En estas pginas dedicadas a las tcnicas histolgicas vamos a describir los procesos experimentales necesarios para obtener secciones teidas y listas para observar al microscopio partiendo de tejidos vivos extrados de un animal o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios a laobtencin, fijacin, inclusin, corte y tincin de los tejidos. Todos estos apartados seguirn el mismo esquema que los captulos dedicados a los tejidos o a la clula, partir de un esquema bsico y ampliar la informacin sucesivamente en pginas adicionales. No dedicaremos demasiado espacio a los instrumentos, desde el punto de vista operativo, pero s a la conveniencia de su uso y a sus capacidades.La mayora de las tcnicas histolgicas van encaminadas a preparar el tejido para su observacin con el microscopio, bien sea ste ptico o electrnico. Ello es debido a que la estructura de los tejidos est basada en la organizacin de los tipos de clulas que los componen y, salvo contadas ocasiones, las caractersticas morfolgicas de las clulas slo se pueden observar con estos aparatos.Existen procedimientos rpidos y simples para la observacin de tejidos y clulas vivas que reciben el nombre devitales. Por ejemplo, la observacin del flujo sanguneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma de observar clulas o tejidos vivos es mediante las tcnicas histolgicassupravitales, en los que las clulas y los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de clulas y de tejidos.Las tcnicas histolgicaspostvitalesson aquellas en las que las clulas mueren durante el proceso, pero las caractersticas morfolgicas y moleculares que posean en estado vivo se conservan mejor o peor dependiendo del tipo de tcnica. Estas pginas estarn dedicadas a este tipo de tcnicas, puesto que son las ms comnmente usadas en los laboratorios de histologa.Denominamosproceso histolgicoa una serie de mtodos y tcnicas utilizados para poder estudiar las caractersticas morfolgicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu caracterstica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los mtodos y tcnicas comnmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos "caminos" y su eleccin depender del resultado final que queramos obtener.

Esquema del proceso histolgico.El proceso histolgico comienza con laobtencin del tejidoobjeto de estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los distintos rganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcin de dicho tejido o procesar una parte, rgano o parte corporal, o el animal completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente fijadas con unos soluciones lquidas que contienen unas sustancias denominadasfijadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambin podemos fijar las molculas de los tejidos por congelacin rpida. Fijar un tejido es como si hicisemos una fotografa del tejido que se mantendr hasta su observacin. Sin embargo, el uso de fijadores o medios de inclusin afectan a veces las caractersticas tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelacin para endurecer el tejido para despus poder obtener secciones del mismo.Normalmente, tras la fijacin se procede aincluir el tejidopara posteriormente obtener secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea nuestra seccin ms tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias lquidas que posteriormente polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes (ceras). Tambin se puede conseguir el mismo efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusin usando el vibratomo. Los medios de inclusin son normalmente no hidrosolubles por lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgnicos liposolubles y posteriormente aadir el medio de inclusin.Tras la inclusin o la congelacin se procede acortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanometros), semifinas (de 0.5 a 2 m), finas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscopa, por ejemplo con contraste de fase, permiten observar tejidos sin teir. Normalmentelas secciones se tiencon colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusin para que los colorantes pueden unirse al tejido. Las secciones, secciones ultrafinas, que se observan con el microscopio electrnico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a los electrones, sin eliminar la resina.Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos bsicos demicroscopios: electrnico y ptico. Los primeros permiten un gran poder de resolucin, pudindose observar caractersticas ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de resolucin, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos : fluorescencia, contraste de fase, polarizacin o contraste de interferencia diferencial.Como dijimos al comienzo existen mltiples variaciones sobre este esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrnico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero slo observaremos superficies. En las siguientes pginas veremos con cierto detalle algunas de las tcnicas ms empleadas para la observacin de los tejidos.FijacinTodos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo muere, sufren dos tipos deprocesos degradativos: autolisis(accin de enzimas intracelulares, es decir, autodigestin) yputrefaccin(accin bacteriana). Adems, el procesamiento histolgico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone unametodologaque puede degradar las estructuras tisulares.Fijar un tejido es preservar sus caractersticas morfolgicas y moleculares lo ms parecidas posibles a las que posea en estado vivo.Es como hacer una fotografa del tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. As, los fijadores deben proteger frente a ataques bacterianos, evitar autolisis, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, prenetrar y modificar el tejido para poder llevar a cabo tinciones especficas posteriores, si es necesario, etctera.No existe un fijador universal, ni un mtodo de fijacin nico. Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente segn nuestras necesidades. La eleccin depende de las caractersticas fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimticas debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de dichas enzimas, y quiz para ello tengamos que sacrificar en cierta medida la morfologa tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusin en resinas, y quiz esto altere su apetencia por los colorantes generales. Si queremos teir un determinado componente celular difcilmente teible quiz debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido ms fcilmente por los colorantes.En cualquier caso, haycaractersticas de los fijadoresque tenemos que tener en cuenta antes de su uso:Velocidad de penetracin. El proceso de fijacin ha de ser rpido y la velocidad de difusin de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este parmetrocondiciona el tamao de la piezaque queramos fijar, ms pequea cuanto menor la velocidad de difusin, y el tiempo de fijacin, mayor cuanto menor tiempo de difusin.Velocidad de fijacin. Esta caracterstica no dependen de la velocidad de difusin sino de las propiedades qumicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador.Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a l.smosis y pH.Es indispensable evitar cambios de volumen en la clulas producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario aadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con aadir 0.9 % de cloruro sdico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadas a unpH semejante al del tejido e isoosmticascon dicho tejido.Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difciles de teir puesto que tienen poca apetencia por los colorantes, pero puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos fijadores, adems de fijar, modifican qumicamente a ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modificacin qumica se le denomina efecto mordiente.Artefactos. Los procesos de fijacin pueden acarrear alteraciones tisulares como variaciones morfolgicas, cristalizacin de compuestos, desplazamiento de sustancias, etctera. Estos cambios pueden producirse por las caractersticas del fijador o por un mal uso de ste. En cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como caractersticas tisulares lo que es un artefacto introducido durante la fijacin.Mtodos de fijacin Existen diferentes formas de fijar los tejidos, dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los mtodos de fijacin se pueden clasificar en dos tipos:fsicos y qumicos.Losfijadores fsicosestn basados en unacongelacinmuy rpida del tejido, en la aplicacin decaloromicroondas. Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los fijadores qumicos alteran la estructuras que queremos observar, o cuando necesitamos una fijacin muy rpida.La congelacin rpidaes un buen mtodo de preservacin de las caratersticas moleculares y es conveniente que sea rpida puesto que as se impide la formacin de grandes cristales de hielo que nos destrozaran la estructura del tejido. Existen variantes de esta tcnica como son la criodesecacin o liofilizacin y la criosustitucin. Lacriodesecacinparte de tejido previamente congelado, pero posteriormente se realiza una sublimacin del hielo, es decir, el agua pasa de estado slido a gaseoso sin pasar por estado lquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones qumicas por lo que adems de la fijacin preserva el tejido en el tiempo. Lacriosustitucintambin parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitucin lenta del hielo por una solucin fijadora. Con ello se posibilita una fijacin qumica sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que est congelado. Los mtodos defijacin por calorde fijacin no son frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos.Losmtodos qumicosutilizan soluciones acuosas compuestas por molculas fijadoras que establecen puentes entre las molculas celulares, mantenindolas en sus lugares originales e impidiendo su degradacin. Hay dos mtodos de fijacin con fijadores lquidos:inmersinyperfusin. En cualquier caso el fijador debe entrar en contacto con el tejido lo ms rpidamente posible.Inmersin. Por el mtodo de inmersinlas piezas de tejido se sumergen en la solucin fijadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones.1) Las piezas de tejido no deberan superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que sta comience a deteriorarse. Esto depende de lavelocidad de penetracindel fijador y de las caractersticas del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la solucin fijadora.Fijacin por inmersin. 2) El volumen recomendado de fijador debe ser20 vecessuperior al volumen de la pieza.3) Laosmolaridadentre tejido y solucin fijadora deben estar equilibradas.4) ElpHdel fijador debe ser prximo al fisiolgico.5) Eltiempo de fijacindepende de cada tipo de fijador, pero generalmente existe un tiempo mximo para cada uno de ellos que no debe ser excedido.

