HEMATOLOGIA

Especialidad en el laboratorio clínico relacionada con el estudio de la sangre y con los tejidos formadores de la misma. Son ellos quienes estudian, diagnostican y tratan desórdenes de la sangre, como la leucemia, la anemia y la hemofilia; así como enfermedades de los órganos que producen la sangre, incluyendo los ganglios linfáticos, la médula ósea y el bazo. En esta área también se realizan los estudios de coagulación sanguínea. La hematología en la práctica diaria es una herramienta que no sólo permite diagnosticar enfermedades, sino también orienta en patologías que tienen signos y síntomas similares, por lo que se ha convertido en el principal estudio de cualquier laboratorio de análisis clínicos.

INTRODUCCION

La biometría hemática es un auxiliar en el diagnostico y seguimiento de anemias, leucemias, pacientes con quimioterapias, síndrome febril e infecciones. La biometría hemática también denominada hemograma, es uno de los estudios de rutina de mayor importancia, ya que da información que de aquí se deriva i nos proporciona una idea muy confiable del estado general de salud del paciente.Este estudio consta de varios parámetros.

HEMOGLOBINA.La hemoglobina es una mediada indirecta de la capacidad de transporte de oxigeno de la sangre. La sangre se diluye en líquido de Drabkin, que destruye los eritrocitos y convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina. La solución que se produce se examina por medio de un espectrofotómetro o un colorímetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre .El método fotoeléctrico de la cianometahemoglobina permite hacer los cálculos más precisos de la cantidad de hemoglobina existentes.

CUENTA DE ERITROCITOS.El número de eritrocitos contenidos en un litro de sangre se denomina concentración de número de eritrocitos. Es difícil lograr determinaciones precisas de la concentración de número de eritrocitos con una cama para recuento. Los eritrocitos se diluyen por medio del líquido para diluir eritrocitos. Los eritrocitos se cuentan con el microscopio en una cámara para recuento y se calcula el número por litro.

MICROHEMATOCRITOVolumen del paquete globular, después de centrifugación respecto del volumen sanguíneo total expresado en litros/litros. El volumen total que ocupan los eritrocitos en un volumen dado de sangre, dividido entre el volumen de sangre, se denomina fracción de volumen de eritrocitos. El resto de

sangre se compone de casi completamente de plasma, junto con una reducida cantidad de glóbulos blancos.

RECUENTO DE LEUCOCITOS.Constituye una guía muy útil sobre la gravedad de la enfermedad. Endistintos procedimientos, se observa patrones específicos de las respuestas leucocitarias. La concentración de leucocitos es el número de ellos que se encuentra en un litro de sangre. La sangre se deposita en un líquido para diluir leucocitos (türk), que destruye los eritrocitos y deja intacto a los glóbulos blancos.

TINCIONES (Wright y Giemsa)Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto de Romanowsky y da una coloración purpúrica a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrófilos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes principales causantes de este efecto son el azul B (un producto de oxidación del azul de metileno) y la eosina Y. La amplia variación en los colores y sombras observadas con la tinción de Romanowsky permiten distinciones sutiles de las características celulares. La naturaleza ácida o básica de las estructuras celulares determina suavidez por los componentes del colorante policromático de Wright; es así como los ácidos nucleicos se tiñen con azul B que es el básico y la hemoglobina con la eosina Y que es ácida. Otras estructuras se tiñen por una combinación de ambos y se denominan neutrófilas. La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos. Esto permite distinguir perfectamente al microscopio núcleo celular Los índices eritrocitarios son aquellos q se miden el tamaño y su contenido de hemoglobina, su utilidad extrema es para clasificar eritrocitos, se basan en las mediciones de la hemoglobina, el numero de eritrocitos y el hematocrito.

MATERIAL Tubos de ensaye de 13X100 Pipetas de 1 y 5 ml Pipeta de shally (0.02ml) Pipeta de Thoma para glóbulos rojos y blancos Cámara de Neubauer  Tubo de Witrobe graduado Tubos capilares Porta y cubreobjetos Papel parafilm Cerillos Guantes Gasas Gradilla

EQUIPO Microscopio Agitador de pipetas Espectofotometro Centrifuga Lector de hematocrito

REACTIVOS Liquido de Türk  Etanol al 70% Liquido de Hayem Reactivo de Drabkin Solución estantard de cianometahemoglobulina

DESARROLLO:

A). Hemoglobina1. En un tubo de ensaye agregue 4 ml de cianometahemoglobina y0.02 ml de sangre, agitar cuidadosamente. Reposar 10 minutos y leer la absorbancia o el % de transmitancia contra el blanco reactivo.

