Guion

PPRRAACCTTIICCAASS DDEE BBIIOOQQUUIIMMIICCAA Licenciatura en

Ciencias Ambientales

Dpto. de Ciencias de la Salud III Área de Bioquímica y Biología Molecular

Universidad Rey Juan Carlos

Prácticas de Bioquímica

- 2 -

Prácticas de Bioquímica: Índice. NORMAS GENERALES DE LABORATORIO. 05 INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS 06 EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS 07 PRACTICA Nº 1: PRECIPITACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS. 08 1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS. 08 2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 09 2.1.2 MÉTODO. 09 1.2 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS. 11 2.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 12 2.2.2 MÉTODO. 12 1.3 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 1. 14 1.4 EJERCICIO: DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS CADENAS LIGERA Y PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS. 18 PRACTICA Nº 2: DETERMINACIÓN DE LA Km DE LA FOSFATASA ÁCIDA PARA EL p-NITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIÓN POR FOSFATO MONOPOTÁSICO. 23 2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO . 28 2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 28 2.1.2 MÉTODO. 28 2.2 ENSAYOS ENZIMÁTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR 29 2.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 29 4.2.2 MÉTODO. 29 2.3 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 2. 34


- 3 -

PRÁCTICA Nº 3: PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA 39 3.1 PRESENTACIÓN DEL PROGRAMA INFORMÁTICO . 39 3.1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA 39 3.1.2 MÉTODO. 42 3.2 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 3. 42 PRÁCTICA Nº 4: TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS. 45 4.1. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL. 46 4.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 47 4.1.2 MÉTODO. 47 4.2. DEMOSTRACIÓN: CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN. 49 4.3 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 4. 52


- 4 -

LABORATORIO DE PRÁCTICAS: UBICACIÓN. Laboratorio 006. Planta baja del Edificio Polivalente I.

Campus de Móstoles – U.REY JUAN CARLOS.

C/ Tulipán s/n 28933 Móstoles – Madrid.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO

Antes de la realización de las prácticas:

1. Estudiar cuidadosamente el guión que corresponda antes del comienzo de

cada práctica. Las posibles dudas se resolverán brevemente al inicio de la

práctica.

2. Se pasará lista para comprobar la asistencia a la práctica, por lo que se pide

puntualidad.

Durante la realización de las prácticas:

1. El uso de bata y guantes es obligatorio, así como cualquier otro material de

protección que indiquen los profesores.

2. Está absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio.

3. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca.

4. Mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las prácticas, y

una vez acabadas limpiarlo completamente.

Después de la realización de las prácticas en el laboratorio:

1. Completar el cuaderno de prácticas y entregarlo al final de las mismas

cuando el profesor lo indique.


- 5 -

INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS

Las clases prácticas del laboratorio de Bioquímica pretenden proporcionar

al estudiante una primera aproximación experimental a las técnicas básicas

empleadas habitualmente en un laboratorio de Bioquímica, lo cual le permitirá

aprender posteriormente técnicas más complejas con mayor facilidad.

Cada práctica presenta una breve introducción teórica que centra al

alumno sobre los objetivos de la misma. A continuación, se detallan los reactivos,

materiales y métodos que el alumno deberá utilizar en el desarrollo de la misma.

Por último, se plantean cuestiones relacionadas que el alumno deberá responder

razonadamente. En el cuaderno de laboratorio deberá anotar los resultados

experimentales obtenidos, realizar el trabajo indicado con esos resultados, anotar

las incidencias que hubieran podido ocurrir y responder a las preguntas

planteadas en el laboratorio, en éste guión de prácticas y en el propio

cuaderno.

El trabajo de laboratorio se concreta en cuatro prácticas, a realizar en

cuatro sesiones. Las primera práctica introduce al estudiante en las técnicas más

utilizadas en el estudio de proteínas: precipitación y cuantificación. También se

hará un ejercicio de determinación del peso molecular de una proteína. En la

segunda práctica avanzamos en la actividad biológica de las proteínas,

caracterizando los parámetros cinéticos de un enzima. En la tercera práctica se

utilizará un programa de ordenador que permite diseñar la mejor estrategia para

la purificación de una proteína con actividad enzimática. En la cuarta práctica

se realizará una cromatografía en papel y adicionalmente se realizará una

demostración de la técnica de cromatografía de exclusión.


