I Conferencia Nacional de BiotecnologíaLima, 12 y 13 de Mayo 2009

Perspectivas de la Biotecnología Aplicada a los Recursos Hidrobiológicos del Perú

APLICACIONES EN ACUICULTURA

Susana Sirvas Cornejo, PhD

Aspectos a saber para una acuicultura razonada:

• Rasgos de vida, reproducción y crecimiento de la especie a cultivar.

• Genética de la especie.

• Nutrición en los diferentes estadíos de desarrollo (Requerimientos nutricionales).

• Enfermedades potenciales de la especie.

• Condiciones del medio de cultivo.

Desconocimiento de cualquiera de estos aspectos podría conducir a un mal manejo de la especie.

EFECTO DE DIETAS MICROENCAPSULADAS SUPLEMENTADAS CON UNA BACTERIA

GENETICAMENTE MODIFICADA SOBRE EL DESARROLLO DE POSTALRVAS DE

Fenneropenaeus indicus

Sirvas S., Latchford J. W., y Jones D. A.

Journal of Aquaculture Nutrition, 2007, 13, p. 10 -16

Financiamiento:

- Overseas Development Administration – ODA (British Council)- Recursos propios

School of Ocean Sciences - SOSUniversity of Wales, Bangor, Reino Unido de La Gran Bretaña

INTRODUCCION

- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990a) Ontogenetic change in

digestive enzyme activity in larval and postlarval white shrimp Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda, Penaeidae). Biol. Bull., 178: 144-159.

- Lovett, D.L. & Felder, D.L. (1990c) Ontogenetic changes in

enzyme distribution and midgut function in developmental stages of Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda; Penaeidae). Biol. Bull. Woods Hole, 178: 160-174.

- Jones D. A. et al. (1993) The Potential for Replacement of Live

Feeds in Larval Culture. Journal of World Aquaculture Society, Nº 2, 24: 199 – 210.

- Kolkovsky et al. (1990) The use of exogenous digestive enzymes to

improve microdiets for gilthead seabream (Sparus aurata) larval rearing. International Symposium on Development and Aquaculture of MarineLarvae held in Bergen, Norway, 12 – 15 August 1990.

- Munilla-Moran et al.(1990) The role of exogenous enzymes in

digestion in culture turbot larvae (Scophthalmus maximus L.). Aquaculture,88:337-350

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN DIFERENTES ESTADIOS DE DESARROLLO LARVAL Y POSTLARVAL EN ESPECIES DE PECES Y

CRUSTACEOS.

ANTECEDENTESPROBLEMAS

- Mortalidad alta

- Tasa de crecimiento baja

CAUSAS

- Indigestibilidad

del alimento

HIPOTESISUn suplemento de enzimas digestivas

microbianas en la dieta incrementaría

la digestibilidad de la misma en

postlarvas de camarón.

Los camarones requieren enzimas digestivas en

estadíos tempranos de desarrollo:

principalmenteProteasas del tipo

tripsina

Aeromonas hydrophila (PERO…potencialmente patógena)

Aislar sólo el gen de proteasa de A.h. Pm

La Mancha

Negra

Propuesta: Uso de cepas bacterianas productoras de proteasastipo tripsina.

¿Cuándo clonar?

Cuando otros métodos no representan la mejor estrategia de solución.

Objetivo General

MEDIR EL EFECTO DE DIETASSUPLEMENTADAS CON UNA CEPA

BACTERIANA GM, EN EL DESARROLLO Y SUPERVIVENCIA DE

POSTLARVAS DE CAMARON.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Identificación de la cepa donadora (API 20 NE)

2. Clonación y expresión del gen de proteasa de la cepa donadora en Escherichia coli XL1-Blue (Contiene parte del gen de la β-galactosidasa, Bullock,1977).

3. Perfil de proteínas y ensayos enzimáticos en cepa donadora y en la clona productora de proteasa.

4. Secuenciado del gen de proteasa.

5. Preparación de dietas microencapsuladas suplementadas con la cepa productora de proteasa, y bioensayos con postlarvas de Fenneropenaeus indicus.

