Histología.

Técnicas histológicas.

Microscopía. Prof. Tomás Atauje Calderón

Histología

Obstetricia – Ciclo III

Histología

• Proviene de los vocablos griegos: ▫ “Histos”: Tejido ▫ “Logía”: Tratado o estudio

• Es una disciplina que estudia todo lo relacionado con los tejidos orgánicos, su estructura microscópica, su desarrollo y sus funciones.

• También se le puede llamar Anatomía microscópica, ya que no solo estudia los tejidos sino que también observa el interior de las células.

• Las primeras investigaciones histológicas fueron posibles gracias a la incorporación del microscopio a los estudios anatómicos.

Clasificación

• Ya que solo se reconoce la presencia de tejidos en dos grupos de organismos, se consideran dos tipos:

▫ Histología vegetal: Estudio de los tejidos vegetales (plantas vasculares).

▫ Histología animal: Estudio de los tejidos animales (metazoos).

*Solo se consideran 4 grupos fundamentales dentro de los tejidos animales: Epitelial, conectivo (el más diverso), muscular y nervioso.

Técnicas histológicas • Casi todos los componentes de las células y de la matriz extracelular

son transparentes, así que para diferenciar los tejidos usaremos colorantes. Sin embargo la mayoría de los colorantes son tóxicos y las células vivas no los resisten.

• Par tal motivo, antes de ser coloreados, los tejidos son fijados, es decir, muertos mediante procedimientos que producen la menor distorsión posible de las células y de la matriz extracelular; incluidos en materiales dotados de cierta consistencia y cortados en laminillas muy delgadas, capaces de ser atravesadas por la luz.

• La mayoría de los preparadas histológicos que el estudiante observa con el microscopio óptico corresponden a tejidos fijados con formol al 10%; incluidos en parafina, cortados en laminillas muy delgadas y coloreados con hematoxilina y eosina.

*Las piezas se extraen después de matar al animal mediante una sobredosis de

anestésico o por un traumatismo craneano; también se utiliza material procedente de biopsias 0 de autopsias humanas (que deben ser realizadas inmediatamente después de producida la muerte).

Fijación • La fijación del material es esencial para preservar la morfología y la composición

química de los tejidos y las células. Consiste en la muerte de estas ultimas de una manera tal que las estructuras que presentan en vida se conserven con un mínima distorsión.

• La elección del fijador depende del estudio que se desea realizar. En lo posible, el fijador debe: Actuar con rapidez, matando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos; poseer un alto grado de penetración, a fin de que se fijen todas las partes de la pieza; conservar los detalles estructurales que presentaban los tejidos cuando estaban vivos; evitar que desaparezcan ciertos compuestos tisulares y favorecer los siguientes pasos, como la inclusión, el corte y la coloración del material.

• Conviene fijar piezas pequeñas, que no excedan el centímetro de lado. El volumen del fijador debe ser 40 a 50 veces superior al volumen de las piezas. La fijación con formol al 10% dura unas 6 horas. Para estudios que exigen una muy buena conservación de las estructuras, el fijador se perfunde por vía sanguínea en el animal anestesiado, lo cual permite que llegue rápidamente a todos los tejidos.

Inclusión • Para que el material pueda ser cortado en laminillas muy delgadas debe ser

incluido en un material que le confiera cierta consistencia. Si el tejido va a ser coloreado con métodos convencionales, se lo suele incluir en parafina, que es sólida a la temperatura ambiente pero funde entre los 50 y los 60 °C.

• Por último, la pieza se sumerge en un pequeño recipiente cúbico con parafina líquida (fundida a unos 55 °C), que al enfriarse se convierte en un bloque sólido llamado vulgarmente taco, con el tejido incluido en su interior.

• El taco se corta mediante instrumentos llamados micrótomos, que permiten obtener laminillas de 2 a 15 μm de espesor, suficientemente delgadas como para que la luz pueda atravesarlas. Cada corte es montado sobre un portaobjeto y despojado de la parafina mediante baños de xileno.

• Cuando se desea mantener la composición quimica de ciertos componentes celulares, se emplean micrótomos dentro de cámaras enfriadas con CO2 líquido lIamados micrótomos de congelaci6n 0 criostatos.

• Debido a que producen una aceptable fijación y no requieren inclusión, permiten efectuar cortes de tejidos frescos, destinados a la realización de estudios citoquímicos.

