I. MARCO DE REFERENCIA

ÍNDICE

LISTA DE TABLAS.................................................................................... iii

LISTA DE FIGURAS.................................................................................. iv

RESUMEN................................................................................................. v

INTRODUCCIÓN.................................................................................... vi

JUSTIFICACIÓN........................................................................................ viii

OBJETIVOS.............................................................................................. ix

HIPÓTESIS................................................................................................ xi

I. MARCO DE REFERENCIA

1.1 CAMARÓN (Penaeus sp).............................................................. 1

1.1.1 Producción de camarón..................................................... 2

1.1.2 Composición química de los residuos del camarón........ 2

1.1.3 Morfología......................................................................... 4

1.1.4 Composición química........................................................ 6

1.2 PROTEÍNAS.................................................................................... 6

1.2.1Clasificación........................................................................ 8

1.2.2 Proteínas de productos marinos....................................... 10

1.2.3 Composición en aminoácidos.......................................... 10

1.2.4 Propiedades funcionales.................................................... 12

1.3 HIDROLIZADOS DE PROTEÍNAS................................................ 13

1.3.1 Métodos de obtención...................................................... 14

1.3.2 Hidrólisis enzimática........................................................ 15

1.3.3 Ensilado............................................................................. 15

1.4 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ELECTROFORESIS.............................. 17

1.4.1 Definición............................................................................ 17

1.4.2 Parámetros eléctricos.......................................................... 18

1.4.3 Electroforesis como método analítico de proteínas.......... 19

1.4.4 Punto isoeléctrico en electroforesis (IEF)........................... 20

1.4.5 La matriz. .............................................................................. 21

1.4.5.1 Gel de agarosa........................................................... 21

1.4.5.2 Gel de poliacrilamida............................................. 24

II. MATERIAL Y MÉTODOS 29

2.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO............................................... 29

2.2 MATERIAL BIOLÓGICO.............................................................. 29

2.3 DESCRIPCIÓN DE EQUIPOS Y REACTIVOS................................ 30

2.3.1 Determinación de proteína................................................. 30

2.3.2 Preparación de los hidrolizados de proteínas................... 30

2.4 METODOLOGÍA........................................................................... 31

2.4.1 Electroforesis SDS –Poliacrilamida (SDS - PAGE)............ 31

2.4.2 Electroforesis con gel de agarosa......................................... 37

III. ESULTADOS Y DISCUSIÓN 40

3.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS............................................... 40

3.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida............................. 41

3.1.2 Electroforesis en gel de agarosa.......................................... 44

CONCLUSIONES........................................................................................... 46

BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................. 48

LISTA DE TABLAS

TABLA PÁGINA

1 Volumen de producción de camarón en peso desembarcado, por

origen y entidad federativa, 1999 (toneladas)................................ 3

2 Composición de los desechos de camarón, análisis de cabeza y

Cáscara.............................................................................................. 3

3 Composición del camarón (100 g, de porción comestible)........... 6

4 Clasificación de proteínas de acuerdo con su composición

forma, solubilidad y función biológica.......................................... 9

5 Composición de aminoácidos de las proteínas de los productos

marinos............................................................................................... 11

6 Perfil de aminoácidos de las proteínas de cefalotórax de camarón 11

7 Propiedades funcionales de las proteínas empleadas en alimentos 13

8 Las normas de la proteína con el peso molecular aproximado....... 19

9 SDS – PAGE........................................................................................... 33

10 Cantidad de muestra por poso........................................................... 35

11 Contenido de proteína del extracto hidrolizado de cabeza de

camarón de bahía.............................................................................. 40

LISTA DE FIGURAS

FIGURA PÁGINA

1 El camarón y sus partes............................................................................ 5

2 Estructura química de la agarosa y la estructura de la polimerización

del gel.......................................................................................................... 23

3 Estructura química del gel de poliacrilamida.......................................... 25

4 Acción del tamizado del gel de poliacrilamida............................... 27

5 Placa de vidrio formando un sandwich agregándole el gel de

Poliacrilamida.................................................................................... 34

6 Cámara de electroforesis................................................................... 35

7 Cámara de electroforesis para geles de agarosa bandas de papel

filtro sumergidas una en ácido acético y NaOH.............................. 37

8 Refrigerante para equipo de electroforesis en gel de agarosa........ 38

9 Proteínas de extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una

placa de gel de poliacrilamida con marcador de pesos

moleculares.......................................................................................... 42

10 Proteínas de extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una

placa de gel de poliacrilamida con marcador de pesos

moleculares.......................................................................................... 43

11 Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en

una placa de gel de agarosa.............................................................. 44

12 Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en

una placa de gel de agarosa.............................................................. 45

RESUMEN

En la presente investigación se partió de extractos proteicos de cabeza de camarón

de bahía que fueron hidrolizados por tres métodos diferentes que son hidrólisis

química, hidrólisis enzimática e hidrólisis mediante fermentación láctica.

A los hidrolizados proteicos se les determinó la cantidad de proteína por el método

Bradford, se les determinó el peso molecular por medio de electroforesis con gel de

poliacrilamida y su punto isoeléctrico por electroforesis con gel de agarosa.

Los resultados obtenidos de los distintos hidrolizados muestran que estos contienen

la misma cantidad de proteína: La diferencia obtenida en la electroforesis por gel

de poliacrilamida fue la posición de sus bandas; en la electroforesis por gel de

agarosa todas las bandas se encontraron en la misma posición y el mismo número

de bandas, por los resultados obtenidos se considera que es más conveniente la

utilización de los hidrolizados químicos y enzimáticos debido a la optimización en

tiempo en comparación con la hidrólisis mediante fermentación láctica.

INTRODUCCIÓN

Actualmente la industria pesquera en nuestro país y en particular en el estado de

Sonora es muy productiva. Con incrementos promedios por año del 12 % en la

producción camaronera, el camarón es considerado como una especie de alto

valor económico (Semarnap, 1996). El camarón es un organismo artrópodo el cual

se divide en tres regiones principales: cefalotórax, abdomen y telsón.

De la producción nacional de camarón, el 39% se distribuye en el mercado interno

y el 61% en el mercado internacional (La Economía mexicana en cifras, 1993). En

los últimos años los municipios costeros del sur de Sonora han generado 3100

toneladas de cabeza de camarón. Tomando en cuenta que solo el 50% de camarón

es comestible y el resto (cefalotórax) no lo es, convirtiéndose en contaminantes los

cuales son desechos sólidos depositados en basureros, rellenos sanitarios o tirados

directamente al mar. El cefalotórax o cabeza de camarón como es mejor conocido

tiene varios componentes como son; las proteínas, enzimas, pigmentos y quitina,

los cuales se pueden aprovechar.

De estos residuos podemos obtener productos de valor agregado como en el caso

de la proteína utilizada como suplementos alimenticios, tanto en animales como

en humanos. Las proteínas también cuentan con propiedades funcionales las

cuales pueden ser utilizadas en la industria alimentaría.

Considerando lo anterior es necesario dar un tratamiento a los desechos

desarrollando tecnologías que permitan la recuperación de los compuestos de

interés que están contenidos en el cefalotórax, como son las proteínas

caracterizándolas en base a su peso molecular y punto isoeléctrico.