B). cuenta de eritrocitos.

1. Llenar con sangre bien mezclada, la pipeta de Thoma hasta lamarca 0.5

2. Limpiar cuidadosamente la parte externa de la pipeta, completar con el líquido de Hayem, hasta la marca de 101.

3. Sellar con papel parafilm, agitar durante 3 minutos, mezclar perfectamente.

4. Colocar el cubrehematimetro sobre la cámara.5. Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cámara por capilaridad por uno de los bordes del cubrehematimetro sobre la cámara.

6. Dejar reposar de 3-5 minutos., con el objetivo de 40x se cuentan los eritrocitos contenidos en los 80 cuadros pequeños.

C). Microhematocrito.1. Se llena con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3partes de dos tubos capilares.

2. El extremo vacio de cierra con la flama o plastilina.

3. Colocar en los canales de centrifuga, con el extremo cerrado dirigido hacia fuera, centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos.

D). Leucocitos.1. Homogenizar la sangre, con la pipeta de toma para glóbulos blancos, aspirar sangre hasta la marca de 0.5, secar cuidadosamente la parte superior de la pipeta.

2. Completar con líquido de Türk hasta la marca 11, agitar 2 minutos.

3. Desechar las primeras 4-5 gotas y se carga la cámara de Neubauer.

4. Dejar reposar la cámara con la muestra durante 3 minutos. Observar al microscopio con el objetivo de 10x.

5. Se cuentan los leucocitos en cada uno de los cuadrados de 1 mm2 de las esquinas de la cámara.

E). Frotis sanguíneo.1. Se coloca un agita de sangre anticoagulada en uno de los extremosde un portaobjetos, se sujeta colocando pulgar e índice en extremosopuestos, con un segundo portaobjetos se toca la gota de sangre ypor capilaridad difunde, en un ángulo de 30° se desliza rápida yfirmemente en la dirección opuesta.

F). Tinción de Wright1. En el soporte de tinción se coloca el frotis en posición horizontal

2. Se le añade colorante de Wright, sobre el frotis de manera quequede todo cubierto con el colorante. Se deja actuar durante 2 min.

3. Agregar sol. Amortiguadora, de manera que se forme una capametálica, con una pipeta soplar para que la muestra sea uniforme,se deja la muestra durante 3-6 minutos.

4. Se lava la tinción con agua corriente y se dejas secar.

G). Tinción de Giemsa.1. Colocar el frotis en el soporte de tinción, fijar el frotis con metanol dede 10-20 minutos.

2. Se cubre el frotis con el colorante de Giemsa y 10 ml deamortiguador de fosfatos por 30 min.

3. Se lava la tinción con agua corriente y el frotis se seca al aire libre.

4. Se observa al microscopio con el objetivo de 40x.

H). Índices eritrocitarios.Se calculan cada uno de los índices.

RESULTADOS

Cuenta eritrocitariaCálculos:

Hematocrito:Cálculos:

HEMOGLOBINACálculos:

CUENTA LEUCOCITARIACálculos:

Indices eritrocitariosVCM(Volumen Corpuscular Medio)

CMHb (concentración media de hemoglobina corpuscular)

RECUENTO DE PLAQUETAS 

Los trombocitos o plaquetas constituyen una parte esencial del organismo hemostático del cuerpo. Son cuerpecillos hialinos incoloros que miden de 2-4 μ, de bordes irregulares, pero pueden tener forma esférica u ovalada, carecen de núcleo y son muy frágiles. Provienen de una célula gigante que mide de entre 50-100 μ de diámetro llamada megacariocito.Una de las principales funciones de las plaquetas es participar en los mecanismos de la hemostasia (Hemos=sangre,

stasis=detención) adhiriéndose entre ellas y a las paredes de los vasos sanguíneos lesionados, para formar así el trombo plaquetario o tapón hemostático.El líquido diluyente puede ser una solución estéril de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo (85 milimolar) y cloruro de sodio (31 milimolar). Este líquido se provee listo para usar y su conservación es indefinida en refrigerador (2 - 10° C) o puede ser también oxalato de amonio al 1%. El fundamento del método consiste en la producción de hemólisis por la utilización de un líquido hipotónico, y el mantenimiento de las plaquetas intactas y sin agrumar por la presencia de p-aminobenzoato de dietilaminoetilo.