Micrótomo

Coloración • La mayoría de los colorantes histológicos son sales de naturaleza

orgánica. Se clasifican en básicas y ácidas. En los primeros, el grupo cromóforo es básico (catiónico), pues es capaz de unirse con grupos tisulares de carga negativa. En cambio, en los segundos el grupo cromóforo es acido (aniónico), pues se combina con grupos tisulares de carga positiva.

• La mayoría de los preparados que analizan los estudiantes están teñidos con hematoxilina y eosina. La hematoxilina tiñe los núcleos de color violeta oscuro y la eosina tiñe los citoplasmas y la matriz extracelular con distintos tonos de rojo.

*Los componentes de los tejidos que se tiñen con colorantes básicos se

llaman basófilos; los que se tiñen con colorantes ácidos se llaman acidófilos.

• Una vez terminado el proceso de coloración. se coloca sobre el

preparado una laminilla cubreobjeto, que se adhiere con un líquido especial (bálsamo de Canadá).

Métodos histoquímicos

• Los métodos histoquímicos permiten identificar compuestos químicos en sus localizaciones tisulares originales. Estos métodos no sol0 son cualitativos sino también cuantitativos.

• Además, a veces involucran el estudio de los

cambios dinámicos producidos en el contenido químico durante distintos estadios funcionales de los tejidos. L0 cual ha permitido establecer la función de algunos componentes tisulares en varias procesos metabólicos.

Histoquímica • Para la determinación histoquímica de una sustancia se deben cumplir los

siguientes requisitos:

▫ Debe ser inmovilizada en su posición original.

▫ Debe ser identificada por un procedimiento que sea especifico para ella 0 para un grupo químico que contenga.

• Para detectar proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos se emplean agentes cromógenos que son capaces de unirse selectivamente a denominados grupos químicos de esas moléculas.

• Entre ellos tenemos:

• Reactivo de Schiff: Es selectivo de los grupos aldehído, de modo que sirve para detectar el ADN y algunos lípidos e hidratos de carbono.

• Reacción de Feulgen: EI ADN puede ser detectado por medio de la reacción de Feulgen. Para ello, los cortes del tejido fijado se someten a una hidrólisis ácida débil y luego se tratan con el reactivo de Schiff.

• Reacción de PAS (Periodic Acid-Schiff): Se basa en la oxidación, mediante el ácido peryódico, de los grupos glicólicos 1-2' de los polisacáridos, lo cual produce la liberación de los grupos aldehído, que entonces reaccionan con el reactivo de Schiff.

Histoquímica

• Colorantes liposolubles: La detección de lípidos en tejidos fijados por congelación puede lograrse mediante el tetróxido de osmio (ácidos grasos no saturados de los triacilgliceroles), Sudan IV o rojo escarlata (gotas lipídicas) y Sudan negro B (fosfolípidos y colesterol).

• Estudio de las enzimas: Para que ciertas enzimas puedan ser reveladas, los cortes deben realizarse can el crióstato. Otras resisten una breve fijación en acetona fría, formaldehido 0 glutaraldehido.

• Fluorescencia: Los componentes tisulares pueden ser descubiertos por la fluorescencia que emiten, que puede ser natural (derivada de sustancias normales de los tejidos) o secundaria (inducida por colorantes fluorescentes llamados fluorocromos). Algunas proteínas pueden ser marcadas con los fluorocromos mencionados, ser inyectadas en el animal y detectadas en las céulas o en la matriz extracelular.

• Trazadores: Permiten detectar las vías de transporte de ciertas sustancias, tanto dentro de las células como fuera de ellas. Los trazadores suelen ser enzimas cuyos productos son opacos a los electrones.

Inmunohistoquímica

• Se basa en las propiedades antigénicas de las proteínas tisulares que pueden detectarse mediante anticuerpos marcados. Cada anticuerpo posee dos sitios de fijación para la proteína (0 antígeno).

• Una vez formado, el complejo antígeno-anticuerpo se conjuga con marcadores especiales, los cuales se revelan con la ayuda del microscopio óptico común, del microscopio de fluorescencia o del microscopio electrónico.

• El anticuerpo puede unirse a las enzimas peroxidasa, fosfatasa

alcalina o galactosidasa; también puede conjugarse con fluorocromos o con ferritina.

*Otra técnica inmunohistoquímica (que utiliza el microscopio

electrónico) se basa en el usa de partículas de oro coloidal.

Radioautografía • Se basa en la marcación de ciertas sustancias con un

radioisotopo, el cual se descubre porque es capaz de interactuar con los cristales de bromuro de plata de las emulsiones fotográficas.

