· I Universidad Nacional de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de...

I

Universidad Nacional de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Biología y Biodiversidad

Cancrosis del Álamo en Plantaciones Comerciales de la Región

del Comahue. Estado Actual y Perspectivas.

Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Biología

Autor: María Cristina Pozzo Ardizzi

Director: Silvia Lopez

Lugar de Trabajo: Centro Universitario Regional Zona Atlántica Universidad Nacional del Comahue

Viedma – Río Negro

Viedma (2013).

II

Cancrosis del Álamo en Plantaciones Comerciales de la Región

del Comahue. Estado Actual y Perspectivas

Resumen

El agente causal de la Cancrosis del Álamo es Septoria musiva y entre las

especies e híbridos del género Populus hay genotipos que van desde

tolerantes a muy susceptibles. La hipótesis de esta tesis estableció que esos

diferentes comportamientos se debían a diferencias anatómicas y fisiológicas

en los órganos susceptibles que constituían mecanismos de defensa pasiva

que podían regular la intensidad de los síntomas. Utilizando métodos

histológicos se describieron y compararon diversas características foliares y

caulinares en clones susceptibles (Í 214è Í 488`) y tolerantes (Ćonti 12` y

´Ballestra`). Mediante análisis de Componentes Principales se determinó que

los clones tolerantes poseían hojas más gruesas, con células epidérmicas y

cutículas de mayor espesor generando una superficie foliar lisa, con un

menores densidades estomáticas y tallos con peridermis más gruesas, con una

menor superficie lenticelar, y con cortezas que forman las peridermis

necrofilacticas más próximas a las lesiones, que los clones susceptibles.

Debido a que los clones más difundidos presentaban diferentes niveles de

incidencia en los diferentes valles irrigados de la región del Comahue, se

realizaron muestreos en diferentes localidades y el patógeno sólo fue

encontrado en los valles de Viedma, General Conesa y Río Colorado.

Palabras clave: Septoria musiva - Pxcanadensis - intensidad de la enfermedad

- características de los órganos susceptibles - mecanismos de defensa pasiva.

III

Septoria Leaf Spot and Stem Canker of Poplar in Commercial

Plantations of the Comahue Region. Current State and

Perspectives

Summary

The causal agent of the Septoria Leaf Spot and Stem Canker is Mycosphaerella

populorum and there are genotypes that ranging from tolerant to very

susceptible among Populus species and hybrids. The hypothesis of this thesis

established that those different behaviors were due to anatomical and

physiological differences in the susceptible organs constituting passive defense

mechanisms that could regulate the symptoms intensity. Different

characteristics of the stem and foliage were described and compared in

susceptible (Í 214 'e Í 488') and tolerant (Ćonti 12' and ´Ballestra') clones

using histological methods. Through Principles Components Analysis was

determined that the tolerant clones had thicker leaves, with thicker epidermis

and cuticles, with a lower stomata densities and thicker peridermis stems, with a

lower lenticelar surfaces, and with cortex that form the necrophilactic periderm

closer to injuries, than the susceptible clones. Since the most widespread

clones had different levels of incidence in the different irrigated valleys of the

region of Comahue, samplings were carried out in different locations and the

pathogen was only found in the Viedma, General Conesa and Colorado River

valleys.

Keywords: Septoria musiva - P. xcanadensis - disease intensity - susceptible

organs characteristics - passive defense mechanisms.

IV

Agradecimientos

A mi Directora, la Dra. Silvia Lopez, por su gran dedicación y capacidad

para orientarme en esta etapa de mi formación académica. Gracias por

el esfuerzo realizado durante las largas horas de revisión y corrección.

A mis compañeras y amigas del alma Gaby y Graciela, por compartir

esta etapa de mi vida, por ayudarme y contenerme siempre.

A la institución universitaria que me contuvo durante tantos años, y

donde realicé la mayor parte de esta tesis, el Centro Universitario

Regional Zona Atlántica de la Universidad Nacional del Comahue.

A la Dirección Provincial de Bosques del Ministerio de Agricultura,

Ganadería y Pesca de Río Negro por haberme facilitado sus

instalaciones de donde se extrajo gran parte del material analizado.

A mis hijos que, aunque a veces no comprendían por qué yo seguía, a

mi edad, estudiando y persiguiendo metas, me alentaban porque me

veían feliz.

A Roberto, mi compañero de toda la vida, porque él sí entendió siempre

mi necesidad de seguir para adelante.

A mis nietitos que están en el centro de todo lo que hago.

V

INDICE DE LA TESIS

1 Introducción. Consideraciones generales sobre la Cancrosis del Álamo: antecedentes y consecuencias económicas.....................................................

1

1.1. Características generales del gro. Populus (Hospedante)

1.1.1. Origen y desarrollo del cultivo.................................................. 7 1.1.2. El cultivo de álamos en la Argentina........................................ 8 1.1.3. El género Populus y aspectos relevantes de su ciclo bioló-

gico...........................................................................................

9 1.1.4. Encuadre taxonómico............................................................... 10 1.1.5. Órganos susceptibles a Septoria musiva................................. 12 1.1.5.1. La hoja.............................................................

Diversidad Morfológica....................................... Diversidad anatómica.........................................

12 12 15

1.1.5.2. El tallo.............................................................. 15 Peridermis..................................................... 16 Albura y duramen.......................................... 17 1.2. Características generales del patógeno

1.2.1. Identidad y posición taxonómica.............................................. 18 1.2.2. Descripción de Septoria musiva............................................... 18 1.3. Características generales del patosistema.............................................. 19

1.4. Antecedentes regionales............................................................... 22

1.5. Objetivos....................................................................................... 24

1.6. Hipótesis........................................................................................ 25 1.7. Relevancia..................................................................................... 25 2. Metodología

2.0. Selección de los clones a estudiar.......................................................... 26

2.1. Análisis de la evolución de la enfermedad.............................................. 26

2.1.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih)................................ 27 2.1.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It)................................. 29 2.1.2.1. En álamos adultos................................................. 30 2.1.2.2. En estacas inoculadas...........................................

Preparación de las estacas............................... Preparación del inóculo..................................... Inoculación de las estacas.................................

30 30 31 32

VI

Evaluación de la inoculación............................. Reaislamiento del patógeno..............................

33 33

2.1.2.3. Validación de las It en álamos adultos.................... 34 2.1.3. Relación entre la intensidad de la enfermedad en hojas y en

tallos de álamos adultos...........................................................

34

2.2. Descripción de Septoria musiva.............................................................. 34

2.2.1. Ascomas pseudoteciales en la hojarasca................................ 35 2.2.2. Picnidios en hoja...................................................................... 38 2.2.3. Picnidios en medios de cultivo................................................. 38

2.3. Análisis de las características anatómicas de las hojas y de los tallos.

2.3.1. Estructura de la hoja................................................................ 38 2.3.1.1. Aspectos morfológicos............................................

Forma de la lámina............................................ Tamaño de la lámina.........................................

38 39 39

2.3.1.2. Aspectos anatómicos.............................................. Cultivo de estacas para el muestreo de hojas... Espesor de la hoja y de sus tejidos................... Caracterización de los estratos epidérmicos.....

Densidad estomática (DE) y caracterización de los estomas................. Densidad y caracterización de las células epidérmicas indiferenciadas (DCEI).......... Composición y estructura de la cutícula.... Aspectos topográficos de las superficies foliares.......................................................

39 39 40 41

42

43 44

44

2.3.2. Estructura del tallo................................................................... 44 2.3.2.1. Peridermis exofiláctica...........................................

Características del Felema................................ Características de las lenticelas........................ Densidad de lenticelas.................................. Dimensiones de las lenticelas......................

Superficie caulinar ocupada por las lenticelas.......................................................

Anatomía de las lenticelas............................

45 46 46 46 47 47 47

2.3.2.2. Corteza............................................................ 47

2.4. Relación entre las características anatómicas y morfológicas de los órganos susceptibles con la incidencia de la enfermedad en los clones seleccionados..........................................................................................

47

2.5. Prospección de la enfermedad en la región del Comahue..................... 48 3. Resultados y Discusión

3.1. Análisis de la evolución de la enfermedad.............................................. 50

3.1.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih)............................... 50 3.1.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It)................................. 58

VII

It en álamos adultos............................................................. It en estacas inoculadas...................................................... Validación de la It en álamos adultos.................................

58 60 60

3.1.3. Relación entre la intensidad de la enfermedad en hojas y en tallos de álamos adultos...........................................................

66

3.2. Desarrollo de Septoria musiva sobre clones susceptibles y tolerantes... 67

3.2.1. Estudio ontogénico de ascomas pseudoteciales según la

escala Szkolnik (1969), modificada..........................................

68 3.2.2. Picnidios en hoja...................................................................... 75 3.2.3. Picnidios en medios de cultivo................................................. 76

3.3. Análisis de las características anatómicas de las hojas y de los tallos... 80

3.3.1. Estructura de la hoja................................................................. 80 3.3.1.1. Aspectos morfológicos

Forma de la lámina........................................... Área foliar..........................................................

80 81

3.3.1.2. Aspectos anatómicos.............................................. Espesor de la hoja y de sus estratos celulares. Caracterización de los estratos epidérmicos..... Densidad (DE) y caracterización los

estomas........................................................ DE en la epidermis abaxial..................... DE en la epidermis adaxial..................... Tamaño y maduración de los estomas... Longitud de los estomas......................... Estomas abaxiales.............................. Estomas adaxiales.............................. Caracterización de las células epidérmicas

indiferenciadas............................................. Densidad de las células epidérmicas

indiferenciadas (DCEI)....................... Composición y estructura de la

cutícula.............................................. Aspectos topográficos de las

superficies foliares..............................

82 82 85

85 88 89 90 91 92 95

96

96

104

106

3.3.2. Estructura de tallo..................................................................... 110 3.3.2.1. Peridermis exofiláctica............................................

Característica del felema.................................. Características de las lenticelas........................ Densidad de lenticelas.................................. Dimensiones de las lenticelas...................... Anatomía de las lenticelas...........................

110 111 113 113 113 116

3.3.2.2. Corteza................................................................... Espesor de la corteza....................................... Características anatómicas de la corteza........

120 120 122

3.4. Relaciones entre las características anatómicas y morfológicas de los

VIII

órganos susceptibles con la intensidad de la enfermedad en los clones seleccionados.........................................................................................

126

3.4.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih) vs. las

características foliares.............................................................

126 3.4.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It) vs. las

características del tallo.............................................................

136

3.5. Análisis del impacto que produce la enfermedad en el valle inferior del río Negro y en la región del Comahue.....................................................

140

4. Conclusiones.........................................................................................

149

5. Bibliografía.............................................................................................

152

6. Anexos................................................................................................... 171

IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1. Mapa de distribución de Septoria musiva (CABI, 2013).................

2

Fig. 2. A. Lesiones foliares con aspecto anguloso, delimitadas por las nervaduras. B. Detalle de una lesión foliar con el centro grisáceo y el margen necrosado. (Fotos del autor)......................

3

Fig. 3. Aspecto de un cancro incipiente en un tallo joven (madera desarrollada en la estación de crecimiento) (Foto del autor).

4

Fig. 4. (A) Detalle de un cancro profundo sobre el tallo principal; (B) fuste quebrado a la altura de un cancro en árboles de doce años de edad, en el VIRN (Fotos del autor).................................

5

Fig. 5. Esquema de la pirámide epidemiológica correspondiente a la Cancrosis del Álamo en el VIRN...................................................

7

Fig. 6. Vista aérea de cortinas de álamos enmarcando cultivos hortícolas en el VIRN....................................................................

9

Fig. 7. Área natural de los álamos de la sección Aigeiros. Fuente: FAO, 1980...........................................................................................................

11

Fig. 8. Distintas formas de la lámina foliar correspondientes a diferentes especies del género Populus (Fotos del autor)...............................

14

Fig. 9. Esquemas de las láminas foliares mostrando la diversidad morfológica que expresan las diferentes especies del género Populus.........................................................................................

14

Fig 10. Corte transversal de una hoja adulta donde se observa la vaina del haz (BS) y las extensiones de la vaina (SE). Fuente: Isebrands y Larson (1973)...........................................................

15

Fig. 11. Aspecto del ritidoma de diferentes ejemplares del género Populus (Fotos del autor)..............................................................

16

Fig. 12. Aspectos de lenticelas en tallos jóvenes de diferentes clones del género Populus (Fotos del autor)............................................

17

Fig. 13. Esquemas descriptivos de las estructuras de S. musiva (M. populorum) según Sievanesan (1990)..........................................

19

Fig. 14. Esquema de un picnidio de S. musiva con conidios ante una inminente liberación. Fuente: Thompson, 1941............................

20

Fig. 15. Ciclo biológico de S. musiva según Sinclair y Lyon (2005).......... 20

X

Fig. 16. Lesión foliar magnificada donde se distinguen los picnidios

(flecha) Fuente: Sincler y Lyon, 2005...........................................

21

Fig. 17. Cortina rompeviento bordeando una parcelas implantada con pasturas en el VIRN (Foto del autor)............................................

23

Fig. 18. Cortina rompeviento del clon ´I 214` con algunos ejemplares quebrados a la altura de los cancros formados luego de varios años de evolución. (Foto del autor)..............................................

24

Fig. 19. Imagen satelital de la colección de álamos que se utilizó como fuente de muestreo para realizar el presente trabajo, ubicada en el campo experimental de la Dirección de Bosques del MAG y P de la Provincia de Río Negro........................................................

27

Fig. 20. Aspecto del desarrollo de S.musiva en placas de Petri en medio de cultivo AEM...................................................................

32

Fig. 21. Estacas inoculadas con S. musiva. (A) cancro desarrollado; (B) testigo...........................................................................................

33

Fig. 22. Reaislamiento de S. musiva en SMM de estacas de álamo inoculadas artificialmente..............................................................

34

Fig. 23. Clasificación de las hojas según el Índice Foliar Plastocrom (LPI) en el clon Conti 12...............................................................

40

Fig. 24. Epidermis adaxial de una hoja de álamo I 214 pintada con laca transparente para uñas.................................................................

42

Fig. 25. Epidermis foliares en P. xcanadensis. Las flechas con líneas completas señalan estomas maduros y con líneas cortadas, estomas inmaduros.......................................................................

43

Fig. 26. Esquema de los tejidos de protección durante la transición del desarrollo primario al secundario, en un tallo joven. Tomado de Rost et al., 1992............................................................................

46

Fig. 27. Mapa de la región de Comahue donde se marcan los itinerarios recorridos y las localidades donde se tomaron las muestras para analizar la dispersión de la enfermedad...............................

49

Fig. 28. Evolución de la intensidad de Cancrosis sobre las hojas de diferentes clones de álamo durante la temporada 2002/2003....

51

Fig. 29. Evolución de la intensidad de Cancrosis sobre las hojas de diferentes clones de álamo durante la temporada 2003/2004....

51

Fig. 30. Representación semilogarítmica de los valores de Intensidad

XI

de Cancrosis sobre hoja (Ih), en las temporadas 2002/2003 y 2003/04. La flecha indica el momento en que ´Ballestra` comenzó a expresar los síntomas de la enfermedad en la temporada 2003/04.....................................................................

52

Fig. 31. Coeficientes de las rectas de regresión “Ln de la intensidad vs tiempo” registradas en las dos temporadas. A. Ih inicial. B. Tasa de incremento de la enfermedad. Las columnas apareadas, encabezadas con * no difieren entre sí, y las encabezadas con ** sí lo hacen según el Test de Student (P < 0,01).......................

55

Fig. 32. Intensidad máxima de la Cancrosis del álamo en hojas. (A) 2002/2003, (B) 2003/04. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).....................

57

Fig. 33. Intensidad de Cancrosis del álamo en tallos adultos en 2003/04. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,01).......................................

58

Fig. 34. Cancrosis del Álamo en el híbrido Ï 488` en el campo experimental de la Dirección Provincial de Bosques (VIRN)........

59

Fig. 35. Lesiones en estacas de los clones seleccionados 145 días después de la inoculación artificial con S. musiva........................

61

Fig. 36. Tejidos de una estaca del clon ¨Ballestra¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos..............................

62

Fig. 37. Modelo anatómico para los mecanismos de defensa inespecíficos: (a) penetración de la corteza, (b) penetración del cambium vascular y (c) penetración de albura. Tomado de Biggs (1992), modificado de Mullick (1977)..................................

63

Fig. 38. Tejidos de una estaca del clon ¨Conti 12¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos..............................

64

Fig. 39. Tejidos de una estaca del clon Ï 214¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos..............................

65

Fig. 40. Tejidos de una estaca del clon Ì 488´ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos..............................

65

Fig. 41. Relación entre la Ih y la It en los clones estudiados durante la temporada 2003/04.......................................................................

67

Fig. 42. Ontogenia de los ascomas desarrollados en la hojarasca de Í

XII

214` y Ćonti 12` durante el período otoño-inverno-primaveral del 2003........................................................................................

69

Fig. 43. Ontogenia de los ascomas desarrollados en la hojarasca de Í 214` y Ćonti 12` durante el período otoño-inverno-primaveral del 2004........................................................................................

69

Fig. 44. Evolución del tamaño de los ascomas en la hojarasca de dos híbridos del gro. Populus durante el período otoño-inverno-primaveral del año 2004...............................................................

71

Fig. 45. Aspecto de los acomas en Í 214` y Ćonti 12` en el estadío 3 de desarrollo. Las barras representan 10 µm...............................

72

Fig. 46. Aspecto de los ascomas en Í 214` y Ćonti 12` en el estadío 5 de desarrollo. Las barras representan 10 µm...............................

72

Fig. 47. Aspecto de los ascomas en 214` y Ćonti 12` en los estadío 6 de desarrollo. Las barras representan 10 µm...............................

72

Fig. 48. Aspecto de los ascomas en el estadío 7 de desarrollo en (A) Ćonti 12` y (B) Í 214`. Las barras representan 10 µm...............

73

Fig. 49. Ascomas de S. musiva provenientes de la hojarasca de (A) Í 214`, y (B) y (C) de Ćonti 12`. Las barras representan 10 µm....

74

Fig. 50. Aspecto de un picnidio maduro inmerso en el mesófilo de Í 214`. La barra representa 10 µm......................................................

76

Fig. 51. Aspecto de una colonia desarrollada sobre agar V-8 perteneciente al aislamiento Sm11 luego de 15 días de cultivo. La barra representa 5 mm............................................................

77

Fig. 52. A. Detalle del borde de una colonia en agar V-8 donde se observan los conglomerados de picnidios (La barra representa 5 mm). B. Detalle de un grupo de picnidios desagregados, a 30 días de la siembra (La barra representa 100 µm).........................

78

Fig. 53. Detalle de la masa conídica liberada desde los picnidios formados en medio de cultivo V-8 a 30 días de la siembra (La barra representa 50 µm)...............................................................

78

Fig. 54. Detalle de las picnidiosporas formadas en agar V-8 (La barra representa 10 µm).........................................................................

79

Fig. 55. Aspecto de las láminas foliares de los clones estudiados en el presente trabajo (La barra representa 1 cm)................................

81

Fig. 56. Área foliar promedio de los clones estudiados. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD

XIII

(P < 0,01)......................................................................................

82

Fig. 57. Comparaciones del espesor total de las hojas en los clones estudiados. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,05)......................................

83

Fig. 58. Corte transversal de una hoja adulta (PLI 10.0). (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488` (Las barras representan 25 µm)...........................................................................................

86

Fig. 59. DE en las epidermis adaxial y abaxial durante el desarrollo foliar, LPI 0.0, LPI 1.0, LPI 5.0 y LPI 10.0., en los clones estudiados.....................................................................................

88

Fig. 60. DE en la cara abaxial. (A) en hojas jóvenes (LPI 0.0); (B) en hojas adultas (LPI 10.0). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01).........

89

Fig. 61. DE de la epidermis adaxial. A en hojas jóvenes (LPI 0.0) y B en hojas adultas (LPI 10.0). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01).........

90

Fig. 62. Aspecto de un estoma inmaduro desarrollado en la cara abaxial en una hoja de Ćonti 12` en LPI 0.0 (La barra representa 10 µm)................................................................................................

91

Fig. 63. Epidermis abaxiales en hojas LPI 0.0. Círculos blancos: estomas inmaduros. Círculos negros: estomas maduros. (Las barras representan 10 µm)...........................................................

93


93


94

Fig. 66. Epidermis abaxiales en hojas LPI 10.0. Círculos negros: estomas maduros. (Las barras representan 10 µm).....................

94

Fig. 67. Variación de la proporción de estomas según el grado de madurez durante el desarrollo foliar en la epidermis abaxial de los cuatro híbridos estudiados....................................................

95

Fig. 68. DCEI por mm2 en las epidermis adaxial y abaxial durante el desarrollo foliar, en los clones estudiados..................................

97

Fig. 69. DCEI por mm2 en las epidermis abaxial (A) y adaxial (B) en el estadío de desarrollo foliar LPI 10.0. Las columnas con letras

XIV

distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (P<0,01)......................................................................................

99

Fig. 70. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 0.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm)..............................

100

Fig. 71. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 1.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm)..............................

101

Fig. 72. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 5.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm)................................

102

Fig. 73. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 10.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm)................................

103

Fig. 74. Esquema representativo del complejo cuticular. (www.lipidlibrary.oacs.org.)...........................................................

104

Fig. 75. Espesor del complejo cuticular en las epidermis (A) abaxial y (B) adaxial en el estadío de desarrollo LPI 10.0, en los clones estudiados. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).....................

105

Fig. 76. Microfotografía electrónica (250x) que muestra el aspecto de la epidermis abaxial de hojas LPI 10.0 en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`...............................................

108

Fig. 77. Microfotografía electrónica (2000x) que muestra el aspecto de la epidermis abaxial de hojas LPI 10.0 en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`...............................................

109

Fig. 78. Aspecto del felema desarrollado en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 50 µm).......................................................................

112

Fig. 79. Densidad de las lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (p < 0,01).......................................................................................

113

Fig. 80. Longitud de las lenticelas, en tallos jóvenes (madera del año). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (p < 0,01)......................................

114

Fig. 81. Ancho de las lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).......................................................................................

115

Fig. 82. Área promedio de las lenticelas en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01)..............................................................

115

XV

Fig. 83. Área total de lenticelas en tallos jóvenes. Las columnas con

letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).......................................................................................

116

Fig. 84. Aspecto de las lenticelas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 1 mm)..............................................................................

117

Fig. 85. Aspecto de una lenticela de incipiente formación donde se puede observar el estoma en el estrato epidérmico que aún perdura. Corte de un tallo de ´Ballestra` (La barra representa 50 µm)................................................................................................

118

Fig. 86. Lenticela madura en un tallo de Í 214` donde se observa el tejido de relleno y el desplazamiento interno del felógeno (La barra representa 50 µm)...............................................................

118

Fig. 87. (A) Ancho interno y (B) profundidad de lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,05 y P<0,01 respectivamente)..........................................................................

119

Fig. 88. Aspecto externo de una lenticela donde se puede observar la apertura de la peridermis y el tejido de relleno. La flecha indica una zona algo translúcida que recubre la expansión lateral interna del tejido de relleno. Tallo joven de Í 214`.......................

120

Fig. 89. Anatomía las lenticelas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 100 µm)...........................................................................

121

Fig. 90. Espesor de la corteza en los clones estudiados. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,008)........................................................................

122

Fig. 91. Aspecto de las cortezas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 100 µm).....................................................................

123

Fig. 92. Aspecto de los tejidos subperidérmicos desarrollados en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras presentan 50 µm).............................................

124

Fig. 93. Aspecto de las fibras que protegen al floema primario en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`.......................

125

Fig. 94. Gráfico Biplot de las características foliares representadas como puntos-variables y los clones representados como puntos-individuos..........................................................................

135

XVI

Figura 95. Gráfico Biplot de las características caulinares representadas

como puntos-variables y los clones representados como puntos-individuos..........................................................................

139

Fig. 96. Vista panorámica de un establecimiento ubicado en el VIRN con parcelas hortícolas rodeadas por doble hilera de álamos enmarcando las acequias.............................................................

141

Fig. 97. Cortina rompeviento con fustes quebrados a la altura de los cancros producidos por S. musiva en el VIRN.............................

142

Fig. 98. Alameda del clon Ćonti 12` dispuesta en macizo implantada en el valle de General Conesa...........................................................

144

Fig. 99. Alameda del clon Ćonti 12` dispuesta en macizo implantada en el VIRN..........................................................................................

145

Fig. 100. Alameda del clon Í 214` dispuesta en macizo implantada en el VIRN..........................................................................................

146

Fig. 101. Alameda del clon Í 488` dispuesta en macizo implantada en el valle de General Conesa...........................................................

146

Fig. 101. Mapa de la región del Comahue donde se destacan las localidades en las que se confirmó la presencia de S. musiva en ejemplares del género Populus....................................................

148

XVII

INDICE DE TABLAS

Tabla I. Caracteres botánicos de las especies P. nigra y P. deltoides................

12

Tabla II. Grados de severidad del ataque de S. musiva en hojas.............

28

Tabla III. Grados de severidad del ataque de S. musiva en madera........

31

Tabla IV. Características de los estados ontogénicos utilizados en este estudio para describir la evolución de Septoria musiva.............................

36

Tabla V. Coeficientes de las rectas de regresión “Ln de Ih vs. Tiempo” para cada clon en las temporadas 2002/03 y 2003/04..............................

53

Tabla VI: Intensidad de la enfermedad registrada en estacas inoculadas con Septoria musiva y en tallos adultos ...................................................

60

Tabla VII: Características morfométricas de los ascomas (µm) en los clones estudiados......................................................................................

74

Tabla VIII. Dimensiones de los ascomas de Septoria musiva registrados en este trabajo y los datos aportados por la bibliografía...........................

75

Tabla IX: Características morfométricas de los picnidios (µm) en ´Conti 12` e ´I 214`...............................................................................................

76

Tabla X: Características morfométricas de los picnidios (µm) desarrollados agar V-8 y en los mesófilos.................................................

79

Tabla XI. Espesor de los estratos celulares del mesófilo (µm) en los distintos clones estudiados........................................................................

83

Tabla XII. Relaciones celulares en el parénquima de empalizada de los clones estudiados......................................................................................

84

Tabla XIII. Longitud promedio de los estomas (µm) en ambas epidermis durante el desarrollo foliar, en los clones estudiados................................

91

Tabla XIV. DCEI y área celular promedio en los distintos estadíos de desarrollo foliar en cada uno de los clones estudiados.............................

98

Tabla XV. Contenido de n-alcanos en hojas de álamos (mg/kg MS*)...........................................................................................................

106

Tabla XVI. Características del felema en estacas de los clones estudiados.................................................................................................

111

XVIII

Tabla XVII. Correlaciones entre la Ih y las características foliares.............

127

Tabla XVIII: Correlación de Pearson entre las variables foliares evaluadas en este trabajo..........................................................................

132

Tabla XIX: Autovalores. Proporción de la variabilidad explicada por cada componente principal........................................................................

133

Tabla XX. Contribución relativa de cada variable original en la construcción de cada componente principal (autovectores)......................

133

Tabla XXI. Coeficientes de correlación entre las variables originales y los componentes principales.....................................................................

134

Tabla XXII. Relaciones y correlaciones de la It de los clones con las características anatómicas de los tallos....................................................

136

Tabla XXIII: Correlaciones entre las variables caulinares evaluadas en este trabajo................................................................................................

137

Tabla XXIV. Autovalores. Proporción de la variabilidad explicada por cada componente principal........................................................................

138

Tabla XXV. Coeficientes de correlación entre las variables originales y los componentes principales.....................................................................

138

Introducción

1

Cancrosis del Álamo en Plantaciones Comerciales de la Región del Comahue. Estado Actual y Perspectivas

1. Introducción. Consideraciones generales sobre la Cancrosis del Álamo: antecedentes y consecuencias económicas. Esta enfermedad, denominada “Cancrosis del Álamo” en Argentina y “Septoria

leaf spot” y “Septoria Stem Canker” en los países de habla inglesa, es causada

por Septoria musiva Peck., uno de los problemas más graves que padecen los

distintos híbridos y cultivares del género Populus. Las lesiones que produce,

tanto en las hojas como en los fustes, ocasionan grandes pérdidas económicas

y condicionan el uso de algunos genotipos que, pese a reunir características

óptimas desde el punto de vista productivo, se tornan inadecuados para la

explotación de la madera por la elevada incidencia de este patógeno.

Fue descripta por primera vez en 1884, sobre Populus monilifera en Albany,

Nueva York, por C. H. Peck, quien determinó que el agente causal era Septoria

musiva. Bier, en 1939, atribuyó al mismo patógeno la responsabilidad de la

muerte de extensas plantaciones de diversas especies del género Populus en

Canadá. Thompson en 1941, en una investigación específica sobre esta

enfermedad en Estados Unidos, determinó la forma perfecta del patógeno y lo

denominó Mycosphaerella populorum.

Está presente en Canadá y en USA, principalmente en los estados centrales y

del este. En Sudamérica, fue diagnosticada en Argentina, y recientemente en

Brasil (Figueredo dos Santos et al., 2010) (Fig. 1).

_____________________________________________________________ En este trabajo se sigue el criterio recientemente adoptado en el XVIII Congreso Internacional

de Botánica, Melbourne, Australia, julio 2011, designando al patógeno por su nombre más

antiguo, Septoria musiva (Greuter& Rodríguez 2012).

Introducción

2

= Presente = Dispersado = Localizado

Fig. 1. Mapa de distribución de Septoria musiva (CABI, 2013)

El agente causal fue citado en Crimea y en la región de los Cáucasos asiáticos

(Teterevnikova-Babayan, 1976) pero en Europa no hay registros de esta

enfermedad (Arthaud y Taris, 1979; Castellani y Cellerino, 1980; Cellerino,

1999).