Fijacin por perfusin de un rgano. Mediante perfusin se consigue que la solucin fijadora llegue a todas las clulas del rgano a travs del sistema sanguneo. Mediante una bomba peristltica se introduce la solucin fijadora a travs de la arteria que irriga el rgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al rgano.Perfusin. Por este procedimiento la solucin fijadora se introducea travs del sistema circulatoriomediante el cual accede a todas las clulas del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este mtodo se puede fijar un animal completo introduciendo la solucin fijadora a travs del ventrculo cardiaco, con lo que el fijador llegar a todas las clulas irriegadas por la sangre bombeada por dicho ventrculo (circuito pulmonar o corporal). Tambin podemos fijar un nico rgano en el caso de que podamos aislar e introducir la solucin fijadora en la arteria principal que irriga dicho rgano. La perfusin no siempre es posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos vegetales. Este mtodo es mucho ms efectivo que el de inmersin, ya que la solucin fijadora llega a escasa distancia de todas las clulas de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetracin del fijador no es una condicin limitante. El volumen de fijador necesario tambin es menor puesto que la solucin fijadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el medio acuoso del tejido y no pierde potencial fijador.Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguneos hay eliminar previamente la sangre con unasolucin de lavado oxigenada, de otra manera su interaccin con el fijador produce trombos que impediran la fijacin de determinadas zonas del animal o del rgano. Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el mtodo de inmersin debemos cuidar aqu tambin la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijacin.

Fijacin por perfusin de un organismos completo. Mediante este tipo de perfusin se introduce la solucin fijadora en el sistema sanguneo. La bomba peristltica aporta la presin suficiente permitiendo al fijador entrar a travs del ventrculo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar, la solucin fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurcula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solucin fijadora, una vez realizada su funcin, salga del circuito. Ai: aurcula izquierda; Vd: ventrculo derecho.Este mtodo de fijacinrequiere conocer la presina la que se va a introducir la solucin fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presin sangunea normal en estado vivo. La presin que ejercer la solucin fijadora se puede regular mediante bombas peristlticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la solucin fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presin muy baja prodra impedir que la solucin fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presin muy alta podra provocar roturas de los vasos sanguneos y de la propia estructura tisular.FijadoresExisten multitud de fijadores en los manuales de tcnicas histolgicas. Aqu slo trataremos aquellos que consideramos de uso ms comn para la observacin de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular.Los fijadores qumicos son los ms frecuentemente empleados, bien con un solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas.Atencin! La mayora de las sustancias fijadorasson txicaspor inhalacin o por contacto, algunas de ellas cancergenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilizacin.Fijadores simplesAlcohol etlico. Fija por deshidratacin y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para preservar molculas, como ciertas enzimas, propiedades antignicas, glucgeno, pigmentos y para las extensiones citolgicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar tambin como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la retraccin de los tejidos. Carece de efecto mordiente.cido actico. Su proceso de fijacin consiste en cambiar el estado coloidal de las protenas. Se utiliza a una concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para cidos nucleicos y nucleoprotenas. Como inconvenientes cabe destacar la destruccin de las mitocondrias y mala fijacin de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinacin con otros fijadorescido pcrico. La fijacin la produce porque sales del tipo picrato coagulan con las protenas de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una solucin saturada de cido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es ptimo, preserva bien glucgeno y lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que favorece la unin de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la parafina. Se suele usar combinado con otros fijadores.Formaldehdo. Acta mediante la formacin de puentes entre las molculas tisulares. Se utiliza a concentraciones prximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena preservacin del tejido, acta como conservante, produce poca retraccin tisular, es un buen fijador para lpidos, es compatible con la mayora de las tinciones histolgicas, incluidas las de inmunocitoqumica e hibridacin de cidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solucin tamponada e isotnica.Glutaraldehdo. Forma puentes entre las molculas de los tejidos. Se usa a una proporcin de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para observacin de ultraestructuras celulares con el microscopio electrnico. Pero hay que tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotnicas.Tetrxido de osmio. Forma puentes entre molculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la clula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrnico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi.Mezclas fijadorasLa mayor parte de los procesos de fijacin usan distintas sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solucin acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de stos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido queremos fijar y qu queremos ver de dicho tejido. A continuacin vamos a mencionar algunas combinaciones usadas frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace apropiadas para las observacin de una gran variedad de tejidos y de tcnicas de tincin.Lquido de BOUIN: Est formado por cido pcrico, formaldehdo y cido actico glacial. Es una solucin muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirn en parafina (ver captulo de inclusin) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy til para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersin. Tras la fijacin las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70. No est recomendado para el rin ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en parafina es conveniente eliminar el cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70 porque puede hacer que no se produzca una buena inclusin o que las tinciones no sean adecuadas.Karnoy: Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de carbono simples y para las protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los cidos nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y cido actico glacial 10 %.Mezclas con formaldehdo: El formaldehdo es quiz el fijador ms usado hoy en da, tanto para tcnicas histolgicas rutinarias como para otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos nucleicos. Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros fijadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcin del formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su mayo capacidad de penetracin, mientras que el glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa, pero ms lenta que afectar a la estructura tisular puesto que el formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa.Glutaraldehdo-tetrxido de osmio:Los fijadores en combinacin no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopa electrnica sean inicialmente fijados en glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada. Este ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperacin con los aldhedos. Esto es importante porque el proceso para microscopa electrnica supone incubar el tejido en solventes orgnicos y polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.InclusinUna vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observacin con el microscopio. Ello implica hacer secciones para teirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es quecuanto ms delgada queramos una seccin ms consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijacin, pero sta no es muy alta e impide la obtencin de cortes generalmente ms delgados que 20 o 30 m. Slo en el caso de que queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 m) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza en ciertas tcnicas donde es necesaria una buena preservacin molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer ms el tejido para obtener secciones ms finas y se puede hacer de dos formas: congelacin e inclusin.La congelacinde los tejidos previamente fijados permite la obtencin de secciones que pueden ir desde unas 50 m hasta nm, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelacin para secciones de decenas de m, criostato para secciones de entre 5 y 20 m y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Paraevitar los daos que se producen durante los procesos de congelacin, formacin de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos: a)Anticongelantesque impidan la formacin de cristales. El crioprotector ms usado es la sacarosa al 30 %, aunque tambin se usa el dimetil sulfxido, el glicerol, etiln glicol y otros. La eleccin de uno u otro depende del tipo de muestra y de la tcnica que se vaya a usar. b) Unacongelacin lo ms rpida posible, por ejemplo, con nitrgeno lquido. Cuanto ms rpida es la congelacin menores son las dimensiones de los cristales de agua formados.

Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando diferentes mtodos. Secciones ms finas se obtienen endureciendo ms el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelacin o embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina o resinas. Tngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y objetos del dibujo no estn a escala. Una rejilla es mucho ms pequea que un portaobjetos. Las dimensiones en m y nm se refieren al espesor de las secciones.La inclusines el mtodo ms comn de endurecer el tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias lquidas que tras un proceso de polimerizacin o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las caractersticas del tejido. Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde decenas de m a nm segn el medio de inclusin) sin que el tejido se rompa o se deteriore. Adems son un buen mtodo depreservar las muestrasdurante largos periodos de tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusin dependiendo del grosor del corte y de la tcnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observacin con elmicroscopio pticolos medios de inclusin ms frecuentemente usados son laparafinao la celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con elmicroscopio electrnicola inclusin se realiza conresinas, principalmente de tipo acrclicas o epoxy. La mayora de los medios de inclusinno son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un lquido miscible con nuestro medio de inclusin. Si una muestra no est completamente embebida en el medio de inclusin se deteriorar y la obtencin de secciones homogneas ser imposible.Inclusin en parafinaPara la inclusin de muestras que han de observarse con microscopa ptica se utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusin. Vamos a describir los pasos para la inclusin en parafina de muestras de tejido previamente fijadas.La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que estformada por mezclas de hidrocarburossaturados. A temperatura ambiente es slida y su punto de fusin puede variar entre 40 y 70 C segn su composicin de la mezcla de hidrocarburos.Resultan distintos tipos de parafinas a temperatura ambiente que se emplean segn las necesidades. As, parafinas ms duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusin mayor, mientras que las ms blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras ms duras. Las parafinas ms usadas tienen un punto de fusin en torno a los 60 C. Podemos tambin modificar las caractersticas de las parafinas aadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etctera.La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos estn formados principalmente por agua. Adems, la mayora de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina lquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgnico. Esto se consigue mediante ladeshidratacin del tejido en alcoholes, normalmente metanol, de gradacin creciente hasta alcohol de 100. Posteriormente se transfiere el tejido a un lquido que sea miscible tanto con el alcohol de 100 como con la parafina, denominadosustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el xido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetracin de la sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de incubacin de la pieza algunos de estos lquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y provocar problemas hacer las secciones.Por ltimose pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufaregulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina para favorecer una buena impregnacin. El tiempo que duran dichos pasos depende de lo voltil que sea el lquido intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Ser mayor cuanto menos voltil es el lquido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina lquidaen un molde, se intruduce la muestra y se coloca segn la orientacin deseada de corte yse deja solidificara temperatura ambiente.Un protocolo comn de inclusin en parafina es el siguiente:

Esquema de la inclusin en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubacin en cada sustancia pueden variar en funcin del tamao de la muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el lquido intermediario. Sin embargo, los pasos son comunes a cualquier inclusin en parafina.Inclusin en ResinaPara la observacin de la ultraestructura celular es necesario hacersecciones de tejido muy delgadasdenominadas ultrafinas, del orden de nanometros, y usar un microscopio electrnico de transmisin. La obtencin de secciones ultrafinas implica que tenemos queendurecer enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelacin, obteniendo entonces la secciones con un ultracriotomo. Sin embargo, lo ms frecuente es incluir el tejido en un material de alta dureza como son las resinas lasresinasde tipo epoxy, y en menor medida las resinas acrlicas, como el metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en forma lquida y posteriormente polimerizan sin afectar a la ultraestructura celular.El procedimiento estndar de inclusin en resinas es similar al descrito para la parafina con algunas modificaciones. As, los pasos que se siguen sonfijacin de las muestras, por inmersin o perfusin, deshidratacin, lquido intermediario, infiltracin y polimerizacin en el medio de inclusin. Algunos medios de inclusin de tipo acrlico, por ejemplo la resina LR white, son parcialmente miscibles con el agua por lo que no es necesario pasar la muestra por solventes como el etanol absoluto, acetona o el xido de propileno, y adems polimerizan con luz ultravioleta a bajas temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoqumicos.a) Las soluciones fijadoras suelen contenerglutaraldehdoy es necesaria una postfijacin posterior entetrxido de osmio. Con ello nos aseguramos una fuerte fijacin para preservar la ultraestructura celular y que no perderemos los lpidos que forman las membranas celulares durante el proceso de inclusin, gracias al tetrxido de osmio.b) Partimos de tamaos demuestrasmucho mspequeas, de unos pocos milmetros, puesto que no nos interesa ver la organizacin general del tejido sino detalles del mismo. Si queremos observar zonas diferentes de un rgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeos e independientes de cada una de ellas.c) La resinas ms comnmente usadas para la inclusin no son hidrosolubles, por lo que tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgnico que sea miscible con la resina. Para ellose deshidrata el tejidomediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol o acetona, esta ltima es frecuentemente usada. Como lquido intermediario entre la acetona pura o etanol de 100 y las resinas se suele utilizar el xido de propileno.d) El endurecimiento del medio de inclusin no es por enfriamiento sino porpolimerizacin, normalmente a 60 C, como la resinas tipo epoxy, o por exposicin a rayos ultravioleta a temperaturas en torno a los 20 C, con es el caso del metacrilato.e) Al medio de inclusin, la resina, se le aaden aceleradores y plastificantes que regulan las caractersticas de la polimerizacin y la dureza de la resina polimerizada.El medio de inclusin ms usado para la observacin de la ultraestructura celular son lasresinas tipos epoxypuesto que son las que aportan una mayor homogeneidad en las polimerizacin y ms facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas acrlicas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de polimerizacin, obtencin y tratamiento de los cortes ultrafinos.A continuacin se muestra un proceso de inclusin habitual en resinas de tipo epoxy.

Esquema de la inclusin en resina de tipo epoxy de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubacin en cada sustancia pueden variar en funcin del tamao de la muestra o tipo de tejido.