• Así, tras ser marcada, la sustancia que se investiga se incorpora al tejido y se localiza en el preparado histológico mediante una emulsión fotográfica. Para ello, el preparado se pone en contacto con la emulsión fotográfica durante un breve periodo y la radioautografía se revela como una fotografía común.

• La localización del radioisotopo (que se distingue porque

forma puntitos brillantes sobre un fondo oscuro) se descubre cuando la radioautografía se superpone a la imagen de un corte tisular inmediato, procesado para ser visto con el microscopio óptico o con el microscopio electrónico.

Miscroscopía

• Conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que, por ser pequeños, están fuera del rango de visión normal.

• Anton Van Leewenhoek logró fabricar lentes lo suficientemente

poderosos para observar bacterias hongos y protozoos (animáculos). • El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert

Hooke, quien estudió cortes de corcho y denominó a los pequeños poros en forma de caja que había observado como “células”.

• El proceso de la microscopía se basa en hacer pasar un haz de luz

visible a través de lentes ópticos (simples o múltiples) para lograr una vista ampliada de la muestra. Las imágenes resultantes pueden ser observadas directamente; impresas en una placa fotográfica o registradas digitalmente.

Microscopio óptico

• Consta de dos sistemas de lentes convergentes llamados objetivo y ocular que están separados por una distancia definida y alineados en un mismo eje. Al sumarse sus respectivos aumentos, ambos sistemas concurren para la formación de la imagen microscópica definitiva.

• Un microscopio óptico de modelo mediano (monocular 0

binocular) que habitualmente es usado por los estudiantes, posee una parte mecánica y una parte óptica.

• La parte mecánica es la montura del microscopio. Está representada por el pie, la columna, el tubo, los mecanismos de movimiento, la platina y la subplatina. La parte óptica está compuesta por el objetivo, el ocular y el aparato de iluminación.

Microscopio óptico y Estereoscopio

Microscopio de contraste de fase • Se utiliza para estudiar las células y los tejidos vivos. Aprovecha los

cambios (retrasos) de fase que se producen en los rayos de luz cuando atraviesan ciertas estructuras biológicas.

• Los componentes celulares poseen índices de refracción diferentes de los del medio, de modo que, si bien la amplitud de onda de la luz que los atraviesa no cambia, si lo hace su velocidad, que se retrasa (cambio de fase). Este retraso ocurre en el interior del material observado y prosigue después que el rayo lo abandona.

• En este microscopio, los rayos periféricos atraviesan el objetivo con

un adelanto o un retraso de un cuarto de longitud de onda respecto a los rayos centrales, que son los que inciden sobre el preparado. Debido a que las dos longitudes de onda se suman, cuando hay una diferencia positiva a favor de los rayos centrales, el material aparece mas brillante que el medio que lo rodea. En cambio cuando la diferencia es negativa, el material aparece mas oscuro que el medio.

Microscopio de contraste de fase

Microscopio de interferencia

• Se basa en principios similares a los del microscopio de contraste de fase, pero tiene la ventaja de proporcionar resultados cuantitativos.

• Este instrumento es capaz de discriminar

diferencias muy pequeñas entre los índices de refracción.

• Además las variaciones de fase pueden generar

colores a veces tan acentuados que parece que las células vivas fueron teñidas.

Microscopio de interferencia

Microscopio de fondo oscuro

• En este microscopio la luz se dispersa en el deslinde entre los componentes celulares, siempre que estos posean índices de refracción distintos.

• El microscopio posee un condensador que ilumina el material de manera oblicua. La luz directa no ingresa en el objetivo, de modo que, a causa de la dispersión de la luz, el material brilla en media de un fondo oscuro.

• Por ejemplo, en una célula cultivada, el nucléolo, la

membrana celular, las mitocondrias y las gotas de lípidos aparecen brillantes y se destacan sobre el fondo oscuro del resto del citoplasma.

• Por medio de este instrumento se pueden descubrir estructuras mas pequeñas que las que se ven con el microscopio óptico común.

Microscopio de fondo oscuro

Microscopio de luz ultravioleta • Emplea una luz cuya longitud de onda mide menos de la

mitad de la longitud de onda de la luz visible, lo que le permite aumentar el poder de resolución del objetivo. Además, debido a que la luz ultravioleta es invisible para el ojo humano pero impresiona las películas fotográficas, el ocular de este microscopio se halla acoplado a una cámara fotográfica.

