodium falciparum separation from sites of sphingomyelin synthesis and impliations for organization of the Golgi. EMBO J. 12, 4763-4773.

Langreth, S.G..1978. Fine structure of human malaria in vitro. J. Protozool. 25, 443-452.

Lanners HN, Bafford RA, Wiser MF. 1999.Characterization of the parasitophorous vacuole membrane from Plasmodium chabaudi and implications about its role in the xport of parasite proteins. Parasitol Res.May;85(5):349-55

Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E.New York: W. H. Freeman & Co.; c1999.Molecular Cell Biology. 4th ed.

Lowry O Rosebrough N,Farr A,Randall R.J. 1951.Protein Measurement with the folin Phenol Reagent. J Biol Chem. 193:265 -275.

Gladys Thalia Cortes, Enrique Winograd , Mark F. Wiser. Characterization of proteins localized to a subcellular compartment associated with an alternate secretory pathway of the malaria parasite. Molecular & Biochemical Parasitology 129 (2003) 127–135.

Meis, J.F.G.M. et al. 1983. Ultrastructural studies of a vesicle system associated with the endoplasmic reticulum in erythrocytic forms of Plasmodium berghei. J. Protozool. 30, 111-114.

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11

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Trager W, Jensen JB Human malaria parasites in continuous culture. Science. 1976 Aug 20;193(4254):673-5

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Wiser MF, Grab DJ, Lanners HN. 1999 An alternative secretory pathway in Plasmodium: more questions than answers. Novartis Found Symp ;226:199-211; discussion 211-214.Wiser MF, Lanners HN, Bafford RA. 1999. Export of proteins via a novel secretory pathway. Parasitol Today 1999 May;15(5):194-198.


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ANEXOS

Figura 1 a. Manteniendo de cultivo de P.falciparum a gran escala para la obtención de proteínas citosólicas

Figura 1 b. Coloración de láminas para determinar el estadio de los parasitos


13

Figura 1 c. Coloración de láminas de frotis

Figura 1 d. Coloración de Laminas

AAnniillllooss

EE

EE

EE

EE

EE

EE

EE


14

Figura N°2 . Electroforesis de proteínas de P.falciparum.1; Estándar de peso molecular; 2: cepa 7G8; 3. cepa D6 ; 4: cepa D6 ( medio completo con eritrocitos).

RESULTADOS DE ELISA

1 2 3 4 5 6 7 8 9A 1.468 2.018 0.859 1.411 1.766 0.052 0.627 0.038 0.040B 1.491 1.933 0.785 1.239 1.75 0.051 0.595 0.040 0.040C 0.143 0.728 0.978 0.143 0.057 0.600 2.673 0.037 0.040D 0.14 0.657 0.986 0.122 0.050 0.660 2.597 0.04 0.041E 1.632 1.985 0.782 1.235 1.674 0.610 0.578 0.046 0.042F 1.645 1.641 0.837 1.279 1.504 0.055 0.523 0.051 0.031G 0.198 0.54 1.073 0.129 0.050 0.064 2.583 0.039 0.037H 0.18 0.485 1.036 0.121 0.057 0.074 2.601 0.051 0.043

g Monoclonal contra HRP II500 ng Monoclonal contra HRP IIDilución de los antígenos 1/25

Tabla N° 1. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas.

1155 KKDDaa

2255 KKDDaa

3355 KKDDaa

5500 KKDDaa

7755 KKDDaa

110000 KKDDaa

11 22 33 44

~~ 55 KKDDaa

~~ 2200 KKDDaa

~~ 3300 KKDDaa


15

Cepa PSSI

1 2 3 4 5 6 7

sobrenadante cultivomedio de cultivo sin infectar

Sangre Perifierica

infectar

Eritrocitos s/infectar

Suero de Paciente

sangre total de Paciente

0.859 0.978 0.057 0.060 0.052 0.627 2.6731ug

0.785 0.986 0.050 0.066 0.051 0.595 2.5970.822 0.982 0.0535 0.063 0.0515 0.611 2.635

Tabla N° 1a. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Deteccion de HRPII por ELISA1ug de Monoclonal

Sobrenadante de Cultivo

Cultivo

medio de cultivo solo

Sabgre periferica

Eritrocitos sin infectar

Suero de Paciente

Sangre de Paciente

Grafico N° 1. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug) empleando el Anticuerpo Monoclonal HRPII.


16

1 2 3 4 5 6 7

sobrenadante cultivomedio de cultivo sin infectar

Sangre Perifierica

infectar

Eritrocitos s/infectar

Suero de Paciente

sangre total de Paciente

0.782 1.073 0.050 0.064 0.061 0.578 2.583500 ng

0.837 1.036 0.057 0.074 0.055 0.523 2.6010.8095 1.0545 0.054 0.069 0.058 0.551 2.592

Tabla N° 1b. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 500 ng)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Deteccion de HRPII por ELISA500ug de Monoclonal

Sobrenadante de Cultivo

Cultivo

medio de cultivo solo

Sabgre periferica

Eritrocitos sin infectar

Suero de Paciente

Sangre total de Paciente

Grafico N° 2. Absorbancias obtenidas durante el ELISA para detección de proteínas secretadas (cepa PSS1, 1ug) empleando el Anticuerpo Monoclonal HRPII


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Figura N°3. Electroforesis de productos de PCR . PM, 100 pb ladder; 2: cepa D6 (GLURP); 3. cepa D6 (MSA2); 4: cepa PSSI (MSP2); 5: cepa PSSI (GLURP).

Tabla N° 2.Perfil de Resistencia a la droga antimalarica: Cloroquina

PSSIFCR3

W2

D6

CQ-SHB3

Honduras

CQ R Brasil

CQ R Africa

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