En Argentina, fue diagnosticada en el Delta del Paraná (Sarasola, 1944;

Fernández Valiela, 1951), en Mendoza (Golfari, 1958, Fischetti et al., 1965) y

en el Alto Valle de Río Negro (Sarasola, 1975). Luego de estas investigaciones

se produjo, en el país, un vacío temporal en las publicaciones referidas a la

Cancrosis del Álamo de aproximadamente 20 años. Recién en 1995, Pozzo

Ardizzi et al. describieron por primera vez la enfermedad y a su agente causal

(S. musiva) en Viedma, en el Valle Inferior de Río Negro (VIRN).

Las numerosas investigaciones realizadas sobre esta enfermedad a lo largo del

tiempo, describen los siguientes síntomas (Thompson, 1941; Zalasky, 1978;

Sarasola, 1975; 1978; Spielman et al., 1986; Ostry, 1987; Luley y MaNabb,

1989; Strobl y Fraser, 1989; Sievanesan, 1990; Pozzo Ardizzi et al., 1995;

Stanosz et al., 2002; Ward y Ostry, 2005; Le Boldus et al., 2009a; Le Boldus et

Introducción

3

al., 2009c; Lucero et al., 2011a; Lucero et al., 2011b; Riu et al., 2011a; Riu et

al., 2011b):

Las lesiones en hojas se presentan como manchas necróticas, pardo-rojizas o

negruzcas, angulosas, delimitadas por las nervaduras. A medida que

evolucionan, el centro se vuelve grisáceo, con márgenes oscuros, rodeados por

una zona amarillenta. Al avanzar la temporada, se incrementa el número de

lesiones, coalescen, y forman zonas necróticas expandidas. En plantas que

presentan algún nivel de resistencia, las lesiones son escasas y se mantienen

pequeñas (Fig. 2).

Fig. 2. A. Lesiones foliares con aspecto anguloso, delimitadas por las nervaduras. B. Detalle de una lesión foliar con el centro grisáceo y el margen necrosado. (Fotos del autor).

Introducción

4

Muchas investigaciones se han enfocado en el proceso foliar de la enfermedad

porque tienen una importancia muy relevante desde el punto de vista

epidemiológico y porque, al disminuir la superficie fotosintética efectiva, ya sea

por las manchas foliares o por la abscisión prematura de las hojas (Ostry, 1987;

Liang et al., 2001; Gyenis et al.; 2003; Feau et al., 2010; Lucero et al., 2011a;

Lucero et al., 2011b), afecta la tasa de crecimiento de los árboles (Ostry y

Ward, 2003; Weiland et al., 2003; Ward y Ostry, 2005).

Sin embargo, el mayor daño económico lo ocasionan las lesiones producidas

en los tallos, que son las que deterioran la calidad productiva. Se inician en la

madera del año con el aspecto de manchas oscuras, húmedas y algo

deprimidas, que se van extendiendo en sentido longitudinal. En pocos días, la

peridermis comienza a agrietarse y se inicia la formación del cancro (Fig. 3).

Fig. 3. Aspecto de un cancro incipiente en un tallo joven (madera desarrollada en la estación de crecimiento) (Foto del autor).

La lesión progresa anualmente, generando una profunda hendidura que puede

llegar hasta la médula. En los genotipos que manifiestan algún nivel de

resistencia, la formación del cancro puede detenerse temprano y quedar

delimitada por un tejido superficial de cicatrización. En los susceptibles, la

lesión continúa evolucionando y el tallo reacciona con mayor o menor

Introducción

5

velocidad. Se activan meristemas accidentales que intentan detener el avance

del patógeno formando los cancros característicos (Fig. 4-A). El sector afectado

constituye una zona de debilidad en el fuste que, frente a otras adversidades

como la colonización de otros patógenos oportunistas, o los fuertes vientos

patagónicos, aumenta las probabilidad de quiebre (Fig. 4-B). Los cancros más

importantes se ubican desde la base del fuste hasta los dos o tres metros de

altura reduciendo el largo comercial de las tablas que se puedan extraer. En

plantaciones jóvenes de genotipos susceptibles, los cancros pueden ocasionar

el quiebre de los fustes en uno o dos años (Sinclair y Lyon, 2005).

Fig. 4. (A) Detalle de un cancro profundo sobre el tallo principal; (B) fuste quebrado a la altura de un cancro en árboles de doce años de edad, en el VIRN (Fotos del autor).

La gran mayoría de las especies e híbridos que integran la populicultura

moderna es susceptible en mayor o menor grado a este patógeno. Sin

embargo, las diferencias en la incidencia, no sólo se manifiestan entre los

distintos genotipos, sino que existe una variabilidad interna que hace que un

mismo cultivar o clon se comporte como tolerante en un determinado hábitat y

como susceptible en otro (Riffle y Wysong, 1986; Riu et al., 2011a; Sarasola,

1975). Esto hace suponer que la respuesta a la enfermedad puede estar sujeta

a la variabilidad en la expresión anatómica y/o fisiológica del genotipo,

condicionada por el ambiente (Isembrands y Larson 1973 y 1977; Schumaker et

A B

Introducción

6

al., 1997; Taylor et al., 2003; Wittig et al., 2005). Además de los cambios en el

fenotipo de los hospedantes el ambiente puede producir cambios en el balance

poblacional del patógeno, alterando la relación entre las cepas más y menos

agresivas (Krupinsky, 1989; Ward y Ostry, 1994 y 2005).

Esto conlleva a incluir en el análisis de un patosistema los conceptos de

“susceptibilidad” y “resistencia” que describen el comportamiento del

hospedante frente al patógeno. Según Agrios (2005), cuando un patógeno

logra penetrar y establecerse en una planta, ésta se considera “susceptible”, en

cambio, si el patógeno encuentra dificultades para entrar e incluso para

progresar, se dice que la planta es “resistente” o “tolerante”. Estos conceptos

son relativos y opuestos. Para el autor mencionado existen tres tipos de

resistencia: 1) resistencia a la infección, que consiste en la evasión o escape a

la enfermedad y que resulta en un desfasaje entre la dispersión del inóculo del

patógeno y el desarrollo de los órganos susceptibles del hospedante, 2)

resistencia a la penetración del patógeno, lo que implica mecanismos de

defensa estructurales, y 3) resistencia al desarrollo del patógeno, proceso en el

cual el mismo penetra, pero luego ve dificultado su progreso en el interior de

los tejidos porque el hospedante posee estructuras adversas. También pueden

existir condiciones particulares de algunos tejidos como pH, presión osmótica,

presencia de compuestos como taninos, ácidos, fenoles, entre otros.

Las plantas en general pueden presentar dos mecanismos de defensa frente a

los patógenos denominados defensa activa y defensa pasiva. La primera,

también conocida como “inducida” o “dinámica”, representa a estructuras o

sustancias producidas como respuesta al desarrollo de la enfermedad. La

segunda, hace referencia a propiedades o estructuras preexistentes a la

infección y que cumplen alguna función en el desarrollo adaptativo de la planta.

Debido a que estas características están presentes, independientemente de la

actividad del patógeno, también se las designa como “factores constituyentes”

o “defensa preformada” (Cruz Borruel et al., 2006).

Introducción

7

Para realizar el análisis de estos conceptos en la Cancrosis del Álamo hay que

considerar los componentes de la pirámide epidemiológica para esta

enfermedad (Fig. 5):

Fig. 5. Esquema de la pirámide epidemiológica correspondiente a la Cancrosis del Álamo en el VIRN. 1.1. Características generales del gro. Populus (Hospedante). 1.1.1. Orígenes y desarrollo del cultivo. La madera fue uno de los primeros

materiales que el hombre primitivo utilizó para su sobrevivencia y

gradualmente, con el paso de los siglos y milenios, fue incorporándose a las

necesidades básicas de las comunidades. Si bien en las últimas décadas fue

reemplazada por otros materiales, la mayoría sintéticos (en la construcción, en

el transporte, en las herramientas, etc.) hoy en día, hay un retorno a las

aplicaciones maderables con el fin de constituir objetos y estructuras

biodegradables, no contaminantes.

El género Populus apareció inicialmente en los bosques templados del

hemisferio norte integrado pequeños macizos puros o como árboles

intercalados entre otras especies. Los desmontes masivos producidos debido

al avance de la agricultura, los fueron restringiendo a ciertas zonas ribereñas y

(Populus sp.)

(S. musiva) (VIRN)

(Oportunidad)

Introducción

8

antiguos lechos de ríos. La utilización de estos relictos como fuentes

maderables reveló las virtudes de estas especies tales como la alta tasa de

crecimiento y la fácil reproducción por estacas. Estas características

contribuyeron a la amplia difusión de los diversos genotipos del género.

Los datos históricos de Europa, Asia y África, muestran que antiguamente la

difusión de los álamos se realizaba a partir de los genotipos locales, que en su

mayoría eran P. nigra. Recién en el siglo XVIII se registra la introducción de los

álamos americanos, dando lugar a la hibridación natural de los materiales y la

aparición espontánea de nuevos ejemplares.

A principios del siglo XX, cuando la industria papelera comenzó a utilizar la

madera de álamo como materia prima, surgió la necesidad de seleccionar

genotipos más aptos para esta explotación. Así se iniciaron programas de

mejoramiento, los que también atendieron los problemas sanitarios surgidos

con la expansión del cultivo. Italia fue pionera en su dedicación a la

investigación aplicada referida a este género seguida rápidamente por Francia,

Inglaterra y los Países Bajos, entre otros. En 1942, se creó en Francia la

Comisión Nacional del Álamo con el objeto de organizar y coordinar las

actividades científicas y productivas, y en 1947, en Paris, se conformó la

Comisión Internacional del Álamo que funcionó y funciona en el marco de la

FAO. La República Argentina participa a través de su Comisión Nacional del

Álamo (CNA) desde el año 1952, promoviendo actividades de difusión e

investigación en todo el país.

1.1.2. El cultivo de álamos en la Argentina. Se remonta, como en el resto de

las colonias de España, a la época de la Conquista. Es muy posible que las

primeras introducciones se hayan realizado hacia fines del siglo XVI,

ingresando estacas de Populus nigra cv itálica desde Chile a Mendoza. Sin

embargo, el cultivo comienza a tener relevancia económica cuando se produce

la implantación masiva en la zona del Delta del Paraná, donde llegó a constituir

la principal actividad económica (Borodowski y Suarez, 2004; Cortizo, 2011).

Introducción

9

Otras áreas de relevancia para este cultivo, fueron y son los valles irrigados de

Cuyo y de los ríos Neuquén y Negro en la Norpatagonia. Para la zona del

Comahue se citan 17.500 has forestadas, de las que un 20% son macizos y el

resto, cortinas rompevientos a lo largo de las acequias de riego que enmarcan

los lotes productivos (García, 2002) (Fig. 6).

Fig. 6. Vista aérea de cortinas de álamos enmarcando cultivos hortícolas en el VIRN.

El desarrollo de la fruticultura y la horticultura en esta región, fue acompañado

por el establecimiento de plantaciones forestales para la elaboración de

envases. Además, se promocionaron cultivos a nivel nacional (créditos IFONA)

con destino a la industria celulósico-papelera.

1.1.3. El género Populus y aspectos relevantes de su ciclo biológico. Las

especies del género Populus son árboles de un solo tronco recto y cilíndrico

(fuste), con una fuerte dominancia apical, y una peridermis gruesa de color gris

castaño. Pueden alcanzar hasta 35 o 40 metros de altura y 2 metros de

diámetro. Son deciduos, con hojas simples, alternas y estipuladas. La forma

foliar es básicamente oval a triangular con lóbulos de distinta profundidad y

nerviación retinervada o palmatipinada.

Introducción

10

Muchas especies se reproducen en forma vegetativa espontánea mediante la

emisión de brotes radiculares gemíferos, o artificialmente por el enraizamiento

de tallos aéreos (estacas).

1.1.4. Encuadre taxonómico: Según el sistema de Engler (1964), el género

Populus presenta el siguiente encuadre taxonómico:

Reino: Plantae División: Angiospermae Clase: Dicotyledoneae Subclase: Archichlamydeae Grupo: Amentiflorae Orden: Salicales Familia: Salicaceae

Género: Populus

Las especies del género Populus se ha divido tradicionalmente en cinco

secciones cuyas importancias económicas son dispares. Representan

agrupamientos en función de criterios morfológicos y ecológicos: Turanga,

Leucoides, Aigeiros, Tacamahaca y Leuce. A su vez, existe una hibridación

natural entre estos agrupamientos, y también una manipulación genética

dirigida a la búsqueda mejores aspectos productivos, sanitarios y ecológicos.

El 90 % de los álamos cultivados pertenecen a la sección Aigeiros aunque su

distribución natural no es tan expandida como otros grupos (Fig. 7).

Introducción

11

Fig. 7. Área natural de los álamos de la sección Aigeiros. Fuente: FAO, 1980.

El híbrido P. xcanadensis es el genotipo básico sobre el que se ha desarrollado

la populicultura moderna en Europa y América. Es el resultado de una

hibridación espontánea entre P. deltoides como progenitor femenino y P. nigra

como progenitor masculino. A partir de ésta se han obtenido más de un

centenar de cultivares por hibridación artificial, de fácil propagación vegetativa y

de alta calidad forestal. P. deltoides ha aportado cualidades maderables y P.

nigra su facilidad para la reproducción vegetativa por medio de estacas y su

adaptación a una amplia variación ambiental.

Introducción

12

Tabla I. Caracteres botánicos de las especies P. nigra y P. deltoides.

Especies

Ramas Hojas Inflorescencias Distribución geográfica Masculinas Femeninas

P. nigra Delgadas,

cilíndricas.

Pequeñas, coriá-

ceas, romboidales

sobre ramas cor-

tas; más o menos

deltoides sobre

ramas largas (lon-

gitud del limbo

inferior a 10 cm).

Amentos cor-

tos; 6 a 30 es-

tambres en

cada flor.

Amentos cortos,

8 a 13 cm; cáp-

sulas globosas

y densas con 2

valvas hemies-

féricas.

Europa,

Asia, África

del Norte.

P.

deltoides

Gruesas, más

o menos angu-

losas.

Bastante grandes

y deltoides sobre

ramas cortas;

muy grandes y

cordiformes sobre

ramas largas (lon-

gitud del limbo

hasta 30 cm).

Amentos bas-

tante cortos;

40 a 60 es-

tambres en

cada flor.

Amentos muy

largos, entre 20

y 30 cm; cáp-

sulas ovoides,

alargadas en

racimos sueltos

que se abren en

3-4 valvas.

América

Fuente: Los álamos y los sauces. FAO. 1980.

1.1.5. Órganos susceptibles a Septoria musiva. Las infecciones generadas

por el patógeno afectan a las hojas y a los tallos jóvenes y sus ramificaciones.

1.1.5.1. La hoja. El desarrollo del área foliar está relacionado con la producción

de madera que es el fin económico de este cultivo. Los genotipos con alta tasa

de crecimiento se caracterizan por una rápida tasa de expansión foliar y por

hojas grandes (Gardner et al. 1995).

Diversidad Morfológica. Este órgano presenta una gran diversidad de formas

y tamaños, con un fuerte condicionamiento ambiental en la expresión fenotípica

(Ridge et al., 1986; Bassman y Zwier, 1991; Gardner et al., 1995; Schumaker et

al., 1997; Harrington et al., 1997; Ferris et al., 2001; Gielen et al., 2001; Taylor

et al., 2003; Günthardt-Goerg, 2004; Wittig et al., 2005; Aasamaa et al., 2005).

Probablemente esa variabilidad tenga algún efecto sobre la relación con los

Introducción

13

patógenos. Por ejemplo, la superficie foliar promedio de ´I 214` en árboles

implantados en el VIRN (Argentina, América del Sur, a 2,5 m s.n.m.) fue de 48

cm2, y en el mismo clon, pero en álamos implantados en la ciudad Tuscania

(Italia, Europa, ubicada a 150 s.n.m.) fue de 94 cm2 (Ferris et al., 2001). Por el

contario, Schumaker et al. (1997) y Gielen et al. (2001) registraron valores

semejantes a los presentados en este trabajo (58,6 cm2 y 56,6 cm2) en clones

distantes genéticamente. O sea, la plasticidad fenotípica puede establecer

diferencias entre genotipos semejantes, y mostrar semejanzas entre genotipos

diferentes.

Hay evidencias de que los álamos que crecen bajo condiciones de estrés

nutricional o hídrico (por exceso o por déficit) tienen hojas más pequeñas que

los mismos genotipos cuando crecen bajo condiciones favorables o

equilibradas (Harrington et al., 1997; Kozlowski, 1997; Abbruzzese et al., 2009).

Como la diversidad morfológica tiene su correlato en la organización histológica

(Ferris et al., 2001), es probable que también tenga efecto sobre la

susceptibilidad o tolerancia de los clones.

Las variaciones en la forma de la base de la lámina, del ápice foliar y de los

bordes (Fig. 8 y 9) generan diversas morfologías: lanceoladas, triangulares,

romboidales, deltoides, y todas la transiciones entre estos patrones. La

nerviación es retinervada o palmatipinada según su morfología. La sección

transversal de los pecíolos puede ser circular, elíptica, triangular o aplanada.

Suelen existir glándulas en su inserción con la lámina de alto valor taxonómico.

El color de las hojas que se están expandiendo puede ser verde, verde

amarillento, anaranjado, rojizo, bronceado o violeta dependiendo de la

eficiencia en la síntesis de clorofila. En las hojas adultas la intensidad del verde

está asociada con el espesor de la lámina y con la exposición a la luz.

Las áreas foliares varían desde 30 hasta 400 cm2 y la longitud del pecíolo

oscila entre 4 y 15 cm.

Introducción

14

Fig. 8. Distintas formas de la lámina foliar correspondientes a diferentes especies del género Populus (Fotos del autor).

Fig. 9. Esquemas de las láminas foliares mostrando la diversidad morfológica que expresan las diferentes especies del género Populus.

Populus canescens Populus alba Populus deltoides

Introducción

15

Diversidad anatómica. La estructura de una hoja adulta presenta una

epidermis adaxial, dos capas de parénquima en empalizada, una capa central

de parénquima asociada a la banda del haz y a las expansiones de la vaina,

tres capas de parénquima esponjoso y la epidermis abaxial (Fig. 10).

Fig 10. Corte transversal de una hoja adulta donde se observa la vaina del haz (BS) y las extensiones de la vaina (SE). Fuente: Isebrands y Larson (1973).

Las hojas maduras de los álamos son anfiestomáticas aunque los estomas son

más numerosos en la epidermis abaxial (entre 130 y 350 estomas/mm2) que en

la adaxial (entre 30 y 290 estomas/mm2) (Isebrands y Larson, 1973; Dunlap y

Settler, 2001). El análisis de estas estructuras tiene gran relevancia pues son la

principal puerta de ingreso para que el patógeno colonice el mesófilo. Su

ontogenia está fuertemente condicionada por factores ambientales (Ferris et

al., 2001).

1.1.5.2. El tallo. Como cualquier estructura perenne tiene simultáneamente

madera producida por la actividad de los meristemas apicales (tejidos

primarios) y madera con desarrollo secundario que resulta de la actividad del

cambium vascular y del felógeno. La transición del desarrollo primario al

secundario, en los álamos se produce a la altura del entrenudo asociado con la

primera hoja madura desde el ápice. El cambium aparece antes de finalizar el

Introducción

16

primer año, una vez que los entrenudos han completado su crecimiento (Larson

e Isebrands, 1974; Esau, 1985).

Peridermis. La primera peridermis se forma debajo de la epidermis a partir del

felógeno, y las siguientes, más profundamente en la corteza. También aparece

luego de la abscisión de las hojas y en el entorno de los tejidos lesionados o

muertos (Esau, 1985). El espesor es variable entre los diferente clones de

álamos (Biggs et al., 1983; Weiland y Stanosz, 2007). Con el paso de los años,

se produce una acumulación de tejidos muertos que se resquebraja y queda

adherido a la superficie, el ritidoma (Fig. 11).

El primer felógeno se forma generalmente de modo uniforme en la

circunferencia del eje caulinar pero los siguientes, suelen formarse como

estratos discontinuos, que se solapan en la profundidad del tallo.

Cuando se produce una herida o una lesión generada por un patógeno, los

tejidos del hospedante son inducidos a cambios metabólicos y reacciones

citológicas que tienden a cicatrizar la lesión. Este tejido cicatricial incluye

células muertas en la superficie y células vivas por debajo, que se suberizan y

lignifican formando la “capa de cierre” debajo de la cual se origina el felógeno.

La capacidad para desarrollar la peridermis en torno a las heridas en respuesta

a la colonización de un patógeno puede distinguir las plantas resistentes de las

susceptibles (Biggs et al., 1983 y 1984).

Fig. 11. Aspecto del ritidoma de diferentes ejemplares del género Populus (Fotos del autor).

Introducción

17

Las lenticelas son estructuras frecuentes en las peridermis de los tallos

jóvenes. Externamente tienen el aspecto de una protuberancia labial más o

menos pronunciada, de forma redonda, oval o alargada verticalmente y de

dimensiones variables (Fig. 12).

Fig. 12. Aspectos de lenticelas en tallos jóvenes de diferentes clones del género Populus (Fotos del autor).

El felógeno, a la altura de una lenticela, se invagina y produce hacia afuera un

tejido laxo, con células de paredes delgadas y suberizadas denominado “tejido

de relleno”. Estas estructuras tienen gran relevancia en la Cancrosis del Álamo,

pues constituyen una de las puertas de entrada del patógeno al tallo.

En los tallos jóvenes las lenticelas se forman en correspondencia con la

ubicación de los estomas en la epidermis y en los tallos adultos se forman en

las grietas del ritidoma.

Albura y Duramen. Debido a su hábito de crecimiento rápido la madera es

clara, liviana, con porosidad difusa lo que dificulta individualizar los anillos de

crecimiento. El sector funcional pude alcanzar 30 a 32 mm de espesor (Esau,

1985). La corteza permanece delgada y verde durante el primer año de vida y

puede representar hasta el 42 % del diámetro del tallo, contribuyendo

moderadamente con la fotosíntesis. A medida que pasan los años, ese

I 488 Conti 12 I 214

Introducción

18

porcentaje disminuye hasta 15 o 20 %. La madera recién cortada muestra una

albura de color claro, blanco amarillento y el duramen es poco diferenciable.

Presenta un alto nivel de humedad, entre el 75 y el 300 % del peso seco de la

madera, que se distribuye con mayor concentración en la médula e

inmediatamente debajo de la peridermis (Bjurhager et al., 2010).

1.2. Características generales del patógeno. 1.2.1. Identidad y posición taxonómica (Index Fungorum)

División: Fungi Phylum: Ascomycota Clase: Dothideomycetes Orden: Capnodiales Familia: Mycosphaerellaceae Septoria musiva Peck. (Teleomorfo: Mycosphaerella populorum G. E.

Thompson)

1.2.2. Descripción de Septoria musiva. Los ascomas son globosos,

ostiolados, errumpentes, con desarrollo similar al de otros Dothideomycetes

(Alexopoulus et al., 1996; Crous, 1998; Moore-Landecker, 1992). Pueden estar

aislados o agregados en el tejido del hospedante. Cuando han completado su

desarrollo las dimensiones oscilan entre 60 – 110 µm ancho x 60 – 88 µm de

largo. Sus paredes están formadas externamente por un pseudoparénquima de

células alargadas con paredes gruesas y melanizadas, e internamente, por

células más ovales con escasa o nula melanina en sus paredes. Los ascos

maduros son bitunicados, fasciculados, cilíndrico-clavados, cortamente

pedunculados, de 54 – 70 µm de largo x 13 -16 µm de ancho. Las ascosporas

maduras son hialinas, rectas o algo curvadas, con dos células prácticamente

Introducción

19

iguales, levemente constreñidas a la altura del septum, cuyas dimensiones

oscilan entre 16 - 28 µm de largo x 4 – 6 µm de diámetro (Niyo et al., 1986;

Sievanesan, 1990) (Fig. 13).

Los picnidios que se forman inmersos en los tejidos vivos de la hoja o los tallos

jóvenes, son anfígenos, globosos, deprimidos en sentido vertical, ostiolados, de

130 µm de diámetro, formados por una fina pared de pseudoparénquima. Las

células conidiógenas que revisten internamente al picnidio, suelen ser

subglobosas o ampuliformes, hialinas y holoblásticas. Los conidios son

cilíndricos, rectos o ligeramente curvados, con 1 a 4 septos, con medidas de 28

– 54 µm de largo x 3,5 – 4 µm de diámetro. (Fig. 14). Son exudados a través

del ostíolo en una masa color rosa (Sievanesan, 1990).

1.3. Características generales del patosistema. El ciclo biológico de M.

populorum ha sido esclarecido con el aporte de numerosas investigaciones

(Thompson, 1941; Ostry, 1987; Luley y McNabb, 1989) (Fig. 15).

Fig. 13. Esquemas descriptivos de las estructuras de S. musiva (M. populorum) según Sievanesan (1990).

A. Sección longitudinal de un ascoma; B. Asco; C. Ascospora; D. Conidio

Introducción

20

Fig. 14. Esquema de un picnidio de S. musiva con conidios ante una inminente liberación. Fuente: Thompson, 1941.

Fig. 15. Ciclo biológico de S. musiva según Sinclair y Lyon (2005).

Ascos y ascoporas

Picnidios y conidios

Pseudotecios

Introducción

21

Los ascomas del patógeno se desarrollan a partir del micelio que coloniza el

mesófilo de las hojas caídas, originado en un estroma subcuticular. Este

proceso, que acontece durante el otoño, invierno y principios de primavera,

también ocurre, aunque con menor frecuencia, en la madera afectada.

Las primeras lesiones de la temporada son causadas por las ascosporas que

se liberan a partir de los ascomas pseudoteciales, se diseminan con el viento y

la lluvia y germinan sobre las superficies de las hojas y los tallos. Las

condiciones ambientales que favorecen este proceso resultan de la

combinación del número de horas de hoja mojada (y madera joven) con la

temperatura promedio del aire. Estas, son consideradas las infecciones

primarias pues son las que inician el ciclo anual de la enfermedad. Los puntos

de ingreso son los estomas y las lenticelas y/o las heridas generadas por la

abscisión de las hojas. Entre los siete y catorce días de producida la infección

aparecen las lesiones foliares y los picnidios se forman en tres o cuatro

semanas, inmersos en los tejidos. En algunos cultivares se pueden observar a

ojo desnudo, como estructuras errumpentes sobre una o sobre ambas

epidermis foliares (Fig. 16).

Fig. 16. Lesión foliar magnificada donde se distinguen los picnidios (flecha) Fuente: Sincler y Lyon, 2005.

Picnidioss

Introducción

22

Dentro de los picnidios se desarrollan los conidios que, cuando maduran, son

liberados y germinan sobre las superficies susceptibles. Producen los mismos

síntomas que las ascosporas y originan sucesivos ciclos de repetición en la

misma temporada. Hacia el final de la estación de crecimiento, cuando las

infecciones foliares son muy intensas se produce una defoliación prematura en

los cultivares más susceptibles. Durante el otoño, en la hojarasca constituida

por hojas enfermas, mientras se produce la descomposición foliar, se inicia la

formación de los ascomas.

1.4. Antecedentes regionales. Los primeros álamos introducidos en la región

del Comahue fueron clones de Populus nigra Ítálica` o Ćriollo` y ´Thayssiana`

o Ćhileno`. Por su porte erecto, su fuerte dominancia apical y su desarrollo

radicular marcadamente pivotante, resultaban ideales para la plantación de

cortinas rompevientos a lo largo de las acequias y canales de riego. Estos

ejemplares reunían el doble propósito de proteger los cultivos y de producir

madera, y resultaron ser robustos frente a problemas de plagas y

enfermedades.

En la década del 60 se introdujeron desde el Delta del Paraná, clones italianos

del híbrido “Populus xcanadensis” tales como el ‘I 154`, Í 214`, Í 488`, Ćonti

12`, Í 262`, entre otros. Sin embargo, al plantarlos a la vera de las acequias,

algunos de ellos resultaron ser muy competitivos por sus rápidas tasas de

crecimiento y sus sistemas radiculares más superficiales, generando una

disminución en el desarrollo y rendimiento de los cultivos próximos. Por ello, en

la actualidad, están dejando de plantarse en cortinas nuevas y su uso quedó

limitado a las plantaciones en macizos. Fue en esa década que se crea la

colonia del IDEVI (Instituto de Desarrollo del Valle Inferior) en el VIRN, y el

asesoramiento técnico recibido desde el INTA (Instituto Nacional de Tecnología

Agropecuaria) condujo a que los productores de esta zona, enmarquen sus

parcelas con los álamos mencionados. Así, los establecimientos hortícolas y

ganaderos del Valle Inferior tienen, en la actualidad, la mayoría de sus

acequias bordeadas por estos híbridos (Fig. 17).

Introducción

23

Fig. 17. Cortina rompeviento bordeando una parcelas implantada con pasturas en el VIRN (Foto del autor).

El efecto de competencia no resultó tan pronunciado en las explotaciones

hortícolas del Valle Medio y del Valle Inferior, donde los perfiles de suelo

explorados por los cultivos son superficiales. Por ello, en estos valles irrigados,

los híbridos euramericanos continúan utilizándose en las explotaciones

forestales, incluidas las cortinas.

Sin embargo, a mediado de los años 80, comenzó a observarse la aparición de

cancros en los fustes de algunos clones que fueron incrementando su tamaño

hasta producir el quiebre de los mismos en las temporadas ventosas (Fig. 18).