MATERIAL Equipo para venopuncion Tubo con anticoagulante EDTA Boquilla roja Tubo de goma Tubos de ensayo Papel parafilm Cubrehematimetro Gasas Caja de Petri Papel filtro

EQUIPO Pipeta de Thoma para glóbulos rojos Cámara de Neubauer Microscopio

REACTIVOS Alcohol al 70% Diluyente de plaquetas

PROCEDIMIENTO

1.    Obtener 10 ml de sangre venosa, en un tubo con anticoagulante EDTA

2.    Agitar la sangre de manera suave en el tubo para mezclarla con el anticoagulante

3.    Llevar la sangre hasta la marca 1.0 de la pipeta de Thoma. Limpiar la punta con una gasa 4.    Aforar con liquido diluyente de plaquetas hasta la marca 101 de la pipeta (Dilución 1:100)

5.    Tapar los extremos con papel parafilm y mezclar durante 1 minuto 6.    Colocar la Cámara de Neubauer sobre una superficie horizontal y poner el cubrehematímetro sobre las mesetas

7.    Descartar las primeras 4 gotas de la pipeta. Con la quinta gota cargar la cámara, depositándola entre la meseta y el cubrehematímetro y dejarla difundir por capilaridad, teniendo cuidado de que no se formen burbujas o se derrame el líquido hacia los surcos 8.    Colocar la cámara de Neubauer  ya cargada en el interior de una caja de Petri, con papel filtro humedecido en agua para evitar la evaporación, dejar en reposo de 10 a 15 minutos  9.    Observar al microscopio contando en la cuadricula central (para glóbulos  rojos) las plaquetas  que aparecen mucho más pequeñas que los hematíes, redondas, alargadas u ovales, altamente refringentes

10. El cuadro central de la cuadricula mide 1.0 mm por lado y está dividido en 16 cuadritos más pequeños, de tal manera que el número total de estos últimos es de 400, mismos en los que se lleva a cabo el recuento de plaquetas.

RESULTADOSLos recuentos de plaquetas, al igual que los eritrocitos y leucocitos,  se expresan como concentraciones, que en este caso serían número de células por unidad de volumen de sangre, que es 1mm3.

Después de contar las plaquetas presentes en los 400 cuadritos centrales, el número obtenido se multiplica por el factor de dilución  de la siguiente manera:

N° de plaquetas x mm3 = No. De plaquetas contadas X dilución X 10Dilución: 1:100 

Este factor corresponde, para obtener los resultados por mm3 ya que el volumen de la cámara es de 0.1 mm3

El número de plaquetas fue de 535, por lo que al realizar los cálculos quedaron así:No. de plaquetas = 535 X 100 X 10= 535 000 plaquetas por mm3, lo que indica un índice elevado de plaquetas.

VALORES DE REFERENCIA

(Millones de células/mm3)

Hombres y Mujeres:………………………………..150 000 - 450 000

GRUPO SANGUINEO

A comienzo del siglo pasado, Landsteiner descubrió que los individuos podían ser agrupados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos fuertemente inmunogénicos en la superficie de los glóbulos rojos. También demostró la existencia de anticuerpos (aglutininas) dirigidos contra los antígenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero sí contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la práctica transfusional.

La determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO se efectúa enfrentando los glóbulos rojos del paciente con anticuerpos monoclonales Anti-A, Anti-B o Anti-AB. La aglutinación o no de los hematíes ensayados frente a cada uno de los reactivos indica la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos.

MUESTRAa) Recolección: la sangre debe ser obtenida asépticamente, con o sin anticoagulante. Puede analizarse sangre obtenida por punción digital para la técnica en placa. Para evitar la coagulación de la sangre al utilizar esta técnica, se la debe mezclar rápidamente con el reactivo a ensayar.Para los ensayos con sangre de cordón, los glóbulos rojos deberán lavarse previamente con solución fisiológica.b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (ácido cítrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina)

MATERIAL - Centrífuga- Tubos de hemólisis- Placas- Palillos mezcladores descartables

REACTIVOS Anti-A, Anti-B o Anti-AB monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales de clase IgM secretados por líneas celulares de hibridoma de ratón en una solución tamponada conteniendo 1 g/l de azida sódica como conservante. Los clones involucrados y la coloración de cada producto se detallan en la siguiente tabla:

PROCEDIMIENTOPreparar una suspensión de glóbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensión al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.