Desde principios del presente siglo, muchos científicos se dedicaron a la creación

de técnicas para el estudio de proteínas. Se generaron métodos para separar

proteínas de mezclas por su aptitud de migrar en un campo eléctrico. Se crearon

las bases de lo que hoy se conoce de manera general como electroforesis de

proteínas.

En un inicio se utilizaron las técnicas en solución libre y más adelante se encontró

que éstas presentaban muchas desventajas, tanto en el procedimiento como en la

evaluación e interpretación de resultados. Se descubrió que la utilización de

soportes inertes por donde migran las proteínas, permitía obtener mejores

resultados y su interpretación no resultaba tan complicada. Estos fueron

cambiando a medida que se requería mejorar la técnica y resolución de la misma.

Uno de los soportes más recientes y versátiles usado en electroforesis es el gel, el

cual presenta características ideales para análisis de proteínas. Las más utilizadas

son las de agarosa y de poliacrilamida, donde éstos últimos han desplazado casi

por completo a todos los demás soportes.

JUSTIFICACIÓN

No se sabe que componentes se encuentran presentes en los diferentes extractos

hidrolizados de cabeza de camarón los cuales se pueden obtener por medio de una

hidrólisis química(QC), hidrólisis enzimática(EA) e hidrólisis de ensilado(EL); Por

lo que en este trabajo pretende caracterizar las proteínas extraídas de la cabeza de

camarón, basándose en sus propiedades como son peso molecular y punto

isoeléctrico. Con esta característica se le daría una mejor utilización a las proteínas

extraídas.

Tomando en cuenta que la cabeza de camarón es un producto de cierto valor

nutricional y puede ser aprovechado por las industrias alimenticias por sus

propiedades funcionales o como suplemento alimenticio para el mismo camarón,

es importante desarrollar tecnologías que permitan la recuperación de los

productos de interés contenidos en la cabeza de camarón. De esta formase

determinaría la factibilidad de las proteínas obtenidas, evitando un poco la

contaminación del ambiente y manteniendo así su equilibrio ecológico.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar químicamente las proteínas que fueron extraídas por tres métodos

diferentes de hidrólisis (químico, enzimática y fermentación láctica), en base a su

peso molecular y su punto isoeléctrico.

OBJETIVOS PARTICULARES

Establecer la técnica para la evaluación del peso molecular de las proteínas

extraídas de la cabeza de camarón con electroforesis en poliacrilamida.

Estandarizar la técnica de electroforesis con agarosa, para determinar

puntos isoeléctricos de las proteínas extraídas de la cabeza de camarón.

HIPÓTESIS

La composición de las proteínas obtenidas de los extractos al aplicar los métodos de

hidrólisis química, enzimática y ensilado láctico, son diferentes.

1

I. MARCO DE REFERENCIA

1.1 CAMARÓN (Penaeus sp).

La literatura sobre los camarones peneidos se remonta al año de 1798, cuando

Fabricius publicó la descripción taxonómica de género Penaeus. Los camarones

peneidos son animales de aguas marinas. Se encuentran tanto en aguas someras

como en profundas, en regiones tropicales, subtropicales y templadas. La mayoría

de las especies comerciales son miembros de la subfamilia Penaeinae y viven en

aguas litorales.

Desde el punto de vista comercial los camarones del género Penaeus son

importantes debido a su gran tamaño y alto precio en el mercado. Las especies de

importancia comercial en México son, en el Atlántico: P.setiferus, y P. aztecus y en

el Pacífico: P. californiensis, P. stylirostris, P. vannamei y P. brevirostris (CICTUS,

1984).

2

1.1.1 Producción de camarón.

La industria pesquera en nuestro país y en particular en el Estado de Sonora es

muy productiva, con incrementos promedios por año del 12% en producción

camaronera, por lo que el camarón es considerado como una especie de alto valor

económico (Semarnap, 1996). Lo anterior hace ver la necesidad de implementar

métodos que hagan más rentable la operación de captura, cultivo e

industrialización del camarón.

De la producción nacional del camarón, el 39% se distribuye en el mercado

interno y el 61% en el internacional (La economía mexicana en cifras, 1993). La

superficie potencial disponible para la camaronicultura en México es

aproximadamente 335, 000 Has, distribuidas en ambos litorales; el Estado de

Sonora cuenta con 40,000 Has disponibles (Barrera, 1987).

El volumen de la producción de camarón en peso vivo (toneladas) por origen y

entidad federativa se muestra en la Tabla 1, según el anuario estadístico de pesca

de la SEMARNAP, 1999.

1.1.2 Composición química de los residuos del camarón.

Como ya se había visto sólo del 50-65 % del camarón es comestible, el resto es el

cefalotórax y es considerado como un desecho. Este cefalotórax contiene

aproximadamente un 50 % de proteína (ver Tabla 2), la cuál podría aprovecharse.

La mayor parte de la proteína se encuentran en la cabeza de camarón.

3

Tabla 1. Volumen de producción de camarón en peso desembarcado, por origen y

entidad federativa, 1999 (toneladas).

ORIGEN

LITORAL / ENTIDAD TOTAL CULTIVO ESTEROS Y ALTAMAR BAHÍAS TOTAL 78,234 28,288 22,314 27,632 LITORAL DEL PACÍFICO 60,499 26,901 16,388 17,210 BAJA CALIFORNIA 535 48 - 486 BAJA CALIFORNIA SUR 458 38 308 313 SONORA 21,183 12,496 1,351 7,335 SINALOA 25,251 12,680 5,904 6,667 NAYARIT 6,51 1,474 4,074 967 COLIMA 220 63 23 134 JALISCO 9 1 7 - GUERRERO 66 - 19 48 OAXACA 2,438 - 1,916 522 CHIAPAS 3,824 101 2,785 938 LITORAL DEL GOLFO Y CARIBE 17,735 1,387 5,926 10,422 TAMAULIPAS 9,822 368 4,392 5,062 VERACRUZ 1,950 - 1,241 709 TABASCO 403 - 276 127 CAMPECHE 4,063 11 - 4,052 YUCATÁN 1,030 1,008 17 5 QUINTANA ROO 466 - - 466

Fuente: http: //www.semarnap.gob.mx:8891/estad/anua99/c98a04.htm

Tabla 2. Composición de los desechos de camarón, análisis de cabeza y cáscara.

% Proteína %Grasa % Quitina % Cenizas % Calcio % Fósforo

Cabeza 53.5 8.9 11.1 22.6 7.2 1.68

Cáscara 22.8 0.4 27.2 31.7 11.1 3.16

Fuente: Meyers, 1986.

4

1.1.3 Morfología.

Los camarones pertenecen a la clase de los crustáceos que son organismos

artrópodos mandibulados con apéndices birrameos articulados, con dos pares de

antenas y branquias. Una de las principales características de los crustáceos es la

presencia de un exoesqueleto de origen quitinoso, secretado por la epidermis, con

calcificación posteriores (CICTUS, 1984).

El camarón (Penaeus sp.) además cuenta con cinco pares de patas “caminadoras” y

cinco pares de patas “nadadoras”. En su exoesqueleto se observa más la

segmentación del cuerpo, el cual se divide en tres regiones principales: cabeza,

abdomen y telson o cola, como se observo en la Figura 1 (Ruello, 1976).