CorteLas catersticas tisulares y celulares microscpicas internas se observan con microscopios pticos o electrnicos de transmisin (excepto si queremos ver superficies, para lo que usamos el microscopio electrnico de barrido). Con estos aparatos slo se pueden observargrosores muy pequeos de tejidopor problemas de difusin y penetracin de la luz en el caso de los microscopios pticos y de penetracin de los electrones en el caso del microscopio electrnico de transmisin. Por tanto tenemos que hacerseccionesde los tejidos que queremos estudiar, que pueden irdesde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los vegetales, por sus caractersticas celulares, permiten su observacin en secciones de cientos de micras. Como hemos mencionado en los captulos anteriores,podemos decir que cuanto ms delgada queramos hacer una seccin de tejido ms endurecido ha de estar dicho tejido. La dureza de los tejidos depende de sus caractersticas (por ejemplo, las paredes celulares hacen a los vegetales tejidos duros), de la fijacin que hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera ms directa de endurecer el tejido es mediante congelacin.Los aparatos mecnicos para hacer secciones de un grosor de micrmetros se denominanmicrotomosy existen diferentes tipos segn el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusin en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelacin o por inclusin. Los microtomos ms usados son:Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 m de grosor, para observar con el microscopio ptico.Vibratomo: Corta material no incluido, aunque s fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de m de grosor, para observar con el microscopio ptico.Microtomo de congelacin: Con l se consiguen secciones de 30 a unas 100 m de material congelado para su observacin con el microscopio ptico.Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 m, para observar con el microscopio ptico.Ultramicrotomo: Con l se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrnico de transmisin.Ultracriotomo: Su uso no est muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrnico de transmisin.Los aparatos de corte ms usados tradicionalmente para estudiar las caractersticas generales de los tejidos y de las clulas son el microtomo para material incluido en parafina para observaciones con el microscopio ptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopio electrnico de transmisin. El criostato se usa tambin frecuentemente en microscopa ptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado.Microtomos para parafinaLos microtomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los ms usados en los laboratorios de histologa. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un portabloques y un sistema mecnico que permite acercar el bloque de parafina a la cuchilla una distancia que se corresponde con el grosor de la seccin que pretendemos obtener y realizar el corte.Hay dos tipos de microtomo para parafina: elde rotaciny elde deslizamiento. El microtomo de rotacin provoca el corte gracias a la transformacin de un movimiento de rotacin en otro de ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla segn el espacio seleccinado. En el puertamuestras existe un sistema que permiteorientarla superficie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse elngulo de ataquea la muestra. Con el microtomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos microtomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posicin del bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dar el grosor del corte.Tanto el microtomo de rotacin como el de deslizamiento tienen ventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de rotacin es su presicin, la posibilidad de obtener secciones seriadas con facilidad y la automatizacin del proceso de corte. Los microtomos de deslizamiento son ms sencillos mecnicamente y su disposicin permite cortar bloques ms grandes o bloques de celoidina, aunque estn cayendo en deshuso.Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina antes de hacer el primer corte til a nuestra muestra. En primer lugar hay queretallarel bloque hasta hacer unapirmide truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras de esta pirmide ser elfrente de ataque, es decir, cual ser la que primero se ponga en contacto con la cuchilla. Esta cara deber ser ms ancha que la opuesta, y ambas han de serparalelas. Con todo ello se consigue una buena orientacin de nuestra muestra en las secciones, que cada nuevo corte arrastre sin problemas al previamente cortado y que se puedan obtenertiras rectas de cortes. Una vez retallada la pirmide nuestra muestra queda dentro de ella pero no est en contacto directo con la cara superior o de corte, por lo que es necesario un proceso dedesbastado, es decir, la eliminacin del espesor de parafina que hay entre la superficie del bloque y nuestra muestra.Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es laorientacin de la cuchillarespeto a la superficie de corte de la pirmide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ngulo de uno 10 respecto a la superficie de corte, aunque se puede modificar segn nuestras necesidades.Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su fijacin definitiva en la superficie de un portaobjetos, han deestirarsepara que nuestro tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofocidad de la parafina, las secciones se colocan sobreagua calentada a unos 35 C a 40 Cy el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de fusin, que est en torno a los 60 C. El estiramiento se puede realizar en baos de agua con regulacin trmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de agua y colocados sobre una plancha trmica regulable.

Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que sern colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren consoluciones de gelatina, albmina, u otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido.Una vez que el agua se ha evaporado y estn extendidas las tiras de cortes de parafina sobre el portaobjetos, se procede a unsecado exahustivoen una estufa a una temperatura de entre 35 C y 40 C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones estn listos para el procesamiento posterior.VibratomosPuede haber varias razones para evitar la inclusin de un tejido del que posteriormente obtener secciones. Durante los procesos de inclusin, como las inclusiones en parafina o en resinas tipo epoxy, se ha de someter a las muestras a deshidratacin. Esto ocasiona a veces dao en algunas molculas o regiones moleculares que son las que queremos detectar posteriormente con tcnicas como la inmunocitoqumica. Adems, para observar algunas caractersticas tisulares o celulares se requieren secciones gruesas del orden de 50 m, a veces de 100 o 200 m. Por ejemplo, para estudiar la organizacin espacial de determinadas clulas como las neuronas es recomendable hacer cortes de un grosor superior a las 50 m y emplear inmunocitoqumica o histoqumica para ponerlas de manifiesto. La obtencin de secciones gruesas sin necesidad de inclusin se pueden conseguir de dos manera diferentes: mediante congelacin de la muestra y corte en un microtomo de congelacin o mediante el uso del vibratomo.

Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.El vibratomo es un aparato con el quese obtienen secciones de un grosor que puede oscilar entre las 40-50 m hasta varios centenares de m partiendo de una muestra animal endurecida slo mediante fijacin. El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se sita la muestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde muy afilado que se deplaza horizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La caracterstica del vibratomo es quela cuchilla, adems de avanzar sobre la muestra,posee un movimiento de vibracin lateral a modo de sierra que facilita el corte y evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra fijada, normalmente mediante pegamento de contacto, directamente a un bloque portamuestras que se coloca sobre la plataforma elevadora.

Pegado de la muestra al bloque portamuestras.No todas las muestras son apropiadas para ser cortadas en un vibratomo. As, aquellas que sean muy blandas o que posean porciones demasiado duras o elsticas son normalmente arrastradas por la cuchilla, a pesar de que disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos la oscilacin de la cuchilla. Es decir, la muestra ha de tener una cierta consistencia y no poseer elementos distorsionadores del corte.Otra caracterstica del vibratomo es que todoel proceso de corte se realiza bajo una solucin acuosaque normalmente es una solucin tamponada o una solucin salina. Para ello tanto la muestra como el borde de corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que se obtienen se denominancortes en flotacin, es decir, no sujetos a ningn soporte. Estos cortes se pueden procesar de esta manera, flotando, o adherirse a un portaobjetos y procesarlos despus. Sin embargo, el proceso de secado necesario para la adhesin al portaobjetos suele conllevar alteraciones de la calidad del tejido. As, los cortes se suelen procesar durante toda la tcnica en flotacin y posteriormente se montan sobre portaobjetos para su observacin con el microscopio ptico.Criotomo La congelacin de los tejidos es una manerarpidade endurecerlos sin necesidad de inclusin, por lo quela preservacin moleculares mxima. Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. Igual preservacin se consigue con los cortes de vibratomo, pero las muestras congeladas pueden cortarse en secciones ms finas, del orden de varias m, cosa muy difcil con el vibratomo. Otra ventaja de la obtencin de secciones mediante congelacin es que la calidad de las secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornificados). Por ltimo, es posiblemente la manera ms rpida de obtener secciones puesto que es posible congelar la muestrasin necesidad de fijaciny cortarla de inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelacin muy rpida, normalmente en isopentano enfriado con nitrgeno lquido, lo que evita la formacin de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.En el caso de que no se requiera un corte rpido las muestras se fijan y posteriormente se incuban en unasolucin anticogelanteque contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelacin se formen cristales de hielo grandes que puedan daar las estructuras celulares. Como dijimos anteriormente, se puede congelar de manera muy rpida connitrgeno lquido. Dicha congelacin permite preservar incluso la ultraestructura celular y observarla al microscopio electrnico, siempre con el uso previo de anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar la congelacin de la muestra a temperaturas superiores que dependen del aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso de anticongelantes.Los dos aparatos ms usados para realizar cortes por congelacin son elmicrotomo de congelaciny elcriostato. El microtomo de congelacin realiza cortes de decenas de m de grosor y consiste en una plataforma que se enfra a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado. En los microtomos de congelacin antiguos se produca la congelacin mediante gas carbnico que haba que suministrar regularmente. Actualmente se produce la congelacin (de -30 a menos -40 C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeracin externo al propio dispositivo de corte. Adems, existe la posibilidad de congelar tambin la cuchilla si se desea. En los apartos actualesla muestra se congela por contactodirecto con la plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de m, se recogen con un pincel, se aaden a un recipiente con tampn de trabajo y se trabaja con ellasen flotacin, igual que en el caso del vibratomo.

Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.El criostato se utiliza para obtener secciones por congelacin de 10 a 30 m, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en unacmara refrigeradacuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 C. La congelacin se suele hacer en una plataforma dentro de la propia cmara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 C. Tambin se puede congelar el tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrgeno lquido, pero es conveniente colocar la muestra en la cmara del criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de sta para obtener secciones homogneas. Antes de la congelacin,la muestra se encastraen un medio que es lquido a temperatura ambiente y slido a la de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque slido, encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijar a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparacin del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describi para el microtomo de rotacin para parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rpidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos estn a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las tcnicas que deseemos.Ultramicrotomo Para la observacin con detalle de laultraestructura celulares necesario realizarseccionesmuy delgadas denominadasultrafinas, del orden de nanometros, y observarlas con el microscopio electrnico de transmisin. Para ello se incluye nuestra muestra en resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez polimerzada resulta en un bloque de gran dureza. La obtencin de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparato denominadoultramicrotomo. Otra manera menos habitual de obtener secciones ultrafinas es mediante elultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se corta en una cmara refrigerada a muy bajas temperaturas. Este ltimo es un mecanismo similar al visto para el criostato. Es un aparato que slo se usa cuando queremos detectar con microscopa electrnica molculas que son daadas durante el proceso de inclusin.Elultramicrotomotiene un diseo de corte similar al microtomo de parafina de rotacin, pero mucho ms preciso y sofisticado. Quiz el sistema ms delicado sea el que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de varios nanometros. Actualmente estesistema de avancees mecnico pero en los ultramicrotomos ms antiguos era por calor, que produca dilatacin del eje sobre el que se sujetaba la muestra. Tambin tiene un sistema completo deorientacinde la muestra sobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibracin o cambio de temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe situarse en una habitacin donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Adems, estos aparatos se colocan sobre mesas especiales paradisminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen unpanel de control externoal aparato desde donde se controla electrnicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la seccin, velocidad de corte, ventana de corte, iluminacin de la muestra, etctera.Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual que ocurra con los cortes de parafina, es necesario retallar y desbastar el bloque para crear unapirmide truncada. Aunque todo este proceso se puede hacer con una cuchilla se suele utilizar un aparato denominadopiramitomoque lima y crea las caras de la pirmide con un disposivo a modo de torno, adems de producir el desbastado para obtener la superficie de corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de ser preciso porque lasuperficie de cortedebe ser muy pequea, en torno a unos 0,5 mm2. Los lados de la superficie de corte deben ser similares a los descritos para el corte en inclusiones de parafina, dos lados han de ser paralelos y uno ms grande que el otro. Con esto nos aseguramos que una nueva seccin empujar a la previa del borde de la cuchilla y que conseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer unaseccin semifina, de 1 o 2 m para tener una imagen de la muestra observable al microscopio ptico.

Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.Lascuchillasempleadas para hacer secciones ultrafinas son especficas para este tipo de aparatos puesto que han de tener unos filos muy agudos. Las ms comnmente usadas sonde vidrioespecial y se otienen mediante unos aparatos que mediante ralladuras con puntas de diamante y golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sin embargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filode diamante, pero son mucha ms caras. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor.El grosor de una seccin ultrafina se conoce por el colorque produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro plido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), prpura (150 a 190 nm), etctera.

Corte y recogida de secciones en una rejilla.Las secciones ultrafinas recin obtenidos quedan flotando sobre una balsa de agua que posee la propia cuchilla y no se recojen sobre portaobjetos sino directamente sobresoportes de nquel o cobre denominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos que dejan cavidades, las cuales son de distino tamao segn el tipo de rejilla, normalmente desde 100 a varios cientos de m cuadradas. Estas rejillas tienen la ventaja de que permiten una gran nitidez de las imgenes del tejido que ofrece el microscopio electrnico puesto que los electrones slo atraviesan la seccin antes de incidir sobre la pantalla de visualizacin. Sin embargo, presentan el problema de que la porcin de seccin que caiga sobre el hilo de la rejilla quedar oculto. Por ello existen las "rejillas" de ojal, que tienen una sola cavidad y suficientemente grande como para que quepa un corte entero. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la seccin no se cuele por la cavidad que es normalmente una membrana muy fina hecha de una sustancia denominada formvar, la cual deja pasar los electrones y sostiene a las secciones.TincinLos tejidos animales son en su gran mayoraincoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo de pigmento como la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observacin directa con el microscopio ptico, a lo que tambin ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la delimitacin celular y la discriminacin entre diferentes tejidos. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cmo teir los tejidos para poder desentraar sus caractersticas morfolgicas. Se observ que algunospigmentoscomo el carmn o la eosina, disueltos en agua, se unan a determinados componentes de las clulas. La expansin de la industria textil y su necesidad de colorear las telas provoc un rpido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas de estas sustancias fueron usadas comocolorantesen la histologa de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas tcnicas y molculas sintticas que se usan segn las necesidades del investigador. Con la llegada de labiologa molecularse han puesto en marcha otras tcnicas mucho ms sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoqumicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o ms sofisticadas an como las que mediante el diseo de animales transgnicos permiten identificar y observar a las clulas que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la protena verde fluorescente (GFP).No vamos a describir con detalle las tcnicas ms complejas, al menos no en estas pginas bsicas, sino las ms comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de tcnicas histolgicas en cuatro categoras.a)Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad qumica.b)Histoqumica. Son aquellas tcnicas de tincin que implican la modificacin qumica de algunas molculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este apartado incluiremos tambin a los mtodos de tincin basados en la capacidad cataltica de algunas enzimas presentes en los tejidos que queremos estudiar.c)Lectinas. Las lectinas son dominios de protenas, como las selectinas, que son capaces de reconocer glcidos que forman parte de polisacridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el tipo de glcido que aparece en las glucoprotenas de la membrana plasmtica o de la matriz extracelular de los diferentes tejidos.d)Inmunocitoqumica. Son tcnicas histolgicas muy potentes basadas en la alta especificidad de unin de los anticuerpos a los antgenos contra los que se produjeron. Estos antgenos pueden ser cualquier molcula tisular que, purificada en inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos anticuerpos aadidos a una seccin de tejido reconocern y se unirn especficamente a dicha molcula.e)Hibridacin. Son tcnicas basadas en la unin complementaria de las bases de cidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos cadenas complementarias de cidos nucleicos se unan entre s de forma muy especfica, es decir, hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN con una secuencia de bases determinada que llevan una molcula unida para poder detectarlas. La secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que est presente en la clula, normalmente en forma de ARNm. Con ello podemos observar qu clulas expresan un determinado gen.Tinciones generalesLa mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teirlos para observar sus caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en el uso decolorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas presentes en los tejidos gracias aafinidades qumicas. Se utilizan normalmente para teir a las clulas y componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan habitualmentesobre secciones de tejido, siendo las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son molculas que poseentres componentesimportantes: unesqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominadocromforo, y otro que posibilita la unin a elementos del tejido denominadoauxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molcula se denominacromgeno.Segn lanaturaleza qumica del cromforohay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinnicas, derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, derviados del xanteno y derivados de las talocianinas.Segn lanaturaleza qumica del radical auxocromolos colorantes se clasifican en:Bsicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte cida es incolora. Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglucanos. As, ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, as como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes cidos. Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la hematoxilinacidos: son sales con el anin coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias bsicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y tambin el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes cidos son la fucsina cida, verde rpido, naranja G o la eosina.Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede teir tanto las partes bsicas como las cidas de los tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad qumica sino porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir a las gotas de lpidos, especialmente en los adipocitos.En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisularesde manera especficay para ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin denominada azn contiene azocarmn y anilina-naranja-cido actico que tie los ncleos de rojo y sobre todo destaca el conectivo intensamente teido de azul. Otra tincin combinada es el tricrmio de Mallory que tie el colgeno de verde, las clulas musculares de rojo.Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solucin se dice que ha ocurrido un fenmeno demetacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorcin de la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vulve prpura cuando se une a ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color que en solucin se denominaortocromasia.Tincin general. Una de las tinciones ms comnmente usada en histologa es lahematoxilina-eosinasobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro cido para teir de diferente color a las estructuras cidas y bsicas de la clula. Antes de proceder a la tincin, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Seccin de un glomrulo de un rin de mamfero obtenida a partir de una inclusin en parafina y teido con hematoxilina-eosina. Los ncleos aparecen de color violceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tincin general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentracin de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusin, la parafina. El paso por agua de grifo es tpico de la hematoxilena y se denominadiferenciacin. Las sales del agua permiten obtener una coloracin ms violcea, en vez de prpura. La deshidratacin final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades pticas excelentes. Adems, conservan las preparaciones durante aos en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporacin del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio ptico.Tincin de semifinos. Cuando se procesa material para microscopa electrnica es necesario, a veces, hacerse una idea de qu zona del tejido vamos a cortar. Tngase en cuenta que el rea de una seccin para observar con el microscopio electrnico es muy pequea. Adems, el proceso de osmificacin que ha de llevarse a cabo previamente a la inclusin acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo que dificulta an ms la orientacin de la muestra. Por ello es frecuente hacer secciones de 0.5 a 1 m de grosor con el ultramicrotomo, para orientarnos en la muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos suelen tener reas ms ms grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtencin de las secciones ultrafinas. El colorante usado para teir secciones semifinas es normalmente el azul de toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido

Proceso de tincin de una seccin semifina. La porosidad de la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que se pueda ter el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina .

Contraste de ultrafinos. El contrasteno es estrictamente una tincin, puesto que no aporta color a la muestra, pero s es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de la clula, por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopa electrnica se pueden observar directamente con el microscopio electrnico se suelen tratar previamente conmetales pesadosen un proceso denominadocontraste, obteniendo as una imagen ptima de la ultraestructura celular. Tngase en cuenta que en la microscopa electrnica lo importante no es aadir sustancias coloreadas sino molculas que puedan interferir con el camino de los electrones emitidos por el microscopio y que atraviesan la muestra. Los electrones que atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitir destellos de luz cuando reciban el impacto de un electrn y permite observar las caractersticas del tejido. Los metales pesados unidos al tejido impedirn que pasen los electrones y por tanto se ver una zona negra en la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la clula donde no estn estos metales provocaran reas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imgenes originales de microscopa electrnica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un ordenador.

Proceso de contraste de secciones semifinas. Los tiempos de incubacin en citrato de plomo y acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidrxido sdico eliminan humedad del aire y dificultan la pricipitacin del citrato de plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo repetidas veces (en ingls, "deeping") la rejilla en el agua durante un tiempo de aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.

HistoqumicaVamos a incluir dentro de las tcnicas histoqumicas a aquellas que supongan unareaccin qumica en la que intervienen molculas pertenecientes al propio tejido(trataremos la deteccin de glcidos mediante lectinas y la inmunohistoqumica en apartados diferentes a ste, aunque algunos autores las incluyen como tnicas histoqumicas). El objetivo de la histoqumica es poner de manifiesto una molcula o familia de molculas presentes en una seccin histolgica y estudiar su distribucin tisular "in situ". Estas molculas son difcilmente discernibles con colorantes generales. Durante el procesamiento del tejido previo a la reaccin histoqumica, como la fijacin o la inclusin, hay queevitar daara la molcula que queremos detectar porque de otra manera resultara en falsos negativos, es decir, no tener tincin cuando en realidad la molcula de inters s est presente en el tejido, aunque deteriorada. En algunas ocasiones es necesario realizarpasos previosa la reaccin histoqumica para descubrir la molcula que queremos detectar, por ejemplo usando un fijador adecuado, ya que de otra manera no reaccionara con los reactivos qumicos. Vamos a dividir las tcnicas histoqumicas en dos grupos: reacciones qumicas e histoqumica enzimtica.Lasreacciones qumicasconsisten en la modificacin qumica de molculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen tcnicas histoqumicas para detectar glcidos, protenas y nucletidos. La tcnica histoqumica ms empleada es la reaccin dePAS(Periodic Acid Schiff). Se utiliza para la deteccin de hidratos de carbono, libres o conjugados, en los tejidos cuando estn en cantidades relativamente grandes. La modificacin qumica del tejido consiste en la oxidacin mediante el cido peridico de los enlaces entre los carbonos prximos que contienen grupos hidroxilos. Esto provoca la formacin grupos aldehdos que sern reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinar con ellos para dar un color rojizo brillante. Entre los componentes del reactivo de Schiff est la pararosanilina (un componente de la fucsina bsica) tratada con cido sulfrico. Una gran ventaja de la tincin histoqumica PAS es su capacidad de discriminacin de tipos de glcidos con pequeas modificaciones de la tcnica.

Tincin con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las clulas caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido en mucopolisacridos, mientras que en una ticin general aparecen transparentes, sin teir.

Pasos de la tincin histoqumica PAS-Hemtaoxilina sobre cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son los especficos para esta tincin.Lahistoqumica enzimticao histoenzimologa se basa en la capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener funcional su centro activo tras el proceso de fijacin. Estos enzimas y las clulas que los poseen se ponen de manifiesto mediante unareaccin enzimtica que convierte a unos sustratos solubles e incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son especficos para el enzima y los productos se depositan en el lugar preciso donde se produjo la reaccin, es decir, donde se localiza el enzima. Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etctera. Hay que tener en cuenta que cuando queremos detectar una actividad enzimtica es recomendable no incluir el material para obtener secciones puesto que la deshidratacin y la temperatura elevada pueden daar la conformacin de la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas tcnicas se realizan normalmente en secciones obtenidas por congelacin o con el vibratomo.En el esquema de abajo se muestra el proceso para la deteccin de la actividad NADPH diaforasa, que actualmente se asocia a la enzimas sintasas del xido ntrico en sistema nervioso y vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguneo y con ciertos aspectos de la fisiologa del sistema nervioso. Esta tcnica permite detectar neuronas que expresan la enzima sintasa del xido ntrico de una forma sencilla y rpida. La reaccin es NADPH + tetrazolio = NADP++ formazn. Es el formazn el producto coloreado e insoluble que se puede observar con el microscopio ptico, incluso con el electrnico.