Si bien los síntomas correspondían a los descriptos por Sarasola (1975) para la

Cancrosis del Álamo, recién en el año 1995, a pedido de la Dirección Provincial

de Bosques de la Provincia de Río Negro en la Universidad Nacional del

Comahue (UNComa)se confirmó que el agente causal era Mycospaherella

populorum (Pozzo Ardizzi et al., 1995).

En función de estos antecedentes y por requerimiento de diversas instituciones

locales (Dirección de Bosques, Estación Experimental del INTA Valle Inferior y

Introducción

24

sus Agencias de Extensión, el IDEVI, el Ente de Desarrollo de General Conesa,

y la UNComa, se decidió abordar el tema y desarrollar el presente trabajo. Se

trata de aportar elementos que expliquen por qué, clones muy próximos

genéticamente, difieren en su respuesta a la enfermedad.

Fig. 18. Cortina rompeviento del clon ´I 214` con algunos ejemplares quebrados a la altura de los cancros formados luego de varios años de evolución. (Foto del autor).

1.5. Objetivos.

1°) Analizar la evolución de la enfermedad en el VIRN sobre clones de Populus

sp cuyos antecedentes los categoricen como susceptibles y tolerantes.

Introducción

25

2°) Estudiar el desarrollo ontogénico de Septoria musiva sobre clones

susceptibles y tolerantes.

3°) Describir y comparar las características anatómicas de las hojas y de la

madera en los clones seleccionados para el estudio.

4°) Relacionar las diferencias registradas en el objetivo anterior con la

incidencia de la enfermedad.

5°) Analizar el impacto que produce la enfermedad en el VIRN y aportar datos

sobre la distribución de la enfermedad en la región del Comahue.

1.6. Hipótesis. El comportamiento de clones de álamo, susceptibles y tolerantes frente a

Septoria musiva, responde a ciertas diferencias cuantitativas en las

características anatómicas y fisiológicas de la hoja y el tallo. Estas

particularidades constituyen mecanismos de defensa pasiva, que pueden

inhibir o disminuir la colonización.

1.7. Relevancia. El cocimiento de los caracteres fenotípicos que influyen en la incidencia de la

Cancrosis del Álamo puede ser una herramienta en la búsqueda de resistencia.

Metodología

26

2. METODOLOGIA.

2.0. Selección de los clones a estudiar. Dada la gran diversidad de genotipos

del género Populus, muchos de ellos de origen desconocido, se tuvieron en

cuenta ciertos elementos para seleccionar los clones a estudiar en el presente

trabajo. Por un lado los antecedentes bibliográficos referidos a la escala

tolerancia/susceptibilidad (Fernandez Valiela, 1951; Fischetti et al., 1965;

Bakarcic, 1978; Ostry y McNabb, 1986. Cellerino, 1999; Arreghini et al., 2000;

Lucero et al., 2011a; Riu et al., 2011a), por otro lado, el aporte de informantes

locales calificados, inspecciones realizadas a distintos establecimientos de la

zona, y la magnitud de la superficie plantada en VIRN. Así, se seleccionaron

dos clones del híbrido Populus xcanadensis considerados susceptibles, Í 488`

e Í 214` y dos considerados tolerantes, ´Ballestra` y Ćonti 12`.

Estos clones forman parte de una colección de álamos implantada en el campo

experimental de la Dirección Provincial de Bosques de la provincia de Río

Negro (Parcela C – 90 de la colonia agrícola del IDEVI), ubicado a 35 km de

Viedma (Fig. 19). En una superficie de aproximadamente 3 ha se hallan

implantados 24 clones de álamos, de 22 años de edad al momento de iniciar

esta tesis. Están distribuidos en unidades experimentales de 60 ejemplares por

clon, en parcelas de 4 hileras con 15 árboles, espaciados 1 m dentro de la

hilera y 3 m entre hilera. Estas unidades están dispuestas en un diseño

experimental de Bloques Completos al Azar con cuatro repeticiones.

2.1. Análisis de la evolución de la enfermedad. S.musiva tiene la capacidad

de atacar a dos órganos histológicamente diferentes, las hojas y los tallos. Por

ello, la evaluación de la enfermedad se realizó en forma independiente en cada

uno de ellos.

Metodología

27

Fig. 19. Imagen satelital de la colección de álamos que se utilizó como fuente de muestreo para realizar el presente trabajo, ubicada en el campo experimental de la Dirección de Bosques del MAG y P de la Provincia de Río Negro.

2.1.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih). Desde el 24 de septiembre

del 2002 hasta el 7 de marzo del 2003 y desde el 27 de septiembre en el 2003

hasta el 12 de marzo del 2004, se realizaron 9 muestreos por temporada. Cada

20 días se extrajeron 200 hojas adultas de cada una de las cuatro unidades

experimentales de cada clon. Las muestras se tomaron a partir de

ramificaciones de los fustes, entre 1,30 y 1,80 m del suelo. Las hojas de cada

muestra se categorizaron según la escala de Spielman et al., 1986, modificada

a 7 grados de severidad (Tabla II). Los porcentajes que definieron cada

categoría fueron estimados a ojo desnudo.

Metodología

28

Tabla II. Grados de severidad del ataque de S. musiva en hojas.

Grado de la escala

Rango porcentual de severidad

Imagen representativa de cada grado de severidad (*)

0 Hojas sanas

1 1 a 10 % de la superficie afectada


3

26 a 50 % de la superficie afectada


Metodología

29


6 91 a 100% de la superficie afectada

(*) Fotos del autor.

La Ih se calculó aplicando la siguiente fórmula:

Intensidad en hoja (Ih) = [(N° de hojas/grado) x grado] x 100

N° total de hojas x 7 grados de severidad

Con los valores obtenidos se construyeron las curvas de regresión (Ih vs

Tiempo) para cada cultivar. Para comparar la evolución de la enfermedad entre

clones, los valores de Ih, fueron transformados en logaritmos naturales lo que

permitió linealizar las curvas sigmoideas. Luego se compararon las ordenadas

al origen (estado temprano de la enfermedad) y las pendientes de las rectas

(tasa de incremento de la enfermedad) mediante Análisis de la Varianza

(ANOVA) y Test de Comparaciones Múltiples de Duncan (TCMD). Se

analizaron las (Ih) finales de cada año, mediante ANOVA y TCMD. Las

diferencias entre años, dentro de cada clon se evaluaron mediante el Test de

Student.

2.1.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It). Estudiar la evolución de la

enfermedad en los tallos puede insumir varios años de observación debido al

lento desarrollo de los cancros. Por ello, la It se calculó en el 2004, sobre los

ejemplares adultos, asumiendo que esos valores eran el resultado de la

Metodología

30

evolución de la enfermedad durante los años previos. Sin embargo, existen

otros patógenos que producen cancros en álamos generando infecciones

complejas como Phomopsis, Dothichiza, Hypoxylon, Cytospora chrysosperma,

Entoleuca mammata (Sarasola, 1975; Palmer et al., 1979; Biggs et al., 1983; Ostry

y McNabb, 1985; Riffle y Peterson, 1986; Bucciarelli et al., 1999; Cellerino, 1999).

Si bien en este trabajo se le ha atribuido a S. musiva la responsabilidad de

producir la primera infección, es muy difícil diagnosticar la sucesión de

patógenos en lesiones viejas. Ante la posibilidad de sobreestimar la It, se

planteó corroborar esos datos, calculando dicha It sobre estacas inoculadas

artificialmente con el patógeno (Weiland et al., 2003). Estos autores encontraron

una buena relación entre la incidencia de la Cancrosis del Álamo en plantas adultas

con la incidencia en estacas inoculadas artificialmente.

2.1.2.1. En álamos adultos. Entre el 15 y el 18 de febrero del año 2004, los

fustes de las cuatro unidades experimentales de cada clon, se categorizaron

según la escala de (Strobl y Frasser, 1989) con 4 grados de severidad (Tabla

III).

Para calcular la It, se aplicó la siguiente fórmula:

Intensidad en tallo (It) = [(N° de tallo/grado) x grado] x 100

N° total de fustes x 4 grados de severidad

Estos datos fueron comparados mediante ANOVA y TCMD.

2.1.2.2. En álamos estacas inoculadas.

Preparación de las estacas. En el mes de mayo del año 2008, 20 estacas de

cada clon, en estado de dormición, se trataron con hormonas enraizantes y se

plantaron en recipientes de 5 Kg en una mezcla de suelo y turba comercial 1:1

(V/V). Las estacas permanecieron en el invernáculo de la UNComa, hasta el

mes de septiembre y luego se trasladaron al exterior para su rustificación. En el

mes de octubre, cuando las estacas ya habían brotado y expandido las hojas

Metodología

31

nuevas, se las inoculó con S. musiva siguiendo la metodología de Weiland et

al. (2003).

Tabla III. Grados de severidad del ataque de S. musiva en madera.

Grado de la escala

Grado de desarrollo de los cancros

Imagen representativa de cada grado de

severidad (*) 0 Madera sana.

1 Pequeños cancros menores de 25 cm de largo.

2 Cancro (s) que ocupa (n) menos de la mitad de la circunferencia del árbol.

3 Cancro (s) que ocupa (n) más de la mitad de la circunferencia

del árbol.

(*) Fotos del autor.

Preparación del inóculo. El inóculo fue producido en el Laboratorio de la

UNComa a partir de aislamientos provenientes de lesiones foliares. El

Metodología

32

aislamiento Sm11, seleccionado por su rápido crecimiento en APD, se repicó

en tubos de ensayo con Agar V-8 en pico de flauta, y fue expuesto durante 15

días a 20 °C con luz continua (3.000 Lux) hasta lograr un profuso desarrollo de

micelio y picnidios. Se preparó una suspensión de conidios introduciendo agua

destilada estéril en los tubos y agitando con vortex durante varios minutos. Se

diluyó la suspensión hasta obtener una concentración de 2 x 106 esporas/mL.

Alícuotas de 5 mL de esa suspensión se esparcieron sobre cajas de Petri de 90

mm de diámetro con Agar Extracto de Malta (AEM). Luego de dos semanas de

crecimiento, en las condiciones de cultivo mencionadas, las cajas estuvieron

totalmente colonizadas (Fig. 20).

Fig. 20. Aspecto del desarrollo de S. musiva en placas de Petri en medio de cultivo AEM. (Fotos del autor). Inoculación de las estacas. En el mes de octubre, 15 de las 20 estacas

correspondientes a cada clon, se inocularon con el patógeno y las cinco

restantes se utilizaron como blancos. Se extirpó la cuarta o quinta hoja

expandida para sostener con parafilm sobre la herida ocasionada, un inóculo

de 8 mm de diámetro proveniente del cultivo madre. Los quince ejemplares

inoculados de cada clon se organizaron en grupos de cinco que se

distribuyeron según un Diseño Completamente Aleatorizado. Los blancos

fueron tratados solo con agar. A las dos semanas se retiraron las protecciones

Metodología

33

de parafilm y el punto de inoculación se enmarcó con dos líneas de tinta

indeleble.

Evaluación de la Inoculación. La respuesta de los clones a la inoculación se

evaluó en el mes de marzo del 2009. De cada planta se seccionó un segmento

de 10 cm de longitud en cuyo centro se ubicaba el punto de inoculación. Se

registró la presencia/ausencia de cancros (incidencia) y se descubrió el margen

de la lesión para registrar su longitud y describir su histología (Fig. 21).

Para calcular la incidencia en cada clon, se registró el número de plantas

inoculadas en las que se desarrollaron cancros, menos el número de plantas

testigo en las que se desarrollaron cancros. La incidencia y la severidad se

analizaron estadísticamente realizando los respectivos ANOVA y TCMD.

Fig. 21. Estacas inoculadas con S. musiva. (A) cancro desarrollado; (B) testigo. (Fotos del autor).

Reaislamiento del patógeno. Se realizó a partir de cinco lesiones al azar de

cada clon. Pequeños segmentos de madera extraídos del margen de los

cancros, se desinfectaron superficialmente y se transfirieron a cajas de Petri

con Medio Septoria musiva (SMM) (Stanosz y Stanosz, 2002). Las cajas se

matuvieron a 20 °C bajo luz fluorescente continua durante dos semanas

(Krupinsky, 1989) hasta el desarrollo de micelio (Fig. 22).

A B

Metodología

34

Fig. 22. Reaislamiento de S.musiva en SMM de estacas de álamo inoculadas artificialmente.

Esos aislamientos se repicaron en Medio V-8, se cultivaron en las mismas

condiciones descriptas para la preparación del inóculo y se identificaron

morfológicamente (Sivanesan, 1990).

2.1.2.3. Validación de las It en álamos adultos. Con los valores registrados

en 2.1.2.1 y 2.1.2.2, se construyó una tabla que permitió realizar un análisis

comparativo entre ambos parámetros y se calculó el Coeficiente de Correlación

de Pearson.

2.1.3. Relación entre la intensidad de la enfermedad en hojas y tallos adultos. La relación entre las respectivas intensidades se estableció a través

del análisis de regresión y el Coeficiente de Correlación de Pearson.

2.2. Descripción de Septoria musiva. Para el estudio del patógeno en la

hojarasca se utilizaron dos de los cuatro clones seleccionados: ‘I 214`

(susceptible) y ‘Conti 12` (tolerante).

Metodología

35

2.2.1. Ascomas pseudoteciales en la hojarasca: En los meses de marzo de

los años 2003 y 2004, antes de que se produzca la abscisión natural y masiva

de las hojas, se cosecharon 200 hojas senescentes, a partir de las parcelas

experimentales de cada clon, insertas entre el 1,5 m y 1,8 m del suelo. Se las

ubicó en sendas bolsas de red de 0,5 x 1 m, perfectamente identificadas y se

las acondicionó en el suelo de la alameda, inmersas en la cama natural de

hojarasca, a la intemperie. A partir del 1 de junio, y cada 15 días se

muestrearon al azar 10 hojas de cada bolsa y se las llevó al laboratorio para su

estudio microscópico. Con un sacabocado se extrajeron 5 discos de 1 cm de

diámetro, por lámina y se los fijó en FAA. Luego, se impregnaron en parafina

con la metodología usual (D´Ambrogio de Argüeso, 1986) y se realizaron cortes

de 10 µm de espesor con un micrótomo rotatorio (Senior Rotatory Microtome.

Modelo: RMT-30). Se dispusieron sobre portaobjetos, se desparafinaron y se

montaron en lactofenol y/o azul de lactofenol. El material observado no fue

teñido dado que los ascomas son estructuras melanizadas con buen contraste.

No se encontró en la bibliografía algún estudio que definiera etapas en el

desarrollo de los ascomas en la hojarasca para S. musiva por lo que se adaptó

la escala evolutiva que James y Sutton (1982a) utilizaron para Venturia

inaequalis. Ellos determinaron 14 estadíos de desarrollo desde el estroma

hasta los ascomas pseudoteciales vacíos. Debido a que en S.musiva no se

forman paráfisis ni pseudoparáfisis y que sus ascosporas no cambian de

pigmentación, la escala se redujo a 9 estadíos que se describen en la Tabla IV.

Para calcular los estadíos promedios y los desvíos estándar por clon y por

fecha, se observaron 50 ascomas en su plano medio, los que fueron

adjudicados a los distintos niveles de la escala de desarrollo (Tabla IV). Con

estos datos se construyeron las curvas de regresión “estadío vs tiempo” para

ambos clones.

En cada muestreo, además de las observaciones ontogénicas, se registraron

los diámetros de los ascomas mediante un microscopio óptico con ocular

micrométrico (Zeiss. West Germany. Modelo 4670589903). Con estos datos se

Metodología

36

construyeron las curvas de evolución del tamaño de los ascomas en función del

tiempo para cada clon. En el estadío 7, se registraron el espesor de las

paredes del ascoma y el tamaño de ascos y ascosporas. Las comparaciones

de estos parámetros entre clones y entre años se realizaron mediante el Test

de Student.

Tabla IV. Características de los estados ontogénicos utilizados en este estudio para describir la evolución de S. musiva.

Estadíos Caracterización Imágenes fotográficas de los estadíos (*).

1 Estroma subcuticular.

2 Formación de un estroma

macizo globoso.

3 Aparición del lumen con

contenido indiferenciado.

4 Aparición de un himenio

basal.

Metodología

37

5 Aparición de ascos inma-

duros, de tamaño reducido o

contenido indiferenciado.

6 Ascos con ascosporas.

7 Ascos con esporas septadas

maduras.

8 Ascomas pseudoteciales a-

biertos con los ascos y

ascosporas liberándose.

9 Ascomas vacíos con restos

de ascos desintegrados.

(*) (Fotos del autor) El estadío 8 es muy difícil de registrar fotográficamente pues dura minutos.

Metodología

38

2.2.2. Picnidios en hoja. En el mes de diciembre del 2005, se tomó una

muestra de 20 hojas con síntomas a partir de las cuatro parcelas

experimentales de cada clon (‘I 214` y ‘Conti 12`). Porciones de 1 cm2 con 2 o 3

lesiones foliares se fijaron en FAA, se incluyeron en parafina y se cortaron en

secciones transversales de 8 µm de espesor con micrótomo rotatorio. Se

montaron sobre portaobjetos para la descripción de los picnidios con su

coloración natural, y se registraron el diámetro de 50 picnidios. La comparación

de este parámetro entre clones se realizó mediante el Test de Student.

2.2.3. Picnidios en medios de cultivo. Se realizaron aislamientos del

patógeno a partir de hojas del clon ´I 214` y de ´Conti 12` que presentaban las

lesiones foliares características. Porciones de tejido enfermo de

aproximadamente 5 mm2 fueron desinfectadas superficialmente y ubicadas en

cajas de Petri de 90 mm de diámetro sobre medio APD al 2 %. Fueron

incubadas a 20 °C, bajo luz continua (3.000 Lux), controlando diariamente el

desarrollo de micelio para repicar a partir de las primeras hifas formadas. Los

aislamientos así obtenidos, se transfirieron a cajas de Petri con agar V-8, a 20

°C bajo luz continua (3.000 Lux) para inducir la formación picnidios (Ostry y

Skilling, 1988). Luego de 15 días bajo estas condiciones, se observó el

desarrollo de las primeras estructuras, y 15 días más tarde se registraron sus

dimensiones. Las comparaciones se realizaron mediante el Test de Student.

2.3. Análisis de las características anatómicas de las hojas y de los tallos. Para el desarrollo de este objetivo se utilizaron materiales de los cuatro clones

seleccionados: ‘Conti 12` y ‘Ballestra` (tolerantes) e ‘I 214` e ‘I 488`

(susceptibles).

2.3.1. Estructura de la hoja.

2.3.1.1. Aspectos morfológicos. Se muestrearon 25 hojas adultas de cada

una de las cuatro parcelas experimental de cada clones, ubicadas entre 1,60 m

y 2 m del suelo.

Metodología

39

Forma de la lámina. Los criterios que se consideraron para describir la

morfología foliar fueron: forma de la lámina, aspectos de la base, del ápice y

bordes del limbo, y pecíolos.

Tamaño de la lámina. Cada hoja se pasó en forma individual por un

medidor de área foliar (Licor LI-3100) y con esos valores se calcularon los

promedios, los desvíos estándar para cada clon, que fueron comparados

mediante ANOVA y TCMD.

2.3.1.2. Aspectos anatómicos. Debido al crecimiento indeterminado de los

álamos coexisten hojas de diferentes edades en una misma temporada. En

consecuencia el tamaño no es un buen indicador para seleccionar las hojas de

la misma edad, condición necesaria para realizar los análisis comparativos. Por

lo expuesto se resolvió seleccionar las hojas según el “índice foliar plastocrom”

(LPI) a partir de estacas crecidas bajo condiciones controladas (Larson e

Isebrands, 1971). Este índice permite medir la edad de estos órganos según

una escala morfológica más que temporal, eliminando las variaciones debidas

a factores genéticos y ambientales sobre la tasa de crecimiento. La escala

establece que, entre las últimas hojas emergidas del brote, se designa como

LPI 0.0, a aquella que mide 20 mm de largo. A partir esta se designan como

LPI 1.0, LPI 2.0, etc., a las que se ubican sucesivamente en sentido basípeto.

Cultivo de estacas para el muestreo de hojas. En julio del 2006 se extrajeron

estacas de los clones seleccionados, a partir de la colección de álamos

utilizada para este estudio. Veinte ramas de un año de edad correspondientes

a cada cultivar, fueron cortadas en secciones de 60 cm de largo e implantadas

en macetas de 5 Kg, de 20 cm de diámetro por 30 cm de altura. Se ubicaron en

un túnel de plástico de 4 x 4 m de base y 2 m de altura hasta que concluir el

período de heladas, regándolas con 250 cm3 de agua, dos veces por semana.

En el mes de noviembre, cuando ya contaban con un número considerable de

hojas completamente expandidas, se trasladaron al campo experimental de la

UNComa y se mantuvieron a la intemperie para su rustificación. A las 20

plantas de cada clon se las agrupó en unidades experimentales de cinco

Metodología

40

plantas para armar un diseño de Bloques Totalmente Aleatorizados con cuatro

repeticiones.

En el mes de diciembre se muestrearon 5 hojas de cada unidad experimental

en los estadíos LPI 0.0, LPI 1.0, LPI 5.0 y LPI 10.0 para estudiar las

características anatómicas y epidérmicas de sus láminas (Fig. 23).

Espesor de la hoja y de sus tejidos. A partir de las hojas LPI 10.0 de

cada clon se extrajeron secciones de 1 cm2 de la parte basal-central de un

hemilimbo. Estos segmentos se fijaron en FAA, se incluyeron en parafina

(D´Ambrogio de Argüeso, 1986) para obtener secciones transversales de 10

µm de espesor, y se observaron sin tinción con un microscopio óptico. En 25

cortes por cada unidad experimental (5 de cada hoja), se registraron los

siguientes parámetros: el espesor total de la lámina, del parénquima en

empalizada, del parénquima lagunoso y de las epidermis adaxial y abaxial.

Fig. 23. Clasificación de las hojas según el Índice Foliar Plastocrom (LPI) en el clon Conti 12. (Foto del autor).

LPI 0.0 LPI 1.0 LPI 5.0 LPI 10.0

Metodología

41

Para realizar una cuantificación de los espacios intercelulares en el parénquima

en empalizada, se recurrió a la metodología utilizada por Isebrands y Larson

(1973) modificada. Estos autores crearon un Índice de Separación Celular

(ISC) fundamentado en que, si no existieran espacios intercelulares, una

determinada longitud del estrato celular, dividida por el número de células que

contiene, indicaría el ancho promedio de una célula. También demostraron que

en el parénquima en empalizada la expansión celular se completa cuando las

hojas están en LPI 3.0 y a partir de allí comienzan a formarse los espacios

intercelulares. Por lo tanto, el ISC calculado en LPI 10.0 es el promedio del

ancho célular más el espacio intercelular adyacente. Este índice es válido

cuando se trata de comparar tejidos en un mismo material genético donde,

fijando el ancho de las células, a mayor índice de separación celular, mayor

espacio intercelular. Cuando se comparan diferentes materiales genéticos,

como en este caso, que pueden diferir en el ancho celular, un mismo valor del

índice puede indicar espacios intercelulares diferentes. Para estimar esas

diferencias se definió el Indicador del Espacio Intercelular (IEI).

IEI = ISC – ACP

ACP es el ancho celular promedio de las células. Para calcularlo se alineó la

regla del ocular micrométrico (245 µm), sobre el estrato celular y se registró el

número de células y el ancho de las mismas en 10 preparados por clon,

tomados al azar.

Con los datos registrados para cada uno de estos parámetros se realizaron

ANOVA y TCMD. Se tomaron registros fotográficos de campos representativos

con el objeto de describir en conjunto, las características más conspicuas de

los mesófilos. En estos mismos campos se midió el espesor de las respectivas

cutículas.

Caracterización de los estratos epidérmicos. Entre las variables que

ofrecen las células epidérmicas se pueden mencionar, el número, tamaño,

distribución y ontogenia de los estomas, el número y tamaño de las células

Metodología

42

epidérmicas indiferenciadas y la composición química de sus cutículas. Para

registrar estos parámetros se utilizaron las muestras foliares tomadas en los

estadíos LPI 0.0, LPI 1.0, LPI 5.0 y LPI 10.0. Un sector de aproximadamente 1

cm2 ubicado en la base foliar de la cara adaxial, se pinceló con laca para uñas

transparente. Se dejó secar durante 20 minutos y se cubrió con una cinta de

papel adhesivo transparente. Al retirar la cinta, se desprendió la laca con la

impresión epidérmica (Ferris y Taylor, 1994), la cinta se adhirió a un

portaobjeto y se examinó al microscopio óptico. Esta operación se repitió en la

epidermis abaxial (Fig. 24).

Fig. 24. Epidermis adaxial de una hoja de ´I 214` pintada con laca transparente para uñas. (Foto del autor).

Se observaron un total de 160 preparados seleccionando un campo óptico

representativo por superficie adaxial y abaxial por hoja. Cada uno de esos

campos fue fotografiado con una cámara digital (Canon Shot S5IS), generando

un archivo con extensión GIF. A partir de esas fotografías se evaluaron los

siguientes parámetros:

Densidad estomática (DE) y caracterización de los estomas. La DE es el

número de estomas por unidad de superficie. En los archivos fotográficos de

cada clon se recontó el número de estomas por campo óptico y se convirtió en

número de estomas por mm2. También se midieron las longitudes estomáticas.

Metodología

43

Se calcularon los promedios y los desvíos estándar de ambos parámetros y se

compararon por medio de ANOVA y TCMD.

Se observaron estomas con diferentes grados de desarrollo en una misma

fecha: a) estomas inmaduros, que abarcan desde células oclusivas

recientemente formadas, hasta estomas menores del 50 % del tamaño

promedio y b) estomas maduros, funcionales, cuyas longitudes superan el 50

% del tamaño definitivo promedio (Fig. 25). La proporción de estomas

inmaduros/maduros en los distintos estadíos de desarrollo foliar, permitió

establecer algunas consideraciones sobre la ontogenia de los estomas.

Fig. 25. Epidermis foliares en P. xcanadensis. Las flechas con líneas completas señalan estomas maduros y con líneas cortadas, estomas inmaduros. (Fotos del autor).

Densidad y caracterización de las células epidérmicas indiferenciadas: Esta densidad (DCEI) corresponde al número total de células epidérmicas

indiferenciadas o pavimentosas por unidad de superficie. Para realizar los

recuentos y registrar las dimensiones de estas células, los archivos fotográficos

con extensión GIF, fueron procesados y analizados por el programa “Scion

Image” (Scion Image 4.0.3.2. Scion Corporation, 2008). El software calculó la

DCEI de por mm2 y el área media de estas células seleccionando al azar 10

células por campo. Los datos por cada clon fueron comparados por ANOVA y

TCMD.

Metodología

44

Composición de la cutícula. La cutícula, es una cubierta cerosa que recubre

las células epidérmicas y está compuesta principalmente por n-alcanos de

cadena larga, y en menor proporción, por alcoholes, ésteres y flavonoides,

entre otros. Algunos autores han reportado la influencia de la composición

cuticular sobre el desarrollo de ciertos patógenos foliares (Alcerito et al., 2002;

Conn y Tewari, 1989) por lo que se planteó analizar la composición de los n-

alcanos cuticulares en los clones seleccionados. Para ello, en el mes de

febrero del 2007, se coleccionaron al azar 25 hojas adultas, incluidos los

pecíolos, de cada clon. Se lavaron individualmente con agua corriente fría, se

dejaron secar al aire a temperatura ambiente durante 48 hs y luego se molieron

en molinillo eléctrico. El material así acondicionado se envió al Laboratorio de

Análisis Químicos de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad

Nacional de Centro de la Provincia de Buenos Aires, para su análisis. La cera

cuticular fue extraída y purificada, y el contenido y proporción relativa de los n-

alcanos de número impar de carbonos (C23…..C35), fue cuantificada mediante

cromatografía gas-líquido capilar. La concentración total de los n-alcanos se

expresó en mg/kg de materia seca.

Aspectos topográficos de las epidermis foliares. Se registraron imágenes

con un microscopio de barrido para completar los estudios realizados con el

microscopio óptico, fundamentalmente en los aspectos descriptivos. Se

fotografiaron las epidermis adaxiales y abaxiales de hojas en estado PLI 10.0

de los clones seleccionados. Las fotografías aportaron datos sobre el

microrelieve de las superficies foliares y permitieron corroborar con mayor

precisión el largo de los estomas.

2.3.2. Estructura del tallo. Las observaciones y las mediciones histológicas se

realizaron sobre cortes transversales de tallos jóvenes de los clones

estudiados. En el género Populus el cambium se activa a pocos cm del ápice

caulinar y la transición entre el desarrollo primario y secundario acontece a la

altura del entrenudo asociado a la primera hoja completamente expandida (LPI

10.0) (Larson e Isebrands, 1974; Esau, 1985). Por tal motivo, los estudios

Metodología

45

comparativos de los tejidos del tallo se hicieron en el entrenudo comprendido

entre LPI 10.0 y LPI 11.0 para estandarizar el grado de desarrollo de las

muestras.

En el mes de diciembre del 2008 se podaron 10 ramas jóvenes de cada clon,

tomadas al azar de las parcelas experimentales ubicadas en el predio de la

Dirección de Bosques. En el laboratorio, con la ayuda de un calibre, se

seccionaron segmentos de 10 cm de largo por de 4 mm de diámetro que se

utilizaron sin fijación para los recuentos y mediciones de lenticelas.