El cefalotórax o cabeza se encuentra localizado en la parte anterior del organismo

y contiene la mayor parte de los organismos vitales: rostro, anténulas, antenas

(órganos sensitivos), y aparato bucal. En el interior se encuentra la parte anterior y

media del aparato digestivo, hepatopáncreas, branquias y gónadas. En el exterior

se observan cinco pares de las patas que le sirven para caminar, llamadas

ambulacrales, caminadoras o periódopos (Soluap, 1998).

Abdomen, es la parte que se aprovecha para el consumo y está cubierta por un

caparazón duro que sirve de protección (Nickerson, 1978).

Telson (cola), le proporciona sentido de dirección al movimiento y también le sirve

para nadar a contracorriente (Nickerson, 1978).

5

Figura 1. El camarón y sus partes.

Fuente: Soluap, 1998.

6

1.1.4 Composición química

El camarón es muy nutritivo, en general su valor calórico es aproximadamente de

4.5 kJ/g y contiene entre 75 y 80 % de agua, 18-20 % de proteína y cerca de 1 %

de grasa (Tabla 3).

Tabla 3. Composición del camarón (100 g de porción comestible).

Componente Cantidad

Agua (g) 78.2

Proteína (g) 18.1

Grasa (g) 0.8

Carbohidratos (g) 1.5

Calorías (cal) 91.0

Calcio (mg) 63.0

Fósforo (mg) 166.0

Hierro (mg) 1.60

Tiamina (mg) 0.02

Niacina (mg) 3.20

Riboflavina (mg) 0.03

Fuente: Charley, 1987.

1.2 PROTEÍNAS

Las proteínas son biomoléculas de alto peso molecular y están formadas por la

unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. Todas sus propiedades

7

nutritivas y sus características físicas y químicas dependen completamente del

tipo, de la concentración y de la secuencia de unión de los monómeros

constituyentes (Badui, 1996).

Por definición las proteínas son polímeros de un alto peso molecular, cuando se

solubilizan son de dimensiones coloidales, tienen propiedades anfotéricas, y su

hidrólisis completa produce una mezcla de aminoácidos. Estos aminoácidos son

ácidos orgánicos que contienen ya sea un grupo amino o uno imino en el átomo

del carbono alfa (Mertz, 1992).

Debido a que están constituidas de aminoácidos, las proteínas también desarrollan

una carga neta que depende de la influencia de los diferentes grupos R ionizables

(R-radicales alifáticos o aromáticos) y el pH al que se encuentren. Es decir, pueden

tener una carga positiva o negativa, o bien no tener carga cuando se llega a su

punto isoeléctrico (Badui, 1982).

Originalmente las proteínas se clasifican como globulares y fibrosas, de acuerdo

con su estructura física tridimensional; las primeras tienen forma casi esférica,

mientras que las segundas son cadenas largas lineales y muy rígidas.

Posteriormente, se descubrió que las proteínas globulares presentan diferentes

estados de ordenación dentro de su propia molécula. La destrucción de dicha

conformación de la proteína trae consigo la pérdida de su actividad.

Estructura primaria. Está determinada por la forma secuencial y ordenada que se

encuentran distribuidos los aminoácidos a lo largo de la cadena de la proteína y es

una propiedad altamente reproducible, controlada genéticamente y única para

cada fracción proteica.

Estructura secundaria. Se refiere a la ordenación regular y periódica del espacio de

las cadenas polipeptídicas a lo largo de una dirección, lo que es más evidente en

8

las proteínas fibrosas. Existen tres principales tipos de estructuras secundarias de

las proteínas: la alfa hélice, la conformación beta y la hélice de la colágena, pero

todas están estabilizadas por diferentes fuerzas, siendo las más importantes las

electrostáticas, los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrófobas y las

interacciones dipolo-dipolo.

Estructura terciaria. Se refiere al modo que la cadena polipeptídica se curva o se

pliega tridimensionalmente para producir una estructura estrechamente plegada

y compacta, característica de las proteínas globulares. A diferencia de las proteínas

fibrosas, que son moléculas lineales, las globulares tienen su cadena compacta con

un alto grado de organización y presentan uniones covalentes (disulfuroS-S),

hidrófilas, hidrófobas y también iónicas (Badui, 1993).

Estructura cuaternaria. A diferencia de las anteriores no necesariamente existen en

todos los polipéptidos y se refiere a la asociación de dos o más cadenas (iguales o

diferentes) a través de uniones no covalentes; Pone de manifiesto la disposición en

el espacio de las proteínas compuestas por más de una fracción (Badui, 1993).

1.2.1 Clasificación.

Existen varios métodos de clasificación de las proteínas, los principales están

basados en la composición, la forma, la solubilidad y la función biológica de estos

biopolímeros. En general los criterios más comunes para clasificarlas se refieren a

su composición y a su solubilidad.

Las proteínas simples son aquellas que están compuestas exclusivamente de

aminoácidos, mientras que las conjugadas contienen además un grupo no

proteico, como se muestra en la Tabla 4(Badui, 1993).

9

Tabla 4. Clasificación de proteínas de acuerdo con su composición, forma,

solubilidad y función biológica.

Clasificación Propiedades A. Por composición

1. Simple

2. Conjugado

a) Metaloproteína

b) Glucoproteína

c) Fosfoproteína

d) Lipoproteína

e) Nucleoproteínas

Contiene solo aminoácidos

Contiene una fracción no proteica

Pigmentos

Contiene hidratos de carbono

Contiene fósforo

Contiene lípidos

Contiene ácidos nucleicos

B. Por su forma

1. Globular

2. Fibrosa

Esférica u ovoides

Forman fibras de tejido conectivo, de ligamentos y

tendones. Pelo, lana, uñas, cuernos. Proteína

muscular. Responsable de la coagulación de la

sangre.

C. Por solubilidad

1. Albúminas

2. Globulinas

3. Histonas

4. Glutelinas

5. Prolaminas

6. Escleroproteínas

Solubles en agua y en soluciones salinas diluidas

Poco solubles en agua, solubles en soluciones salinas

Alto contenido de aminoácidos básicos

No coagulan por calor

Insolubles en agua y en alcohol

Solubles en álcalis y ácidos débiles

Solubles al 70% de alcohol

Insolubles en la mayoría de los disolventes

D. Por función biológica

1. Estructurales

2. Enzimas

3. Hormonas

4. Toxinas

5. Anticuerpos

6. Transporte de O2

Forman parte estructural de cuerpo

Catalina reacciones biológicas

Mensajeros químicos

Proteínas dañinas, generadas por microorganismos

Proteínas protectoras elaboradas por el organismo

Transporta O2 de los pulmones a los tejidos

Almacén de O2 en el músculo

Fuente: Badui, 1996.

10

1.2.2 Proteínas de productos marinos.

Los pescados crudos y los invertebrados marinos tienen proteínas de excelente

calidad nutricional; su alto valor nutritivo ha sido confirmado en experimentos

biológicos. La digestibilidad in vivo de las proteínas de pescado crudo esta en el

rango de 90% a 98%, y la de los crustáceos es de alrededor del 85% (Zdzislaw,

1990).