1) Colocar en una placa limpia y rotulada, una gota deReactivo Anti-A, Anti-B o Anti-AB monoclonal y agregar al lado 1 gota de suspensión de glóbulos rojos. El gotero provisto dispensa un volumen de 50 ± 5 ul. Es importante que se mantenga la relación reactivo: células en todos los sistemas de ensayo.

2) Mezclar el Reactivo y los glóbulos con un palillo descartable cubriendo un área circular de 2 cm de diámetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinación visible macroscópicamente hasta los 2 minutos. La observación puede facilitarse si se emplea una fuente de luz difusa. No debe emplearse microscopio.La prueba debe ser interpretada dentro de los 2 minutos para evitar que el reactivo se seque por evaporación. Cuando se observa aglutinación débil debe repetirse la prueba utilizando la técnica en tubo (por centrifugación).

Pueden agregarse 2 volúmenes de reactivo a 1 volumen de muestra para resaltar la aglutinación, sin riesgos de falsos positivos.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Reacción positiva: los hematíes aglutinan en segundos y permanecen aglutinados al balancear la placa. Indica la presencia del antígeno eritrocitario correspondiente.

Reacción negativa: no se observa aglutinación a los 2 minutos, indicando ausencia del antígeno correspondiente.

DETECCION DE ANTIGENO D (RHo)

Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clínica en la detección de los anticuerpos anti-D.Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antígeno D y son fácilmente estimulados cuando reciben este antígeno, ya sea por transfusión o durante el parto, produciendo anti-D. Algunos individuos presentan una disminución cuantitativa en la expresión de su antígeno D, llamados D débiles (antiguamente Du ). Otros, en cambio, presentan una variación cualitativa en la expresión de dicho antígeno, denominados como D parcial. Dentro de este grupo se encuentra la categoría DVI,caracterizada por poseer una mínima cantidad de epitopes.El antígeno D es altamente inmunogénico siendo responsable de severas reacciones post-transfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido. Existen más de 40 antígenos diferentes identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antígeno D el que posee mayor importancia en la clínica después del sistema ABO.

Los glóbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antígeno correspondiente, se producirá una aglutinación visible macroscópicamente.El componente IgM anti-D del reactivo produce aglutinación directa de los glóbulos rojos portadores del antígeno D normal. En la mayoría de los casos los D débiles no se aglutinan directamente con este reactivo.

El componente IgG anti-D del reactivo puede detectar las variantes débiles (detecta DVI) mediante la prueba indirecta conanti-globulina.

MUESTRARecolección: obtener la sangre en forma aséptica con o sin anticoagulante. Puede analizarse sangre obtenida por punción digital para la técnica en placa. Para evitar la coagulación de la sangre al utilizar esta técnica, se la debe mezclar rápidamente con el reactivo.

MATERIAL - Placa de vidrio- Palillos mezcladores descartables

REACTIVO PROVISTOAnti-D (Rho): mezcla de anticuerpos monoclonales humanizados IgM/IgG (Blend) perteneciente a los clones TH-28 (secretor de IgM) y MS-26 (secretor de IgG), en una solución tamponada conteniendo 1 g/l de azida sódica como conservante.

PROCEDIMIENTO

Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 40-50% en plasma/suero autólogos, PBS pH 7,0 ± 0,2 o solución fisiológica. También puede emplearse sangre entera.

1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia y rotulada.

2) Agregar al lado una gota de la suspensión de glóbulos rojos a probar. Debe mantenerse la relación antisuero:células en todos los ensayos.

3) Mezclar el antisuero y los glóbulos rojos con un palillo descartable en un área de 2 cm de diámetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. La observación puede facilitarse si se emplea una fuente de luz difusa. Si el período de observación es mayor a 2 minutos, efectos de la evaporación del reactivo pueden conducir a resultados equivocados (débilmente positivos). Algunas muestras D débiles o D parcial pueden no aglutinar cuando se utiliza la técnica en placa. Ante resultados indeterminados o negativos deben confirmarse utilizando la técnica en tubo.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLa observación de aglutinación indica presencia del antígeno D; la reacción es positiva y el individuo será clasificado como Rh positivo.La no aglutinación con el reactivo Anti-D en la prueba antiglobulina indirecta para D débil indica ausencia del correspondiente antígeno; la reacción es negativa y el individuo será clasificado como Rh negativo.TIEMPOS DE COAGULACIÓN

Tiempo de Protrombina (TP)Tiempo de Tromboplastina Parcial (TTP)

La coagulación resulta de una secuencia (cascada) de

reacciones que involucran algunas proteínas que se conocen

como factores de coagulación. Algunos de estos factores

tienen otros nombres como, por ejemplo, el Factor I también

llamado fibrinógeno, el Factor II es la protrombina y el Factor

XII es el de Hageman. Estas proteínas se producen en el

hígado y se segregan en la sangre. Además, la vitamina K es

importante en la coagulación ya que el organismo la convierte

en protrombina.