De las 10 ramas de cada clon se seccionaron otros segmentos de 3 cm del

mismo calibre que se destinaron a los estudios anatómicos de las peridermis,

las lenticelas y las cortezas. Se fijaron en FAA durante una semana, luego se

los hirvió durante 20 minutos con el fin de ablandar las estructuras y finalmente

se los incluyó en parafina. Se cortaron 5 secciones transversales de 10 µm de

espesor con el micrótomo rotatorio que se montaron sobre portaobjetos, se

desparafinaron y se observaron al microscopio óptico inmersos en lactofenol,

sin tinción. El valor de cada parámetro registrado surgió del promedio de esas

cinco lecturas, con diez repeticiones.

Cada segmento (fijado y sin fijar) fue considerado una unidad experimental por

lo tanto, los datos se organizaron en un diseño de Bloques Completamente

Aleatorizados, con cuatro tratamientos (clones) y 10 repeticiones (segmentos

de tallo).

2.3.2.1. Peridermis exofiláctica. Es el tejido de protección que reemplaza a la

epidermis cuando se desencadena el desarrollo secundario del tallo. Está

constituida por tres estratos de células denominadas “felema”, “felógeno” y

“felodermis” (Fig. 26). En esta capa aparecen las lenticelas que son estructuras

por donde se produce el intercambio gaseoso y suelen constituirse en la puerta

de entrada de algunos patógenos como S. musiva (Sarasola, 1975; Ostry,

1987; Sinclair y Lyon, 2005).

Metodología

46

Fig. 26. Esquema de los tejidos de protección durante la transición del desarrollo primario al secundario, en un tallo joven. Tomado de Rost et al., 1992. De la estructura peridérmica se analizaron sólo el felema y las lenticelas pues

el felógeno tiene una célula de profundidad y la felodermis es un tejido

parenquimático que establece una suerte de continuidad con la corteza.

Características del Felema. Con la ayuda de una lente micrométrica se

registraron 2 espesores del felema (que se promediaron) en cada uno de los 5

preparados por unidad experimental, considerando la distancia entre el

felógeno y la superficie del tallo, o sea, se incluyeron los vestigios de epidermis.

Además, se registró el número de estratos celulares que componen el felema y

se calculó el espesor de esos estratos dividiendo el espesor total del felema por

el número de estratos. Los datos registrados para los distintos clones se

compararon mediante ANOVA y TCMD.

Características de las lenticelas. Para la caracterización de las

lenticelas en los distintos clones se evaluaron los siguientes parámetros:

Densidad de lenticelas (Número de lenticelas por unidad de superficie): El

recuento en cada clon, se realizó sobre los segmentos no fijados del muestreo

de diciembre del 2008, de 10 cm de largo por 4 mm de diámetro, que

Metodología

47

representaba una superficie peridérmica de 12,57 cm2. El procedimiento se

realizó a ojo desnudo.

Dimensiones de las lenticelas. Se midieron el largo y el ancho de las

lenticelas registradas en el ítem anterior, con la ayuda de una lente

micrométrica instalada en un microscopio estereoscópico (Arcano).

Superficie caulinar ocupada por las lenticelas. Se calcularon las superficies

promedio de las lenticelas en cada clon, aplicando la fórmula de una elipse (π x

largo de la lenticela x ancho de la lenticela). Multiplicando este valor por el

número de lenticelas, se estimó el área total de lenticelas por segmento de tallo

analizado (12,57 cm2).

Todos los parámetros medidos en los cuatro clones fueron comparados por

ANOVA y el TCMD.

Anatomía de las lenticelas. Se utilizaron los mismos cortes histológicos

preparados para el análisis de la peridermis. Se describieron las lenticelas de

fines de primavera y se midieron el ancho interno y la profundidad. Los

registros en los distintos clones se compararon mediante ANOVA y TCMD.

2.3.2.2. Corteza. Se utilizaron los mismos cortes anatómicos que en los item

anteriores. Se midieron dos espesores de corteza (desde el felógeno hasta el

cambium) en cada uno de los cinco cortes, se promediaron y se compararon

mediante ANOVA y TCMD. Se analizó la anatomía cortical de cada clon,

resaltando las diferencias.

2.4. Relación entre las características anatómicas y morfológicas de los órganos susceptibles con la incidencia de la enfermedad en los clones seleccionados. En este ítem se realizó una recopilación de los resultados

obtenidos para el análisis de la enfermedad (ítem 2.2) y los datos morfológicos

y anatómicos de hojas y tallos (2.3). Se construyó una tabla de doble entrada,

donde se dejó constancia de la posición relativa de los clones para cada

Metodología

48

parámetro y se calcularon las correlaciones entre cada parámetro foliar y la Ih, y

cada parámetro caulinar y la It. Como indicador de la intensidad o “fuerza” de la

relación lineal entre las dos variables se calculó el “coeficiente de correlación

momento-producto de Pearson” que se simboliza con la letra “r” (Mendenhall et

al., 2008).

Una vez determinadas las variables que correlacionaban fuertemente con Ih y

con It, se investigó si el nivel de incidencia de S. musiva en los clones

estudiados, podía ser una función multivariada. Para ello se utilizó el Análisis

de Componentes Principales (ACP) que permite sintetizar la información,

reduciendo el número de variables con la menor pérdida de información posible

(Mendenhall et al., 2008). Esta metodología se aplicó por separado para las

variables relacionadas con la hoja y con el tallo. Se construyeron las

respectivas matrices de correlación entre las variables anatómicas y

morfológicas y se seleccionaron las que iban a participar del análisis. Para el

análisis se utilizó el paquete estadístico INFOSTAT (Departamento de

Estadística. Universidad Nacional de Córdoba).

2.5. Prospección de la enfermedad en la región del Comahue. Se llevaron a

cabo consultas a informantes calificados y visitas a instituciones oficiales como

Viveros Provinciales, Ente de Desarrollo de General Conesa, Agencias de

Extensión del INTA, Estación Experimental INTA Alto Valle.

Con el objeto de aportar datos que contribuyan al conocimiento del alcance de

la enfermedad se realizaron dos viajes por la región del Comahue. En los

meses de marzo del 2005 y del 2008, previo a la senescencia de las hojas, se

trazaron y recorrieron dos itinerarios (Fig. 27) haciendo evaluaciones visuales

de la enfermedad en hojas y tallos sobre ejemplares del género Populus de

origen conocido (viveros y forestaciones productivas) y desconocido (cortinas

rompeviento, cascos urbanos y asentamientos rurales) distribuidos en

diferentes puntos geográficos.

Metodología

49

En las localidades donde se observaron síntomas semejantes a los producidos

por S. musiva en hojas, se tomaron muestras foliares que fueron conservadas

en bolsas de nylon y almacenadas en un recipiente refrigerado. En el

laboratorio se sometieron a los procedimientos mencionados en el ítem 2.2.3

para intentar aislar el agente causal. La finalidad de estos muestreos fue la de

citar las localidades donde se haya confirmado la presencia de la enfermedad.

Fig. 27. Mapa de la región de Comahue donde se marcan los itinerarios recorridos y las localidades donde se tomaron las muestras para analizar la dispersión de la enfermedad.

Gral. Conesa

El Chocón

Piedra del Águila

El Chañar

2005

2008

Valcheta

Región del

Comahue

Río Colorado

Resultados y Discusión

50

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Análisis de la evolución de la enfermedad. Para estudiar la dinámica de

esta enfermedad es necesario conocer cómo varían los indicadores

“incidencia”, “severidad” o una combinación de ambos, la “intensidad de la

enfermedad” (Arneson, 2006; Madden et al., 2007), en función del tiempo.

El impacto de la actividad de los patógenos y las pérdidas que ocasionan, son

funciones del progreso de enfermedad, por ello es tan importante entender los

términos cuantitativos de dicho progreso y los factores que influyen, así como

determinar si es monocíclica o policíclica.

3.1.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih). La fase foliar de la

enfermedad se inicia en primavera, cuando comienzan a liberarse las

ascosporas producidas en la hojarasca infectada en la temporada anterior.

Estos propágulos se descargan durante un período de seis a ocho semanas

infectando las hojas nuevas ubicadas en los nudos inferiores de los tallos

(Luley y McNabb, 1989). Después de aproximadamente 10 a 14 días, a partir

de cada lesión ascospórica se produce un segundo tipo de esporas, los

conidios, generan numerosas repeticiones del ciclo (Fig. 15) y son

responsables del incremento exponencial de los síntomas (Sarasola, 1975;

Ostry, 1987).

En las dos temporadas estudiadas, la Ih aumentó con el avance del tiempo

describiendo curvas sigmoides en todos los clones (Fig. 28 y 29). En ambos

casos las primeras lesiones aparecieron en la última semana de septiembre,

iniciándose un período en el que el incremento de la Ih fue lento (fase lag).

Según Luley y McNabb (1989 y 1991) el inóculo presente en esa etapa está

compuesto mayoritariamente por ascosporas. Tanto en la temporada

2002/2003 como en 2003/2004, los clones que primero ingresaron a la fase

lineal de la curva (tasa de incremento constante) fueron ´I 488` e ´I 214`

mientras que los otros dos clones permanecieron en la etapa inicial uno o dos

muestreos más. El caso más notorio fue el de ´Ballestra` en la temporada


51

2003/2004 porque recién manifestó las primeras lesiones foliares a principios

de noviembre pese a estar sometido a la misma presión de inóculo que el resto

de los clones (Fig. 29).

Fig. 28. Evolución de la intensidad de Cancrosis sobre las hojas de diferentes clones de álamo durante la temporada 2002/2003.

Fig. 29. Evolución de la intensidad de Cancrosis sobre las hojas de diferentes clones de álamo durante la temporada 2003/2004.


52

El resultado de las transformaciones logarítmicas de los datos de Ih permitió la

comparación entre clones y temporadas (Fig. 30).

Fig. 30. Representación semilogarítmica de los valores de Intensidad de Cancrosis sobre hoja (Ih), en las temporadas 2002/2003 y 2003/04. La flecha indica el momento en que ´Ballestra` comenzó a expresar los síntomas de la enfermedad en la temporada 2003/04.


53

El coeficiente (a) de las rectas representa la Ih en el momento de iniciar los

muestreos, y (b) las tasas de incremento de la enfermedad. En este trabajo se

observaron diferencias significativas entre los clones, en ambas temporadas

(Fig. 30 y Tabla V).

Tabla V. Coeficientes de las rectas de regresión “Ln de Ih vs. Tiempo” para cada clon en las temporadas 2002/03 y 2003/04.

Temporada 2002/03

Clones Ih inicial (a) Tasa de incremento de la enfermedad (b)

Ln del Ih final calculado

Conti 12 0,208 c 0,0217 b 4,114

Ballestra 0,046 d 0,0232 b 4,222

I 214 0,353 b 0,0242 ab 4,709

I 488 0,716 a 0,0320 a 6,476

Temporada 2003/04

Conti 12 0,367 b 0,0188 b 3,751

Ballestra -0,987 c 0,0279 a 2,991

I 214 0,899 a 0,0221 b 4,877

I 488 0,813 a 0,0223 b 4,827

Dentro de cada columna, en de cada temporada, los tratamientos con letras distintas representan diferencias significativas según el TCMD (P< 0,01).

Todos los factores que afectan la supervivencia y el desarrollo del patógeno

durante la etapa otoño-invernal en la hojarasca, afectan a estos coeficientes

porque pueden estimular o retrasar el momento de liberación de las ascosporas

y regular el caudal de las mismas. Dado que todos los clones estudiados, están

implantados en el mismo lugar y con las mismas pautas de manejo, estuvieron

sometidos a la misma presión y calidad de inóculo. Por lo tanto, las diferencias

registradas fueron atribuidas a variaciones en algunas características foliares

que influyeron en la entrada y colonización del patógeno.

En el ciclo 2002/03 Ih inicial difirió significativamente en todos los clones

resultando Í 488` mayor que Í 214`, mayor que Ćonti 12`, mayor que

´Ballestra`. En la temporada 2003/04, la misma comparación detectó tres tipos

de comportamiento. Por un lado, Í 488` e Í 214` registraron los mayores


54

valores, siendo estadísticamente semejantes. Por otro lado, Ćonti 12` tuvo un

valor intermedio, y por último, ´Ballestra` tuvo un valor negativo que representa

la ausencia de síntomas visibles en los primeros muestreos. En la figura 29 se

puede observar que la curva para este clon comenzó a despegarse del eje

horizontal entre el tercer y cuarto muestreo a diferencia de los otros clones que

lo hicieron más tempranamente.

Las tasas de incremento de la enfermedad (b) mostraron diferencias entre los

clones, en ambas temporadas de crecimiento (p<0,01 para ambos ciclos) (Fig.

30 y Tabla V). En procesos biológicos como las enfermedades, la magnitud de

este coeficiente puede depender de un número variable de factores, incluyendo

las condiciones ambientales y las prácticas de manejo (Arneson, 2006; Agrios,

2005). Como se manifestó previamente estos factores fueron iguales para

todos los clones por lo que, las diferencias en el incremento de los síntomas se

atribuyeron a variaciones en las características foliares.

La comparación de las tasas de incremento de la enfermedad (b) arrojó

diferencias no significativas entre los clones con las excepciones de Í 488` en

el 2002/2003 y de ´Ballestra` en el 2003/2004 (Tabla V) que fueron superiores

al resto. En el caso particular de ´Ballestra`, pese el elevado valor de (b)

mantuvo niveles relativamente bajos de Ih hasta finalizar el ciclo debido a la

tardía aparición de los síntomas en primavera (Fig. 29 y 30). El Coeficiente de

Correlación de Pearson calculado entre la Ih inicial y la Ih final, alcanzó un valor

de 0,59. Si bien no es alto, indicaría una cierta influencia de la Ih inicial sobre la

Ih final. Hay que tener en cuenta, que entre ambos registros transcurrieron seis

meses, y la variabilidad de la Ih final carga con todo el peso del efecto ambiental

sobre la relación hospedante – patógeno.

La figura 31 muestra el análisis comparativo de sendos coeficientes entre

temporadas, en cada clon. En Ćonti 12` los valores (a) y (b) fueron semejantes

en ambos ciclos, lo que indicaría un comportamiento estable. En Í 214` solo

difirió (a) y en Í 488` (b). Ambos coeficientes fueron diferentes en ´Ballestra`. Si


55

bien la diferencia en la intensidad inicial (a) en ambas temporadas fue

significativa, los valores fueron los bajos de todos los clones.

Fig. 31. Coeficientes de las rectas de regresión “Ln de la intensidad vs tiempo” registradas en las dos temporadas. A. Ih inicial. B. Tasa de incremento de la enfermedad. Las columnas apareadas, encabezadas con (*) no difieren entre sí, y las encabezadas con (**) sí lo hacen según el Test de Student (P < 0,01).

Al comparar los coeficientes en ambas temporadas se observó que, con

cuando la Ih inicial era elevada, se registraba un incremento menor de la

enfermedad. Si bien una mayor sintomatología temprana (Ih inicial) resultaría


56

en mayor producción de inóculo (Luley y McNabb, 1989 y 1991), también se

reduciría la superficie de tejido sano disponible para posteriores infecciones.

Aparentemente disminuiría la eficacia del inóculo secundario generando una

tasa de crecimiento menor. Resalta el caso particular de ´Ballestra` en el que la

ausencia de síntomas tempranos determinaría una mayor cantidad de tejido

disponible para el inóculo secundario generando la mayor tasa de incremento

en la temporada 2003/2004.

Las diferencias en las intensidades registradas en ambas temporadas, son una

pauta del efecto del ambiente sobre el desarrollo de las enfermedades,

afectando a las poblaciones del patógeno (Szkolnik, 1969; Sutton et al., 1976;

Tomerlin y Jones, 1983; O´Leary y Sutton, 1986; Luley y McNabb 1989 y 1991),

del hospedante (Schumaker et al., 1997; Taylor et al., 2003; Wittig et al., 2005)

y al patosistema en su conjunto (Maxwell y Stanosz, 1994 y 1995).

Las Ih registradas en el último muestreo de cada año fueron consideradas la

máxima expresión de los síntomas foliares pues más allá de esas fechas

comienza la defoliación. Por otra parte, hacia el final de la temporada, se

manifiestan intensos ataques de Roya que interfieren en la evaluación. En la

figura 32 se presenta la comparación de las Ih finales entre los clones, en

ambas temporadas estudiadas.

Como se puede observar, en Í 488` y en Í 214` se registraron los mayores

valores de Ih al final de ambas temporadas. Estos datos concuerdan con otras

evaluaciones realizadas en Argentina, en décadas pasadas (Fernandez Valiela,

1951; Fischetti et al., 1965; Bakarcic, 1978) y en los últimos años (Anselmi et

al., 2006; Lucero et al., 2011a) donde estos clones siempre han resultado

susceptibles mientras que Ćonti 12` fue identificado como tolerante. ´Ballestra`

fue catalogado dentro del “grupo menos susceptible” e Í 214` como el “más

susceptible de la colección” en una reciente investigación realizada en

Mendoza (Lucero et al., 2011a y 2011b).


57

Fig. 32. Intensidad máxima de la Cancrosis del álamo en hojas. (A) 2002/2003, (B) 2003/04. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).

Este análisis confirmó la opinión de los informantes calificados y de las

observaciones preliminares: Ćonti 12` y ´Ballestra` se comportan como

tolerantes mientras que, Í 214` e Í 488` como susceptibles.

Conti 12 Ballestra I 214 I 488

Clones

0

15

30

45

60

Inte

nsi

dad d

e l

a e

nf.

en h

oja


Clones

0

15

30

45

60

Inte

nsi

dad d

e la

enf.

en h

oja

a

c

b

c

a a

b b

A

B


58

3.1.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It).

It en álamos adultos. Se ha reportado una amplia variabilidad entre

híbridos y clones del género Populus en relación con la susceptibilidad al

patógeno en tallo y la consecuente formación de cancros (Fischetti et al., 1965;

Fernandez Valiela, 1978; Cellerino, 1999; Stanosz et al., 2002; Weiland et al,

2003; LeBoldus et al., 2009a; Feau et al., 2010).

Como resultado de este estudio, en la figura 33 se representan las intensidades

de la enfermedad en los fustes de los distintos clones y la comparación entre

ellos.


Clones

0

15

30

45

60

75

Inte

nsi

dad d

e l

a e

nf.

en t

allo

Fig. 33. Intensidad de Cancrosis del álamo en tallos adultos en 2003/04. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,01). Tal como se registró en hoja, la evaluación en tallo determinó que Ćonti 12` y

´Ballestra` se comportaron como tolerantes a la enfermedad, mientras que Í

214` e Í 488` fueron los más afectados (64 % y 56 % respectivamente). Estos

valores son incompatibles con producciones económicamente rentables, sin

embargo, estos clones están muy difundidos en plantaciones destinadas a la

explotación de madera en el VIRN (Fig. 34).

b

a

a

b


59

Estos niveles de incidencia condicen con los comunicados por investigaciones

internacionales y nacionales. Tanto en Canadá como en USA, se analizaron los

comportamientos de un gran número de híbridos provenientes de cruzamientos

entre especies del género Populus autóctonas y exóticas, frente a este

patógeno. Dichos estudios reportaron valores de incidencia que oscilaban entre

el 30 % y el 100 % (Ostry y McNabb, 1985; Spielman et al., 1986; Ostry et al.,

1989; Strobl y Fraser, 1989; LeBoldus et al., 2009b; LeBoldus et al., 2010).

En Argentina, tanto las investigaciones más antiguas (Fernández Valiela, 1951;

Fischetti et al., 1965; Bakarcic, 1978) como las más recientes (Pozzo Ardizzi y

López, 2006; Riu et al., 2011a), señalan índices muy elevados de la

enfermedad en diferentes clones (60 % a 90 %). La difusión de genotipos

susceptibles fue el resultado de programas de mejoramiento con objetivos

productivos. En la búsqueda de genotipos con altos niveles de rendimiento,

aptos para rotaciones más cortas, altas densidades de plantación y prácticas

culturales intensivas, se generó frecuentemente susceptibilidad a agentes

patógenos como S. musiva (Ostry y McNabb, 1985; Ostry y Berguson, 1993;

Maxwell y Stanosz 1994 y 1995; Maxwell et al., 1997).

Fig. 34. Cancrosis del Álamo en el híbrido ¨I 488` en el campo experimental de la Dirección Provincial de Bosques (VIRN). (Foto del autor).


60

It en estacas inoculadas. En la tabla VI se presentan los resultados

obtenidos en la inoculación artificial de estacas con S. musiva. Se detectaron

diferencias significativas entre las It de los clones estudiados. El TCMD ubicó a

los clones en el mismo orden de susceptibilidad que la evaluación hecha en el

campo con ejemplares adultos (Fig. 33 y Tabla VI).

Tabla VI: Intensidad de la enfermedad registrada en estacas inoculadas con S. musiva y en tallos adultos.

Clon It en estacas inoculadas (%)

Longitud del cancro (mm)

It en tallos adultos (%)

Ćonti 12` 23 b 12 b 18 b

´Ballestra` 0 c 0 c 9 b

Í 214` 73 a 32 a 64 a

Í 488` 65 a 27 a 56 a

Dentro de cada columna, los tratamientos con letras distintas difieren significativamente según el TCMD (P< 0,01).

En las estacas de ´Ballestra` inoculadas, lo mismo que en los blancos, no se

produjo ninguna lesión, lo que indica que el patógeno no pudo colonizar los

tejidos corticales, al menos en forma perceptible durante el tiempo que duró el

experimento. También se observa que las intensidades de la enfermedad en Í

214` e Í 488` fueron marcadamente superiores la registrada en Ćonti 12`.

Estos datos se corresponden con los resultados registrados para tallos adultos.

Validación de la It en álamos adultos. Weiland et al. (2003)

encontraron que la correlación entre estacas inoculadas y ejemplares adultos

fue válida para los genotipos que se hallaban en los extremos de la escala de

susceptibilidad. Es el caso de los materiales estudiados en este trabajo y el

cálculo de la correlación arrojó un valor de r = 0,72 (p < 0,01). De acuerdo a

estas consideraciones se asumió que las It registradas en tallos adultos

guardan correspondencia con el ataque de S. musiva.


61

Con respecto a la severidad de las lesiones, la longitud de los cancros

formados en Í 214` y en Í 488` fue significativamente mayor a la registrada en

Ćonti 12` (Tabla VI y Fig. 35).

Fig. 35. Lesiones en estacas de los clones seleccionados 145 días después de la inoculación artificial con S. musiva. (Fotos del autor).

En el trabajo de Weiland et al. (2003), el largo de los cancros fue de 5 a 22 mm,

en los clones tolerantes, de 20 a 24 mm en los intermedios y de 20 a 53 mm en

los muy susceptibles. Según esta escala ´Ballestra` y Ćonti 12` se pueden

considerar tolerantes e Í 214` e Í 488` muy susceptibles.

La información sobre la colonización de los tejidos caulinares por S. musiva y

la respuesta histológica de los hospedantes es limitada y contradictoria.

Algunos investigadores han encontrado que la colonización estaba limitada a la

peridermis, la corteza y el floema primario (Zalasky, 1978; Sievanesan, 1990), y

otros han reportado que la misma alcanzaba al xilema (Krupinsky, 1989;

Stanosz et al., 2002; Weiland y Stanosz, 2007).

Si bien en el presente trabajo no se realizaron estudios anatomopatológicos de

las lesiones, se pudieron establecer algunos aspectos comunes con otros

estudios de este carácter, realizados en patosistemas similares (Biggs et al.,

1983 y 1984; Biggs y Alm, 1992; Bucciarelli et al., 1999; Weiland y Stanosz,

2007; LeBoldus et al., 2009a; LeBoldus et al., 2010).



62

La figura 36 corresponde a tejidos del clon ´Ballestra`, debajo del punto de

inoculación luego de separada la PN. Se observó una corteza sana conformada

por un parénquima aun clorofílico debajo de una joven peridermis, y por una

zona floemática más clara. El cilindro central mostró un xilema claro y

funcional. Esto indicaría que el patógeno no se pudo instalar o al menos, no

pudo generar algún síntoma visible.

Fig. 36. Tejidos de una estaca del clon ¨Ballestra¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos. (Foto del autor). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Weiland y Stanosz (2007) al

inocular artificialmente un clon resistente a la Cancrosis del Álamo. Las mismas

respuestas fueron comunicadas en otros patosistemas similares (Bucciarelli et

al., 1999; Biggs y Alm, 1992; Biggs et al., 1983; Bostock y Middleton, 1987;

Robinson y Morrison, 2001). Varios de estos trabajos han postulado que la

restauración del felógeno, o sea, la formación de la PN no es una respuesta

específica (Biggs at al., 1984; Bucciarelli et al., 1999).

En la figura 37 se reproducen las posibles respuestas en lesiones caulinares

(Biggs, 1992). En la más superficial (a), la PN se forma inmediatamente debajo

de la lesión, preservando la integridad de los tejidos más profundos. La

c.c.h.f.

p.c


63

reacción del clon ´Ballestra` (Fig. 36) podría explicarse por este mismo

esquema, también aplicado por Weiland y Stanosz (2007).

Fig. 37. Modelo anatómico para los mecanismos de defensa inespecíficos: (a) penetración de la corteza, (b) penetración del cambium vascular y (c) penetración de albura. Tomado de Biggs (1992), modificado de Mullick (1977).

La respuesta (b) del esquema anterior corresponde a una reacción del

hospedante más lenta o más alejada del punto de infección de modo que, la

formación de la PN no impide un cierto avance del patógeno sobre los tejidos

funcionales del tallo. En el clon ´Conti 12` (Fig. 38) los tejidos afectados se

extendieron sólo en profundidad en coincidencia con esta parte del modelo. La

corteza en la periferia de la lesión se observó sana, con características

similares a las descriptas en ´Ballestra`.

Capa suberizada impermeable Capa suberizada impermeable Capa suberizada impermeable

PN Peridermis Necrofiláctica

PE Peridermis Exofiláctica

CV (r) Posición del cambium vascular al momento de formarse la PN

CV (i) Posición del cambium vascular al momento de la injuria

Leño formado después de la injuria

Leño existente al momento de la injuria

Zona fenólica: cambium transformado

Zona de CV recientemente restaurado

Zona de xilema no conductiva

Leño no conductivo

PN PN PN

PE

CV (r) CV (i)

C O R T E Z A

L E Ñ O


64

Fig. 38. Tejidos de una estaca del clon ¨Conti 12¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos. (Foto del autor). Un resultado semejante fue encontrado por Bucciarelli et al. (1999) cuando

inocularon dos clones de P. tremuloides (uno resistente y uno susceptible) con

Entoleuca mammata. Este tipo de respuesta permite cierto avance del micelio.

En las lesiones ocasionadas por la inoculación en ´I 214` e ´I 488` (Fig. 39 y 40)

se desarrollaron importantes zonas necrosadas que se expandieron en todas

las direcciones a partir del punto de inoculación indicando la ausencia de

barreras para el patógeno. Se alternaron zonas de tejido necrosado con zonas

de tejido sano. Varios autores (Kaufert, 1937; Biggs et al, 1982; Bucciarelli,

1999; Weiland y Stanosz, 2007) asociaron resultados semejantes con la

presencia de múltiples PN. Cuando la barrera conformada por una PN es

vencida, nuevas PN se van formando en profundidad (Biggs et al., 1983).

Algunos autores consideran que la formación de múltiples PN son evidencias

de sucesivos fracasos del hospedante por detener el avance del patógeno y su

presencia puede ser usada como indicadora de susceptibilidad (Weiland y

Stanosz, 2007).

c.c.h.f.

p.c.


65

Fig. 39. Tejidos de una estaca del clon ¨I 214¨ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos. (Foto del autor).

Fig. 40. Tejidos de una estaca del clon `I 488´ en el punto de inoculación con S. musiva. (c.c.) cilindro central; (p.c.) parénquima cortical; (h.f.) haces floemáticos. (Foto del autor). Este patrón secuencial de las PN ha sido asociado por otros autores ya citados,

con la degradación celular y la necrosis de los tejidos.

Resumiendo, los genotipos resistentes y susceptibles utilizados en este

estudio, inoculados con S. musiva, se diferenciaron por la localización de la

c.c. h.f. p.c.

c.c.h.f.

p.c.


66

zona de respuesta en relación al margen de la herida y por la magnitud de las

zonas necrosadas. En ´Ballestra`, la PN se formó inmediatamente debajo de la

herida y en Ćonti 12`, se formó algo más profundamente. En ambos casos no

se percibió el avance del patógeno más allá de las PN. En Í 214` e Í 488`, se

formaron al menos dos PN, una debajo de la PE y otra rodeando el xilema.

Siguiendo la interpretación de Weiland y Stanosz (2007) en un patosistema

equivalente, se puede inferir que, en estos clones, el patógeno venció la primer

PN y colonizó centrípetamente el tallo hasta la formación de la segunda PN

logrando expandirse longitudinalmente.

3.1.3. Relación entre la intensidad de la enfermedad en hojas y en tallos de álamos adultos. Bajo condiciones naturales, S. musiva no puede degradar

enzimáticamente o atravesar físicamente los tejidos de protección del género

Populus (Dickman et al., 1989). Tanto en las hojas como en los tallos, el

inóculo ingresa mayoritariamente por aberturas naturales como son los

estomas y las lenticelas o las heridas producidas por la abscisión de las hojas.

Pese a las diferencias morfológicas y funcionales entre ambos órganos, en la

figura 41 se muestra una relación positiva entre la Ih (Tabla V) y la It (Fig. 33).

El coeficiente de Correlación de Pearson obtuvo un valor de r = 0,835, lo que

demuestra la fortaleza de la relación.

Es así como, los clones con menor incidencia en las hojas, también mostraron

menor daño en los tallos. Este valor del r es considerado elevado por provenir

de datos registrados bajo condiciones productivas donde los factores

ambientales generan muchas interferencias en las respuestas. Al respecto, hay

que considerar que las lesiones foliares son el resultado de la interacción

hospedante-patógeno-ambiente de una temporada de crecimiento, mientras

que los cancros acumulan los efectos ambientales de varios años. Sivanesan

(1990) y Sinclair y Lyon (2005) comunicaron que los genotipos que

desarrollaban más cancros eran los que mostraban un alto índice de la

enfermedad en hojas.