1.2.3 Composición de aminoácidos.

La composición de aminoácidos de las proteínas se establece, después de la

hidrólisis de los enlaces peptídicos, mediante el análisis de aminoácidos liberados

(Cheftel, 1989).

Ningún procedimiento hidroliza completamente a las proteínas en sus

aminoácidos constituyentes sin la pérdida parcial de alguno de ellos. Por lo general

el método que se elige es la hidrólisis con HCl 6N a 110ºC en tubo sellado al vacío,

durante 24 a 96 horas (Murray, 1988).

En la Tabla 5 se muestra la composición en aminoácidos promedio de los

productos marinos y en la Tabla 6 se indica la composición en aminoácidos

esenciales del cefalotórax de camarón.

11

Tabla 5. Composición de aminoácidos de las proteínas de los productos marinos.

Aminoácido Media (%) Rango(%) Alanina 7.91 7.7-8.8 Arginina 5.95 5.7-6.3 Ácido aspartico 10.34 9.9-10.9 Sistina 1.04 0.9-1.1 Ácido glutámico 14.91 14.3-15.4 Glicina 4.6 4.2-5.4 Histidina 2.01 1.8-2.2 Isoleucina 6.03 5.5-6.3 Leucina 8.41 7.8-9.1 Lysina 8.81 7.9-9.5 Methionina 2.97 2.8-3.2 Fenilalanina 3.92 3.7-4.1 Prolina 3.52 3.3-3.7 Serina 5.14 4.6-6.0 Treonina 4.62 4.4-5.0 Triptófano 0.96 0.9-1.0 Tirosina 3.27 3.1-3.4 Valina 5.95 5.6-6.2

Fuente: Braekkan, 1962

Tabla 6. Perfil de aminoácidos de las proteínas de cefalotórax de camarón.

Aminoácido Cantidad Arginina 6.13 Histidina 2.24 Isoleucina 5.78 Leucina 7.01 Lysina 6.58 Methionina 2.24 Fenilalanina 5.13 Treonina 4.14 Triptófano 1.19 Valina 5.95

g/100g de proteína

Fuente: Shahidi, 1997.

12

1.2.4 Propiedades funcionales.

Las proteínas no sólo son fuente de aminoácidos sino que, debido a su naturaleza

polimérica, su presencia influye decididamente en las características reológicas y

de textura del alimento que hacen que este sea más aceptado por el consumidor.

Las propiedades funcionales se definen como cualquier propiedad fisicoquímica de

los polímeros que afectan y modifican alguna característica de los alimentos y

contribuye a la calidad final del producto, como se muestra en la Tabla 7 (Badui,

1996).

Las proteínas y específicamente las de origen animal, presentan diversas

propiedades fisicoquímicas y mecánicas como solubilidad, plasticidad, carácter

ligante y emulsificante, Es necesario dominar estas propiedades para poder

controlar las características de los sistemas alimentarios durante la transformación

y las propiedades mecánicas de los productos obtenidos. Por lo tanto las proteínas

serán valoradas en el mercado, basándose en sus propiedades funcionales

(Bourgeois, 1986).

13

Tabla 7. Propiedades funcionales de las proteínas empleadas en alimentos.

PROPIEDAD FUNCIÓN

Hidratación Solubilidad, dispersión, absorción de agua, espesante,

gelificante, viscosidad, formación de masa y

propiedades reológicas en general.

Estructural y reológica Elasticidad, cohesión, formación de redes

tridimensionales, formación de fibras, viscosidad,

agregación, gelificación.

Sensorial Color, sabor, olor, textura, turbidez, arenosidad, etc.

Superficie Emulsificación, espumante, estabilización, formación

de complejos lípido proteicos.

Otras Compatibilidad con aditivos, acción enzimática y

modificación de propiedades de alimentos.

Fuente: Badui, 1996.

1.3 HIDROLIZADOS DE PROTEÍNAS.

DEFINICIÓN

Es un producto obtenido por la hidrólisis (química o enzimática) de las

proteínas de la materia prima, por acción de un agente preexistente o adicionado

(Bourgeois, 1986).

Durante el proceso de hidrólisis de una proteína hay liberación o captura de

protones H+ (Sorensen, 1908). Durante el proceso de reacción proteolítica, el pH

cambiará, excepto en la región de 5.0-6.0 donde la captura y liberación de

protones está en equilibrio. A pH menor a 3.1 –3.6, el grupo carboxílico estará

14

más del cincuenta por ciento disociado y el grupo amino completamente

protonado; Presentándose una captura de 0.5 a1.0 equivalentes de H+ por cada

equivalente de enlaces peptídicos rotos, manifestándose un rápido incremento de

pH si éste no es controlado (Steinhardt y Beychok, 1964).

1.3.1 Métodos de obtención.

Hidrólisis Química

Esta se da por la acción de agentes químicos, generalmente inorgánicos. Las

condiciones de proceso son drásticas: temperatura de 100 ºC y altas presiones.

Puede ser realizada por condiciones ácidas o básicas:

Hidrólisis ácida.

En la hidrólisis ácida el uso del ácido clorhídrico tiene la ventaja, después de la

neutralización con sosa, de producir cloruro de sodio que es importante

conservador para el producto. La hidrólisis ácida tiene el inconveniente de

descomponer en forma parcial algunos aminoácidos y destruir por completo al

triptofano. Es necesario suplementar al hidrolizado con estos aminoácidos

(Bourgeois, 1986).

Hidrólisis alcalina.

La hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio provoca la destrucción de la cisteína,

cistina, arginina y metionina. También produce una racemización de aminoácidos,

con lo que se reduce el valor alimenticio del producto, por que sólo los L-

aminoácidos son asimilables. La hidrólisis moderada produce un hidrolizado que

15

contiene aún una porción importante (50%) de proteínas de alto peso molecular

(Bourgeois, 1986).

1.3.2 Hidrólisis enzimática.

Las enzimas son catalizadores de origen proteico producidas por organismos vivos.

Tres son las principales características que hacen notables a las enzimas sobre

otros catalizadores: el poder catalítico, su especificidad y la capacidad para regular

su capacidad catalítica por una variedad de compuestos naturales (Rodríguez,

1999).

Las proteínas vegetales, las del pescado y las desnaturalizadas por el calor o por los

disolventes, pueden solubilizarse mediante una proteólisis parcial, con enzimas

como la papaína, la bromelina, la pepsina o proteasas de diversa especies de los

géneros Aspergillus, Bacillus, o Streptomyces. La proteolisis parcial puede así,

facilitar la extracción y purificación de proteínas a partir de diversas fuentes

(Fennema, 1993).

1.3.3. ENSILADO

Este es el proceso de preservación de materiales mediante el uso de ácidos que

previenen el crecimiento de microorganismos que producen putrefacción. Ha sido

aplicado a los desechos de pescado por muchos años y durante el proceso las

enzimas presentes de manera natural en las vísceras digieren las proteínas,

resultando un producto líquido que puede ser usado en la alimentación animal. El

ácido puede ser agregado o generado in situ por fermentación bacteriana (Hall,

1994).