MATERIALES Y METODOSMATERIALES

Materiales para Clonación

Cepas

bacterianas : Aeromonas hydrophila Pm (c. donadora)

Escherichia coli XL1 Blue (c. receptora)

Plasmidios : pUC19, pP635

Enzimas : Sau3AI, HindIII, PstI, BamHI

proteinasa K, fosfatasa alcalina, ligasa T4

Medios

de cultivo : Caldo y agar nutritivo, caldo LB, caldo y

agar LB-TET-AMP, agar Leche,

agar TET-AMP-X-GAL-IPTG

MATERIALES …continuación

Materiales para Secuenciado

Clona E. coli XL1p635 (conteniendo gen proteasa)

Plasmidio pP635

Primer M13 (forward)

Primer M13 (reverse)

Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Didesoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

Polimerasa T7

Celda de electroforesis GT Sequi-Gen (BIO RAD)

Acrilamida / bisacrilamida

Papel hiper fotográfico, soluciones de revelado

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Y METODOS

Materiales para Bioensayos

Dieta CD2 : comercial Frippak CD2 (INVE)

Dieta 2 : CD2 reencapsulada

Dieta XL1 : Dieta 2 + E. coli XL1Blue (no proteasa)

Dieta 635 : XL1 + E. coli XL1p635 (proteasa)

Dieta 7 : XL1 + E. coli XL1p7 (lipasa)

Microscopio

300 postlarvas de F. indicus (PL1)

15 recipientes de 5 L c/u

MATERIALES …continuación

METODOS

Para Clonación

Extracción de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989)

Extracción de ADN Plasmídico : Birnboim y Doly (1979)

Digestión de ADN Cromosomal : Sambrook et al. (1989)

Unión ADN cromosomal y plasmidio

(Ligation) : King (1986)

Transformación : Sambrook et al. (1989)

Prueba de Alfa complementación : Sambrook et al. (1989)

Electroforesis : Sambrook et al. (1989)

Para Secuenciado : Sanger et al. (1977)

Análisis de la secuencia del gen : PC, Genetic Computing

Group (GCG) paquete

SEQNET, Daresbury,

England

MATERIALES Y METODOS

Para Bioensayos

Se llevaron a cabo 5 tratamientos, cada uno por triplicado,

colocando 20 PL1 en cada recipiente.

Temperatura del agua : 28 °C

pH : 8.0 – 8.3

Salinidad : 3.3 %

Alimentación : 3 veces al día (15 % biomasa)

Longitud total : cada 2 días

Supervivencia : monitoreada cada 2 días

El tamaño de microcápsulas se analizó con un ANVA y con la prueba de Tukey Kramer. El proceso de disolución de las mismas, con ANVA y con la prueba de Scheffe.

El desarrollo y la supervivencia se analizaron con ANVA , y Tukey Kramer.

3. MATERIALES Y METODOSMETODOS …continuación

Vector Fragmentos de ADN del organismo donador

Construcción de moléculas de ADN recombinanteCada una contieneun fragmento diferente

Se introducen en una bacteria receptora

Se cultivaen placa

Cada colonia contiene múltiples copiasde sólo una molécula de ADN recombinante

CONSTRUCCIÓN

DE MOLÉCULAS

DE ADN

RECOMBINANTE

RESULTADOS

LB-AMP-TET-XGAL-IPTG

MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA IDENTIFICACION DE CLONAS:

Expresión de β-galactosidasa

RESULTADOS

PRUEBA DE ALFA-COMPLEMENTACION

Las

colonias

blancas

son

clonas,

las

azules,

no lo son.

RESULTADOS

PRUEBA DE PROTEASA A.h.Pm 635

XL1-Blue

Halo de degradación

de lasproteínasde la leche.

RESULTADOS

AGAR LECHE

PERFILES DE PROTEINAS

CELULARES Y EXTRACELULARES

RESULTADOS

ACTIVIDAD ENZIMATICA

La actividad de proteolítica

(trypsina) fue mayor en las clonas

que en la cepa donadora:

A.hydrophila Pm: 1.7156 unid./mg E. coli XL1pP635: 2.4950 unid./mg.

