HEMOGLOBINA FETAL

HEMOGLOBINA FETAL

Método de Singer

A1, A2

Fetal

Normales

S, C, D, E

Álcalis

540 nm

Patológicas

Procedimiento

6,8 ml Sulfato de Amonio 50%

TUBO A

3,2 ml

0,2 ml Solución deHemolizado 10%

1 min

TUBO B

Procedimiento

- 0,02 ml Solución deHemolizado 10%

- 5ml de Agua destilada

Filtro verde

TUBO C

TUBOS B Y C

Cálculos

% Hb F = ¼ Lectura B x 100 Lectura C

Solución B: 1/50

Solución C: 1/200

VR: < 2% En Adultos

Utilidad Clínica

45 al 90%Fetal

15% 5% 2%

Utilidad Clínica

Utilidad Clínica

Talasemia mayor Hb fetal 40-100%

Talasemia menor Hb fetal A2

Hb fetalPersistencia del gen Hb Fetal

26%

Solución de Hemolizado

SSF

5 min10 ultima3000rpm

Agua destilada

30 a 60 minutos

Agregar volumenIgual de cloroformo

AGITAR5 min 15 min

3000rpm

Descartar el sobrenadante, donde se encuentra el hemolizado. Por debajo se debe situar, una capa del estroma de color rojo, y en el fondo, el cloroformo utilizado para la extracción. Finalmente se determina la concentración de hemoglobina, del hemolizado, y se ajusta al10% si es necesario según la tabla confeccionada para tal fin.Cuando a la solución de hemolizado se

le noten grumos volver a centrifugar, para poder ser utilizado debe de tener menos de 40 horas.

Solución de Hemolizado

Solución de Hemolizado

Hidróxido de potasio, 12N: A 1 volumen de hidróxido de potasio N/A (50ml). Añadir 2 volúmenes de agua destilada (100ml. Solución estable a medio ambiente.

Sulfato de amonio al 50% de saturación: 50ml sulfato, 50ml agua, 0,25 de acido clorhídrico concentrado.

REACTIVOS

TEST DE HAMPrueba de suero ácido para el diagnóstico de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

Anemia Hemolítica

Defectos en la membrana del eritrocito.

Es adquirida.Mutación en el gen que

codifica a la proteína GPI.Eritrocitos susceptibles a la

lisis mediada por el complemento (vía alternativa)

Fundamento

En la HPN, el paciente tiene una población de eritrocitos inusualmente sensibles a la lisis por el complemento, el cual se activa por la vía alterna y se une a ellos en el suero acidificado.

BbC3b

C3b Vía Alterna del

Complemento Medio Ácido

GPI

Fundamento

Hemólisis

Procedimiento

Sangre del paciente sin

Anticoagulante

Suspensión 50% de

Eritrocitos con SSF

Suero Normal Inactivado (56ºC 30’ a 1 h)

Suero Fresco

No Hemolisado

NH4OH HCl

--- --- --- 0.5 ml 0.5 ml

0.5 ml 0.5 ml --- --- ---

--- --- 0.5 ml --- ---

--- 0.05 ml 0.05 ml --- 0.05 ml

0.05 ml 0.05ml 0.05 ml 0.05 ml 0.05 ml

Suero Normal Fresco

Susp.. 50% de

Eritrocitos

HCL 0,2 N

Suero Normal

Inactivado

Suero del Paciente

1 2 3 54

Esquema del procedimiento

(-) (+++++) (-) (+++) (++++)

Esquema del procedimiento

MEZCLAR 37ºC 30’

CENTRIFUGAR

Comprobar si hay señales de lisis en el

líquido sobrenadante

Utilidad Clínica

Cuando una prueba de hemólisis de la sucrosa da un resultado positivo, se recurre al Test de HAM como prueba confirmatoria de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

La lisis de las células de la HPN se produce con suero acidificado normal y del paciente. (Prueba positiva)

Si también se observa lisis con el suero normal acidificado inactivado por el calor (Prueba negativa) Las células marcadamente esferocíticas pueden reaccionar de esta forma.