Imagen de un corte de 60 m de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoqumica enzimtica que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima xido ntrico sintasa neuronal que aparece en algunas neuronas (clulas con un color azul intenso).

Los pasos para la deteccin histoqumica de la actividad diaforasa es muy sencilla. Tras una fijacin, preferentemente por perfusin, hay que permeabilizar el tejido con un disolvente de lpidos como el Triton-X100. El revelado se produce a 37oC y el final de la reaccin se controla mediante observaciones peridicas. La concentracin de los sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) vara segn el tejido o el proceso de fijacin.

LectinasAparte de las tcnicas de tincin generales y las histoqumicas, ms especficas, existen otras que se usan para detectar molculas tisulares con una alta especificidad. Ello es posible gracias a la capacidad que tienen ciertas molculas como las lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y unirse slo a una molcula determinada presente en el tejido. En esta pgina vamos a tratar sobre el uso de laslectinaspara ladeteccinen los tejidos dedistintos tipos de glcidosde manera especfica. En muchos textos la tcnica de las lectinas se incluye dentro del apartado de la histoqumica.Las lectinas son protenas que tienen dominios o secuencias de aminocidos que son capaces de reconocer y unirse a glcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacridos, bien libres o formando parte de glucoprotenas. Por ello se dice quelas lectinas reconocen glucoconjugados. Las lectinas estn ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitos desde el torrente sanguneo hacia los tejidos daados se produce gracias a la accin de unas lectinas denominadas selectinas que expresan las clulas endoteliales prximas al lugar de la lesin. Es decir, el linfocito puede salir por la pared endotelial gracias a la unin de las selectinas endoteliales a los glcidos de la membrana del linfocito. En el laboratorio de histologa las lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la distribucin tisular de distintos tipos de azcares de manera especfica. Se pueden usar diferentes tipos de lectinas en base a su especificidad de reconocimiento de azcares determinados. Hay al menoscinco grupos de lectinassegn se unan a manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a cido silico (Neu5Ac), respectivamente.Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes que se nombran segn el organismo animal o la planta de la que se obtienen. En el siguiente cuadro se listan las lectinas usadas comnmente segn el glcido que reconocen.Para poder observar el lugar de unin especfica entre la lectina y su glcido tenemos que unir a la lectina un marcadorque nos produzca una seal visible con el microscopio ptico o electrnico de transmisin. Normalmente el marcaje consiste en la unin de unaenzimacomo la peroxidasa de rbano o la fosfatasa alcalina. Es el resultado de la reaccin enzimtica lo que se puede observar. Tambin se usa como marcador una molculafluorescenteque se puede observar directamente en el tejido con un microscopio de fluorescencia. Cuando la enzima o la molcula fluorescente estn directamente unidas a la lectina se denomina mtodo de deteccin directa y cuando se unen a la lectina mediante una molcula interpuesta se denomina deteccin indirecta. Las molculas interpuestas ms comunes son la biotina o anticuerpos especficos (inmunoglobulinas tipo G) obtenidos contra la lectina.

Pasos para la deteccin de glcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar segn el material o la lectina usada. En este ejemplo se usa un mtodo de deteccin indirecta puesto que la lectina lleva unida una protena intermendiaria que es la biotina, la cual ser reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene molculas de la enzima peroxidasa. Es la reaccin de este enzima tras aadir los sustratos apropiados, diaminobencidina ms perxido de hidrgeno, la que produce productos insolubles y visibles con el microscopio ptico. El paso de BSA (albmina de suero bovino) sirve para saturar posibles sitios de unin inespecficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafina hubisemos usado cortes de vibratomo podrmos procesar, tras la reaccin de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reaccin con el microscopio ptico y tambin con el electrnico de transmisin.La tcnica con lectinas se suele complementar con una serie de tratamientos que sirven para obtener ms informacin acerca de la composicin sacardica de los glicoconjugados. Por ejemplo, la desulfatacin se usa para demostrar las uniones tipo steres de sulfato de las cadenas terminales y la eliminacin tipo beta permite conocer si las cadenas sacardicas son uniones con enlaces tipo O (uniones covalentemente a grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces convalentes a grupos amino). En este ltimo caso la alcalinizacin de los cortes elimina las uniones tipo O.LectinasLa inmunocitoqumica es una tcnica para la localizacin de molculas en los tejidos mediante el empleo deanticuerpos(protenas del tipo inmunoglobulina G). Es una tcnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarizacin de su protocolo se ha convertido en un mtodo sencillo, rpido y muy potente. Se basa en lagran especificidad y alta afinidadque tienen los anticuerpos para reconocer a molculas y unirse a ellas. Adems, la conjugacin o combinacin de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades nfimas de molculas presentes en el tejido.Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las tcnicas inmunocitoqumicas son del tipo G, producidas por unas clulas del sistema inmunitario denominadoslinfocitos B. La produccin masiva deanticuerposse produce en un animal cuando le inyectamos una molcula que reconoce como extraa, es decir, nuestra molcula problema. Estos anticuerpos pasan alsuero sanguneo que se extrae del animal inmunizadoy a partir del cual se purifican los anticuerpos producidos, los cuales se usarn posteriormente en la tcnica inmunocitoqumica. Las molculas complejas como la protenas tienen en su estructura variosdeterminantes antignicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antignico activar un clon, grupo de de linfocitos B, que producir anticuerpos contra l. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molcula inyectada irn a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoqumica se dice que se estn empleandoanticuerpos policlonales. Existe una tcnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producir un tipo de inmunoglobulina G que reconocer slo a uno de los determinantes antignicos de la molcula inyectada. A estos anticuerpos se les denominamonoclonalesya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idnticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtencin de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse endos dominos: la fraccin cristalizable y la variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antignico de nuestra molcula. Hay dos sitios de unin por lo quecada inmunoglubulina podra reconocer a dos molculas o determinantes antignicos, que han de ser iguales y estar muy prximos entre s. La fraccin cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por los individuos de una misma especie.Para que un anticuerpo se una a su determinante antignico localizado en una molcula, sta no debe alterarse. De otro modo ese determinante antignico no ser reconocido por el anticuerpo. Por ello el proceso defijacindel tejido debe elegirse para preservar al mximo a la molcula que queremos detectar. Por ello se usan diferentes fijadores segn el tipo de molcula en la que estemos interados. Tambin es necesario considerar el mtodo de obtencin de loscortes. Inclusiones en parafina pueden daar las molculas por lo que en la mayora de los casos se suele trabajar con cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelacin.Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molcula que queramos detectar, no son visibles con el microscopio por lo que la tendremos queconjugar(unirla) a otras molculas que nos den una seal visible. Estas molculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos tipos:molculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en productos insolubles y coloreados. La seal aparece all donde est la sustancia fluorescente o el enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.El mtodo del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos ms adelante, pero tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz emitida por la molcula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y mantenerse permanentemente para su obeservacin. Las enzimas habituales que se unen a las inmunoglobulinas son laperoxidasay lafosfatasa alcalina.

Mtodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos especficamente a una molcula del tejido.La conjugacin directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se denominamtodo de deteccin directa. Hoy en da se suele emplear elmtodo de deteccin indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molcula marcadora. Inicialmente se us el mtodo indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver figura anterior), pero actualmente es ms frecuente usar el mtodo del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El mtodo indirecto permite una mayor versatilidad de la tcnica y mayor intensidad de seal frente a una misma cantidad de antgeno.Lainmunofluorescenciase basa en las propiedades de los fluorocromos. Son molculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molcula tisular, su verdadero potencial se muestra cuando necesitamos unamltiple inmunodeteccin, es decir, dos o ms molculas presentes en una misma clula o matriz extracelular de forma simultnea. Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con el que iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar molculas diferentes. Tomando fotografas tras cada excitacin y superponiendo dichas imgenes podemos averiguar si las molculas se expresan, por ejemplo, en la misma clula.