16

Fermentación láctica

La fermentación ácido láctica es uno de los métodos ancestrales para preservar

alimentos; por medio de ésta también se logran mejoras de las propiedades

sensoriales y nutricionales. Las fermentaciones lácticas son aquellas en las que el

ácido es producido in situ por bacterias lácticas a partir de una fuente de

carbohidratos. Los microorganismos responsables pueden pertenecer a la

microflora natural o ser cultivos iniciadores (Frazier, 1993).

Las condiciones para que se desarrolle con seguridad la fermentación láctica

dependen sobre todo de la rapidez de crecimiento y producción de ácido por parte

de la bacteria láctica y la supresión, por la disminución del pH u otros factores

antimicrobianos, de microorganismos competitivos. La mayor influencia en el

crecimiento de bacterias lácticas y la velocidad con la cual decrece el pH de la

fermentación son debidos a: (i) disponibilidad de carbohidratos fermentables; (ii)

disponibilidad de factores orgánicos de crecimiento; (iii) anaerobiosis; (iv)

temperatura; (v) concentración de cloruro de sodio; (vi) concentración de ácidos

orgánicos y valor de pH; (vii) concentración de bióxido de carbono; (viii)

producción de otros compuestos inhibitorios; (ix) capacidad de amortiguamiento

del sustrato; (x) cantidad inicial de bacterias lácticas; y (xi) cantidad inicial de

microorganismos competidores (Owens, 1985).

17

1.4 PRINCIPIOS BÁSICOS DE ELECTROFORESIS.

1.4.1 Definición.

La electroforesis de manera sencilla puede definirse como la migración de una

partícula cargada bajo una influencia (Andews, 1986).

La electroforesis consiste en mover partículas cargadas (iones) dentro de un campo

eléctrico. El desplazamiento ocurre por medio de un líquido sostenido por una

sustancia sólida inerte, por ejemplo un papel o un gel (Bohinski, 1973).

Electroforesis se refiere al movimiento de las partículas cargadas contenidas en un

medio, debido a la influencia de un campo eléctrico; ésta constituye una técnica

más poderosa para la purificación de las moléculas biológicas. En la separación de

proteínas por medio de un campo eléctrico, la carga y naturaleza anfotérica de esa

juega un papel fundamental (Tejeda, 1995).

Electroforesis es el trasporte de partículas a través de un disolvente mediante un

campo eléctrico (Freifelder, 1991).

Principios físicos

Cuando una molécula es colocada en un campo eléctrico, una fuerza es ejercitada

en ella, que depende tanto de la intensidad del campo eléctrico como además de la

carga de esta molécula (Cooper, 1977: Freifelder, 1976). La ecuación matemática

usada para expresar ese fenómeno es:

F=(E/d)(q)

Donde F es la fuerza, E la diferencia de potencial entre electrodos (campo

eléctrico), d es la distancia entre electrodos, e/d es la intensidad del campo y q es

la carga neta de la molécula.

18

Si la molécula o partícula con carga q es colocada en un campo eléctrico E, se

moverá con una velocidad constante v, que esta determinada por el balance

eléctrico Eq y la resistencia al avance por viscosidad fv. La ecuación que representa

este fenómeno es:

Eq=fv

Donde Eq es la fuerza eléctrica, f es el coeficiente de fricción de la molécula (una

función de los parámetros físicos de la molécula), v es la velocidad de carga y fv la

resistencia al avance por viscosidad.

Usando estas ecuaciones es posible determinar la movilidad μ característica de una

molécula definida, que es su velocidad por campo eléctrico externo conocido:

Movilidad = μ= v/E=q/f

1.4.2. Los Parámetros eléctricos

Lo fundamental de electroforesis es el voltaje aplicado al sistema. La velocidad de

una moléculas es directamente proporcional al gradiente de voltaje circundante.

Dos ecuaciones eléctricas básicas son importantes en la electroforesis.

La ley de Ohm’s

V = IR ó I = V/R

La ley de Ohm’s relaciona el voltaje moderado en los voltios (V), actual (I)

moderado en los amperios (UN), y resistente (R) midió en los ohms (Ω).

La ecuación de poder describe la cantidad de calor que se produce en un circuito:

P=VI ó P=I2R ó P=V2/R

19

Donde P es poder, que es moderado en watts (W). En el circuito de electroforesis,

el voltaje y corriente son proporcionadas por un poder de suministro (DC);

electrodos, conductores, buffer y gel actúan como resistencias simples. La

resistencia de Buffer baja cuando la temperatura aumenta, la resistencia en las

cargas son discontinuas cuando aumenta el calor en los iones.

1.4.3 Electroforesis como método analítico de proteínas.

Puesto que las proteínas poseen una carga neta a cualquier pH distinta al de su

punto isoeléctrico (pI), ellas también pueden migrar y su velocidad de migración

va a depender de sus densidades de carga; a mayor densidad de carga, la

molécula migra muy rápido.

La aplicación de un campo eléctrico a una mezcla de proteínas provocará que esta

migre a distintas velocidades hacia uno u otro de los electrodos, dependiendo de su

carga neta, lo que provocara que se separen una de otra. En la Tabla 8 se muestran

los pesos moleculares aproximados de algunas proteínas.

Tabla 8. Las normas de la proteína con el peso molecular aproximado.

Proteínas MOL. WT Aprotinin, Bovine Lung 6,500 α-Lactalbumin, bovine milk 14,200 Trypsin inhibitor, soybean 20,000 Trypsinogen, bovine pancreas 24,000 Carbonic anhydrase 29,000 Glyceraldehyde-3-dehydrogenase 36,000 Albumin, egg 45,000 Albumin, bovine 66,000 Phosphorylase b, rabbit muscle 97,000 β- Galactosidase, E.Coli 116,000 Myosin, rabbit muscle 205,000

Fuente: Navarrete del toro

20

Una proteína con una carga eléctrica positiva, se desplaza hacia el cátodo con

carga negativa; por el contrario se posee una carga eléctrica negativa, se desplaza

el ánodo positivo. Si el pH de la solución coincide con el pI de la proteína, no

tendrá carga eléctrica y no se desplazara hacia ninguno de los eléctrodos. Esto es la

migración electroforética de las proteínas.

Si una mezcla de dos o más proteínas cuyos pI sean diferentes se disuelven en un

medio de determinado pH; Las diferencias entre éste y el pI de cada proteína serán

distintos y por ello su valor de carga neta y su velocidad de migración en el campo

eléctrico serán también distintos. Este fenómeno constituye el fraccionamiento

electroforético, o sea la separación de los componentes de una mezcla de proteínas

(Blanco, 1990, Hames y Rickwood,1990).