Utilidad Clínica

Diagnóstico de:

1. Hemoglobinuria Paroxística Nocturna

2. Anemia Aplásica3. Anemia Diseritropoyética

congénita tipo II (da la prueba del suero acidificado positiva, pero la prueba de sucrosa es negativa)

TEST DE SUCROSAPRUEBA SELECTIVA DE LA

SANGRE TOTAL

Fundamento

La sucrosa o sacarosa isotónica proporciona un medio de bajo contenido iónico que promueve la unión de los componente del complemento a los eritrocitos

En la HPN, una porción de los eritrocitos es anormalmente sensible a la lisis mediada por el complemento, el cual es activado hasta el final de la cascada de activación con la consecuente lisis de los eritrocitos anormales.

BbC3b

C3b Vía Alterna del

Complemento Sucrosa 10%

GPI

Fundamento

Hemólisis

Materiales

Sangre completa del paciente con anticoagulante (Citrato de Na 3.8% o Oxalato de K)

10 g de Sucrosa disueltos en agua destilada hasta un volumen final de 100 ml

SUCROSA AL 10%

Procedimiento

1 parte 9 partesCENTRIFUGAR

30’ a Tº Ambiente

INCUBAR5’ a máx. revolución

Observar la hemólisis en el líquido sobrenadante

MEZCLAR

SUCR

OS

A

PACIENTE

Resultados e Interpretación

Presencia de hemólisis en el sobrenadante, indica que hay que realizar la prueba confirmatoria de hemólisis de la sucrosa para confirmar HPN

Ausencia de hemólisis en el sobrenadante indica que no existe HPN. Una muestra sangre control normal debe dar negativo.

Causas de Error

FALSOS POSITIVOS

FALSOS NEGATIVOS

1. Utilizando sangre desfibrinada2. Pacientes anémicos sin HPN3. La solución de sucrosa al 10% que no

ha sido recién preparada.

1. Utilizar heparina o EDTA como anticoagulantes

2. Excesiva centrifugación3. Reactivo de Coombs

contaminado o inactivado.

TEST DE SUCROSAPRUEBA CONFIRMATORIA DE

SUCROSA

Materiales

REACTIVOS: • Solución isotónica de sucrosa• Hidróxido de amonio (NH4OH) 0,01M

5 min máx. rpmCENTRIFUGAR

sobrenadante

en cada lavada

DESCARTAR

Lavar los eritrocitos procedentes del paciente y de una persona normal (control negativo), suero compatible de tipo ABO , el cual debe estar almacenado a – 70ºC o Tº inferiores.

Preparar suspensiones al 50% en solución de NaCl 0.15 M (paciente y suero control).

PACIENTE P.NORMAL

SSF

LAVAR

2 a 3 veces

Procedimiento

MEZCLAR MEZCLAR

0.05 ml 0.85 ml

SUERO

SUCR

OS

A

0.1 ml 0.1 ml

Suspensión de

EritrocitosPACIENTE P.

NORM

AL

5 minmáx. rpm

INCUBARTº Amb por 30’

CENTRIFUGAR

LEER540 nm

ESTÁNDAR: 0.1ml de suspensión de eritrocitos del paciente mas 0.9 ml de NH4OH 0.01M o agua destilada.

BLANCO: Mezcla de suero y sacarosa

Resultados e Interpretación

Hemólisis > 10%. Diagnóstico de HPN, pero es recomendable hacer una prueba de HAM. También la Anemia Hemolítica Autoinmune y Leucemia dan resultados falsos positivos.Hemólisis ≤ del 5 %. Es considerado un resultado dudoso cuando va la hemólisis del 5 al 10%

Causas de error

FALSOS POSITIVOS

FALSOS NEGATIVOS

1. Raramente, en casos de hemólisis autoinmune o anemia megaloblástica.

2. Si se guarda la solución de sucrosa durante largo período antes de utilizarlo

1. Suero sin actividad de complemento por haber sido almacenado inadecuadamente.

Entra por la entrada estrecha; porque ancha es la entrada y

espacioso el camino que lleva a la perdición,

y son muchos los que entran por ella; mas

¡qué estrecha la entrada y qué angosto el camino que lleva a la Vida!; y poco son los que lo

encuentran.

Mateo  7: 13-14

¡GRACIAS!