67

20 25 30 35 40 45 50 55

Intensidad de la enf. en hojas (%)

0

11

23

34

45

56

68

79

90

Inte

nsi

dad d

e l

a e

nf.

en t

allo

s (%

)

Fig. 41. Relación entre la Ih y la It en los clones estudiados durante la temporada 2003/04.

Otros autores obtuvieron resultados discrepantes pero no fueron considerados

por tratarse de sistemas in vitro (Ostry et al., 1988; Maxwell et al., 1995;

Maxwell et al, 1997).

3.2. Desarrollo de Septoria musiva sobre clones susceptibles y tolerantes. Muchas investigaciones relacionadas con esta enfermedad, han estado

dirigidas al estudio de los picnidios generados a partir de aislamientos de las

lesiones foliares o caulinares, durante la temporada de crecimiento del

hospedante (Bier, 1939; Fischetti et al., 1965; Ostry, 1987; Spielman et al.,

1986; Gyenis et al., 2003; Feau et al., 2005; Callan et al. 2007; LeBoldus et al.,

2010). Otras investigaciones han aportado conocimientos básicos a cerca de

papel de los ascomas en la epidemiología de la enfermedad (Sarasola, 1975;

Luley y McNabb, 1989 y 1991; Sinclair y Lyon, 2005). En este trabajo se han

abarcado ambas etapas del desarrollo del patógeno considerándolo un proceso

integral en el patosistema.


68

El ciclo de esta enfermedad es similar al de otras ocasionadas por

ascomicetes, cuya fuente de inóculo primario es la hojarasca que perduran

sobre el suelo en la etapa otoño-invernal, donde se desarrollan los ascomas

pseudoteciales.

3.2.1. Estudio ontogénico de ascomas pseudoteciales según la escala Szkolnik (1969), modificada. Este patógeno forma ascomas constituidos por

un estroma prosenquimático o pseudoparenquimático, dentro del cual se forma

un lóculo y allí originan los ascos (Alexopoulus y Mims, 1996).

Se mantuvo como estroma subcuticular hasta el mes de mayo, en la hojarasca

de ambos clones (Ćonti 12` e Í 214`) y años estudiados.

En el ciclo 2003 (Fig. 42), comenzaron a aparecer los primeros ascomas

(estadío 2) en el mes de junio, desarrollándose muy lentamente hasta alcanzar

el estadío 4 a mediados de agosto. Sin embargo, en la segunda quincena de

ese mes, se observó una pronunciada evolución de los ascomas que se

estaban formando en Í 214`, alcanzando, en promedio, el estadío 6 a fines de

agosto (ascos con ascosporas inmaduras). En esa fecha se incrementó

considerablemente el desvío estándar porque ese promedio estaba compuesto

por un 40% de ascomas en estadío 7 y 8 y un 60 % de estadíos inmaduros. En

consecuencia, desde de la hojarasca de Í 214` ya se estaban liberando

ascosporas. La evolución en Ćonti 12` fue más lenta y se mantuvo en estadío

4 hasta principios de septiembre para alcanzar el estadío 6 (promedio) recién

en la segunda quincena. El desvío estándar fue menor que en Í 214` (24% de

ascomas en estadío 7 y 76 % en estadíos entre el 4 y el 6). En ese muestreo

no se observó ninguno en estadío 8 (liberación de ascosporas) los que

aparecieron a mediados de octubre.

En el ciclo 2004 (Fig. 43) se mantuvo el mismo patrón de desarrollo pero los

primeros ascomas en estadío 8 aparecieron a fines de agosto en Í 214` (como

en el ciclo 2003) y recién a fines de octubre en Ćonti 12`, un mes más tarde

que en el 2003.


69

Fig. 42. Ontogenia de los ascomas desarrollados en la hojarasca de Í 214` y Ćonti 12` durante el período otoño-inverno-primaveral del 2003.

Fig. 43. Ontogenia de los ascomas desarrollados en la hojarasca de Í 214` y Ćonti 12` durante el período otoño-inverno-primaveral del 2004.

La ontogenia de los ascomas podría describirse en dos etapas como lo hicieron

James y Sutton (1982b) para V. inaequalis. La primera, desde la formación del


70

estroma, hasta el estadío 4 (diferenciación de los ascos) y la segunda, desde el

estadío 5 al 9 (desarrollo y maduración de los ascos, y dispersión de las

ascosporas). En este estudio, la primera abarcó un amplio período estromático

que fue mayor en Ćonti 12` que Í 214` generando un retraso en la segunda

etapa (Fig. 42 y 43). La consecuencia epidemiológica de estas diferencias

consiste en una demora en la liberación de las ascosporas desde la hojarasca

de este clon.

Si bien existen factores ambientales que influyen en estos procesos (James y

Sutton, 1982a; Tomerlin y Jones, 1983; O´Leary y Sutton, 1986) las hojarascas

de Í 214` y de Ćonti 12` estuvieron sometidas a las mismas fluctuaciones

climáticas y ambientales. Diferencias semejantes fueron registradas por Moller

(1980) trabajando con V. inaequalis en 6 diferentes cultivares de manzana.

Los datos indican que ha existido una marcada divergencia en el desarrollo de

los ascomas en un clon susceptible y en uno tolerante. Se puede inferir que en

plantaciones puras, con un solo clon de Populus, la liberación de ascosporas

se adelantaría en los montes susceptibles respecto de los tolerantes.

En la temporada 2004, además de registrar el desarrollo ontogénico del

patógeno, se midieron los diámetros de los ascomas en cada estadío. Estas

dimensiones fueron semejantes en ambos clones, hasta el estadío 3 (aparición

del lumen con contenido indiferenciado). Luego, los desarrollados en la

hojarasca de Í 214`, incrementaron su tamaño de forma más pronunciada que

los de Ćonti 12` (Fig. 44), hasta la madurez. Las dimensiones registradas en el

estadío 8 (118 µm en Í 214` y 96 µm en Ćonti 12`) resultaron

estadísticamente diferentes (P< 0,001), con la consecuente diferencia en la

cantidad de ascos/ascosporas producidas. Gadoury y MacHardy (1986) en V.

inaequalis, registraron variaciones en el número de ascos formados dentro de

los ascomas pseudoteciales según su tamaño, oscilando entre 47 ascos en los

más pequeños y 102 en los más grandes.


71

El tamaño del ascoma no resultó directamente proporcional a la madurez. En

Ćonti 12`, los diámetros fueron semejantes entre el estadío 3 y 5, y la

diferencia entre los estadíos 6 y 8 sólo fue de 5 µm. En Í 214`, el incremento

fue más uniforme (Fig. 44). En ambos clones el diámetro del pseudotecio

aumentó entre los estadíos 2 (formación del estroma macizo) y 3 (aparición del

lumen con contenido indiferenciado) de 53 a 72 µm en Í 214` y de 53 a 78,5

µm en Ćonti 12` (Fig. 45).

Los ascomas pseudoteciales en Í 214` continuaron aumentando gradualmente

su volumen. En Ćonti 12`, se mantuvieron sin variantes hasta que se registró

un incremento significativo entre los estadíos 5 (ascos rudimentarios inmersos

en un pseudoparénquima claro y translúcido) y 6 (ascos mayores) alcanzando

los 88 µm (Fig. 46 y 47). El diámetro de los ascomas en Í 214` alcanzó los 93

µm en el estadío 5, dejando un lumen considerable sobre los ascos incipientes

(Fig. 46) que aumentaron su tamaño en el estadío 6 dentro de un ascoma de

104 µm (Fig. 47). El volumen de los ascomas en Ćonti 12` se mantuvo menor

que en Í 214` hasta el final del desarrollo.

Fig. 44. Evolución del tamaño de los ascomas en la hojarasca de dos híbridos del gro. Populus durante el período otoño-inverno-primaveral del año 2004.


72

Fig. 45. Aspecto de los acomas en Í 214` y Ćonti 12` en el estadío 3 de desarrollo. Las barras representan 10 µm. (Fotos del autor).

Fig. 46. Aspecto de los ascomas en Í 214` y Ćonti 12` en el estadío 5 de desarrollo. Las barras representan 10 µm en cada caso. (Fotos del autor).

Fig. 47. Aspecto de los ascomas en Í 214` y Ćonti 12` en los estadío 6 de desarrollo. Las barras representan 10 µm. (Fotos del autor).

Conti 12 I 214

I 214. Conti 12.

Ćonti 12` Í 214`


73

En el estadío 7 (ascosporas septadas maduras) se realizaron las

comparaciones morfométricas de las estructuras (Fig. 48 A, B).

Fig. 48. Aspecto de los ascomas en el estadío 7 de desarrollo en (A) Conti 12 y (B) I 214. Las barras representan 10 µm. (Fotos del autor).

Los análisis estadísticos determinaron que el diámetro de los ascomas y el

espesor de las paredes en ambos clones difirieron significativamente (P <

0.001) (Tabla VII). Todas las dimensiones fueron mayores en el clon

susceptible.

B

A


74

Tabla VII: Características morfométricas de los ascomas (µm) en los clones estudiados.

Clon Diámetro del ascoma

Espesor de la pared

Dimensiones de los ascos

Dimensiones de las ascosporas

Ćonti 12` 93,75

(6,43)

12,25

(2,07)

60,25 x 10,50

(2,27) (1,08)

16 x 3,50

(1,08) (0,64)

Í 214` 113,12

(10,67)

15,75

(2,32)

63,75 x 12,22

(2,73) (1,23)

17,50 x 3,50

(1,09) (0,34)

Los valores ubicados entre paréntesis corresponden a los desvíos estándar.

En la figura 49 se muestran las coincidencias entre las características

observadas en el material muestreado y la descripción de Sivanesan (1990)

para S.musiva.

Fig. 49. Ascomas de S. musiva provenientes de la hojarasca de (A) Í 214`, y (B) y (C) de Ćonti 12`. Las barras representan 10 µm. (Fotos del autor).

Ascomas solitarios o agregados, levemente

errumpentes, marrón oscuro, globosos y

ostiolados. Pared compuesta de 3 o 4 capas

de células pseudoparenquimáticas de aspecto

angular. Ascos fasciculados, cilíndrico-

clavados, cortamente pedicelados, bitu-

nicados con 8 ascosporas septadas en el

centro, con una leve constricción, no

pigmentadas, rectas o levemente curvadas

(Sivanesan, 1990).

Ascomas agregados Ascoma solitarioA B

Ascoma maduroC


75

En la tabla VIII se presentan los valores registrados para las estructuras de S.

musiva en VIRN, los que coinciden con la identificación realizada por otros

autores (Niyo et al., 1986; Luley at al., 1987; Sivanesan (1990).

Tabla VIII. Dimensiones de los ascomas de S. musiva registrados en este trabajo y los datos aportados por la bibliografía. Origen de los datos

Ascoma (µm)

Pared (µm)

Ascos (µm)

Ascosporas (µm)

Datos propios

94 – 113 12 – 16 60 – 64 x 11 – 12 16 -18 x 4

Sivanesan (1990)

>110 3 o 4 capas de pseudoparénquima

54 – 70 x 13 - 16 16 – 28 x 4 - 6

Niyo et al. (1986)

60 - 100 Gruesa 42 – 62 x 10 - 16 13 – 24 x 3 - 6

Luley et al. (1986)

115 - 135 13 - 15 60 12 – 25 x 2 – 6

Los rangos presentados en este trabajo corresponden al promedio en los dos clones analizados.

3.3.2. Picnidios en hoja. En la figura 50 se observa un picnidio desarrollado en

el mesófilo de Í 214` y en la Tabla IX se muestran los valores promedio de las

estructuras. El Test de Student determinó que el diámetro de los picnidios difirió

estadísticamente en ambos clones, siendo mayores y más expandidos en Í

214` (P < 0,01). Las paredes fueron muy delgadas en ambos casos, formadas

por pseudoparénquima, de una o dos células de espesor. Los conidios

desarrollados en Í 214`, fueron más largos (P < 0,01) y con un número mayor

de septos (P = 0,02) que en Ćonti 12`. Sarasola (1975) también encontró

diferencias en las dimensiones de estas estructuras cuando provenían de

distintas especies o híbridos del género Populus en el Delta del Paraná.

Las dimensiones registradas coinciden con las de otros autores (Sivanesan,

1990; Sarasola, 1975; Sinclair y Lyon, 2005).


76

Fig. 50. Aspecto de un picnidio maduro inmerso en el mesófilo de ´ 214`. La barra representa 10 µm. (Foto del autor). Tabla IX: Características morfométricas de los picnidios (µm) en ´Conti 12` e ´I 214`.

Clon Diámetro del

picnidio Espesor de la

pared Dimensiones de

los conidios N° de tabiques en

los conidios

Conti 12 120,73

(8,41)

2,05

(0,17)

35,25 x 3,50

(5,27) (0,08)

2,72

(0,4)

I 214 145,21

(6,77)

2,25

(0,23)

49,75 x 4,22

(6,63) (0,20)

3,97

(1,01)

Los valores ubicados entre paréntesis corresponden a los desvíos estándar de los promedios.

3.3.3. Picnidios en medios de cultivo. Se obtuvieron 24 aislamientos a partir

de tejidos foliares enfermos, que se denominados Sm1…Sm24. Luego de 15

días, las colonias desarrolladas eran de color gris, con borde blanco y con un

exudado color rosado, de aspecto mucoso en las zonas más viejas de las

colonias (Fig. 51). Este resultado estuvo en concordancia con lo publicado por

varios autores (Sarasola, 1975; Spielman et al., 1986; Sivanesan, 1990).


77

El crecimiento de las colonias fue lento y sus diámetros oscilaron entre los 14 y

32 mm en 15 días.

Fig. 51. Aspecto de una colonia desarrollada sobre agar V-8 perteneciente al aislamiento Sm11 luego de 15 días de cultivo. La barra representa 5 mm. (Foto del autor). Se dejaron envejecer los cultivos, y al cabo de otros 15 días, se detectó la

formación de estructuras globosas y oscuras, casi negras, inmersas en el agar,

en toda la colonia. Se disponían en forma muy densa y compacta en la parte

central, y en agregados visibles a ojo desnudo en los bordes de la colonia (Fig.

52 A). El material fue disgregado por presión entre porta y cubre objeto para

detectar los picnidios individuales y los conidios (Fig. 52 B y 53).

La observación con mayor aumento mostró las típicas esporas levemente

curvadas y con varios tabiques (Fig. 54).


78

Fig. 52. A. Detalle del borde de una colonia en agar V-8 donde se observan los conglomerados de picnidios (La barra representa 5 mm). B. Detalle de un grupo de picnidios desagregados, a 30 días de la siembra (La barra representa 100 µm). (Fotos del autor).

Fig. 53. Detalle de la masa conídica liberada desde los picnidios formados en medio de cultivo V-8 a 30 días de la siembra (La barra representa 50 µm). (Foto del autor).

BA


79

Fig. 54. Detalle de las picnidiosporas formadas en agar V-8 (La barra representa 10 µm). (Foto del autor).

El análisis comparativo entre las estructuras formadas en medio de cultivo y las

formadas en el mesófilo, se arrojaron algunas diferencias (Tabla X).

Tabla X: Características morfométricas de los picnidios (µm) desarrollados agar V-8 y en los mesófilos. Parámetro Picnidios en agar V-8 Picnidios en los mesófilos (*)

Diámetro promedio del picnidios

164 121 – 145

Dimensiones de los conidios

58 x 4

35 – 50 x 4 – 4

N° de tabiques en los conidios

3,28

2,72 – 3,07

(*) Estos valores figuran en la tabla IX.

Los picnidios formados en agar V-8 adoptaron formas esféricas no pudiendo

distinguirse fácilmente el ostiolo y desarrollaron un diámetro significativamente

mayor que los formados en los mesófilos (P < 0,01). Cuando se forman en las

hojas, los picnidios son globosos y deprimidos longitudinalmente, con el ostiolo


80

errumpente (Fig. 13 y 50). El crecimiento en medios de cultivo, sin la presión de

los tejidos, daría como resultado estructuras globosas, más expandidas.

También se observaron diferencias en el largo de los conidios: los formados en

agar V-8 resultaron significativamente más largos que los formados en las

hojas (P < 0,01) (Tabla X). El número de tabiques no difirió estadísticamente de

los formados en los tejidos (P = 0,443) y se ubica en los rangos provenientes

de experimentos in vitro comunicados por otros autores (Callan et al., 2007)

3.3. Análisis de las características anatómicas de las hojas y de los tallos.

Para asociar las características anatómicas de un genotipo con el

comportamiento “tolerante” o “susceptible” de acuerdo con la hipótesis

planteada en este estudio, es importante conocer la posible existencia de

estructuras histológicas naturales que puedan facilitar u obstaculizar el proceso

de infección.

Por ello se estudiaron con detalle algunos aspectos anatómicos de las hojas y

tallos en clones tolerantes y susceptibles.

3.3.1. Estructura de la hoja. En el género Populus la hoja presenta una amplia

diversidad de aspectos (Fig. 10) aunque los discriptores de los clones

seleccionados, indican que las diferencias son moderadas (FAO, 1980;

Arreghini, 2000).

3.3.1.1. Aspectos morfológicos.

Forma de la lámina. Los materiales seleccionados para este estudio

(diferentes clones del mismo híbrido Populus xcanadensis), poseen formas

similares. Cuando son jóvenes tienen contorno ovado-acorazonado,

escasamente acuminado y cuando llegan a adultas, adoptan una forma

triangular, similar a la letra griega delta (∆). Poseen el ápice en mayor o menor

grado acuminado, con márgenes dentado-aserrados, lámina glabra, de color


81

verde en ambas caras, aunque tienen el envés algo más pálido. El pecíolo es

generalmente aplanado, levemente triangular, de aproximadamente 10 cm de

longitud (Fig. 55).

Fig. 55. Aspecto de las láminas foliares de los clones estudiados en el presente trabajo (La barra representa 1 cm). (Fotos del autor). .

Área foliar. En la figura 56 se representan las áreas foliares de los

diferentes clones. Las hojas de mayor tamaño correspondieron al clon Í 488`

pero sólo difirió estadísticamente de Ćonti 12` en el que se registró la menor

área foliar. Las dimensiones en ´Ballestra` e Í 214` fueron semejantes entre sí

registrando valores intermedios entre los otros dos clones. Estos datos

indicarían que el área foliar no estaría estrechamente relacionada con el

comportamiento de los clones frente a la enfermedad, al menos en los rangos

estudiados.

Ballestra Conti 12

I 214 I 488


82


Clones

0

15

30

45

60

Áre

a fo

liar

Fig. 56. Área foliar promedio de los clones estudiados. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,01).

3.3.1.2. Aspectos anatómicos. Ferris et al. (2001) corroboraron que las

diferencias en las formas y los tamaños de las hojas en P. deltoides y P.

trichocarpa se reflejaban en la anatomía foliar. Por tal motivo, resultó necesario

analizar la histología de estos órganos para relacionarla con el nivel de

susceptibilidad de los clones.

Espesor de la hoja y de sus estratos celulares. En la figura 57 se

representan y comparan los registros del espesor total de hojas adultas (LPI

10.0) en cada uno de los clones estudiados. Los clones tolerantes (´Ballestra` y

Ćonti 12`) difirieron entre sí pero ambos fueron estadísticamente mayores que

los susceptibles (Í 214` e Í 488`).

El espesor foliar en ´Ballestra` y Ćonti 12` estuvo en el rango del registrado por

Schumaker et al. (1997) en otros genotipos como P. trichocarpa y P.

trichocarpa x P. deltoides. Los valores registrados en Í 214` y en Í 488` fueron

semejantes a los de Isebrands y Larson (1973) en P. deltoides y a los de Taylor

et al. (2003) en un clon no especificado de P. xcanadensis.

a

b

ab ab


83


Clones

0

40

80

120

160

200

240

280

320

Esp

eso

r d

e la h

oja

(µm

)

Fig. 57. Comparaciones del espesor total de las hojas en los clones estudiados. Las barras con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,05).

En todos los casos las hojas presentaron una epidermis adaxial, dos capas de

parénquima en empalizada, una capa central de células parenquimáticas

asociada con el tejido vascular, tres capas de parénquima esponjoso, y una

epidermis abaxial. Esta estructura básica de las hojas coincide con las

descripciones realizadas por otros autores en estos y en otros genotipos del

género, aun bajo diferentes condiciones ambientales (Isebrands y Larson,

1973; Esau, 1985; Gardner et al., 1995; Aasamaa et al., 2005). En la tabla XI

figuran los espesores de cada estrato celular registrados en este trabajo.

Tabla XI. Espesor de los estratos celulares del mesófilo (µm) en los distintos clones estudiados.

Dentro de cada columna, las filas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01).

Cultivar Estratos celulares de las hojas

Epidermis adaxial

Parénquima empalizada

Parénquima lagunoso

Epidermis abaxial

Conti 12 22,4 b 98 a 104,2 b 16,4 a

Ballestra 29,6 a 100,3 a 134,8 a 19,3 a

I 214 12,8 c 69,6 b 84,2 c 10,1 b

I 488 15,2 c 75,8 b 90,9 c 12,5 b

b

a

cc


84

Los ANOVA correspondientes señalaron diferencias significativas. Si bien la

epidermis adaxial de ´Ballestra` mostró un mayor espesor que la de Ćonti 12`,

ambas fueron estadísticamente mayores que las de Í 214` e Í 488` que no

difirieron entre sí. En los dos primeros clones, las epidermis adaxiales

exhibieron un mayor espesor que las respectivas abaxiales, mientras que en Í

214` e Í 488` ambas epidermis presentaron espesores semejantes (P < 0,01).

En todos los clones el parénquima esponjoso presentó mayor espesor que el

parénquima en empalizada, en concordancia con la mayoría de los estudios

referidos a la anatomía foliar de Populus (Esau, 1985; Harrington et al., 1997;

Schumaker et al., 1997; Ferris et al., 2001; Taylor et al., 2003). Ambos tejidos

exhibieron un mayor espesor en Ćonti 12` y ´Ballestra` que en Í 214` e Í 488`

(Tabla XI).

También existieron diferencias entre los clones en el índice de separación de

las células (ISC) del parénquima en empalizada, en el ancho celular promedio,

el indicador de espacio intercelular (IEI) y la densidad celular (Tabla XII).

Tabla XII. Relaciones celulares en el parénquima de empalizada de los clones estudiados.

Relaciones celulares en el parén-quima en empalizada


Índice de separación celular (ISC) 8,64 b 10,21 a 7,21 c 7,90 bc

Ancho celular promedio 7,77 b 9,48 a 7,02 b 8,04 b

Indicador del espacio intercelular 0,87 a 0,73 a 0,19 b - 0,14 c

Densidad celular 29 ab 24 b 34 a 31 ab

Dentro de cada fila las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según

TCMD (P<0,01).

´Ballestra` y Ćonti 12` presentaron los mayores valores de IEI (diferencia entre

el índice de separación celular y el ancho de las células). El valor negativo en el

caso de Í 488` se podría atribuir a la superposición de células en el plano de

observación.


85

En la figura 58 se muestran cortes transversales de hojas adultas. En Ćonti

12` y ´Ballestra` se observaron parénquimas en empalizada medianamente

laxo, con espacios intercelulares perceptibles y parénquimas esponjosos con

grandes espacios intercelulares. En Í 214`, el parénquima en empalizada fue

delgado, compacto, con espacios intercelulares poco perceptibles y un

parénquima esponjoso con espacios intercelulares destacados. En Í 488` el

parénquima en empalizada delgado, fue muy compacto, con espacios

intercelulares imperceptibles y un parénquima esponjoso, con células de forma

regular y espacios intercelulares poco destacados.

En términos generales, el mesófilo en los clones tolerantes fue más laxo que en

los susceptibles.

Caracterización de los estratos epidérmicos. Tanto las ascosporas

como los conidios de S. musiva germinan sobre la epidermis. Las epidermis

foliares de los clones estudiados, están compuestas por tres tipos de células:

las células oclusivas o guardianas que forman los estomas, las células

subsidiarias que los rodean y las células indiferenciadas o pavimentosas. Por

constituir el escenario inicial de la relación hospedante – patógeno, se las

estudió con mayor detalle.

Densidad estomática (DE) y caracterización de los estomas. Los estomas

se forman por la actividad de células meristemáticas llamadas “meristemoides”,

que están dispersas entre las células epidérmicas indiferenciadas (Esau, 1985;

Geisler et al., 2000). En el género Populus se han observado diferencias en el

proceso de formación de los estomas. En P. trichocarpa todos los estomas se

diferencian en los primeros estadíos del desarrollo foliar, agotándose

tempranamente la actividad meristemática. En otros casos, como en P.

deltoides, los meristemoides se van activando en forma gradual y los estomas

se forman durante toda la expansión foliar (Ridge et al., 1986; Ferris et al,

2002).


86

Fig. 58. Corte transversal de una hoja adulta (PLI 10.0). (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488` (Las barras representan 25 µm). (Fotos del autor).

A B

C D


87

Estas características cobran relevancia en aquellas enfermedades foliares,

como en la Cancrosis del Álamo, donde el ostíolo constituye la principal vía

para que el patógeno ingrese a los tejidos del hospedante (Sarasola, 1975,

Fernández Valiela, 1978; Sinclair y Lyon, 2005). Conocer el proceso de

formación de los estomas durante la expansión de la lámina es relevante por su

coincidencia con la dispersión del inóculo, en primavera (Szkolnik, 1969; Luley

y McNabb 1989 y 1991; Sinclair y Lyon, 2005).

La DE varía en el género Populus entre las distintas especies, entre los

cultivares, y dentro de un cultivar, entre hojas ubicadas en distintas posiciones

nodales (Isebrands y Larson, 1973; Reich, 1984; Dunlap y Settler, 2001). Por

eso se estandarizó el estado de desarrollo foliar a través del “Índice

Plastochrom” (Larson e Isebrands, 1971).

En la figura 59 se presenta la variación de la DE durante el desarrollo

ontogénico de las hojas, en los clones estudiados. En todos los casos la DE

fue significativamente mayor en la epidermis abaxial que en la adaxial (P <

0,01). Esto es característico en las dicotiledóneas con hojas planófilas (Esau,

1985; García Breijo, 2001) y se ha confirmado en varias investigaciones

anatómicas en el género Populus (Ferris et al., 2002; Pozzo Ardizzi et al.,

2003). También se observó, en ambas epidermis, un incremento de la DE con

el transcurso del tiempo, para luego disminuir hasta estabilizarse cuando la

hoja alcanzó la expansión definitiva (LPI 10.0). Sin embargo, se registraron

diferencias marcadas entre clones, tanto en la magnitud del incremento, como

en la duración del mismo.


88

Fig. 59. DE en las epidermis adaxial y abaxial durante el desarrollo foliar, LPI 0.0, LPI 1.0, LPI 5.0 y LPI 10.0., en los clones estudiados. DE en la epidermis abaxial. En la figura 60-A se representaron las DE en

hojas LPI 0.0. Si bien los estomas comienzan a formarse en los rudimentos

foliares, la DE en este estado de desarrollo fue considerada como inicial en

este trabajo. Los mayores valores se registraron en Í 488` e Í 214`, luego, en

una posición intermedia, se ubicó Ćonti 12` que no difirió estadísticamente de

los otros clones, y por último, ´Ballestra` que fue significativamente menor que

los dos primeros.

En los estadíos de desarrollo siguientes, la mayor DE se registró en Í 488`

seguido por Í 214`, de Ćonti 12` y de ´Ballestra` (Fig. 59). Pero, además de

estas diferencias, en Í 488` y en Í 214` el incremento se produjo hasta LPI 1.0,

mientras que en Ćonti 12` y ´Ballestra` la DE continuó aumentando hasta LPI

5.0. Esto significa que en los susceptibles, los meristemoides se activaron en

forma simultánea y temprana en el desarrollo epidérmico, mientras que en los

tolerantes, la aparición de los estomas fue más gradual y extendida en el

I 488 I 214Conti 12 Ballestra

Estadíos del desarrollo foliar


89

tiempo. La posterior disminución de la DE que se registró en todos los

genotipos se debió a la expansión de las células epidérmicas indiferenciadas

(CEI).

La DE en LPI 10.0 fue considerada la DE definitiva pues las hojas llegaron a su

máxima expansión. Nuevamente los mayores valores se registraron en Í 488`

e Í 214` y difirieron estadísticamente de los registrados en Ćonti 12` y

´Ballestra` (Fig. 60-B).

Si bien en Ćonti 12` la DE inicial fue mayor que la de ´Ballestra`, durante el

crecimiento de la hoja esa diferencia se fue diluyendo (Fig. 59) hasta alcanzar

la madurez con un número de estomas/mm2 estadísticamente semejante.

Conti 12 Bellestra I 214 I 488

Clones

0

20

40

60

80

100

120

140

DE

ab

axa

il (L

PI 0

.0)


Clones

0

30

60

90

120

150

180

210

240

DE

ab

axa

il (L

PI 1

0.0

)

Fig. 60. DE en la cara abaxial. (A) en hojas jóvenes (LPI 0.0); (B) en hojas adultas (LPI 10.0). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01).