1.4.4 Punto isoeléctrico en electroforesis (IEF).

Las moléculas compuestas de aminoácidos anfotericos. La natural anfotericidad

de las proteínas les permite actuar como un ácido o una base. Debido a sus grupos

ionizables carboxilo, amino y otros, los aminoácidos son capaces de desarrollar

una carga (+) o (-) de acuerdo con el pH al que se encuentren; es decir, su

carácter anfotérico les confiere la capacidad de recibir y de donar electrones; Esta

situación hace que exista un estado químico conocido como punto isoeléctrico (pI)

o de doble ion, en el que se cuenta con el mismo número de cargas positivas y

negativas y cuya carga neta es cero. Los aminoácidos pueden tener, tres estados

que dependen del pH: A PH<pI se encuentra en forma protonada o catiónica; En el

pI su carga cero, y a pH>pI adquiere una carga negativa o aniónica. Es decir no

existe un pH en el cual estos anfolitos estén completamente ausentes de cargas

21

eléctricas, ya que las presentan aún el pI. En cualquiera de sus tres estados pueden

ligar iones de carga contraria por fuerzas electrostáticas débiles (Badui, 1996).

Puesto que las diferentes proteínas poseen valor de punto isoeléctrico diferente,

también son diferentes debido a que difieren en el contenido de aminoácidos con

grupos R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras mediante

precipitación isoeléctrica (Lehninger, 1990)

1.4.5 La matriz.

Pueden entallarse los geles para cribar moléculas de una gama amplia de tamaños

por la opción apropiada de la concentración de la matriz. Entre estos geles se

encuentran el gel de agarosa y de poliacrilamida.

1.4.5.1 Gel de agarosa.

El gel de agarosa es un polímero lineal natural de los polisacáridos galactosa y 3,6

anhidrogalactosa. El material deriva del agar de alga Gelidium amansii

(Bender,1992).

Agarosa es un polisacárido muy purificado derivado del agar. Los poros de un gel

de agarosa son grandes. La agarosa es utilizada para separar las macromoléculas

como los ácidos nucleicos (50 a 30000 pares de bases), proteínas de gran tamaño

y proteínas complejas (Navarrete del Toro).

Esta característica del poro es suficiente para no retener a la mayoría de las

moléculas proteicas que migran, por lo que su separación dependerá

fundamentalmente de la carga neta de éstas, o sea, se utiliza principalmente en los

sistemas de separación en estado nativo.

22

La agarosa, que viene en forma de polvo, es soluble en agua, más aún cuando esta

hervida y caliente. Esta permanece en estado líquido hasta que la temperatura

disminuye a cerca de 40ºC, que es el punto donde gelifica (Hoefer 1994).

En la Figura 2 mostramos la estructura química de la agarosa y la estructura de la

polimerización del gel.

El tamaño del poro y las características de criba de una gel son determinadas

ajustando la concentración de agarosa en el gel. Entre mayor sea la concentración

es más pequeño el tamaño del poro. El rango de la concentración es 0.4% un 4.0%

(W/V). El gel del agarosa es frágil y debe manejarse cuidadosamente. Un gel de

agarosa debe ocuparse siempre con algunos apoyos para que el gel permanezca

entero, ya sea una bandeja o una espátula ancha (Navarrete del Toro).

23

Figura 2: Estructura química de la agarosa y la estructura de la polimerización del

gel. (Hoefer, 1994).

24

1.4.5.2 Gel de poliacrilamida.

Los geles de Poliacrilamida son físicamente más duros que los geles de agarosa.

Además su estructura química es más compleja, así como lo son también su

preparación y uso (Hoefer, 1994).

Estos geles se obtienen por la polimerización del monómero acrilamida (CH2=CH-

CO-NH2) y N,N-metilenbisacarilamida (CH2= CH-CO-NH-CH2-NH-CO-

CH=CH2), también llamada bisacilamida o BIS para abreviar. Este ultimo

compuesto esta formado de cadenas cruzadas (Bender, 1992; Hames y Rickwood,

1990).

La polimerización de acrilamida se lleva a cabo por vía química, debido a que esta

necesita de un iniciador del proceso, y el más comúnmente utilizado es le

persulfato de amonio (APS). Se añade además un acelerador como N, N, N`, N`-

tetrametilendiamina (TEMED). El sistema APS-TEMED, cataliza la formación de

radicales libres persulfatos lo que en definitiva inicia la polimerización (Dunbar,

1987).

En la formación del gel, monómeros de acrilamida se polimerizan en largas

cadenas que están enlazadas covalentemente por el BIS; éste es el que mantiene

junta la estructura. La estructura química del gel de poliacriamida se observa en la

Figura 3 (Hoefer, 1994).

25

-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-

-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-

|NH|CO|

ξCOξNHξ

ξCOξNHξ

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

NH2|CO|


NH2|CO|

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

|NH|CO|

|NH|CO|

NH2|CO|

NH2|CO|

ξCOξNHξ

ξCOξNH2


-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-[CH2-CH]n-CH2-CH-

|NH|CO|

ξCOξNHξ

ξCOξNHξ

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

NH2|CO|


NH2|CO|

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

|NH|CO|

|NH|CO|

NH2|CO|

NH2|CO|

ξCOξNHξ

ξCOξNH2

ξCOξNHξ

ξCOξNHξ

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

NH2|CO|


NH2|CO|

ξCOξNH2

|CO|NH|CH2|NH|CO|

|NH|CO|

|NH|CO|

NH2|CO|

NH2|CO|

ξCOξNHξ

ξCOξNH2

Figura 3: Estructura química del gel de poliacrilamida. (Hoefer, 1994)

26

En los geles de poliacrilamida pueden conseguirse poros de diferentes diámetros

según las condiciones de polimerización; como consecuencia, para un gel de

determinado poro, el tamaño molecular y la carga neta serán los factores

determinantes de la separación de la molécula de una mezcla.

El poro de gel formado dependerá de las concentraciones de acrilamida y BIS

durante la polimerización. El tamaño de éste decrece a medida que la

concentración de acrilamida total aumenta. Para una determinada concentración

de acrilamida monomérica, el tamaño del poro dependerá del entrecruzamiento

producido.

La acción de tamizado del gel de poliacrilamida se observa en la Figura 4 y se da

por la red tridimensional de fibras y poros que se forman por la interacción y

entrecruzamiento del BIS y las cadenas de acrilamida (Deutscher, 1990).

Los patrones de proteína son separados por electroforesis en geles con 5 a 15% de

entrecruzamiento de porosidad variable (Murray, Granner, otros, 1988).

La aplicación más común de esta técnica es la determinación de peso molecular de

los protómeros después de la desnaturalización del oligómero y separando en geles

que contienen el detergente iónico dodecilsulfato sódico (SDS) (Murray, Granner,

otros, 1988)

27

Electroforesis

Gel poroso

Mezcla de macromoléculas

Figura 4: Acción de tamizado del gel poliacrilamida (Lubert, 1993).

28

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una poderosa herramienta a la

que el bioquímico recurre para efectuar separaciones, aislamientos, evaluaciones

de pureza y cuantificaciones del peso molecular. Es posible fraguar una matriz

uniforme de gel de poliacrilamida (no en forma de grumos) moldeándola, ya sea

como una delgada capa entre dos vidrios o como un cilindro o barrera dentro de

un tubo. La estructura química de la poliacrilamida forma una trampa porosa, a

través de la cual se mueven las partículas cargadas con velocidad proporcional a

sus propios valores.

Las ventajas de la PAGE son su facilidad y rapidez de operación, la alta precisión

de su detecciones, el hecho de que no daña sustancias tan delicadas como las

proteínas y los ácidos nucleicos, y que permiten separar los componentes

individuales de mezclas complejas (Bohinski, 1973).