- 6 -

EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

La asignatura de Bioquímica consta de dos partes, teórica y práctica. Ambas partes deben ser aprobadas de forma independiente para ser considerado apto en la asignatura.

Las prácticas tendrán calificación de apto o no apto, siendo requisito indispensable superar las mismas para aprobar la asignatura. En la evaluación de la parte práctica se consideran requisitos indispensables: A.- Asistencia: la realización de todas las prácticas es obligatoria. La no asistencia implica declarar las prácticas suspensas, incluso en el caso de que se aprobara el examen de prácticas. B.- Cuaderno: Su entrega es obligatoria. Se entregará un solo cuaderno por cada equipo de trabajo. En el cuaderno de laboratorio debe constar: 1) Objetivo de cada práctica y desarrollo. 2) Incidencias durante la realización de la práctica. 3) Todos los resultados obtenidos. 4) Respuesta a las cuestiones planteadas en cada práctica. 5.) Resolución de los problemas planteados. Todas las gráficas deben presentarse hechas a mano en papel milimetrado original y pasadas a tinta (no a lápiz).Es normativo que el cuaderno se entregue en la fecha indicada por los profesores de prácticas y debidamente encuadernado en espiral. En caso contrario, el cuaderno no será admitido y se computará como suspenso. La calificación obtenida en él se tendrá en cuenta en la nota final. Una vez evaluados, los cuadernos se podrán recoger en la conserjería del edificio polivalente o en la conserjería del aulario. C.- Examen: En caso de suspender el cuaderno de laboratorio, se exigirá un examen práctico, que consta de dos partes:

C.1.-Test. Cada pregunta tendrá cuatro opciones de respuesta, de las cuales sólo una es la correcta. Las preguntas se corresponderán con los aspectos tanto teóricos como experimentales de las prácticas realizadas. Las respuestas incorrectas no puntúan negativamente. C.2.-Problemas. Resolución de 1 ó 2 problemas que incluyan conceptos y planteamientos experimentales tratados en una o varias prácticas.

El examen de prácticas se convoca conjuntamente con el examen de

teoría, teniendo lugar en la misma fecha, hora y lugar que éste. El alumno que sólo quiera examinarse de prácticas debe indicarlo al principio del examen. De lo contrario se considerará que se presenta a ambos y correrá convocatoria.

Una vez aprobadas las prácticas, la calificación de la parte práctica se conservará hasta aprobar la parte teórica. Así pues, en caso de repetir la asignatura NO se realizarán de nuevo las prácticas si éstas fueron aprobadas previamente.


- 7 -

PRACTICA Nº 1.

PRECIPITADO Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS.

El objetivo de esta práctica es el desarrollo de un protocolo para el

fraccionamiento de una proteína, utilizando la técnica del salting-out. En

concreto, se pretende enriquecer una muestra en anticuerpos, usando como

material de partida suero fetal bovino.

Los anticuerpos pertenecen a un grupo

de proteínas llamadas γ-globulinas ó

inmunoglobulinas, que están

compuestas por dos cadenas pesadas

(de peso molecular 55.000 Da cada

una) y dos cadenas ligeras (de peso

molecular 24.000 Da cada una) unidas

entre sí por puentes disulfuro (Figura 1).

Estas proteínas son muy abundantes en

la circulación sanguínea. Un cierto número de técnicas ampliamente utilizadas

en los laboratorios de bioquímica y biología molecular requieren la utilización de

inmunoglobulinas purificadas.

En la primera parte de esta práctica realizaremos la precipitación fraccionada

de las proteínas de suero de ternera con sulfato amónico, por lo tanto, no

estaremos purificando totalmente las inmunoglobulinas sino obteniendo

fracciones enriquecidas en estas. En la segunda parte se analizará el resultado

obtenido mediante valoración cuantitativa.