DE en la epidermis adaxial. En la figura 61-A se representaron las DE

adaxiales en hojas LPI 0.0. Como en la epidermis abaxial, la mayor DE se

registró en Í 488` que se diferenció estadísticamente de la de Í 214` y ambos,

se diferenciaron de las DE de Ćonti 12` y ´Ballestra`.

a ab

b

a Aa a

b b

B


90

Con respecto al posterior incremento de la DE observado en todos los clones

(Fig. 59), en Í 488` se registró un máximo de 306 estomas/mm2,

diferenciándose marcadamente del resto de los clones. En Ćonti 12`,

´Ballestra` e Í 214` el máximo valor alcanzó los 156, 132 y 134 estomas/mm2

respectivamente. Con respecto al estado ontogénico en el que se registró la

mayor DE, en la epidermis adaxial se repitió el mismo comportamiento que en

la abaxial: en Í 488` y en Í 214` el incremento de la DE se produjo hasta LPI

1.0, mientras que en Ćonti 12` y ´Ballestra` continuó aumentando hasta LPI

5.0.

Las DE en LPI 10.0 (Fig. 61 B) fueron estadísticamente semejantes en Í 488`,

´Ballestra` e Í 214, mientras que en Ćonti 12` fue significativamente mayor.


Clones

0

20

40

60

80

DE

ad

axa

il (L

PI 0

.0)


Clones

0

34

68

102

136

DE

ad

axa

il (L

PI 1

0.0

)

Fig. 61. DE de la epidermis adaxial. A en hojas jóvenes (LPI 0.0) y B en hojas adultas (LPI 10.0). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01). Tamaño y maduración de los estomas. El tamaño de los estomas depende

del tamaño de las células oclusivas y del grado de madurez de las mismas.

Estudios específicos dedicados al esclarecimiento de la ontogenia estomática

(Nadeau y Sack, 2002; Geisler et al., 2003) han demostrado que cuando los

estomas son inmaduros, las células oclusivas son pequeñas, tienen forma

lenticular y las paredes ventrales están completamente unidas (Fig. 62). Sobre

a

b

cc

a

b ab

b

A B


91

este sector de las paredes, se produce un depósito de cutina que, cuando

alcanza un valor crítico, se produce la degradación de la laminilla media dando

lugar al ostíolo (Willmer, 1986; Geisler et al., 2000). Este proceso se inicia

generalmente cuando las células oclusivas han alcanzado el 50 % de su

tamaño definitivo. El ostiolo resulta proporcional a la longitud del estoma

(Willmer, 1986).

Fig. 62. Aspecto de un estoma inmaduro desarrollado en la cara abaxial en una hoja de Conti 12 en LPI 0.0 (La barra representa 10 µm). (Foto del autor).

Longitud de los estomas. En la tabla XIII se presentan las longitudes de los

estomas, que fueron incrementándose con el tiempo, en ambas epidermis, en

todos los clones.

Tabla XIII. Longitud promedio de los estomas (µm) en ambas epidermis durante el desarrollo foliar, en los clones estudiados.

Estadios de LPI

Clones (*)


Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial

LPI 0.0

17,10 (4,71)

6,26 (1,85)

18,35 (4,92)

7,42 (2,86)

17,26 (2,64)

10,57 (2,93)

18,42 (2,31)

9,83 (2,07)

LPI 1.0

17,39 (5,42)

15,77 (3,75)

16,97 (4,29)

14,92 (3,84)

19,67 (3,53)

18,14 (3,66)

21,87 (2,36)

18,03 (2,84)

LPI 5.0

17,71 (3,41)

19,06 (3,16)

18,02 (3,07)

20,17 (4,62)

23,36 (3,91)

26,17 (3,33)

22,83 (3,10)

25,35 (3,14)

LPI 10.0

24,89 (3,96)

26,60 (3,70)

25,12 (3,29)

27,08 (4,19)

26,66 (3,32)

32,22 (4,57)

24,71 (3,43)

31,51 (7,31)

(*) Los valores entre paréntesis constituyen los desvíos estándares de los parámetros.


92

Estomas abaxiales. Las diferencias entre los clones estudiados, en hojas LPI

0.0, no fueron significativas (P = 0,21) (Tabla XIII). En las hojas de Ćonti 12` y

´Ballestra` coexistían pocos estomas grandes, bien desarrollados con un

elevado número de estomas incipientes, apenas diferenciados de las células

pavimentosas, cerrados, y no funcionales. Por el contrario, en Í 488` e Í 214`,

se registraron más estomas pero, más parejos, con un desarrollo intermedio y

funcionales (Fig. 63).

En Ćonti 12` y ´Ballestra` los estomas se mantuvieron en los valores iniciales

hasta LPI 5.0 mientras que en Í 488` e Í 214` aumentaron gradualmente su

longitud. (Tabla XIII y Fig. 64 y 65).

Cuando las hojas llegaron a su máxima expansión (LPI 10.0), los valores

registrados fueron estadísticamente semejantes en todos los clones, oscilando

entre 24,71 y 26,66 µm (P = 0,35) (Tabla XIII, Fig. 66).

Estos registros indican patrones de desarrollo diferentes. En Í 488` e Í 214`

los estomas se forman y maduran en las primeras etapas del desarrollo foliar,

mientras que en Ćonti 12` y ´Ballestra`, lo hacen gradualmente, acompañando

la expansión foliar hasta el final del desarrollo de la hoja. En la figura 67 se

presentan las relaciones porcentuales entre los estomas maduros e inmaduros

en la cara abaxial durante el desarrollo de las hojas. Í 488` e Í 214` tuvieron

patrones de maduración semejantes entre sí y diferentes de los observados en

Ćonti 12` y ´Ballestra`. Mientras en los dos primeros se registraba un 60 % de

estomas funcionales en LPI 0.0, en Ćonti 12` y ´Ballestra` esos porcentajes

eran marcadamente inferiores (32 % y 18% respectivamente) demostrando una

maduración más lenta. En LPI 5.0 se puede observar que, en los clones

susceptibles, la gran mayoría de los estomas ya estaban maduros (entre 95 y

93 %) mientras que, en los tolerantes, ese porcentaje oscilaba entre 72 y 77 %.

Aunque en LPI 10.0, los porcentajes de maduración se equilibraron, las

diferencias en el “riesgo epidemiológico” persiste entre susceptibles y

tolerantes por la diferencia en la DE entre los clones.


93

Fig. 63. Epidermis abaxiales en hojas LPI 0.0. Círculos blancos: estomas inmaduros. Círculos negros: estomas maduros. (Las barras representan 10 µm). (Fotos del autor).


I 488 I 214

Conti 12 Ballestra

Conti 12 Ballestra

I 488 I 214


94


Fig. 66. Epidermis abaxiales en hojas LPI 10.0. Círculos negros: estomas maduros. (Las barras representan 10 µm). (Fotos del autor).

I 488 I 214

Conti 12 Ballestra

I 488 I 214

Ballestra Conti 12


95

Fig. 67. Variación de la proporción de estomas según el grado de madurez durante el desarrollo foliar en la epidermis abaxial de los cuatro híbridos estudiados. Estomas adaxiales. Los estomas adaxiales fueron más pequeños que los

abaxiales en LPI 0.0 y LPI 1.0 en todos los clones. A partir de LPI 5.0 la

relación se invirtió originando estomas adaxiales mayores en los clones

susceptibles que en los clones tolerantes (P < 0,01) (Tabla XIII).

Diferencias en las DE y en la ontogenia de los estomas abaxiales y adaxiales

han sido registradas en los estudios básicos sobre Arabidopsis (Croxdale,

2000; Nadeau y Sack, 2002; Geisler et al., 2003), en otras especies vegetales

(Willmer, 1986; Salas et al., 2001; Hernández et al., 2000) y en otros genotipos

del género Populus (Reich, 1984; Dunlap y Stettler, 2001; Ferris et al., 2002;

Aasamaa et al., 2005; Abbruzzese et al., 2009). En este trabajo, se ha

establecido que las variaciones estomáticas registradas en los clones, estaban

relacionadas con su comportamiento frente a la Cancrosis, tal como se ha

comprobado en otros patosistemas (Arthaud y Taris, 1979; Conn y Tewari,

1989; Hernandez et al., 2000; Anselmi et al., 2006; Rodriguez et al., 2009).


96

Caracterización de las células epidérmicas indiferenciadas (CEI). En el

género Populus, son tabulares y presentan formas irregulares, ondeadas. La

cara interna, que está en contacto con el mesófilo, es plana, y la cara externa

es más o menos convexa.

Al no dejar espacios intercelulares entre sí, la densidad celular es uno de los

factores que regulan la expansión celular (Esau, 1985) y es importante pues el

número y tamaño de estas células determina la separación entre los estomas.

Densidad de las células epidérmicas indiferenciadas (DCEI). En la figura 68

se representa la variación de las DCEI durante el desarrollo de las hojas, en los

clones estudiados.

La DCEI fue mayor en la epidermis abaxial que en la adaxial, en todos los

clones estudiados, siendo más pronunciada en los primeros estadíos. En

consecuencia las células adaxiales fueron siempre de mayor tamaño que las

abaxiales.

En la Tabla XIV se presentan los registros de la DCEI y la superficie promedio

de las células, en todos los clones estudiados.

En el estadío LPI 0.0, las mayores DCEI se observaron en ´Ballestra` y Ćonti

12` seguidos por Í 488` y por último, Í 214`, tanto en la epidermis abaxial

como en la adaxial. En el estadío LPI 1.0 se registró una gran expansión celular

en ambas epidermis en todos los clones y en consecuencia, una marcada

disminución de las DCEI. Las DCEI abaxiales en el estadío LPI 10.0, en los

clones susceptibles fueron estadísticamente mayores que las de los clones

tolerantes (P < 0.01) (Fig. 69 A). En cuanto a las DECI adaxiales, el clon

susceptible Í 214` se comportó igual que los clones tolerantes, todos, menores

que Í 488` (susceptible) (Fig. 69 B). Sin embargo, el área promedio celular fue

menor en los clones susceptibles que en los tolerantes (Tabla XIV).


97

Fig. 68. DCEI por mm2 en las epidermis adaxial y abaxial durante el desarrollo foliar, en los clones estudiados.

En las figuras 70, 71, 72 y 73, se pueden observar otros aspectos morfológicos

de las CEI. A partir de LPI 1.0, los bordes de las células epidérmicas abaxiales

se vuelven marcadamente festoneados, con formas irregulares a modo de

“puzzle” en Í 488` y en Í 214`, contrastando con las formas más regulares,

poligonales, en ´Ballestra` y Ćonti 12`. Esto puede tener efectos sobre las

actividades de los patógenos foliares, ya que el espesor de la cutícula en las

células irregulares puede ser heterogéneo (Willmer, 1986), y además, hay

mayor proporción de laminilla media que en las isodiamétricas (Weier et al.,

1983; Esau, 1985). En las células adaxiales la morfología se mantiene más

regular durante el desarrollo.


98

Tabla XIV. DCEI y área celular promedio en los distintos estadíos de desarrollo foliar en cada uno de los clones estudiados.

Parámetros

por estadios

de LPI

Clones


Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial Abaxial Adaxial

LPI 0.0

DCI (mm2)

Área de

células indi-

ferenciadas

(µm2)

16835

(759)

59,23

(4,12)

14328

(870)

69,57

(6,41)

18599

(937)

53,66

(2.28)

14954

(1109)

66,84

(4,12)

12792

(1630)

77,52

(6,06)

10598

(534)

94,19

(6,89)

15506

(1482)

63,58

(3,67)

11249

(440)

88,83

(7,44)

LPI 1.0

DCI (mm2)

Área de

células indi-

ferenciadas

(µm2)

5604

(195)

178,70

(12,73)

5174

(258)

192,34

(10,59)

4856

(203)

199.02

(14,14)

4087

(177)

236,28

(17,82)

4167

(198)

240,62

(20,21)

3936

(190)

255,62

(18,63)

9437

(563)

105,75

(10,01)

6662

(304)

150,44

(11,47)

LPI 5.0

DCI (mm2)

Área de

células indi-

ferenciadas

(µm2)

3041

(142)

330,14

(24,49)

2697

(132)

372,58

(28,52)

3331

(109)

306,21

(11,09)

2502

(174)

407,22

(26,63)

3898

(325)

257,60

(19,05)

3587

(312)

279,80

(21,61)

3619

(203)

275,33

(25,32)

2312

(197)

434,59

(29,98)

LPI 10.0

DCI (mm2)

Área de

células indi-

ferenciadas

(µm2)

2001

(126)

500

(41,02)

1745

(80)

573,72

(39,67)

2112

(109)

479,04

(40,36)

1728

(107)

584,46

(31,69)

2657

(245)

376,59

(26,51)

1627

(160)

449,44

(37,55)

2556

(311)

390,78

(23,48)

2121

(148)

470,59

(29,57)

Los valores entre paréntesis corresponden a los desvíos estándares.


99

Fig. 69. DCEI por mm2 en las epidermis abaxial (A) y adaxial (B) en el estadío de desarrollo foliar LPI 10.0. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (P<0,01).

Conti 12 Ballestra I 214 I 488Clones

0

700

1400

2100

2800

DC

EI a

ba

xail

(LP

I 10

.0)


Clones

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

DCEI ada

xail (L

PI 10

.0)

aa

bb

a

bb

b

A

B


100

Fig. 70. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 0.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm). (Fotos del autor).

Ballestra (abaxial) Ballestra (adaxial)

Conti 12 (abaxial) Conti 12 (adaxial)

I 488 (abaxial) I 488 (adaxial)



101

Fig. 71. Aspecto de la epidermis en el estadío LPI 1.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm). (Fotos del autor).






102

Fig. 72. Aspecto de la epidermis en LPI 5.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm). (Fotos del autor).


Conti 12 (abaxial)



Conti 12 (adaxial)


103

Fig. 73. Aspecto de la epidermis en LPI 10.0 en los clones estudiados. (Las barras representan 20 µm). (Fotos del autor).






104

Composición y estructura de las cutículas. Las paredes de las células

epidérmicas están compuestas por matrices celulósicas impregnadas de cutina

y ceras epicuticlares, formando una capa continua (Fig. 74).

Fig. 74. Esquema representativo del complejo cuticular. (www.lipidlibrary.oacs.org.)

La cutina está compuesta principalmente por monómeros de ácidos grasos de

C16 y C18, y en menor cantidad por compuestos aromáticos.

El espesor cuticular varía entre las especies vegetales, los órganos de un

mismo individuo, la edad o estado de desarrollo de las plantas, y está

fuertemente influenciado por el ambiente. En la figura 75, se representa el

espesor promedio de las cutículas foliares, abaxiales y adaxiales en los clones

estudiados. En todos los casos, las cutículas adaxiales resultaron más gruesas

que las abaxiales (P < 0.01). A su vez, en los tolerantes, el espesor fue

significativamente mayor que en los susceptibles (P < 0.01).

Ceras epicuticulares

Cutícula (cutina + ceras epicuticulares

Capa cuticular (cutina + ceras + carbohidratos) Laminilla media

Pared celulósica

Membrana plasmática

Citoplasma

Vacuola


105


Clones

0.00

0.79

1.57

2.35

3.14

Esp

eso

r C

utíc

ula

s a

ba

xia

les


Clones

0.00

0.78

1.57

2.35

3.14

Esp

eso

r C

utíc

ula

s a

da

xia

les

Fig. 75. Espesor del complejo cuticular en las epidermis (A) abaxial y (B) adaxial en el estadío de desarrollo LPI 10.0, en los clones estudiados. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01). Los principales componentes de estas ceras son los n-alcanos de cadena larga

y si bien hay pocas referencias del posible efecto de estas moléculas sobre los

patógenos, algunas investigaciones les atribuyen propiedades antifúngicas por

interferencias con la germinación de esporas (Conn y Tewari, 1989; Alcerito et

al., 2002; Wang et al., 2006).

Los n-alcanos presentes en las ceras epicuticulares son del rango C21 a C35

(Kunst y Samuels, 2003).

Bakker y Alvarado (2006) detectaron diferencias muy marcadas en la

concentración total de n-alcanos en diferentes especies de álamos,

fundamentalmente en la proporción relativa de los C27 y C29.

Los resultados de los análisis foliares mostraron diferencias sustanciales en el

contenido total de n-alcanos entre los clones, así como en el contenido parcial

de cada tipo (Tabla XV). Los alcanos C29 fueron los más abundantes aunque

también se destacaron los C28, C30 y C31. Resultados semejantes fueron

obtenidos por otros autores en otras especies del género Populus (Bakker y

Alvarado, 2006; Kunst y Samuels, 2003). En la comparación entre clones, se

b a

c c

a a

b

b

A B


106

pudo observar que, ´Conti 12` mostró los mayores valores seguido por

´Ballestra`, ambos, bien diferenciados de los clones susceptibles, con menores

proporciones de los n-alcanos señalados.

Tabla XV. Contenido de n-alcanos en hojas de álamos (mg/kg MS*)

Clon C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C35 Total

Conti 12 7,9 10,9 30,7 16,1 17,19 132,4 1613,7 59,4 118,0 7,7 10,2 4,4 2382,0

Ballestra 7,0 10,9 17,1 13,3 12,13 72,5 1290,1 37,3 117,8 7,8 9,9 3,0 1786,3

I 214 7,7 12,8 19,0 12,6 11,89 64,7 944,7 39,5 103,3 8,5 11,9 3,6 1375,4

I 488 8,1 13,4 19,9 14,5 11,2 60,3 923,7 34,9 86,0 7,8 7,9 3,6 1312,4

*MS: contenido de materia seca determinado en estufa a 100 °C hasta peso constante (~24 horas).

Aspectos topográficos de las epidermis foliares. Además de considerar la

cantidad y calidad de las ceras epicuticulares, también hay que tener en cuenta

los patrones de cristalización de las mismas que contribuyen a generar

diferentes diseños en la topografía epidérmica. En algunos casos, esas

proyecciones cristalinas aumentan la hidrofobicidad de la epidermis y reducen

la adhesión de partículas contaminantes (efecto lotus) (Pérez García y

Sepúlveda Sánchez, 2011). Si la disponibilidad de agua se reduce a períodos

muy cortos la germinación de las esporas no es exitosa (Rashotte et al., 1997).

Si bien no está claro cómo interfieren las ceras epicuticulares en el proceso de

adherencia de las esporas, existen varias hipótesis: modificando la adherencia,

la recepción de estímulos y las trayectorias del tubo germinativo.

Para evaluar esta situación en los diferentes clones se realizó un estudio de las

epidermis en hojas maduras. Utilizando microscopía electrónica de barrido se

obtuvieron imágenes que permitieron detectar diferencias topográficas sólo en

las superficies abaxiales coincidiendo con Cameron et al. (2002) (Fig. 76).


107

En ´Ballestra` y Ćonti 12` las epidermis abaxiales presentaron relieves

atenuados, donde los límites celulares eran poco definidos y los estomas se

destacaban por la apertura de los ostíolos intercalados en un tapiz celular

pavimentoso (Fig. 76 A y B). En la figura 76 C se puede observar la epidermis

abaxial de Í 214` donde los contornos celulares son más oscuros indicando

una depresión. Esto se interpretó como una microtopografía con elevaciones y

surcos donde sería posible la acumulación de agua, requerida para el

desarrollo del tubo germinativo. En la figura 76 D, los contornos celulares del

clon Í 488` aparecen claros, refringentes y elevados sobre el resto de la

superficie celular por el depósito de ceras epicuticulares. Con el mismo

razonamiento anterior, esta topografía también podría retener agua.

En las observaciones realizadas con mayores resoluciones se descartó la

existencia de expansiones cristalinas sobre el ostiolo estomático en todos los

clones como sucede en otras especies (Pallardy y Kozlowski, 1980), sin

embargo, el mayor aumento permitió diferenciar más claramente la topografía

epidérmica. En ´Ballestra` y Ćonti 12` se observó una cutícula continua, sin

surcos pronunciados que limiten las células, incluidos los estomas (Fig. 77 A y

B). En Í 214` y en Í 488` (Fig. 77 C y D), el microrelieve epidérmico resultó

más complejo, confirmándose las características descriptas anteriormente. En

Í214` las células oclusivas presentaban el aspecto de labios inflamados

enmarcando los ostíolos y en Í 488` se observan engrosamientos

sobresalientes en torno al ostíolo.

Debido a la microtopografía descripta, los clones tolerantes tendrían menos

posibilidad de retener agua en superficie que los clones susceptibles.


108

Fig. 76. Microfotografía electrónica (250x) que muestra el aspecto de la epidermis abaxial de hojas LPI 10.0 en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`.

A

D C

B


109

Fig. 77. Microfotografía electrónica (2000x) que muestra el aspecto de la epidermis abaxial de hojas LPI 10.0 en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`.

A

C D

B


110

3.3.2. Estructura del tallo. El desarrollo óptimo del tallo, evaluado en cantidad

y calidad de madera, es el principal objetivo productivo siendo la Cancrosis del

Álamo, una enfermedad que afecta ambos aspectos. En el género Populus el

tallo presenta una amplia diversidad anatómica y morfológica (Fig. 11) a la que

podría atribuirse la amplia respuesta frente a la enfermedad (Singh y Singh,

2005; Sinclair y Lyon, 2005). Sin embargo, materiales muy próximos

genéticamente, con tasas de crecimiento, arquitecturas y aspectos

morfológicos semejantes, como es el caso de los clones estudiados (Arreghini

et al., 2000; Borodowski y Suarez, 2004; Cortizo, 2011), muestran niveles de

susceptibilidad marcadamente diferentes. Estas diferencias se manifiestan en

la frecuencia y tamaño de los cancros (Ostry y McNabb, 1985; Ostry y Ward,

2003; Callan et al., 2007; LeBoldus et al,, 2009b), y en la capacidad de

colonización del patógeno que ha sido aislado a partir de tejidos corticales y

peridérmicos, (Zalasky, 1978; Sivanesan, 1990), asi como de xilema

(Krupinsky, 1989; Stanosz et al., 2002; Weiland y Stanosz, 2007).

3.3.2.1. Peridermis exofiláctica (PE). Este complejo tejido, constituye el

ámbito receptor de las esporas y es la primera barrera que debe sortear el

patógeno. Las células suberizadas del felema, se ordenan en hileras radiales y

no dejan espacios intercelulares entre sí y su naturaleza impermeable

constituye una barrera física para los patógenos. Las lenticelas son sectores de

la peridermis en los que el felógeno produce hacia afuera un tejido laxo,

denominado “tejido de relleno”, cuya función primordial es la de habilitar una

zona permeable a los gases. Sin embargo, esa misma laxitud las transforma en

zonas vulnerables, factibles de ser invadidas por algunos patógenos

(Buscciarelli et al., 1999; Singh y Singh, 2005; Cruz Borruel et al., 2006).

En general, la peridermis constituye lo que se denomina una “defensa pasiva” o

un “factor constitutivo” (Ordeñana, 2002; Mysore y Ryu, 2004; Cruz Borruel et

al., 2006; Lendzian, 2006) que puede dificultar el establecimiento del patógeno.

Uno de los objetivos principales de este trabajo fue determinar si los clones

estudiados difieren en las características peridérmicas y si esas diferencias

inciden con la actividad del patógeno.


111

Características del Felema. Las especies de Populus y sus híbridos

expresan gran variabilidad en este tejido (Larson e Isebrands, 1974; Isebrands

y Larson, 1977; Yucer et al., 2003; Weiland y Stanosz, 2007) por el número de

capas celulares que lo componen o por el espesor individual de cada capa

(Tabla XVI).

Tabla XVI. Características del felema en estacas de los clones estudiados.

Clon Espesor promedio del felema (µm) (a)

N° de estratos celu-lares del felema (b)

Espesor de cada es-trato (a/b)

Conti 12 71,05 b 2,4 b 29,60 a

Ballestra 76, 93 a 3,0 a 25,64 a

I 214 52,68 c 2,0 c 26,34 a

I 488 54,50 c 2,1 c 25,95 a

(*) Dentro de las columna (a) y (b), las filas con letras distintas indican diferencias significativas según el (TCMD, p < 0,01). Existe una marcada diferencia entre los espesores de los felemas. Los clones

tolerantes, si bien difieren entre sí, tienen felemas más gruesos los

susceptibles. Estos datos se corresponden con los obtenidos por Weiland y

Stanosz (2007) quienes, analizando la histopatología de esta enfermedad,

determinaron que el espesor del felema en un clon tolerante fue más del doble

(entre 69 µm y 108 µm) que en uno susceptible (entre 30 µm y 48 µm).

En este estudio, el número de estratos celulares es el parámetro que establece

la diferencia pues los clones no difirieron estadísticamente en el espesor

promedio de los estratos (P = 0,25).

En los cortes histológicos de Ćonti 12` y de ´Ballestra` (Fig. 78 A y B) se puede

observar que, pese a la actividad del felógeno, el estrato epidérmico se

mantuvo prácticamente intacto. En la mayoría de las células del felema se

detectan contenidos protoplasmáticos. En los cortes de Í 214` y de Í 488` solo

se observaron resabios de la epidermis y la pérdida de los protoplastos en las

células del felema (Fig. 78 C y D).


112

Fig. 78. Aspecto del felema desarrollado en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 50 µm). (Fotos del autor).

A

C D

B


113

Características de las lenticelas. Estas estructuras están fuertemente

influenciadas por el ambiente y por las pautas de manejo del cultivo (Lendzian,

2006; Kalachanis y Psaras, 2007). Ya que en este caso las condiciones

ambientales y las estrategias productivas fueron las mismas para todos los

clones, las diferencias comparativas se pueden atribuir a factores genéticos.

Densidad de lenticelas. En la figura 79 se representan los valores registrados

en los diferentes clones. En ´I 488` la densidad fue estadísticamente mayor que

en el resto de los clones, los que no difirieron entre sí (P< 0,01). En este

aspecto ´I 214`, clon susceptible, se manifestó de forma semejante a los clones

tolerantes.


Clones

0

10

20

30

40

50

60

70

N° de lentic

elas

Fig. 79. Densidad de las lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (p < 0,01). Dimensiones de las lenticelas. El tamaño y la forma de las lenticelas son un

reflejo de la disposición y la actividad del felógeno que puede originar

estructuras alargadas o ensanchadas.

Para conocer la tendencia morfológica en los clones estudiados, se han

registrado el largo y el ancho “externo” de las mismas.

b b

b

a


114

Como se observa en la figura 80, la longitud de las lenticelas no es un

parámetro que puede diferenciar a los clones susceptibles de los tolerantes.

Por un lado, Í 214` presentó las lenticelas más largas, mientras que los demás

clones no difirieron entre sí. Por el otro, ´Ballestra` registró las lenticelas más

angostas e Í 488` las más anchas con valores intermedios para los otros dos

clones (Fig. 81).


Clones

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Longitu

d d

e la

s le

ntic

ela

s (m

m)

Fig. 80. Longitud de las lenticelas, en tallos jóvenes (madera del año). Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas, según el TCMD (p < 0,01). Con estas dos dimensiones, se calculó la superficie promedio de las lenticelas

(Fig. 82). Si bien las de ´Ballestra` resultaron tener una superficies expuesta

menor que las de Ćonti 12`, ambas fueron estadísticamente menores que las

de Í 214` y las de Í 488`, que no difirieron entre sí.

Al relacionar estos valores con la densidad de las lenticelas, se calculó la

potencial superficie de entrada del patógeno por unidad de muestreo (Fig. 83).

b

a

b

b


115


Clones

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Anch

o d

e las le

ntic

elas (mm)

Fig. 81. Ancho de las lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).


Clones

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Áre

a d

e las le

ntic

elas (mm2)

Fig. 82. Área promedio de las lenticelas en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P<0,01).

b

ab

ab

a

c

a a

b


116


Clones

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

Áre

a total lentic

elar (mm2)

Fig. 83. Área total de lenticelas en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,01).

Pese a la diferencia entre los clones tolerantes, ambos mostraron menores

valores que los susceptibles y por lo tanto, la oportunidad que tiene el patógeno

de acceder a sus tejidos vulnerables, es considerablemente menor. Este podría

ser un parámetro que explique, al menos en parte, las diferencias registradas

en la intensidad de la enfermedad en los tallos (Fig. 34 y Tabla VI).

En la figura 84 se muestran los diferentes aspectos de las lenticelas en cada

uno de los clones estudiados.

Anatomía de las lenticelas. Generalmente el felógeno forma las lenticelas

donde había un estoma en la epidermis (Esau, 1985) tal como se puede ver en

la figura 85.

Durante el desarrollo de una lenticela, la producción de tejido de relleno genera

presión sobre el estrato epidérmico mientras este perdura, porque el felógeno

lenticelar es más activo que en el resto de la peridermis (Esau, 1985;

Kalachanis y Psaras, 2007).

a

b

c

d


117

Fig. 84. Aspecto de las lenticelas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 1 mm). (Fotos del autor).

A

D C

B


118

Fig. 85. Aspecto de una lenticela de incipiente formación donde se puede observar el estoma en el estrato epidérmico que aún perdura. Corte de un tallo de ´Ballestra` (La barra representa 50 µm). (Foto del autor). Debido esta mayor actividad mitótica y a la resistencia de la epidermis, el

felógeno se ve desplazado hacia el interior del tallo, adoptando un aspecto de

herradura más o menos pronunciada (Fig. 86). La magnitud de este

desplazamiento determina el ancho interno y la profundidad de las lenticelas, o

sea, la distancia que debería recorrer el patógeno en el caso de producirse una

infección. Este patrón de disposición histológica se observó en todos los

clones, con la excepción de ´I 488`, en el cual, la expansión se produjo hacia

afuera y el felógeno no se hundió.

Fig. 86. Lenticela madura en un tallo de ´I 214` donde se observa el tejido de relleno y el desplazamiento interno del felógeno (La barra representa 50 µm). (Foto del autor).

Estoma

Felógeno

Tejido de relleno


119

En la figura 87 se comparan las dimensiones internas (ancho y profundidad) de

las lenticelas, en los clones estudiados.