• Como los rayos ultravioletas no atraviesan el vidrio, se utilizan

objetivos cuyas lentes son de cuarzo (material que también se usa para fabricar los portaobjetos y los cubreobjetos). Y ya que estos rayos dañan la vista, es necesario observar los preparados con lentes protectores.

*El microscopio de luz ultravioleta se emplea para detectar los ácidos

nucleicos (revela sus bases purínicas y pirimidínicas).

Microscopio de luz ultravioleta

Microscopio de polarización

• Difiere de los microscopios ópticos comunes porque posee dos elementos adicionales: El analizador, situado entre el observador y el objetivo; y el polarizador, que se encuentra por debajo del condensador. Ambos contienen unos cristales especiales. denominados prismas de Nicol, que polarizan la luz (la hacen vibrar en un solo plano).

• Este microscopio se basa en el comportamiento de la luz polarizada

cuando atraviesa los elementos tisulares. Así, cuando los atraviesa siempre a la misma velocidad (cualquiera que sea el plano de incidencia) se dice que son isótropos 0 monorrefringentes, pues poseen un solo índice de refracción. En cambio, si los atraviesa a velocidades que varían según el plano de incidencia de la luz, se dice que son anisótropos o birrefringentes, debido a que los elementos poseen dos índices de refracción distintos (dos velocidades de transmisión de la luz polarizada).

Microscopio de polarización

Microscopio de fluorescencia

• Cuando la luz ultravioleta incide sobre ciertos componentes tisulares hace que emitan colores de longitudes de onda superiores a las originales, los cuales se destacan en un fondo oscuro.

• Al igual que con el microscopio de luz ultravioleta, el

operador debe proteger su vista de las radiaciones. • Este microscopio se utiliza cuando se realizan

estudios histoquímicos e inmunohistoquímicos basados en el uso de colorantes fluorescentes.

Microscopio de fluorescencia

Microscopio confocal

• Es capaz de revelar las estructuras de los tejidos con gran nitidez, puesto que el preparado es iluminado con rayos láser, que enfocan un solo plano del tejido y lo recorren horizontalmente punta por punta. Para ello, el microscopio confocal utiliza un sistema de espejos móviles que desplazan a los rayos láser sin que abandonen el plano enfocado. Además, las imágenes de los planos del tejido situados par arriba y por debajo son eliminadas por una computadora acoplada al microscopio.

• Dado que se pueden analizar todas las capas del preparado y

que las imágenes derivadas de cada capa pueden guardarse en la memoria de la computadora, es posible (mediante un programa especial) confeccionar imágenes tridimensionales del tejido.

Microscopio confocal

Microscopio electrónico de transmisión • Es un instrumento que permite conocer la ultraestructura de las

células y de la matriz extracelular, ya que posee un poder de resolución mayor que el del microscopio óptico. Utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo electrostático o electromagnético, de la misma forma que un rayo de luz se refracta cuando atraviesa una lente.

• EI poder de resolución del microscopio electrónico es tan alto que la

imagen del objetivo puede ser aumentada por el ocular en una proporción mucho mayor que la lograda con el microscopio óptico. Así, con un aumento inicial del objetivo de 100x, se puede ampliar la imagen con la bobina proyectora unas 200 veces, lo que equivale a un aumento de 20.000x.

• Con los instrumentos modernos se obtienen incrementos todavía mayores. ya que poseen lentes intermedias que permiten lograr aumentos de hasta 1.000.000x. Además, los negativos fotográficos pueden a su vez ampliarse.

Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de barrido • Con el microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning

Electron Microscope) se pueden obtener imágenes topográficas tridimensionales de los materiales sujetos a estudio.

• Emplea un haz de electrones que actúa sobre la superficie del material, cuyas moléculas, al ser excitadas emiten un delgado haz de electrones secundarios, los cuales adquieren un movimiento similar al observado en los tubos de rayos catódicos.

• Debido a que estos electrones son desviados hacia un tubo fotomultiplicador, genera imágenes en una pantalla de televisión para aumentar el poder dispersante de las estructuras situadas en la superficie de la muestra. Ésta se recubre con un metal pesado, que debe evaporarse en una cámara de vacío; la muestra se hace tratar para que el metal se deposite de manera uniforme en toda la superficie.

*Se ha logrado una combinación del microscopio electrónico de barrido con el

de transmisión llamado STEM (Scanning-Transmission Electron Microscope).

Microscopio electrónico de barrido