- 8 -

1.1 PRECIPITACION FRACCIONADA DE PROTEINAS.

Cuando una sal se añade a una disolución de proteínas, se produce un

incremento de la solubilidad de las mismas (solubilización por salado o “salting

in”). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilización en solución

de la proteína por la disminución de los coeficientes de actividad de los grupos

ionizables. A medida que la fuerza iónica se eleva, por aumento en la

concentración en la sal, se alcanza un máximo de solubilidad seguido de una

disminución hasta que las proteínas precipitan (precipitación por salado o

“salting out”; Figura 2). Durante la precipitación probablemente existe una

competencia por las moléculas de agua de solvatación entre la proteína y la sal

por lo que las interacciones proteína-proteína se hacen más importantes

produciéndose su precipitación. El sulfato amónico, (NH4)2SO4, tiene una gran

solubilidad (por encima de 700 g/l) y es la sal más utilizada para el

fraccionamiento de proteínas.


- 9 -

1.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

- Suero de ternera (ST)

– Disolución saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturación)

- Agua destilada.

- Tubos de plástico de centrífuga de 12 ml con tapón.

- Tubo graduado de vidrio Corex ó Álamo.

- Pipetas de vidrio y propipetas de plástico.

- Centrífuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.

1.1.2 METODO. 1. Realizar una dilución 1/5 del ST en H2O destilada. Preparar un volumen final de

6 ml. Aplicar la fórmula:

Concentracióninicial x Volumeninicial = Concentraciónfinal x Volumenfinal.

(Ci x Vi = Cf x Vf.)

2. 5 ml de esta dilución se llevan hasta un 30 % de saturación con la disolución

de (NH4)2SO4, saturada aplicando la siguente fórmula:

Vsal=V [(S2-S1)/1-S2] Vsal= volumen que hay que añadir de la disolución saturada de sal a la muestra.

V= volumen de muestra que se tiene.

S2= tanto por uno de la concentración de sal a la que se quiere llevar la muestra.

S1= tanto por uno de la concentración inicial de sal en la muestra

Se mezcla lentamente en frío, se incuba 10 minutos en hielo y se centrifuga a

4000 r.p.m. (revoluciones por minuto) durante 10 minutos a 4ºC.

3. Se pasa el sobrenadante a un tubo graduado y se mide el volumen. El

precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 1).

4. El sobrenadante obtenido en el paso anterior se lleva a un 40% de saturación

con el (NH4)2SO4 saturado. Se mezcla, se incuba 10 minutos en hielo y se

centrifuga a 4000 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. Se pasa el sobrenadante a


- 10 -

un tubo graduado y se mide su volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de

H2O destilada (fracción 2).

5. El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturación con el (NH4)2SO4

saturado. Se procesa del mismo modo que en los pasos anteriores. El

precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 3).

6. Con las tres fracciones obtenidas y la ST(1/5) se realizarán las siguientes

diluciones (en volumen/volumen):

- ST (diluido 1/5): dilución 1/450 y dilución 1/900.

- Fracción 1 dilución 1/12 y dilución 1/24.



Para preparar cada dilución, aplicar la fórmula:

Concentracióninicial x Volumeninicial = Concentraciónfinal x Volumenfinal.

(Ci x Vi = Cf x Vf.)

considerando que el volumen final de las diluciones a preparar es de 900

microlitros (μl), que la concentración inicial es siempre de valor 1 en este tipo

de diluciones y que la concentración final es el valor de la dilución que se

desea obtener (1/12, 1/24, etc). Para diluir se utilizará agua destilada. Estas

diluciones serán necesarias para determinar la concentración de proteína de

cada fracción obtenida.


- 11 -

1.2 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS.

El objetivo de la práctica es calcular la cantidad total de proteína

contenida en una disolución. En un ensayo típico de cuantificación de proteínas

la técnica a utilizar será la colorimetría. En ésta técnica se añade un agente

químico colorante a una muestra de proteína, provocando un cambio de color

en la muestra. El color obtenido será más intenso cuanto mayor sea la

concentración de proteínas en la muestra analizada. Este cambio de color es

cuantificable mediante el uso de un aparato denominado colorímetro, que

analiza la intensidad del color y le asigna un valor correspondiente de

absorbancia (energía retenida por la muestra). El análisis del colorímetro consiste

en hacer pasas a través de la muestra un haz de luz de longitud de onda

correspondiente al color adquirido por la muestra y determinar cuánta energía

de ese haz de luz queda retenida por la muestra. Cuanto más intenso sea el

color de la muestra, más energía retiene (mayor absorbancia). Para determinar la

concentración de proteína presente en una muestra problema, se diluye la

muestra, se pone en presencia del agente colorante y se mide su absorbancia.