RESULTADOS

Secuencia de nucleótidos delinserto en el plasmidio pUC19

Marco de lectura

abierto (ORF) desde posición

371 hastaposición 886.

60

961

ANALISIS DE LA SECUENCIA DE ADN DEL GEN DE PROTEASA EN EL PLASMIDIO pP635

SEQNET - GRUPO DE COMPUTACION GENETICA - GCG

DARESBURY – REINO UNIDO

FRAMES.- Determinó marcos de lectura abiertos (ORF)

TRANSLATE.- Determinó la secuencia de aminoácidos

BESTFIT.- Comparó la secuencia con otras secuencias de

las bases de datos

DIAGRAMA DE ESTRUCTURA DE PEPTIDOS.-

Determinó la afinidad por el agua de la molécula. Identificó

sitios de glicosilación

MAP.- Determinó lugares de corte para enzimas de restricción

RESULTADOS

PLASMIDIO pP635

RESULTADOS

Nombres FAO:

Español: Langostino blanco de la IndiaFrancés: Crevette royale des IndesInglés: Indian white shrimpNombre local: Kiri issaTamaño: Máximo 18 cm en machos y 23 cm en hembras.

Fenneropenaeus indicus

BIOENS

AYOS

4. RESULTADOS DE LOS

FORMULACIÓN DE LAS DIETAS

CD2 : Dieta ME comercial Frippak CD2D2 : 5 g CD2 + 5 g Hb + 50 mL H2OXL1 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa XL1635 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 6357 : 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H2O +1 % cepa 7

Donde: Hb (hemoglobina), XL1 (cepa E. coli XL1Blue pUC19), 635 (cepa E. coli XL1pP635, productora de proteasa del tipo tripsina), y 7 (cepa E. coli

XL1p7,productora de lipasa)

MICROCAPSULAS CONTENIENDO LA CEPA E. coli XL1pP635,PRODUCTORA DE TRIPSINA, ANTES DE SER DIGERIDAS PORLA CEPA.

MICROCAPSULASDESPUES DE SERDIGERIDAS POR LA CEPA E. coli XL1pP635.

RESULTADOS

MICROCAPSULAS

DE HEMOGLOBINA

EN PROCESO DE

DIGESTION

RESULTADOS

DIETAS MICRO -ENCAPSULADASEN SOLUCION.

POSTLARVA DE Fenneropenaeus indicus DESPUES DEINGERIR LADIETA 635.

RESULTADOS

EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN EL DESARROLLO DE POSTLARVAS DE Fenneropenaeus indicus.

CD2 : SIN ENZIMA140 µm

D2 : SIN CEPA NI ENZIMA

218 µm

XL1 : CON CEPA SIN

ENZIMA

218 µm

635 : PROTEASA(TRIPSINA)218 µm

7 : LIPASA218 µm

635

CD2

7

XL1, D2

RESULTADOS

EFECTO DE CINCO DIETAS MICROENCAPSULADAS EN LA SUPERVIVENCIA DE POSTLARVAS DE

Fenneropenaeus indicus.

DIETA % SUPERVIVENCIA

CD2 (CONTROL)

D2 (SIN CEPA)

XL1 (CON CEPA SIN PROTEASA)

635 (CON CEPA Y CON PROTEASA)

7 (CON CEPA Y LIPASA)

83.3376.6755.0083.3371.67

RESULTADOS

CONSIDERACIONES DE BIOSEGURIDAD

En caso de un posible escape de la cepa GM al medio:

• Cuando la cepa ingresa al estómago del camarón, las condiciones para su supervivencia no so favorables, ya que el pH del estómago del camarón es ácido (5.0-7.0) (Dall et al., 1990), y esta cepa no puede desarrollar a un pH de 5 o menos (Sirvas, 1999).

• La cepa receptora o huésped (E. coli XL1-Blue), había sido probada ser no patógena para seres humanos (Bullock et al. 1987).

• Trabajos posteriores mostraron que la cepa GM no se hallaba presente en el medio de cultivo de los camarones, luego de ser alimentados con las dietas suplementadas.

Malecón de La Marina, Miraflores, Lima

GRACIAS