Anlisis Bioqumicos Clnicos EspecialesDELFIA Y QLA Equipo 3:

Las mediciones de hormonas, tuvieron un desarrolo muy importante desde que Yalow y Berson crearon en 1959 el primer radioinmunoanlisis (RIA) para insulina. Desde entonces, se ha incrementado la bsqueda de mtodos no radioisotpicos, ms sensibles para la determinacin de hormonas. Los desordenes endocrinos, pueden ser detectados por medio de ensayos realizados en un Laboratorio Clnico, y es responsabilidad del laboratorio garantizar la veracidad de dichos datos.

En el caso del laboratorio de endocrinologa, el inmunoanlisis es el mtodo ms empleado para la cuantificacin de la mayor parte de las hormonas. Cabe destacar sin embargo la existencia de mtodos ms complejos y laboriosos, que requieren una infraestructura apropiada y un personal experimentado, que suelen estar reservados para los laboratorios de referencia. Tal es el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

El principio de los inmunoanlisis se basa en la reaccin de unin que tiene lugar entre la sustancia a determinar, que acta como antgeno, y un anticuerpo especfico contra dicha sustancia.

Inmunoanlisis Homogneos: El compuesto marcado presenta un comportamiento diferente segn se halle o no unido a un anticuerpo

Inmunoanlisis Heterogneos: El compuesto marcado se comporta de forma anloga, est no unido a su contrapuesto inmunitario, por lo que se hace necesaria la separacin de las fracciones ligada y libre para su determinacin

Un mtodo ms sensible, utilizado en la cuantificacin de hormanas, corresponde al Fluoroinmunoanlisis de disociacin aumentada por lantanidos. Se basa en la utilizacin de compuestos fluorescentes para el marcaje de los inmunocomplejos. La principal caracterstica que han de poseer estos compuestos es una intensidad de fluorescencia elevada, claramente diferenciable de la fluorescencia de fondo presente en los fluidos biolgicos e inalterable tras su unin a los antgenos o anticuerpos.

La QL se define como la emisin de radiacinelectromagntica (normalmente en la regin del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reaccin qumica. Cuando esta emisin proviene de organismos vivos o sistemas derivados de ellos, se denomina bioluminiscencia.

Para que una reaccin qumica emita luz, debe reunir algunos requisitos bsicos:la reaccin debe ser exotrmica y producir la suficiente energa para formar el estado electrnicamente excitado.los requisitos energticos pueden establecerse en trminos de G (Kcal.mol-1):

El camino de reaccin debe ser favorable a canalizar la energa hacia la formacin de un estado electrnicamente excitado. En el caso de que la energa qumica se disipe en forma de calor, mediante vibraciones o rotaciones moleculares, la reaccin no ser quimioluminiscente.

la emisin de un fotn debe ser un proceso desactivacin del producto excitado favorable en relacin a otros procesos no radiantes que pueden aparecer en pequea proporcin, como disociacin molecular, reacciones qumicas con otras especies, transferencia de energa intra- o intermolecular, isomerizacin o atenuacin fsica.

REACCIN DIRECTA:Substrato + ox +cofactor + catalizador producto o intermedio de la reaccin.

parte del producto o intermedio pasa a un estado electrnicamente excitado, que puede a continuacin relajarse hasta el estado fundamental con emisin de un fotn. El substrato es el precursor QL, que se convierte en la molcula excitada electrnicamente, responsable de la emisin deluz, o bien acta para transferir la energa en la QL indirecta.

REACCIN INDIRECTA:En el caso de molculas que no pueden emitir directamente QL, este proceso permite transferir su exceso de energa a un fluorforo que a su vez es excitado, volviendo a su estado fundamental con la emisin de un fotn.

La estructura qumica del precursor quimioluminiscente, no solamente la parte que contiene al grupo excitado electrnicamente, sino tambin las cadenas laterales.La naturaleza y concentracin de otras sustancias que afectan el proceso de QL y que favorecen otros procesos competitivos no radiantes.El catalizador seleccionado.La presencia de iones metlicos, especialmente metales de transicin implicados en el proceso de oxidacin.

La temperatura pH y fuerza inica La hidrofobicidad del disolvente y la composicin de la disolucin (por ejemplo, la fQL del luminol oxidado en dimetilsulfxido (DMSO) es 0.05 comparado con 0.01 en agua, siendo los colores azulvioleta (425 nm) y verde-azulado (480-502 nm), respectivamente)La presencia de aceptores de la energa transferida

Como la velocidad de la reaccin es funcin de las concentraciones de reactivos, la QL es una tcnica adecuada para el anlisis cuantitativo.La tcnica comprende simultneamente caractersticas cinticas y luminiscentes, por lo que proporciona una alta sensibilidad y un amplio rango dinmico. Si es lo suficientemente alta, se pueden alcanzar lmites de deteccinexcelentes, en el rango de los femtomoles.

no se requiere fuente de excitacin externa, por lo tanto hay ausencia de dispersin y seales fotoluminiscentes de fondo, la desaparicin de problemas relacionados con la inestabilidad de la fuente externa, reduccin de interferencias debidas a procesos de excitacin no selectivos, y una instrumentacin ms simple.

La selectividad y la linealidad son ms dependientes de la reaccin y de las condiciones de reaccin escogidas.Las reacciones quimioluminiscentes pueden acoplarse fcilmente como mtodo de deteccin en cromatografa, EC o inmunoensayo, proporcionando informacin cualitativa o cuantitativa sobre una gran variedad de especies en las fases gaseosa y lquida.

Una de las ventajas ms importantes de la QL como tcnica analtica es la simplicidad de la instrumentacin, que incluye como componentes principales: una clula de reaccin, un compartimento cerrado a la luz, un dispositivo de inyeccin y mezcla de reactivos y/o de muestra, un detector de luz y un sistema de adquisicin y procesador de seal.

Un anticuerpo monoclonal cubre las superficie de los pocillos y otro anticuerpo monoclonal es etiquetado con peroxidada de equino, el cual es usado como rastreador. Las molculas de LH presentes en el estndar o el suero son emparedadas entre los dos anticuerpos. Siguiendo la formacin del complejo anticuerpo recubierto-antigeno-anticuerpo-enzima. Las etiquetas desadheridas anticuerpo- enzima son removidas mediante el lavado. La peroxidada de equino limitado en los pocillos es analizado por reacciones quimioluminicientes. La Unidad de Luz Relacionada (RLU) es proporcional a la concentracin de LH presente en la muestra.