Este valor de absorbancia obtenido se compara con una recta patrón realizada

previamente en la que se hacen reaccionar concentraciones conocidas de una

proteína control con el agente colorante. La cantidad de proteína de la muestra

problema puede ser deducida entonces interpolando su absorbancia en la recta

patrón.

Colorímetro y diagrama de funcionamiento.


- 12 -

El ensayo que vamos a realizar, denominado ensayo de Bradford, está

basado en el cambio de color que se produce en la muestra al poner en

presencia de proteína al colorante llamado Coomassie brilliant blue G-250,

principio activo del reactivo de Bradford. El colorante se une a residuos

aminoacídicos básicos (especialmente la arginina) y aromáticos.


1.- Sero albúmina bovina diluida a 1 mg/ml en agua destilada.

2.- Agua destilada.

3.- Tubos eppendorf de 1.5 ml (microtubos).

4.- Micropipetas y puntas de micropipetas.

5.- Diluciones de las fracciones obtenidas.

6.- Reactivo de Bradford.

7.- Colorímetro y cubetas de plástico de colorimetría.

1.2.2 METODO.

1.- A partir de una disolución de albúmina a concentración 1 mg/ml (1000 μg/ml)

y usando agua destilada como diluyente, preparar 6 diluciones con volumen

final de 1 ml (1000 μl), cada una con concentraciones finales de 5, 10, 25, 50,

75 y 100 μg/ml. Realizar las diluciones en tubos eppendorf de 1.5 ml con tapa,

también denominados microtubos. Mezclar bien cada dilución.

2.- Recoger una alícuota de 200 μl de cada una de las diluciones preparadas

de BSA (incluído el blanco) y depositarlos en una nueva batería de microtubos.

3.- Añadir 600 μl del reactivo de Bradford a cada alícuota de 200 ml de cada

dilución (incluído el blanco) y mezclar manualmente por inversión. Añadir el

reactivo por orden desde la concentración más baja a la más alta.

4.- Programar el colorímetro a 595 nm de longitud de onda. Calibrar el

colorímetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de

cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en cada caso. Por


- 13 -

último, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MÁS (sin reajustar a cero)

para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir

ESTRICTAMENTE el mismo orden de concentración más baja a más alta que se

siguió para añadir el reactivo de Bradford.

5.- Representar la recta patrón relacionando la absorbancia obtenida para cada

dilución con la concentración de esa dilución de BSA. Ajustar la recta

gráficamente.

6.- Recoger una alícuota de 200 μl de cada una de las diluciones de las

fracciones obtenidas en la práctica anterior (incluído el blanco) y depositarlos

en una nueva batería de microtubos.

7. Añadir 600 μl del reactivo de Bradford a cada alícuota de 200 ml de cada

dilución de las fracciones (incluír un nuevo blanco) y mezclar manualmente

por inversión. Añadir el reactivo por orden desde la concentración más baja a

la más alta, desde Fracción 1 hasta ST(1/5).

8. Calibrar el colorímetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la

absorbancia de cada una de las muestras anotando el resultado obtenido en

cada caso. Por último, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MÁS (sin

reajustar a cero) para comprobar el error en la medida de las muestras.

9. Interpolar en la recta patrón los valores de absorbancia obtenidos para cada

dilución de fracción analizada, y deducir su concentración.

Es muy importante seguir un orden a la hora de añadir el reactivo de Bradford

para la posterior medida de las muestras. Para que las medidas de absorbancia

sean fiables, todos las muestras deben estar, en la medida de lo posible, el

mismo tiempo en contacto con el reactivo de Bradford.


- 14 -

1.3 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 1.

Precipitación fraccionada con sulfato de amonio

1.- Cálculo de la dilución 1/5 del Suero de Ternera (ST) en H2O destilada.