Clones

0

150

300

450

600

An

cho

in

tern

o d

e l

en

tice

las

(µm

)


Clones

0

50

100

150

200

250

300

350

Pro

fun

did

ad

de

le

ntic

ela

s (

µm

)

Fig. 87. (A) Ancho interno y (B) profundidad de lenticelas, en tallos jóvenes. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (P < 0,05 y P<0,01 respectivamente).

En ´Ballestra` se registró el menor ancho interno (241 µm), mientras que en los

demás, fue semejante, oscilando entre 445 y 486 µm. En todos los casos el

tejido de relleno se expandió por debajo de la apertura del felema, superando

las dimensiones externas de la lenticela. En la figura 88, se puede observar

una zona translúcida en torno a la lenticela que denota la expansión lateral del

tejido de relleno.

En la figura 87 también se representa la profundidad de lenticelas. Los valores

más bajos se registraron en ´Ballestra`, luego siguieron Í 488` y Ćonti 12`, con

un espesor intermedio, semejante estadísticamente, y finalmente, Í 214`, con

los mayores valores. Sin embargo, ninguno de estos parámetros respetó el

agrupamiento de los clones según su comportamiento frente a la enfermedad.

Además de estas diferencias cuantitativas, también se observaron diferencias

en la histología de las lenticelas (Fig. 89).

a a a

b

a

b

bc

c

A B


120

Fig. 88. Aspecto externo de una lenticela donde se puede observar la apertura de la peridermis y el tejido de relleno. La flecha indica una zona algo translúcida que recubre la expansión lateral interna del tejido de relleno. Tallo joven de ´I 214`. (Foto del autor).

3.3.2.2. Corteza. La caracterización anatómica de este sector del tallo cobra

sentido desde el punto de vista de la patogénesis pues constituye el territorio a

colonizar por el patógeno una vez vencida la barrera de la peridermis y es el

ámbito donde se desarrollan los cancros.

Espesor de la corteza. El espesor del parénquima cortical es un

parámetro que varía considerablemente entre especies, y entre cultivares

dentro de una misma especie.

En la figura 90 se compara este parámetro en los diferentes clones. ´Ballestra`

presentó la corteza más delgada y se diferenció en forma significativa de los

clones susceptibles que no difirieron entre sí. El clon ´Conti 12`, considerado

tolerante, no se diferenció estadísticamente del resto.


121

Fig. 89. Anatomía las lenticelas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 100 µm). (Fotos del autor).

A

D C

B


122


Clones

0

100

200

300

400

500

600

700

Esp

eso

r de la c

orteza

(µm)

Fig. 90. Espesor de la corteza en los clones estudiados. Las columnas con letras distintas indican diferencias significativas según el TCMD (p < 0,008). En la figura 91 se presentan cortes transversales de tallos de ´Ćonti 12``,

´Ballestra` e Í 214` respectivamente donde se pueden observar leves

variaciones en el espesor de sus cortezas. La imagen que corresponde a un

corte de Í 488` muestra que este parámetro es fluctuante dando un aspecto

festoneado. Sin embargo, en promedio, sólo se diferenciaba de ´Ballestra`.

Características anatómicas de la corteza. A las diferencias señaladas

se les pueden sumar otras como son las características celulares del

parénquima cortical y del floema.

En términos generales, si bien cada clon tiene sus particularidades histológicas,

se puede resaltar que en los clones tolerantes, la felodermis y el parénquima

cortical se presentan como un conjunto de tejidos más compactos, y que recién

en la corteza profunda se distinguen espacios intercelulares considerables (Fig.

92 A y B). En los susceptibles, la separación celular se hace evidente desde los

estratos subperidérmicos (Fig. 92 C y D).

b

ab a

a


123

Fig. 91. Aspecto de las cortezas desarrolladas en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras representan 100 µm). (Fotos del autor).

A

D C

B


124

Fig. 92. Aspecto de los tejidos subperidérmicos desarrollados en tallos jóvenes de (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`. (Las barras presentan 50 µm). (Foto del autor).

C D

B A


125

Según Esau (1985), en muchas Dicotiledóneas, los elementos del floema

primario que son desplazados en forma centrífuga por la actividad del

cambium, dejan de ser funcionales y se transforman en fibras. Hay algunos

estudios que relacionan la cantidad y distribución de estas fibras con la

susceptibilidad a patógenos que producen cancros porque interrumpen la

continuidad de la peridermis necrofiláctica (PN), lo que le permitiría a los

patógenos acceder a los tejidos sanos (Biggs et al., 1983; Bostock y Middleton,

1987). Weiland y Stanosz (2007) determinaron que la PN que se forma en

torno a los haces de fibras floemáticas era más delgada que la formada en

otros sectores de la corteza, sin embargo, como esto fue similar en el clon

tolerante y en el susceptible, no encontraron evidencias de que esta

característica estuviera asociada con la resistencia o la susceptibilidad. En la

figura 93 se muestra diferencias en la disposición estas fibras, que tampoco

pudieron ser asociadas con la tolerancia/susceptibilidad en los clones

estudiados.

Fig. 93. Aspecto de las fibras que protegen al floema primario en (A) Ćonti 12`, (B) ´Ballestra`, (C) Í 214` y (D) Í 488`.

A

fibras fibras

fibrasfibras

floema

floemafloema

floema

C D

B


126

3.4. Relaciones entre las características anatómicas y morfológicas de los órganos susceptibles con la intensidad de la enfermedad en los clones seleccionados. La hipótesis de este trabajo afirma que algunas

características bioquímicas, anatómicas y morfológicas que presentan los

órganos susceptibles en los diversos genotipos de Populus constituyen

barreras biológicas que dificultan el desarrollo de la enfermedad. Para

demostrarla, se evaluaron y se cuantificaron, por un lado, las intensidades de la

enfermedad en hojas y tallos de clones tolerantes (Ćonti 12` y ´Ballestra`) y

susceptibles (Í 214` e Í 488`) (ítem 3.1 y 3.2), y por otro lado, una serie de

parámetros químicos, morfológicos e histológicos correspondientes a esos

clones (ítem 3.3). En este apartado se calcularon los Coeficientes de

Correlación de Pearson entre cada parámetro foliar y la Ih, y cada parámetro

caulinar y la It.

3.4.1. Intensidad de la enfermedad en hojas (Ih) vs. características foliares. En la tabla XVII se presenta una sinopsis de todos los parámetros registrados

en las hojas y la posición relativa de los clones según los TCMDs.

Al analizar las relaciones entre la morfología foliar y el área foliar con la Ih no se

detectaron diferencias claras entre los clones tolerantes y susceptibles como

para incluir esas variables entre las que influyen en la intensidad de la

enfermedad.

El valor r que cuantificó la correlación entre el espesor de la lámina y la Ih fue

de – 0,84 (p = 0,0092), lo que significa que ambas variables están fuerte e

inversamente asociadas: a mayor espesor foliar, menor susceptibilidad al

patógeno. El TCMD ya había determinado que las hojas de los clones

tolerantes eran significativamente más gruesas que las de los susceptibles (fig.

57). En la Tabla XVII se puede observar que todas las variables que componen

el espesor de la lámina (espesores de las epidermis adaxiales y abaxiales, de

los parénquimas en empalizada y lagunoso) resultaron inversa y fuertemente

correlacionados con las Ih.


127

Tabla XVII. Correlaciones entre la Ih y las características foliares.

Clones Ćonti 12` Ballestra Í 214` Í 488` r p

Nivel de Intensi-dad en hoja

b (Tolerante)

b (Tolerante)

a (Susceptible)

a (Susceptible)

Forma de las hojas Base

Ápice

Deltoides Redondea-da Levemente acuminados

Deltoides Redondea-da Levemente acuminados

Deltoides Levemente cuneadas Definidamente acuminados

Deltoides Levemente cuneadas Definidamente acuminados

Área foliar c b b a

0,66 0,071

Anatomía foliar

Espesor de la hoja

b a d c -0.84 0,0092

Espesor de la epidermis adaxial

b a c c -0.93 0,0008

Parénquima en empalizada

a a b b -0.95 0,0003

Parénquima lagu-noso

b a c c -0.90 0,0021

Espesor de la epidermis aba-xial

a a b b -0,80 0,018

Indicador del es-pacio intercelular

a a b c -0.93 0,0008

DE en PLI 0.0 abaxial

b c a a 0.83 0.0101

DE en PLI 0.0 adaxial

c c b a 0.90 0.0002

DE en PLI 10.0 abaxial

b b a a 0.93 0,008

DE en PLI 10.0 adaxial

a b b b -0.50 0.2111

Long. est. en PLI 10.0 abaxial

a a a a ---- 0,5443

Long. est. en PLI 10.0 adaxial

b b a a 0,95 0,0004

DCEI en PLI 10.0

abaxial

b b a a 0,94 0,0054

DCEI en PLI 10.0

adaxial

b b b a 0,41 0,307

ÁCEI PLI 10.0

abaxial a a b b 0,94 0,004


128

DE = densidad estomática. DCEI = densidad de células epidérmicas indiferenciadas. ACEI = área de células epidérmicas indiferenciadas. Dentro de cada fila, las celdas con letras distintas indican diferencias significativas. El sombreado de las celdas destaca las variables que correlacionan significativamente con la Ih Otra característica anatómica de las hojas, que también resultó inversa y

fuertemente correlacionada con la Ih fue la magnitud de espacio intercelular en

el parénquima en empalizada (- 0,93, p = 0,0008) indicando una menor

incidencia de la enfermedad ante un mayor espacio intercelular. Los resultados

obtenidos fueron contrarios a los esperados ya que se había supuesto que un

mayor espacio intercelular facilitaría el avance, la colonización y el desarrollo

del patógeno en los tejidos. Por el contrario, los picnidios formados en los

mesófilos de “Conti 12" (clon tolerante y con mayor indicador de espacio

intercelular) fueron de menor diámetro que los formados en ´I 214` (clon

susceptible y con menor indicador de espacio intercelular) (Tabla IX). Lo mismo

sucedió con los ascomas formados en la hojarasca de los mencionados clones

(Tablas VII). Una posible explicación sería que los tejidos más compactos, al

tener un mayor número de células, puedan aportar mayores niveles

nutricionales para el patógeno (como parásito o saprófito), así como lo hacen

para los áfidos (Gould et al., 2007). También podría ser que los espacios

intercelulares mayores sean ocupados por compuestos defensivos.

Como ya se señaló oportunamente, la DE es fundamental, dado que el

patógeno ingresa a la hoja a través de los estomas. Este parámetro resultó

diferente en ambas epidermis de una misma lámina y varió con la edad de las

hojas (Fig. 60 y 61). Cuando la mayoría de las hojas eran jóvenes, con bajas

DE, las Ih fueron bajas. A medida que las hojas iban completando su desarrollo,

alcanzando las DE definitivas, las Ih se incrementaron (Fig. 28, 29 y 30) tal

ÁCEI PLI 10.0

adaxial

a a b b 0,92 0,003

Espesor cutícula abaxial PLI 10.0.

a

a

b

b

-0.91

0,0018

Espesor cutícula adaxial PLI 10.0

a

a

b

b

-0.92

0,0012

Contenido de n-alcanos (C29)

a a b b ‐0,91 0,019


129

como lo han comunicado otros autores (Maxwell et al., 1996; Sinclair y Lyon,

2005). Por este motivo, se calcularon las correlaciones entre la Ih y las DE

adaxiales y abaxiales, en hojas jóvenes (LPI 0.0) y hojas adultas (LPI 10.0).

Los coeficientes de correlación entre la Ih y las DE abaxiales y adaxiales, en

hojas LPI 0.0, fueron elevados y positivos [r = 0,83 (p = 0,0101) y r = 0,90

(0.0002) respectivamente]. Desde el punto de vista epidemiológico, la DE

abaxial es la más importante cuando en los árboles hay un predominio de hojas

jóvenes (inicio de la temporada de crecimiento) pues, como el inóculo primario

proviene de la hojarasca, el principal plano de impacto de las ascosporas, es la

cara inferior de las hojas (Moller, 1980; Luley y McNabb Jr., 1989 y 1991). Los

valores de la correlación entre la DE abaxial y la Ih determinan que a menor

cantidad de estomas por unidad de superficie, menor nivel de enfermedad.

La correlación Ih – DE abaxial, en PLI 10.0, fue fuerte y directa (r = 0,93, p =

0,008), no sucediendo lo mismo con la DE adaxial (r = - 0,50, p = 0,2111). Esto

se condice con los agrupamientos de clones determinados por los TCMDs

correspondientes. Los clones tolerantes tuvieron menores DE abaxiales que los

clones susceptibles (Fig. 60) mientras que DE adaxiales no separaron a los

clones tolerantes y susceptibles (Fig. 61). El inóculo secundario (conidios) que

se libera desde las hojas inferiores (las más afectadas por el inóculo primario),

tiene dispersión multidireccional pero predominantemente ascendente. A

medida que avanza el ciclo de cultivo, cuando las lesiones aparecen en la parte

superior del canopéo, la dispersión del inoculo se vuelve aleatoria (Sutton et al.,

1981; Ostry, 1987; Aylor y Anagnostakis, 1991; Sinclair y Lyon, 2005; LeBoldus

et al., 2009b; Feau et al., 2010). Relaciones semejantes entre las mediciones

de incidencia y las DE han sido comunicadas en otros patosistemas (Conn y

Tewari, 1989; Hernández et al., 2000; Salas et al., 2001).

En cuanto a las dimensiones estomáticas, el análisis comparativo determinó

que la longitud de los estomas abaxiales en hojas PLI 10.0 fue semejante en

todos los clones (Tabla XIII), lo que se reflejó en un bajo coeficiente de


130

correlación con Ih (r = 0,36, p = 0,376). La misma correlación, para los estomas

adaxiales, resultó ser fuerte y directa (r = 0,95, p = 0,0004).

Las variables DCEI y ACEI, en general tienen altos coeficientes de correlación

con la Ih (Tabla XVII), sin embargo, el efecto biológico es indirecto. Influyen

sobre otros parámetros como la DE, aumentando o disminuyendo la distancia

entre estomas (Verugo et al., 1999; Ferris et al., 2001), y sobre el espesor de

las cutículas pues las células de mayor tamaño, están potencialmente mejor

capacitadas para generar cutículas más gruesas (Matthew y Athshwoth, 1999;

Cameron et al., 2002; Pérez García y Sepúlveda Sánchez, 2011).

El espesor de las cutículas en ambas epidermis correlacionó fuerte e

inversamente con la Ih (abaxial r = - 0,91, p = 0,0018; adaxial r = - 0,92, p =

0,0012). La cutícula, es considerada como una estructura de defensa pasiva

frente a la actividad de los patógenos (Matthew y Athshwoth, 1999; Ordeñana,

2002; Mysore y Ryu, 2004; Cruz Borruel et al., 2006).

En cuanto a su composición, se sabe que algunas moléculas asociadas a la

cutina como los flavonoides, pueden ejercer actividades antifúngicas (Rashotte

et al., 1997; Silvestri y Yáñez, 1997; Alcerito et al., 2002; Samuels et al., 2008;

Szafranek et al., 2008). En este trabajo, los n-alcanos, tuvieron un coeficiente

de correlación con Ih, elevado y negativo (r = - 0,91, p = 0,019). O sea, a mayor

cantidad de n-alcanos, menor Ih.

Por todo lo expuesto, las diferencias registradas en los niveles de Ih entre los

clones tolerantes y susceptibles, podrían atribuirse a un conjunto de

características foliares asociadas. Para ponderar la contribución de cada

variable en la intensidad de la enfermedad, se utilizó un Análisis de

Componentes Principales (ACP).

En la tabla XVIII se presenta la matriz de correlaciones entre todas las

variables foliares registradas.


131

Tabla XVIII: Correlación de Pearson entre las variables foliares evaluadas en este trabajo Espesor Hoja Esp.Par.Emp Esp.Epid.ABA DE PLI 0.0 ABA DE PLI 10.0 ABA Long.Est.ABA Área CEI ABA Esp. Cutic. ABA Alcanos Esp.Epid.ADA Esp.Par.Lagun. Esp. Intercel DE PLI 0.0 ABA DE PLI10.0 ADA Long.Est.ADA Área CEI ADA Esp. Cutic. ADA

Esp.hoja 1.00 Esp.Epid.ADA 0.99 1.00 Esp.P.Emp 0.92 0.96 1.00 Esp.P.Lag. 0.98 0.99 0.96 1.00 Esp.Epid.ABA 0.88 0.88 0.89 0.82 1.00 Esp.Inter. 0.78 0.85 0.93 0.89 0.69 1.00 DE PLI 0.0 ADA -0.93 -0.95 -0.91 -0.98 -0.69 -0.90 1.00 DE PLI 0.0 ADA -0.75 -0.82 -0.89 -0.88 -0.59 -0.99 0.91 1.00 DE 10.0 ABA -0.94 -0.97 -0.99 -0.98 -0.84 -0.95 0.96 0.92 1.00 DE 10.0 ADA 0.04 0.16 0.42 0.20 0.25 0.59 -0.18 -0.54 -0.37 1.00 Log. Est. ABA -0.51 -0.47 -0.48 -0.36 -0.82 -0.18 0.17 0.04 0.38 -0.06 1.00 Log. Est. ADA -0.90 -0.94 -1.00 -0.94 -0.91 -0.92 0.87 0.87 0.98 -0.46 0.53 1.00 Área CEI ABA 0.87 0.92 0.99 0.91 0.90 0.93 -0.84 -0.87 -0.96 0.52 -0.53 -1.00 1.00 Área CEI ADA 0.95 0.98 1.00 0.96 0.93 0.90 -0.90 -0.84 -0.98 0.35 -0.54 -0.99 0.98 1.00 Cut. ABA 0.98 1.00 0.98 0.99 0.88 0.88 -0.95 -0.85 -0.98 0.21 -0.47 -0.96 0.94 0.99 1.00 Cut. ADA 0.97 0.99 0.99 0.97 0.92 0.88 -0.91 -0.83 -0.98 0.29 -0.54 -0.98 0.97 0.97 0.99 1.00 Alcanos 0.69 0.77 0.91 0.77 0.78 0.93 -0.72 -0.86 -0.87 0.75 -0.42 -0.93 0.96 0.88 0.80 0.85 1.00 Las variables resaltadas son las seleccionadas para el ACM. Los coeficientes entre paréntesis indican que la variable seleccionada en una entrada ofrece información de la variable correspondiente en la otra entrada.


132

Como se puede observar, algunos parámetros resultaron estar fuertemente

correlacionados y por lo tanto, aportaron información redundante. Por ejemplo,

se registraron cinco variables referidas al espesor de los estratos celulares pero

sólo se seleccionó el “espesor de la hoja” para el ACP. Del mismo modo no

fueron considerados otros parámetros como las ACEI por su estrecha relación

con la DCEI.

En la Tabla XIX se presentan todos los CP y la variabilidad explicada por cada

uno de ellos. Se seleccionaron los dos primeros componentes porque entre

ambos explican el 91 % de la variabilidad y permiten analizar en un plano las

posibles interacciones existentes entre los puntos-variables y los puntos-

individuos (clones).

Tabla XIX: Autovalores. Proporción de la variabilidad explicada por cada componente principal.

Componente Principal

Valor Proporción Proporción acumulada

1 8.53 0.78 0.78

2 1.43 0.13 0.91

3 1.04 0.09 1.00

4 0.00 0.00 1.00

5 0.00 0.00 1.00

6 0.00 0.00 1.00

7 0.00 0.00 1.00

8 0.00 0.00 1.00

9 0.00 0.00 1.00

10 0.00 0.00 1.00

11 0.00 0.00 1.00

Las celdas sobreadas indican los componentes seleccionados y sus valores.

En la Tabla XX se presentan los autovectores (e1 y e2) y los coeficientes con

que cada variable original fue ponderada para conformar los CP1 y CP2.


133

Tabla XX. Contribución relativa de cada variable original en la construcción de cada componente principal (autovectores).

Variables e1 e2

Espesor hoja -0.31 -0.33

Esp. Intercel. -0.33 0.22

DE PLI 0.0 ABA 0.32 0.09

DE PLI 0.0 ADA 0.32 - 0.25

DE PLI 10.0 ABA 0.34 0.05

DE PLI 10.0 ADA -0.15 0.67

Long. Est. ABA 0.14 0.44

Long.Est. ADA 0.34 0.03

Espesor Cut.ABA -0.33 -0.19

Espesor Cut.ADA -0.34 -0.16

Contenido de n-alcanos -0.31 0.25

En el CP1 las variables “espesor de la hoja, espacio intercelular, espesor de las

cutículas adaxial y abaxial, y el contenido de n-alcanos” recibieron los pesos

negativos más altos, y las variables DE en PLI 0.0 adaxial y abaxial, DE en PLI

10.0 abaxial y la longitud de los estomas adaxiales recibieron los pesos

positivos más altos. Con un signo o con el otro, resultaron ser las variables más

influyentes. Estas variables, representadas en la figura 94, permiten interpretar

que el CP1 (explica el 77% de la variación) separa estadísticamente a los

clones Conti 12 y ´Ballestra` de Í 214` e Í 488` en sectores opuestos del

gráfico. Los vectores que se ubicaron hacia la izquierda del cruce de los

componentes establecieron una correlación negativa o inversa con la Ih, y los

que se proyectaron hacia la derecha, una correlación positiva o directa.

Estos resultados permiten fundamentar la tolerancia de Ćonti 12` y ´Ballestra`,

en un conjunto de características: hojas más anchas, parénquimas en

empalizada más laxos, cutículas más espesas con mayor contenido de n-

alcanos, menores DE y estomas de menor tamaño. Por otro lado, Í 214` e Í

488`, que son susceptibles, tienen hojas más delgadas, parénquimas en

empalizada más compactos, cutículas más finas con menor contenido de n-


134

alcanos, mayores DE iniciales (hojas jóvenes) tanto en las epidermis adaxiales

como abaxiales, altas DE abaxiales en las hojas adultas y estomas adaxiales

de gran tamaño.

En la Tabla XXI se puede observar que todas las variables originales

estuvieron fuertemente relacionadas con el CP1.

Tabla XXI. Coeficientes de correlación entre las variables originales y los componentes principales.

Variables CP1 CP2

Espesor hoja -0.91 -0.39

Esp. Intercel. -0.96 0.27

DE PLI 0.0 ABA 0.93 0.10

DE PLI 0.0 ADA 0.92 - 0.30

DE PLI 10.0 ABA 0.99 0.06

DE PLI 10.0 ADA -0.44 0.80

Long. Est. ABA 0.42 0.53

Long.Est. ADA 0.99 0.03

Espesor Cut.ABA -0.98 -0.19

Espesor Cut.ADA -0.97 -0.22


Ćonti 12` se diferenció de ´Ballestra` por poseer un mayor indicador de

espacio intercelular, un mayor contenido de n-alcanos y una mayor DE adaxial

en PLI 10.0, ubicándose junto con estas variables en el sector positivo del CP2.

´Ballestra`, con un mayor espesor de sus hojas y de sus cutículas, se agrupa

con estas variables en el sector negativo del CP2. A su vez, Í 488` se

diferenció de Í 214` por presentar una mayor DE adaxial en PLI 0.0

ubicándose muy próxima a esta variable en relación al CP2.

Las variables originales que presentaron una baja correlación con este último

componente (Tabla XXI), no tendrían un aporte significativo en la magnitud de

la Ih.


135

-5.00 -2.50 0.00 2.50 5.00

CP 1 (77.6%)

-5.00

-2.50

0.00

2.50

5.00

CP

2 (

13

.0%

)

Ballestra:27.45

Conti 12:25.15

I 214:47.15

I 488:50.05

Espesor hoja

Esp. Intercel.

DE 0.0 ABA

DE 0.0 ADA

DE PLI 10.0 ABA

DE PLI 10.0 ADA

Long. Est. ABA

Long.Est. ADA

Cut. adaxiales

Cut. abaxiales

Alcanos

Ballestra:27.45

Conti 12:25.15

I 214:47.15

I 488:50.05

Espesor hoja

Esp. Intercel.

DE 0.0 ABA

DE 0.0 ADA

DE PLI 10.0 ABA

DE PLI 10.0 ADA

Long. Est. ABA

Long.Est. ADA

Cut. adaxiales

Cut. abaxiales

Alcanos

Fig. 94. Gráfico Biplot de las características foliares representadas como puntos-variables y los clones representados como puntos-individuos.


136

3.4.2. Intensidad de la enfermedad en tallos (It) vs. las características del tallo. En la Tabla XXII se presenta una sinopsis de todas las evaluaciones

realizadas en los tallos y sus categorización según TCMD, en los cuatro clones

estudiados.

Tabla XXII. Relaciones y correlaciones de la It de los clones con las características anatómicas de los tallos.

Dentro de cada fila, las celdas con letras distintas, representan diferencias significativas según el TCMD. El sombreado de las celdas destaca las variables que correlacionan significativamente con la It Las variables que se incorporaron al análisis fueron: “espesor del felema”, “área

de las lenticelas”, “área total de lenticelas” y “espesor de la corteza” por

registrar coeficientes de Pearson superiores a |0,80|.

La correlación entre el espesor del felema y la It fue de r = – 0,99 (p = 0,0057),

indicando una fuerte relación inversa entre ambas variables. Esto indica que los

clones tolerante desarrollan felemas más gruesos que los susceptibles, en

coincidencia con los resultados de Weiland y Stanosz (2007).

Clones Conti 12 Ballestra I 214 I 488 r p

Nivel de Inten-sidad en tallo

b c a a

Espesor del fe-lema

b a d c -0,99 0,0057

Densidad de lenticelas

b b b a 0,36 0,6424

Largo de las lenticelas

b b a b 0,76 0,244

Ancho de las lenticelas

b b b a 0,38 0,6199

Área de lenti-celas

b c a a 0,93 0,051

Área total de lenticelas

c d b a 0,87 0,0383

Ancho interno de lenticelas

a b a a 0,76 0,2362

Profundidad de lenticela

b c a ab 0,76 0,2411

Espesor de la corteza

ab b a a 0,84 0,0593


137

El área promedio de lenticelas mostró una fuerte correlación directa con la It (r

= 0,93, p = 0,051), lo mismo que el área total de lenticelas (r = 0,87, p = 0,038).

O sea, aquellos tallos con mayor superficie lenticelar, en forma individual o en

conjunto, poseen una mayor vulnerabilidad frente a la enfermedad.

Al analizar el espesor de la corteza, se obtuvo un valor alto del coeficiente de

Pearson (0,84, p = 0,059). Es decir, en las cortezas más gruesas, con una

proporción mayor de parénquima, los cancros se forman con mayor facilidad o

rapidez.

Por lo expuesto, las diferencias que se registraron en la It, entre los clones

estudiados, podrían ser atribuidas a variaciones en algunas características

histológicas que, en conjunto, determinan el comportamiento frente al

patógeno. Por ello, se aplicó el ACP, y la selección de las variables que

participaron se realizó en función de los coeficientes de Person que figuran en

la Tabla XXIII.

Tabla XXIII: Correlaciones entre las variables caulinares evaluadas en este trabajo. Esp. Felema Den.Len. Área Len. ÁreaTot.Lent. Esp. Corteza Esp. felema 1.00

Den. Lentic. -0.44 1.00

Área Lentic. -0.95 0.32 1.00

ÁreaTot.Lent. -0.92 0.71 0.90 1.00

Esp. Corteza -0.89 0.57 0.95 0.97 1.00

Aunque algunas variables seleccionadas resultaron correlacionadas, se las

incluyó en el ACP para determinar cuál es su participación en la variabilidad

total.

En la Tabla XXIV se presentan todos los CP calculados para el número de

variables originales seleccionadas y la variabilidad explicada por cada uno de

ellos.


138

Tabla XXIV. Autovalores. Proporción de la variabilidad explicada por cada componente principal.

Las celdas sombreadas indican los componentes seleccionados y sus valores.

Nuevamente se decidió trabajar con los dos primeros CP pues en conjunto

explican el 98 % de la variabilidad total.

En la Tabla XXV se presentan las correlaciones entre las variables originales y

los CP seleccionados.

Tabla XXV. Coeficientes de correlación entre las variables originales y los componentes principales.

Variables CP 1 CP 2

Espesor felema -0.94 0.22

Densidad de lenticelas 0.63 0.80

Área lenticelar 0.94 -0.35

Área total lenticelar 0.98 0.10

Espesor cortical 0.98 -0.06

Se puede observar que en el CP1 el Espesor del Felema fue la única variable

que recibió un peso negativo elevado. El resto de las variables obtuvieron

pesos similares pero positivos. El aporte de la Densidad de las Lenticelas en

este componente fue positivo pero de menor peso, sin embargo, fue la única

variable con peso significativo en el CP2.

Estas variables están representadas en la figura 95 donde se observa que el

CP1 (explica el 82 % de la variación) separa a Ćonti 12` y ´Ballestra` de Í 214`

e Í 488` ubicándolos en sectores opuestos del gráfico biplot.

Componentes Principales

Valor Proporción Proporción Acumulada

1 4.12 0.82 0.82

2 0.78 0.16 0.98

3 0.10 0.02 1.00

4 0.00 0.00 1.00

5 0.00 0.00 1.00


139

-5.00 -2.50 0.00 2.50 5.00

CP 1 (82.4%)

-5.00

-2.50

0.00

2.50

5.00

CP

2 (

15.6

%)

Ballestra:9.09

Conti 12:17.27

I 214:63.64

I 488:54.55Espesor felema

Den Lentic.

Área Lentic.

Área Tot. Lent.

Espesor Corteza

Ballestra:9.09

Conti 12:17.27

I 214:63.64

I 488:54.55Espesor felema

Den Lentic.

Área Lentic.

Área Tot. Lent.

Espesor Corteza

Figura 95. Gráfico Biplot de las características caulinares representadas como puntos-variables y los clones representados como puntos-individuos.