Los geles de poliacrilamida han remplazado a los de almidón por su mejor efecto

como matriz molecular y por proporcionar el control del tamaño de sus poros

utilizando concentraciones distintas de los monómeros de partida, a demás de

presentar una adsorción despreciable de material proteico. La poliacrilamida es

comúntemente el medio de soporte más efectivo para la electroforesis de proteínas

(Freifelder, 1991). Sin embargo, el manejo de geles de poliacrilamida conlleva

cierta precaución: ya que es neurotóxico y debe manejarse con el cuidado las

soluciones.

29

II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 UBICACIÓN DEL EXPERIMENTO.

El presente trabajo se realizó en los laboratorios de ecodesarrollo de la Unidad

Obregón del Instituto Tecnológico de Sonora.

2.2 MATERIAL BIOLÓGICO.

Como material biológico se empleó extracto de proteína de la cabeza de camarón

de bahía que se recolectó en el campo pesquero del Paredón Colorado, Sonora, el

cual fue transportado en hielo para finalmente ser congelado a –20ºC hasta su

utilización.

30

2.3 DESCRIPCIÓN DE EQUIPOS Y REACTIVOS.

2.3.1 Determinación de proteína. El contenido de proteína y su concentración, fue cuantificada empleando el método

descrito por Bradford (1976) utilizando seroalbumina bovina (BSA, por sus siglas

en ingles), a una concentración 1mg/1ml. La curva estándar se elaboró con 0, 1, 3, 5,

7, 9 y10 mg de BSA. La mezcla de reacción contenía la muestra del hidrolizado de

proteína extraído de cabeza de camarón de bahía (EA, E L, Q C) aplicando 3 μl en

cada tubo y adicionando 5 ml de reactivo Bradford, después se agitó para mezclar

perfectamente y se esperaron 2 minutos para leer la absorbancia en el

espectrofotómetro, antes de 1 hora de reacción.

La absorbancia del complejo colorido fue registrada a 595 nm, en el rango visible.

La concentración de proteína en cada muestra fue calculada interpolando los valores

de absorbancia en la curva estándar y fueron expresados en mg/ml de proteína.

2.3.2 Preparación de los hidrolizados de proteínas.

1. Tomar 2 ml de muestra y colocarlas en un tubo de ensaye.

2. Ajustar el pH con NaOH 10 N hasta 6.7.

3. Agitar y se toma una alícuota de 1 ml.

4. Sé centrífuga, 5ºC, 10000 hertz por 5 min.

5. Se toma la alícuota del sobrenadante 100 Ml y se le agrega 10 Ml de Buffer

de muestra.

31

Buffer de muestra: 2x sample buffer (0.125 M Tris, HCl, 4%, SDS 20%v/v

glycerol, 0.02% azul de bromofenol, pH 6.8)

2.4 METODOLOGÍA.

2.4.1 Electroforesis SDS –Poliacrilamida (SDS - page).

Preparando y vertiendo la solución del monómero.

(es usada con agua destilada y se filtra todas las soluciones)

La solución de Monómero (30.8%T, 2.7%Cbis)

Los geles de Poliacrilamida son descritos por la referencia a dos características:

1) La concentración del monómero total, (T%)

%T = (g Acrilamida + g Bis - Acrilamida / el volumen Total) x100

2) La concentración de monómeros de crosslinking, (C%).

%C=g Bis –Acrylamide / (g Acrylamide + g Bis - Acrylamide) x100

60.0g de acrilamida (FW 71.08)

1.6 g de bisacrylamide (FW 154.2)

H2O a 200ml

Almacene a 3 meses a 4ºC en refrigeración.

Gel buffer de corrida (1.5 tris de M - HCl, pH 8.8)

32

54.4 g Tris base (FW 121.1)

Agregue 150 ml H2O

Ajustar a pH 8.8 con HCl

Ajustar a 300 ml con agua y almacene a 3 meses a 4ºC en refrigeración

Gel buffer de concentración (0.5 M Tris - HCl, pH 6.8)

6.0 g Tris basan (FW 121.1)

Agregue 60 ml H2 O ajustar a pH 6.8 con HCl

Ajustar a 100 ml con el agua y almacene a 3 meses a las 4ºC en refrigeración.

10% SDS ( dodecylsulfate de sodio)

10g SDS

H2O a 100ml

Almacene a 6 meses a la temperatura de 25-26ºC.

10% Persulfato de amonio (Iniciador)

0.1g Amonio persulphate

H 2 O a 1.0 ml

Haga las alícuotas y guarde a –4ºC

33

TEMED (N,N,N',N ', - TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE)

Manténgalo en su lugar en botella ámbar y en ambiente.

El Gel de separación

1. En un vaso de precipitado de 20 ml, mezcle la solución listada en la Tabla

9.

Tabla 9. SDS – PAGE.

Substance Separating gel (ml) Staking gel (ml)

Agua destilada 6.6 6.8

Gel buffer de corrida 5 0.0

Gel buffer de concentración 0.0 1.25

Acrilamida 8 1.7

SDS 10% 0.2 0.1

APS 10% 0.2 0.1

TEMED 0.008 0.01

Total monómero 20 10

2. Agregar 20 ml de la solución ( gel de separación) en medio de la placa

formando el sandwich Figura 5.

34

Figura 5. Placas de vidrio formando un sandwich agregándole el gel de

poliacrilamida

3. Tomar 0.5 ml de alcohol isopropílico y colocar sobre el gel que se

encuentra entre las placas de vidrio.

4. El gel debe ser totalmente polimerizado después de 1-2 horas.

5. Después de la polimerización, con sanitas retirar el alcohol isopropílico.

Gel concentrador

6. En un vaso de precipitados de 20 ml, mezcle la solución listada en la tabla

9.

7. Agregar la solución de gel apilando e inserta un peine en el sandwich.

Tener cuidado para no entrampar ninguna burbuja debajo de los dientes

del peine.

8. Esperar a polimerizar por lo menos 60 minutos.

9. Colocar las placas en una cámara de electroforesis vertical, retirar el peine

y el separador de la parte inferior y agregar la solución Buffer del

electrodo. Ver Figura6.

35

Figura 6. Cámara de electroforesis

El Buffer del electrodo 5X(0.025 M Tris, 0.192 Glicina de M, 0.1% SDS, pH

8.3)

30.28 g de Tris (FW 121.1)

144.13 g de Glicina

10g SDS

Aforar con H2O destilada hasta 2 Lit.

10. Colocar las muestras en los pozos:

TABLA 10. Cantidad de muestra por pozos.

MUESTRA CANTIDAD (μl)

EA 50

EL 50

QC 50

36

11. Se le dan las condiciones de corrimiento set= 0100vts, 50 mA, 8Wts. por

4:30 hrs.

12. Se retira el gel de las placas y se pone a colorear por un tiempo 2-3 hrs. con

solución de stok.

solución de Stok.

La solución stok (0.05% Coomassie Brillant azulan, 40% metanol, 7% acético ácido)

0.5 g azul coomassie brillante R

400ml metanol, disolver por 2 horas con agitación.