Deteccin de la molcula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoqumica usando un anticuerpo primario sin marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante despus se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta concentracin de protena como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van disueltos los anticuerpos. La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de hidrgeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio tico.

Deteccin con inmunofluorescencia de dos antgenos en una seccin de tejido nervioso: la molcula tirosina hidroxilasa (a la izquierda) y el neuropptido Y (a la derecha), usando fluorescena y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un mtodo de marcaje indirecto. En esta seccin la tirosina hidroxilasa aparece en cuerpos celulares (flecha) mientras que el neuropptido Y aparece en fibras. El asterisco indica donde est la clula con tirosina hidroxilasa, pero no emite luz visible porque la foto se ha tomado iluminando la seccin con una longitud de onda que no excita a la fluorescena.

Deteccin simultnea de dos molculas situadas en el mismo tejido mediante inmunofluorescencia. La razn de que los dos anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratn y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

Hibridacin In SituNo se puede considerar a la hibridacinin situcomo una tcnica de uso general. Sin embargo, aporta una informacin sobre la fisiologa de las clulas y los tejidos que no es posible obtener con otras tcnicas. La hibridacinin situse usa ampliamente en investigacin en desarrollo embrionario, diferenciacin de clulas madre, manipulaciones genticas o cambios en la fisiologa celular frente a seales externas, entre otras.Permite descubrir la expresin de un gen mediante la deteccin de su producto, el ARN mensajero. Podemos descubrir qu clulas expresan un gen determinado y cundo lo expresan.La expresin gnica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe otra aplicacin de la hibridacin y consiste en la localizacin fsica de un gen sobre un cromosoma.La hibridacinin situse basa en la complementariedad de bases de nucletidos. Del mismo modo que en la inumocitoqumica se usan los anticuerpos, en la hibridacinin situse usa unasecuencia de nucletidos, denominada sonda, que es complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar y que est marcada con una molcula que luego pondremos de manifiesto.Quiz una de las razones por las que la hibridacinin situno es comn todava en los laboratorios de histologa es porquesintetizar una sonda es complicadoy generalmente no se puede usar en una especie animal o vegetal distinta para la que se ha producido dicha sonda. Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero), por ejemplo un mismo receptor de membrana, de distintas especies tienen secuencias que no son idnticas y por tanto impiden la hibridacin de sondas que no sean especficas. Sin embargo, una vez obtenida la sonda el proceso es sencillo.Para obtener una sonda hay primero que clonar la secuencia de bases del gen (ARN mensajero) que queremos detectar.Clonarl implica realizar una serie de pasos: 1) Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se retrotranscriben (transcripcin inversa), es decir, se hacen copias complementarias de ADN de todos los fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen hebras de ADN denominadascDNA. 2) Mediante la tcnica dePCR("polymerase chain reaction") se consiguen multitud de copias de manera especfica de la secuencia de ARN mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas copias se integran en unplsmidoy posteriormente se introduce enbacterias. 4) Se cultivan las bacterias para que proliferen y as tambin conseguir gran cantidad de plsmidos, que se duplican en cada divisin bacteriana. 5) Los plsmidos se extraen y purifican. 6) Mediante un proceso detranscripcinsimilar al que ocurre en el ncleo de las clulas, a partir de estos plsmidos se consiguen numerosas rplicas complementarias a nuestra secuencia inserta, que ser tambin complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar. El resultado de la transcripcin realizada repetidas veces es un gran nmero de cadenas de ARN denominadassondas. Durante su sntesis es cuando se aaden los nucletidos conjugados con las molculas marcadoras que nos servirn para detectarla una vez la hibridacin se haya producido. Normalmente son molculas pequeas como ladigoxigeninay labiotina, aunque tambin se pueden utilizarmolculas fluorescentes, que se une a los nucletidos que formarn parte de la sonda.

Esquema resumido del proceso de hibridacinin situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina.

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una lamprea.

Esquema del proceso de hibridacinin situsobre secciones de criostato.La hibridacinin situse puede combinar con otras tcnicas como la inmunocitoqumica o tinciones generales.ObservacinEl ltimo paso de todo proceso histolgico es laobservacindel resultado producido por la tcnica realizada. El poder de resolucin del ojo humano es de 0.2 mm (poder de resolucin: distancia mnima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una clula eucariota tpica suele tener unas dimensiones que oscilan entre 10 y 50 micrmetros (m. 1 m=10-6 mm). Adems, si queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta que el grosor de una membrana celular es de unos 70 nanometros. Todo ello implica quenecesitamos aparatos que nos permitan aumentar al imagen de las muestraspara discriminar estructuras tisulares diminutas como son las clulas o sus compartimentos. Estos aparatos se llaman microscopios.Hay dos tipos de microscopios: los pticos y los electrnicos.Losmicroscopios pticos, o de campo claro, ultilizan la luz visible y lentes de cristal que permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolucin de unos 0,2 micrmetros. Esto es la mxima resolucin que permite la luz visible, por sus propiedades de onda. Se usan para observaciones generales, caractersticas celulares y tisulares, y estn presentes en todos los laboratorios de histologa.Losmicroscopios electrnicosse basan en la alta frecuencia de los electrones para conseguir un poder de resolucin de 1 nanometro. Se usan para observar la ultraestructura de la clula y los tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como orgnulos, membranas u organizaciones moleculares (por ejemplo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tipos de microscopios electrnicos: los de transmisin, que se usan para estudiar la ultraestructura membranosa y molecular de la celula, y el de barrido, que permite estudiar superficies.A los microscopios, sobre todo los pticos, se les puede aadir dispositivos que permiten ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al microscopio ptico se le puede adaptar una fuente luminosa y una serie de filtros para observar molculas fluorescentes, o filtros para destacar cambios de densidad en el tejido, etctera. A las diferentes formas de utilizar los microscopios para la observacin de caractersticas de los tejidos se les llamamicroscopa. As podemos hablar de microscopa ptica, de contraste de fase, de fluorescencia, electrnica, etctera.Microscopio OpticoEl microscopio ptico es un elemento esencial para los estudios generales de histologa puesto que es el que nos permite observar las diferentes caractersticas morfolgicas de las clulas y los tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan una muestra de tejido. Su invencin se remonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido perfeccionando hasta llegar a los moderno microscopios. Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a perfeccin y calidad se ha producido en su principal elemento,las lentes, las cuales aumentan la imagen de las secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles ntidos que de otra manera sera imposible observar.Los microscopios pticos tienen un lmite mximo de resolucin de 0,2 m. Elpoder de resolucines la distancia mnima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este lmite viene determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminacin, en este caso la luz visible.Contiene normalmente dos lentes: el objetivo y el ocular. El primero recoge la luz que atraviesa la seccin de tejido, mientras que el ocular es el que forma la imagen que observamos. Elaumento totalque permite un microscopio ptico se calcula multiplicando la magnificacin que producen el objetivo por la que producen los oculares. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x (aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final sera de 400x, es decir, vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios pticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x ms oculare