Debido a la relación que existe entre la vitamina K y la

protrombina, las personas que toman warfarina necesitan

mantener bajo control médico los niveles de vitamina K e

incluirla en la dieta en las cantidades que el médico indique.

La secuencia de coagulación se inicia cuando los factores de

coagulación entran en contacto con el tejido dañado y cada

reacción del factor de coagulación activa la próxima reacción.

El producto final de la cascada es el coágulo de sangre. El

factor X se puede activar por medio de dos secuencias

separadas de reacciones químicas. A los factores involucrados

en las dos secuencias se les llama el sistema intrínseco y

extrínseco. El extrínseco, una sustancia llamada

tromboplastina o factor tisular (una proteína liberada por los

tejidos dañados) activa el factor VII.

El TP se utiliza para evaluar la suficiencia del sistema

extrínseco. Además, mide la capacidad de coagulación de los

factores I (fibrinógeno), II (protrombina), V, VII y X. Cuando

cualquiera de estos factores está presente en cantidades

deficientes, el TP se prolonga.

Fibrinógeno (Factor I)

Esta sustancia coagula por acción de la trombina,

transformándose en fibrina. El fibrinógeno se origina en el

hígado, quizás sólo en él. En condiciones patológicas la

cantidad de fibrinógeno puede disminuir e incluso

desaparecer lo cual provoca que las personas que padecen de

esta anomalía se ven expuestos a hemorragias importantes si

se lesionan vasos grandes o medianos.

Trombina

La trombina coagula las soluciones de fibrinógeno y durante la

coagulación se forma a expensas de la protrombina. La

trombina aumenta la velocidad de coagulación. La trombina

actúa sobre el fibrinógeno desdoblando sus moléculas y

permitiendo la formación de fibrina.

Protrombina

La protrombina pura no coagula al fibrinógeno necesita la

presencia del ion calcio y sustancias que hay en las plaquetas

y en el plasma que la transforman en trombina. Se forma en

el hígado y este necesita la presencia fundamental de la

vitamina K. Existe tendencia a las hemorragias cuando la

protrombina del plasma se reduce a un 20 % del valor normal.

Tromboplastina de los tejidos

La existencia de este conjunto de sustancias en los tejidos

hacen que cuando hay una herida coagule rápidamente, en

cambio si la sangre sale de un vaso y no hay contacto con los

tejidos, la coagulación es más lenta.

Las plaquetas

Estas intervienen en la retracción del coagulo y en la

hemostasis.

  * Forman nudos en la red de fibrina 

  * Liberan substancias importantes para acelerarla 

  * Aumentan la retracción del coágulo sanguíneo produciendo

la trombostenina, semejante a la actomiosnia del músculo. 

  * La trombocitopenia coexiste generalmente con la

tendencia a las hemorragias, y algunos trastornos de la

coagulación como se observa en los casos de hemorrágicas

púrpuras con trombocitopenia. 

  * En las heridas las plaquetas aceleran la coagulación, y

además al aglutinarse obstruyen pequeños vasos, y

engendran substancias que los contraen.

EQUIPO

      * Micropipetas       * Cronometro      * Baño María      * Espectrofotómetro      * Centrífuga

PROCEDIMIENTO

  * Tiempo de protombina (TP)

1. Colocar en un tubo   0.1 ml de plasma incubar 2 minutos.2. Agregar 2ml   de reactivo   TP. Tomar el tiempo hasta la formación del coagulo   blanco.

  * Tiempo de tromboplastina parcial (TTP)

100ml de reactivo de TTP100l de plasma deshidratado100l de CaCl   0.02M

1. Colocar 0.1 ml de plasma en un tubo, incubar durante 1 min.2. Agregar 0.1 ml   de reactivo   TPT, incubar 1 min.

 RESULTADOS

Valores de referencia:

TP= 11 a 13.5 segundosTTP= 25 a 35 segundos