Entonces agregue:

70 ml el ácido acético

H2O a 1000 ml

13. Decolorar con la solución desteñidora I por 12 hrs. y con la II por 3-4 hrs.

Solución Desteñidora I

40 % metanol

7% ácido acético

Solución Desteñidora II

7% ácido acético

5% metanol

14. Secar el gel y observar los corrimientos, comparar con la muestra de pesos

moleculares.

37

2.4.2 Electroforesis con gel de agarosa.

1. Pesar 0.32 gr. de agarosa IEF depositar en un vaso de precipitados.

2. Pesar 4 gr. de sorbitol se mezcla en el vaso que contiene la agarosa.

3. Se agregan 38 ml de agua bidestilada.

4. Poner a hervir por 2 min. A 90ºC.

5. Retirar del calor y esperar a que baje a 75ºC la temperatura.

6. Agregar 1.5 ml de anfolito y mezclar bien

7. Tomar la solución con una jeringa de 20 ml y poner en el sanwich de las

placas previamente preparadas.

8. Esperar a que solidifique y retirar las placas de vidrio para obtener la placa

de gel de agarosa.

9. Colocar la placa de gel en la cámara horizontal de electroforesis 30

minutos a 1400 V, 30 mA, 8 Wtts. Junto con las bandas de papel filtro

sumergidas una en ácido acético 0.25M esta tira se coloca en ánodo (+),

otra es sumergida en NaOH 0.25M y es colocada en el cátodo (-), ver

Figura 7.

Figura 7. Cámara de electroforesis para geles de agarosa con el gel y las bandas de

papel filtro sumergidas una en ácido acético y NaOH.

10. Encender la carga de refrigeración a 4ºC, ver Figura 8.

38

Figura 8. Refrigerante para equipo de electroforesis en gel de agarosa.

11. Transcurridos los 30 min. Se coloca el portamuestras y las muestras ya

preparadas se corre 1 ½ hrs. A 1500vts, 30MA, 8 Wts.

12. Retirar el gel de agarosa.

13. Se fija por 30min.

Solución fijadora

5% ácido sulfosalicilico.

10% ácido tricloroacetico.

Agua destilada 850ml.

14. El gel es lavado en dos ocasiones con la solución desteñidora durante 15 min.

Cada vez.

La composición de la solución decolorante es:

35% metanol

10% ácido acético

agua destilada.

39

15. El gel es secado completamente en un horno a 80 ºC de 30-40 min.

16. Después del secado se pone con la solución colorante de 5-10 min.

Solución colorante:

0.2% de azul de comassie R250.

Disuelto en la solución decolorante.

17. Después se coloca en la solución decolorante de 15-30 minutos hasta que

desaparezca el color del fondo del gel.

18. Por último secarlo de nuevo.

40

A continuación se presentan los resultados de las corridas electroforéticas

realizados a los extractos hidrolizados de cabeza de camarón, así como la

interpretación de los mismos.

3.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS.

En la Tabla 11 se muestran los valores de proteína soluble de los extractos

hidrolizados de cabeza de camarón de bahía.

Tabla 11. Contenido de proteína del extracto hidrolizado de cabeza de camarón de

bahía.

Muestra Proteína soluble (mg/ml).

EA 4.58

EL 4.58

QC 4.58

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

41

Los contenidos de proteína presentan un promedio 4.58 mg/ml de los extractos

hidrolizados. Se considera que no hay variación en la forma de extracción de la

muestra, ya sea una extracción por hidrólisis química, enzimática o ensilado por

fermentación láctica. Debido a que tienen el mismo contenido de proteína.

3.1.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida.

A continuación se muestran las placas de gel de poliacrilamida (Figura 9 y 10)con

los pesos moleculares de proteínas presentes determinados por electroforesis,

empleando geles del 12% de poliacrilamida de 0.75 mm de espesor en los cuales se

utilizaron marcadores de bajo peso molecular de SIGMA.

Las placas de gel de poliacrilamida realizadas a los extractos hidrolizados de

cabeza de camarón mostraron zonas azules sobre un fondo azul un poco más claro

del gel entre 66,000 y 20,000 Da, lo que presenta zonas de peso molecular. En

esta placa se puede observar que la diferencia en la extracción de los hidrolizados

es que la EA tiene proteínas de 36, 000 Da mientas que en EL y QC no se

encuentra presente tomando en cuenta que la EA no contiene la proteína de peso

molecular de 29,000Da y EL y QC si la contienen.

42

Figura 9. Proteínas de los extractos hidrolizados de cabeza de camarón en una

placa de gel de poliacrilamida con el marcador de pesos moleculares.

DDaa 6666,,000000 4455,,000000 3366,,000000 2299,,000000 2244,,000000 2200,,000000

1144,,220000

PPMM EEAA EELL QQCC EEAA EELL QQCC

43

DDaa 6666,,000000 4455,,000000 3366,,000000 2299,,000000 2244,,000000 2200,,000000

1144,,220000

PPMM EEAA EELL QQCC EEAA EELL QQCC


placa de gel de poliacrilamida con el marcador de pesos moleculares.

44

3.1.2 Electroforesis en gel de agarosa.

La proteínas también pueden separarse electroforéticamente según sus contenidos

relativos en aminoácidos ácidos o básicos. En las Figuras 11 y 12 se muestran las

placas con gel de agarosa en el cual se utilizaron anfolitos de un rango de pH 10-

3 y también un marcador de bajo peso molecular de SIGMA.

En las placas de gel de agarosa se puede observar que el marcador de peso

molecular va del rango de pH 9.6 – 4.1. En los extractos de hidrolizados de cabeza

de camarón no se encuentra diferencia alguna en cuanto a su punto isoeléctrico

puesto que los extractos hidrolizados EA, EL, QC presentan las mismas bandas en

todas las extracciones.


placa de gel de agarosa.

PPMM EEAA EELL QQCC PH 9.6 9.4

8.6 8.0 7.4

7.0 6.1 4.1

45


placa de gel de agarosa.

PP MM EE AA EELL QQCC ppHH

4.1

9.6 9.4 8.6 8.0 7.4 7.0 6.1

46

En los extractos hidrolizados de cabeza de camarón no existe diferencia en

cuanto a contenido de proteína puesto que contienen la misma cantidad de

proteína.

En la determinación de bandas en las placas de gel de poliacrilamida en

cuanto a cantidad de numero de bandas no existe diferencia alguna, pero

la diferencia existe en el tipo de extracción del hidrolizado debido a que en

EA contiene la banda de 36,000 Da, y los hidrolizados EL y QC no la

contiene, presentando estas una banda de 29,000 Da que no contiene EA.

CONCLUSIÓN

47

En las placas de gel de agarosa, los extractos hidrolizados de cabeza de

camarón de bahía, no tuvieron diferencia alguna en cuanto al número de

bandas y la colocación del punto isoeléctrico de las proteínas.

Por los resultados obtenidos de los extractos hidrolizados de cabeza de

camarón, se considera que es más conveniente la utilización de los

hidrolizados químicos y enzimáticos; por su rapidez de extracción en

comparación con la fermentación láctica y no encontrarse una diferencia

en cuanto a contenido de proteínas determinada por método Bradford.

48

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I. MARCO DE REFERENCIA

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