140

El espesor del felema fue marcadamente superior en Ćonti 12` y ´Ballestra`,

mientras que Í 214` e Í 488` se caracterizaron por tener mayor densidad de

lenticelas, mayor área promedio de lenticelas y una corteza más ancha.

El CP2, que explica el 16 % de la variación, está determinado por variables que

no separan a Ćonti 12` y a ´Ballestra`, pero si diferencian a Í 214` de Í 488`.

El primero posee una mayor área promedio de lenticelas y el segundo, una

mayor densidad de lenticelas.

Ćonti 12` es el clon menos afectado por las variables consideradas pues está

ubicado muy próximo a la intersección de los CP.

3.5. Análisis del impacto que produce la enfermedad en el valle inferior del río Negro y en la región del Comahue.

Durante el primer recorrido a través de los valles irrigados de los ríos Negro y

Neuquén, realizado en el 2005, se entrevistaron técnicos pertenecientes a las

siguientes instituciones: Ente de Desarrollo de General Conesa, Vivero de

Salicáceas de la Dirección de Bosques de la Pcia. de Río Negro en Gral.

Conesa, la Agencia de Extensión de INTA de Choele Choel y Estación

Experimental INTA Alto Valle. En el segundo viaje realizado en marzo del 2008,

se amplió el recorrido abarcando parte de la zona andina y de la zona este de

la meseta rionegrina (Valcheta). En esta oportunidad se visitaron algunos

establecimientos particulares con álamos implantados en macizos a escala

comercial, y se evaluaron alamedas ubicadas en cascos de estancias y en las

zonas periurbanas de las localidades más importantes. Con la información

recabada, más el aporte de productores del IDEVI (Valle Inferior) y de Colonia

Frías (General Conesa) se elaboró el siguiente informe.

En la región del Comahue se calcula que hay aproximadamente 17.500 has

forestadas con Salicáceas, casi en su totalidad con álamos. El 80 % de estas


141

plantaciones están dispuestas como cortinas rompeviento y sólo un 20% son

macizos (García, 2002).

Las cortinas rompeviento se forman plantando los álamos a ambos lados de las

acequias y reciben agua cada vez que se riegan los cultivos linderos. O sea, la

frecuencia de riego depende de la orientación productiva de la parcela, si es

hortícola, frutícola o ganadera (Fig. 96). Por lo tanto, en algunos casos el

aporte de agua es adecuado, en otros es escaso o excesivo.

Fig. 96. Vista panorámica de un establecimiento ubicado en el VIRN con parcelas hortícolas rodeadas por doble hilera de álamos enmarcando las acequias.

Si bien las cortinas no son el objetivo productivo de las explotaciones, cuando

estas alcanzan el desarrollo óptimo para el corte, la venta de la madera

representa un ingreso puntual importante para los productores. El principal

destino es el tableado para la industria maderera. Sin embargo, si las lesiones

producidas por S. musiva interrumpen la longitud comercial de los fustes y esos

árboles pierden valor comercial (Fig. 97). Además, como los árboles se

quiebran a la altura de los cancros más desarrollados, se forman aberturas en

la cortina, por lo que esta pierde su eficiencia en morigerar el efecto de los


142

vientos. Los individuos quebrados generalmente no son reemplazados por

ejemplares nuevos, sino que son cortados por la base y se los deja rebrotar a

partir de las ramificaciones con mayor dominancia apical. Esto significa que si

en el tocón queda inóculo, perduran los materiales enfermos.

Fig. 97. Cortina rompeviento con fustes quebrados a la altura de los cancros producidos por S.musiva en el VIRN.


143

Se ha observado que por ser un cultivo de apoyo a otras producciones, las

alamedas inspeccionadas no siempre han recibido un manejo sanitario

adecuado por lo que suelen ser atacados por taladrillos, pulgones y fumaginas,

además de ser afectados por la Cancrosis y la Roya.

Las plantaciones en macizo se realizaron a partir de la implementación de

mecanismos promocionales a nivel nacional, como por ejemplo los créditos

IFONA, los que estaban dirigidos a lograr una producción maderera que

abasteciera las industrias celulósico-papelera y de aserrío. Esta última estaba

destinada fundamentalmente a la fabricación de envases para las producciones

frutihortícolas. Sin embargo, los bajos precios que se percibieron por la

madera, los largos turnos de corte (superiores a 13 años), y los problemas

sanitarios que se fueron manifestando, condujeron a que la mayoría de las

explotaciones fueran abandonadas o levantadas, y reemplazadas por otros

cultivos.

Actualmente, con la reconsideración de la madera blanda en las modalidades

de packaging, se han establecido algunas industrias que producen debobinado,

tableros multilaminados, cajones para frutas y hortalizas, bins para jugo, entre

otros destinos. Esto condujo a la reaparición de establecimientos dedicados al

cultivo de álamos.

En el valle inferior del río Negro y en el valle de General Conesa los genotipos

más utilizados, tanto en cortinas como en macizos, son clones P. nigra (cv.

itálica o “criollo” y el cv. thayssiana o “chileno”) e híbridos de P. xcanadensis,

principalmente Í 154`, Í 214`, Ćonti 12` e Í 488`. En estas localidades el

principal problema sanitario es la Cancrosis del Álamo y los informantes

calificados consideran a Ćonti 12` como un híbrido tolerante y, tanto Í 214`

como Í 488`, como susceptibles (Fig. 98, 99, 100 y 101).


144

Fig. 98. Alameda del clon ´Conti 12` dispuesta en macizo implantada en el valle de General Conesa.


145

Fig. 99. Alameda del clon ´Conti 12` dispuesta en macizo implantada en el VIRN.


146

Fig. 100. Alameda del clon ´I 214` dispuesta en macizo implantada en el VIRN.

Fig. 101. Alameda del clon ´I 488` dispuesta en macizo implantada en el valle de General Conesa.


147

En el valle medio del río Negro que abarca desde la localidad de Pomona hasta

Choele Choel, además del fraccionamiento parcelario determinado por las

cortinas, en los últimos años, las industrias madereras han realizado

plantaciones en macizo, generando explotaciones silvopastoriles para

autoabastecer su demanda de materia prima. Los genotipos más difundidos

son Ćonti 12`, Í 214`, Í 488`, Í 262` y ´Guardi` (considerado susceptible a S.

musiva). Si bien los técnicos y productores consultados acordaron que la

Cancrosis del Álamo es una enfermedad endémica que afecta

fundamentalmente al follaje (en esa región), consideran que los principales

problemas sanitarios lo representan la Roya (Melampsora sp.) que se presenta

entre fines de enero y principios de febrero, más tempranamente que en el

Valle Inferior, los pulgones y el Taladrillo (Platypus mutatus). Los ataques

intensos de dicha enfermedad producen una defoliación prematura que reduce

la tasa de crecimiento, y las plagas ocasionan mermas en el crecimiento, el

quiebre de árboles debilitados, disminución de calidad en la madera y el

desarrollo de patógenos secundarios como las fumaginas (Davel et al., 2008).

El alto valle del río Negro y el valle inferior del río Neuquén representan una

economía regional homogénea destinada fundamentalmente a la fruticultura y

viticultura donde los álamos cumplen la función fundamental de proteger el

desarrollo de estos cultivos de los fuertes y frecuentes vientos patagónicos. Los

genotipos más utilizados son P. nigra (Ćriollo` o Ćhileno`) aunque en las

últimas décadas se lo ha ido reemplazando por Í 214` y ´Guardi`. Sin embargo,

pese a que estos clones son considerados susceptibles a la Cancrosis, los

intentos de aislamiento a partir de material foliar, con síntomas semejantes a

los descriptos para esta enfermedad (aunque mucho menos frecuentes),

fracasaron en su totalidad.

En la zona andina, así como en la zona este de la meseta rionegrina, la

frecuencia del cultivo de álamos disminuye considerablemente y, en términos

generales, son de origen y genotipo desconocido. Por la morfología de sus

hojas y el porte de sus tallos, se pudo inferir un predominio de álamo criollo.

Como en el caso anterior, los intentos de aislamiento de S. musiva no fueron


148

exitosos y la información recogida no consideraba la presencia de Cancrosis en

las plantaciones.

Resumiendo, dado que los genotipos más difundidos en la región del Comahue

son ´Conti 12` (tolerante) e ´I 214` (susceptible), se puede inferir que la

enfermedad se presenta como endémica en el VIRN y en el Valle de General

Conesa. Si bien el Valle del Río Colorado (perteneciente a la Pcia de Río

Negro), no fue incluido en los itinerarios realizados, informantes calificados

(Agencia de Extensión de INTA), confirmaron la presencia de la enfermedad en

la zona, otorgándole una importancia considerable en la producción de madera.

Con los datos registrados se puede informar que la enfermedad está localizada

en el VIRN, en Gral. Conesa y en Río Colorado con algunos focos intermitentes

en las localidades del Valle Medio (Fig. 102). Esta distribución es semejante a

la registrada para Venturia inaequalis (Sarna del Manzano), un patógeno muy

próximo filogenéticamente de S. musiva, con un ciclo de vida y requerimientos

climáticos semejantes.

Fig. 101. Mapa de la región del Comahue donde se destacan las localidades en las que se confirmó la presencia de S. musiva en ejemplares del género Populus.

Gral. Conesa

Río Colorado

Región del

Comahue

Valcheta

149

4- CONCLUSIONES.

En este trabajo se ha demostrado que la hipótesis planteada es verdadera:

“Parte de la variabilidad observada en el comportamiento de los distintos clones

de álamo frente a la incidencia de Septoria musiva se debe a a algunas

propiedades anatómicas y fisiológicas de los órganos susceptibles que

condicionan la interacción hospedante – patógeno. Constituyen mecanismos de

defensa pasiva, pre-existentes a la llegada del patógeno que pueden inhibir o

disminuir la entrada y/o colonización de los órganos susceptibles”.

Primero fue necesario demostrar que los clones considerados susceptibles y

tolerantes en función de la información recabada y las observaciones

preliminares realizadas, realmente presentaban dicho comportamiento, en la

zona estudiada. Hoy se puede aseverar que ´Ballestra` y Ćonti 12` se

comportan como tolerantes al patógeno mientras que Í 214` e Í 488` como

susceptibles, en las localidades de la región del Comahue donde está presente

la enfermedad.

Con respecto a la intensidad de los síntomas foliares, las diferencias se

manifiestan desde los estadíos más tempranos de desarrollo foliar y se

acentúan con el avance de la temporada. En el caso de los síntomas en

madera, la comparación se realizó sobre ejemplares adultos y por lo tanto, las

diferencias registradas son producto de la actividad acumulativa del patógeno

sobre los hospedantes.

Se ha determinado que el ciclo del teleomorfo de S. musiva producido en la

hojarasca de los clones susceptibles es potencialmente más abundante

(ascomas de mayor tamaño) y es más breve que el producido en los clones

tolerantes. Las ascosporas formadas en las hojas caídas de Í 214` están en

condiciones de ser liberadas (maduras) entre 30 a 45 días antes que las

formadas en Ćonti 12`. O sea, existe una marcada diferencia en el ritmo

ontogénico según se desarrolle en un clon susceptible o un clon tolerante.

150

Los contrastes anatómicos entre los clones susceptibles y tolerantes

corresponden a diferencias en las magnitudes de algunas estructuras

somáticas las que facilitan o dificultan la colonización de los tejidos, según el

caso.

Lo clones tolerantes tienen, con respecto a los susceptibles, mayores

espesores de las láminas foliares, mesófilos más laxos (mayores espacios

intercelulares), menores densidades estómaticas abaxiales durante todo el

desarrollo de la lámina, y menores densidades estomáticas adaxiales en las

primeras etapas de la expansión foliar, período de maduración de los estomas

más prolongado, cutículas más gruesas, con mayores cantidades de n-alcanos

en su composición. Además los microrelieve formados por los complejos

cuticulares son más atenuados. Estos factores constitutivos, que se desarrollan

como resultado de un proceso adaptativo ambiental, y que se dan,

independientemente de la presencia del patógeno, constituyen un mecanismo

de defensa “pre-existente”. Las consecuencias de las diferencias mencionadas

consisten en menores posibilidades de producir infecciones foliares exitosas en

los clones tolerantes.

Entre las variaciones registradas en la anatomía caulinar, el felema y las áreas

lenticelares por unidad de superficie son determinantes para que los

propágulos del patógeno ingresen al tallo.

Considerando los tipos de resistencia mencionados en la introducción, se está

en condiciones de comunicar que los clones tolerantes poseen ciertos

mecanismos de resistencia a la infección (evasión) pues cuando se produce la

liberación masiva de las ascosporas en primavera, poseen un alto porcentaje

de estomas inmaduros (puntos de ingreso a los mesófilos) de modo que, al no

estar receptivos, el éxito de las infecciones es menor. También despliegan

resistencia a la penetración por las características estructurales descriptas, y

resistencia al desarrollo por las reacciones que se suscitan en los tejidos,

dificultado el progreso del hongo.

151

La observación y comprensión de los mecanismos naturales con que las

plantas resistentes dan respuesta al ataque de patógenos, permite producir

plantas con mayores niveles de resistencia, sin que sea necesario hacer uso de

genes foráneos y deberían ser tenidos en cuenta en los programas de

mejoramiento genético.

Además, se pueden implementar pautas de manejo del cultivo que contribuyan

a disminuir las probabilidades de las infecciones. En el caso de montes

macizos, donde la hojarasca que se produce es muy abundante y queda

retenida en el lugar, hay que podar los ejemplares desde los primeros años

para intentar alejar precozmente al follaje del año, de la expulsión de las

ascosporas desde el suelo. En el caso de las cortinas rompeviento, los árboles

quebrados deben reemplazar por ejemplares nuevos para evitar que los los

rebrotes de los tocones funcionen como fuente de inóculo de S. musiva.

152

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Anexo Estadístico

172

Análisis estadísticos referidos a la Intensidad de la Enfermedad. Intensidad en hoja Variable N R² R² Aj CV

Ordenada al origen de Ih 12 1.00 1.00 4.16

(Ih 2002/2003) Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 0.73 3 0.24 1305.02 <0.0001

Clones 0.73 3 0.24 1305.02 <0.0001

Error 1.5E-03 8 1.9E-04

Total 0.74 11

Test: Duncan Alfa=0.05 Error: 0.0002 gl: 8

Clones Medias n E.E.

Ballestra 0.05 3 0.01 A

Conti 12 0.21 3 0.01 B

I 214 0.35 3 0.01 C

I 488 0.72 3 0.01 D Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.05)

Variable N R² R² Aj CV

Ordenada al origen de Ih 12 1.00 1.00 18.54


Modelo. 7.09 3 2.36 981.90 <0.0001

Clones 7.09 3 2.36 981.90 <0.0001

Error 0.02 8 2.4E-03

Total 7.11 11


Clones Medias E.E.

Ballestra -1.02 3 0.03 A

Conti 12 0.37 3 0.03 B

I 488 0.81 3 0.03 C

I 214 0.90 3 0.03 C

173

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Pendiente de la recta Ih 12 0.97 0.95 3.61


Modelo. 1.9E-04 3 6.3E-05 76.24 <0.0001

Clones 1.9E-04 3 6.3E-05 76.24 <0.0001

Error 6.7E-06 8 8.3E-07

Total 2.0E-04 11



Conti 12 0.02 3 5.3E-04 A

Ballestra 0.02 3 5.3E-04 A

I 214 0.02 3 5.3E-04 A

I 488 0.03 3 5.3E-04 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Pendiente de la recta Ih 12 0.75 0.66 10.06


Modelo. 1.3E-04 3 4.3E-05 8.14 0.0082

Clones 1.3E-04 3 4.3E-05 8.14 0.0082

Error 4.2E-05 8 5.3E-06

Total 1.7E-04 11



Ballestra 0.03 3 1.3E-03 A

I 488 0.02 3 1.3E-03 AB

I 214 0.02 3 1.3E-03 AB

Conti 12 0.02 3 1.3E-03 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)

174

Prueba T para las Ih iniciales en 2002/2003 y 2003/2004 Variable: Conti 12 - Clasific:Columna1 - prueba:Bilateral

Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.21 0.37

pHomVar 0.6154

T -7.66

p-valor 0.0016

Variable: Ballestra - Clasific:Columna1 - prueba:Bilateral

Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.05 -0.99

pHomVar 0.4000

T 80.02

p-valor <0.0001

Variable: I 214 - Clasific:Columna1 - prueba:Bilateral

Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.35 0.90

pHomVar 0.8437

T -20.60

p-valor <0.0001


Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.72 0.81

pHomVar 0.615

T -4.66

p-valor 0.0096

175

Prueba T para las tasas de incremento de Ih en 2002/2003 y 2003/2004 Variable: Conti 12 - Clasific:Columna1 - prueba:Bilateral

Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.02 0.02

pHomVar 0.8389

T 1.91

p-valor 0.1282 Variable: Ballestra - Clasific:Columna1 - prueba:Bilateral

Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.02 0.03

pHomVar 0.6154

T -2.26

p-valor 0.0087


Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.02 0.02

pHomVar 0.4164

T 1.63

p-valor 0.1777


Grupo 1 Grupo 2

2002/2003 2003/2004

n 4 4

Media 0.03 0.02

pHomVar >0.9999

T 5.94

p-valor 0.0040

176

Correlación de Pearson (Ih inicial vs.Ih final)

Variable(1) Variable(2) n Pearson p-valor

Ih inicial Ih inicial 8 1.00 <0.0001

Ih inicial Ih final 8 0.75 0.0314

Intensidad en Tallo Variable N R² R² Aj CV

Intensidad en Tallos adultos 12 0.96 0.94 16.78

Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III) F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 6495.07 3 2165.02 58.57 <0.0001

Clones 6495.07 3 2165.02 58.57 <0.0001

Error 295.73 8 36.97

Total 6790.80 11



I 214 63.64 4 3.51 A

I 488 54.55 4 3.51 A

Conti 12 17.45 4 3.51 B

Ballestra 9.30 4 3.51 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.05)


Intensidad en tallos jóvenes 12 0.99 0.98 10.04


Modelo. 9.607.34 2 4803.67 294.10 <0.0001

Clones 9.607.34 2 4803.67 294.10 <0.0001

Error 65.32 4 16.33

Total 9.672.66 6



I 214 73.00 3 2.02 A

I 488 65.00 3 2.02 A

177

Conti 12 23.00 3 2.02 B

Ballestra 0.00 3 2.02 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Largo del cancro 12 0.91 0.89 25.40


Modelo. 1698.00 2 849.00 41.75 <0.0001

Clones 1698.00 2 849.00 41.75 <0.0001

Error 81.32 4 20.33

Total 1779.32 6



I 214 32.00 4 2.25 A

I 488 27.00 4 2.25 A

Conti 12 12.00 4 2.25 B

Ballestra 0.00 4 2.25 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)

Correlación de Pearson (It adultos vs. It jóvenes)

Variable(1) Variable(2) n Pearson p-valor

It adultos It adultos 3 1.00 <0.0001

It adultos It jóvenes 3 0.99 0.0087

Análisis estadísticos referidos a los aspectos morfológicos y anatómicos de las hojas.


Área foliar 16 0.68 0.60 8.04


Modelo. 374.90 3 124.97 8.39 0.0028

Clones 374.90 3 124.97 8.39 0.0028

Error 178.75 12 14.90

178

Total 553.65 15



I 488 54.62 4 1.93 A

Ballestra 49.19 4 1.93 A B

I 214 47.21 4 1.93 A B

Conti 12 41.08 4 1.93 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Espesor de la hoja 16 0.80 0.75 10.76


Modelo. 29331.08 3 9777.03 16.30 0.0002

Clones 29331.08 3 9777.03 16.30 0.0002

Error 7200.00 12 600.00

Total 36531.08 15



Bellestra 289.10 4 12.25 A

Conti 12 245.00 4 12.25 B

I 488 198.00 4 12.25 C

I 214 178.90 4 12.25 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.05)


Espesor epid. adaxial 16 0.77 0.71 19.85


Modelo. 299.76 3 99.92 13.32 0.0004

Clones 299.76 3 99.92 13.32 0.0004

Error 90.00 12 7.50

Total 389.76 15



179

Bellestra 19.60 4 1.37 A

Conti 12 16.30 4 1.37 A

I 488 10.20 4 1.37 B

I 214 9.10 4 1.37 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Espesor paren. empalizada 16 0.94 0.93 7.52


Modelo. 6464.91 3 2154.97 62.77 <0.0001

Clones 6464.91 3 2154.97 62.77 <0.0001

Error 412.00 12 34.33

Total 6876.91 15



Conti 12 98.00 4 2.93 A


I 488 59.30 4 2.93 B



Espesor paren. lagunoso 16 0.96 0.95 4.19


Modelo. 4264.11 3 1421.37 103.69 <0.0001

Clones 4264.11 3 1421.37 103.69 <0.0001

Error 164.50 12 13.71

Total 4428.61 15




Conti 12 98.00 4 1.85 B

I 214 73.50 4 1.85 C

I 488 71.90 4 1.85 C

180

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


Espesor epid. abaxial 16 0.50 0.38 18.40


Modelo 47.52 3 15.84 4.01 0.0343

Clones 47.52 3 15.84 4.01 0.0343

Error 47.38 12 3.95

Total 94.90 15



Conti 12 12.30 4 0.99 A


I 488 10.50 4 0.99 A B



Indicador del espac. inter.. 16 0.98 0.98 15.57


Modelo. 2.23 3 0.74 212.80 <0.0001

Clones 2.23 3 0.74 212.80 <0.0001

Error 0.04 12 3.5E-03

Total 2.28 15



Conti 12 0.74 4 0.03 A


I 214 0.19 4 0.03 B

I 488 -0.14 4 0.03 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


DE abaxail (PLI 0.0) 16 0.72 0.65 13.08

181


Modelo. 4528.00 3 1509.33 10.20 0.0013

Clones 4528.00 3 1509.33 10.20 0.0013

Error 1776.00 12 148.00

Total 6304.00 15



I 488 112.00 4 6.08 A

I 214 104.00 4 6.08 A

Conti 12 88.00 4 6.08 AB

Bellestra 68.00 4 6.08 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


DE abaxail (PLI 10.0) 16 0.76 0.70 10.55


Modelo. 13018.75 3 4339.58 12.65 0.0005

Clones 13018.75 3 4339.58 12.65 0.0005

Error 4117.00 12 343.08

Total 17135.75 15



I 488 205.50 4 9.26 A

I 214 202.00 4 9.26 A

Conti 12 154.00 4 9.26 B

Bellestra 141.00 4 9.26 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


DCEI abaxail (PLI 10.0) 16 0.91 0.89 4.30


182

Modelo. 1248552.75 3 416184.25 41.45 <0.0001

Clones 1248552.75 3 416184.25 41.45 <0.0001

Error 120499.00 12 10041.58

Total 1369051.75 15



I 214 2654.50 4 50.10 A

I 488 2556.00 4 50.10 A

Bellestra 2112.00 4 50.10 B

Conti 12 2001.00 4 50.10 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


DCEI adaxail (PLI 10.0) 16 0.90 0.87 4.05


Modelo. 564275.00 3 188091.67 35.22 <0.0001

Clones 564275.00 3 188091.67 35.22 <0.0001

Error 64082.00 12 5340.17

Total 628357.00 15



I 488 2121.00 4 36.54 A

Conti 12 1745.00 4 36.54 B

Bellestra 1728.00 4 36.54 B



Espesor Cutículas abaxiales 16 0.95 0.94 9.17


Modelo. 4.01 3 1.34 79.19 <0.0001

Clones 4.01 3 1.34 79.19 <0.0001

Error 0.20 12 0.02

Total 4.22 15

183




Conti 12 1.75 4 0.07 B

I 488 0.98 4 0.07 C



Espesor Cutículas adaxiales 16 0.95 0.94 9.12


Modelo. 8.99 3 3.00 84.82 <0.0001

Clones 8.99 3 3.00 84.82 <0.0001

Error 0.42 12 0.04

Total 9.41 15




Conti 12 2.68 4 0.09 A

I 488 1.47 4 0.09 B


Análisis estadísticos referidos a los aspectos morfológicos y anatómicos de los tallos.


Espesor de Felema 16 1.00 0.99 1.30

Cuadro de Análisis de la Varianza F.V. SC gl CM F p-valor

Modelo. 1735.17 3 578.39 839.44 <0.0001

Clones 1735.17 3 578.39 839.44 <0.0001

Error 8.27 12 0.69

184

Total 1743.43 15

Test:Duncan Alfa=0.05 Error: 0.6890 gl: 12



Conti 12 71.05 4 0.42 B

I 488 54.50 4 0.42 C

I 214 52.68 4 0.42 D Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.05)


N° estratos del felema 16 0.94 0.92 4.94


Modelo. 2.43 3 0.81 58.91 <0.0001

Clones 2.43 3 0.81 58.91 <0.0001

Error 0.17 12 0.01

Total 2.60 15




Conti 12 2.40 4 0.06 B

I 488 2.10 4 0.06 C



Espesor de cada estrato del felema 16 0.53 0.41 6.44


Modelo. 40.37 3 13.46 4.49 0.0248

Clones 40.37 3 13.46 4.49 0.0248

Error 36.00 12 3.00

Total 76.37 15


185


Conti 12 29.60 4 0.87 A

I 214 26.34 4 0.87 A

I 488 25.95 4 0.87 A

Ballestra 25.64 4 0.87 A Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)


N° de lenticelas 16 0.58 0.47 9.98


Modelo. 387.00 3 129.00 5.45 0.0134

Clones 387.00 3 129.00 5.45 0.0134

Error 284.00 12 23.67

Total 671.00 15



I 488 57.00 4 2.43 A

Conti 12 48.00 4 2.43 AB

I 214 45.00 4 2.43 B



Longitud de las lenticelas.. 16 0.74 0.67 12.98


Modelo. 0.26 3 0.09 11.32 0.0008

Clones 0.26 3 0.09 11.32 0.0008

Error 0.09 12 0.01

Total 0.35 15



I 214 0.88 4 0.04 A

186

Conti 12 0.66 4 0.04 B

I 488 0.61 4 0.04 B



Ancho de las lenticelas 16 0.55 0.44 13.92


Modelo. 0.01 3 2.9E-03 4.93 0.0186

Clones 0.01 3 2.9E-03 4.93 0.0186

Error 0.01 12 5.9E-04

Total 0.02 15



I 488 0.21 4 0.01 A

Conti 12 0.18 4 0.01 AB

I 214 0.16 4 0.01 AB



Area de las lenticelas 16 0.87 0.84 9.02


Modelo. 0.09 3 0.03 27.95 <0.0001

Clones 0.09 3 0.03 27.95 <0.0001

Error 0.01 12 1.1E-03

Total 0.10 15



I 214 0.44 4 0.02 A

I 488 0.42 4 0.02 A

Conti 12 0.34 4 0.02 B

Ballestra 0.25 4 0.02 C Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0,01)

187


Área total lenticelar 16 0.95 0.94 6.06


Modelo. 29.23 3 9.74 82.84 <0.0001

Clones 29.23 3 9.74 82.84 <0.0001

Error 1.41 12 0.12

Total 30.64 15



I 488 7.30 4 0.17 A

I 214 6.34 4 0.17 B

Conti 12 5.33 4 0.17 C

Ballestra 3.65 4 0.17 D Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p<= 0.01)

Correlaciones de la Ih vs. Parámetros anatómicos de las hojas Correlación de Pearson: Coeficientes\probabilidades

Intensidad en hoja Espesor Epid. Abaxial

Intensidad en hoja 1.00 0.02

Espesor Epid. Abaxial -0.80 1.00

Intensidad en hoja DE adaxial (PLI 0.0)

Intensidad en hoja 1.00 2.1E-03

DE adaxial (PLI 0.0) 0.90 1.00

Intensidad en hoja DE abaxial (PLI 0.0)


DE abaxial (PLI 0.0) 0.84 1.00

Intensidad en hoja Long. Estom. Abax. (PLI 10.0)


Long. Estom. Abaxial (PLI 10.0) 0.36 1.00

188

Intensidad en hoja Long. Estom. Adaxial (PLI 10.0)


Long. Est. Adaxial (PLI 10.0) 0.95 1.00

Intensidad en hoja DCEI Abaxiales (PLI 10.0)


DCEI Abaxiales (PLI 10.0) 0.94 1.00

Intensidad en hoja DCEI Adaxiales (PLI 10.0)


DCEI Adaxiales (PLI 10.0) 0.41 1.00

Intensidad en hoja Área CEI Abaxiales (PLI 10.0)


Área CEI Abaxiales (PLI 10.0) -0.95 1.00

Intensidad en hoja Área CEI Adaxiales (PLI 10.0)


Área CEI Adaxiales (PLI 10.0) -0.92 1.00

Intensidad en hoja Cutículas abaxial (PLI 10.0)


Cutículas abaxial -0.91 1.00

Intensidad en hoja Cutículas adaxial (PLI 10.0)


Cutículas adaxial -0.92 1.00

Intensidad en hoja Cont. de n-alcanos (PLI 10.0)



Correlaciones de la It vs. Parámetros anatómicos de los tallos. Correlación de Pearson: Coeficientes\probabilidades

189

Intensidad en madera Espesor del Felema (PLI 10.0)

Intensidad en madera 1.00 0.007

Espesor del Felema -0.99 1.00

Intensidad en madera Den. Lenticelar (PLI 10.0)


Espesor del Felema 0.36 1.00

Intensidad en madera Long. de lenticel.(PLI 10.0)



Intensidad en madera Ancho ext. lenticel.(PLI 10.0)



Intensidad en madera Área lenticelar (PLI 10.0)


Área lenticelar 0.93 1.00

Intensidad en madera Sup. total lent.(PLI 10.0)

Intensidad en madera 1.00 <0.0001

Sup. total lent. 0.87 1.00

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