Ci x Vi = Cf x Vf.

Ci Vi Cf Vf

ml ml

.......... ml ST + .......... ml H2O = 6 ml ST 1/5.

2.- Cálculo de los volúmenes de solución saturada de sal [(NH4)2SO4] necesarios

para obtener fracciones al 30%, 40% y 60% de sal.

Vsal=V [(S2-S1)/1-S2]

% Sal

(peso/volumen)

S2

(tanto por uno)

S1

(tanto por uno)

Volumen solución saturada de sal

(Vsal)

30 % ml

40% ml

60% ml

Determinación cuantitativa de proteínas

1.- Inserta aquí los resultados de los cálculos de cada dilución de BSA

Dilución Volumen inicial BSA 1mg/ml Volumen de agua

100 μg/ml μl μl

75 μg/ml μl μl

50 μg/ml μl μl

25 μg/ml μl μl

10 μg/ml μl μl

5 μg/ml μl μl

Blanco 0 μl 1000 μl


- 15 -

2.- Inserta aquí los resultados de los cálculos de cada dilución de las fracciones.

Fracción Dilución Volumen de fracción Volumen de agua

ST (diluido 1/5) dilución 1/450 μl μl

dilución 1/900 μl μl

Fracción 1 dilución 1/12 μl μl






Blanco ---------- 0 μl 900 μl

3.- Inserta aquí las medidas colorimétricas obtenidas.

Diluciones de BSA Densidad óptica (u.a.)

100 μg/ml u.a.

75 μg/ml u.a.

50 μg/ml u.a.

25 μg/ml u.a.

10 μg/ml u.a.

5 μg/ml u.a.

Blanco (última) u.a.

Diluciones de fracciones Densidad óptica (u.a.)

Fr1. dilución 1/24 u.a.

Fr1 dilución 1/12 u.a.





St(1/5) dilución 1/900 u.a.

St(1/5) dilución 1/450 u.a.

Blanco (última) u.a.


- 16 -

4.- Representa gráficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrón de sero albumina bovina poniendo en abscisas concentración de proteína y en ordenadas el valor de absorbancia a 595 nm. Una vez obtenida la recta patrón interpolar los resultados de absorbancia obtenidos para cada dilución de las fracciones. Reflejar en la gráfica TODAS las interpolaciones realizadas. Calcular la concentración de proteína que tiene cada dilución.

Diluciones de fracciones Densidad óptica (u.a.) Concentración de

la dilución (μg/ml)

Fr1 dilución 1/24 u.a. μg/ml






St(1/5) dilución 1/900 u.a. μg/ml

St(1/5) dilución 1/450 u.a. μg/ml

BORRADOR PARA LA GRÁFICA DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS


- 17 -

5.- A partir de la concentración de cada dilución, calcular la concentración real

de proteínas del ST (1/5) y de todas las fracciones obtenidas multiplicando la

concentración de cada dilución por su valor de dilución. Calcular el valor de

concentración real de la fracción como el valor medio de concentración

obtenido a partir de cada dilución. Calcula la cantidad (masa) de proteína en

ST, ST(1/5) y en las tres fracciones, teniendo en cuenta la concentración real y el

volumen de cada fracción.

Factor de dilución Concentración de

la fracción (μg/ml)

Concentración

media de la fracción

(μg/ml)

Masa de proteína

de la fracción

(en μg)

[Fr1. dilución 1/24] x 24 μg/ml Fr1 μg/ml μg

[Fr1 dilución 1/12] x 12 μg/ml

[Fr2 dilución 1/180] x 180 μg/ml Fr2 μg/ml μg


[Fr3 dilución 1/180] x 180 μg/ml Fr3 μg/ml μg


[St1/5 dilución 1/900] x 900 μg/ml St1/5 μg/ml μg

[St1/5 dilución 1/450] x 450 μg/ml

[St 1/5] media x 5 −−−−−−−−−−−− St μg/ml μg

6.- Ordenar entre sí las fracciones obtenidas en función de su masa (de menor

cantidad a mayor cantidad), y justificar si el orden obtenido es lógico o no y

por qué.


- 18 -

1.4 EJERCICIO: DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE LAS

CADENAS LIGERA Y PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS.

La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partícula

cargada cuando se ve sometida a la acción de un campo eléctrico. La

partícula se desplazará hacia el electrodo de carga opuesta. Así pues, una

partícula cargada positivamente (catión) se desplazará hacia el cátodo (polo

con carga negativa). Una partícula cargada negativamente (anión) se

desplazará hacia el ánodo (polo con carga positiva). Como conclusión general,

en un medio determinado, las partículas se moverán más deprisa cuanto mayor

sea su carga, y más despacio cuanto mayor sea su tamaño. En este laboratorio,

las partículas serán moléculas biológicas ó macromoléculas. En la separación de

macromoléculas, como las proteínas, la carga qp es muy baja en relación a su

masa. Para conseguir la migracion habría que aumentar mucho el campo

eléctrico y se produciría la hidrólisis del agua. Se generarían altas

concentraciones de OH- en el ánodo y H+ en el cátodo, lo que provocaría un

gradiente de pH que afectaría a la carga de la partícula. También habría

cambios en la viscosidad del medio debidos a la generación de calor por una

diferencia de potencial muy elevada.

Estos problemas pueden ser solucionados realizando la electroforesis en un

gran volumen de medio tamponado. Aún así la relación carga/masa sigue

siendo muy baja y la macromolécula migra muy lentamente con lo que el

problema de difusión se hace muy importante. Para aumentar la velocidad de la

macromolécula se aumenta la fuerza iónica del medio y para evitar la difusión se

realiza la electroforesis en soportes sólidos inertes denominados “geles porosos”.

La electroforesis es la técnica más utilizada en estudios analíticos, sobre

todo de componentes moleculares, utilizándose frecuentemente en el laboratorio

para la separación de proteínas y de ácidos nucleicos. La separación de

proteínas se realiza habitualmente mediante gel de poliacrilamida en presencia

de SDS. El gel se organiza en una red o malla a través de cuyos poros circulan las


- 19 -

proteínas a separar. Se obtiene mediante la formación de polímeros de

acrilamida y el entrecruzamiento de éstos mediado por la bis-acrilamida. El

tamaño de los poros depende de la concentración absoluta y de la proporción

de acrilamida y bis-acrilamida del gel. La polimerización es promovida por el

persulfato amónico y estabilizada por la N-N-N’N-TEtraMetilEtilenDiamina (TEMED).

Figura 1: Electroforesis en gel de acrilamida. Polo superior: Cátodo (carga negativa). Polo inferior:

Ánodo (carga positiva).

Los pesos moleculares de las proteínas se pueden determinar midiendo su

movilidad en geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecilsulfato

sódico (SDS). Esto es debido a que la cantidad de SDS (cargado negativamente)

que se une a una proteína es proporcional al peso molecular del polipéptido y es

independiente de su secuencia. A saturación, se une aproximadamente 1.4 g de

detergente por gramo de proteína. Existe una relación lineal entre la distancia

que una proteína recorre en un gel y el

logaritmo de su peso molecular. Así pues, si

tenemos una serie de proteínas de las que

conocemos su peso molecular podemos

utilizarlas como patrón y midiendo la distancia

que recorren en el gel, podemos construir una

recta que nos permita calcular el peso

molecular de nuestras proteínas problema

interpolando la distancia que han recorrido.

Figura 2: Resultado de una electroforesis de proteínas tipo SDS-PAGE. A la izquierda, las bandas del marcador de peso molecular. Los carriles 1 a 8 se corresponden con distintas muestras de proteínas. Polo superior: Cátodo (carga negativa). Polo inferior: Ánodo (carga positiva).


- 20 -

En este tipo de electroforesis se suele usar un gel

discontinuo constituido por el gel de separación o

resolución (parte inferior) y el gel de concentración o

empaquetamiento (parte superior, con pocillos). La

función del gel concentrador consiste en concentrar

la muestra hasta conseguir idealmente que forme

una línea al inicio del gel resolutivo. Esto es posible

gracias a que el paso de malla de este gel es muy grande. El propósito es que

todas las muestras de proteínas comiencen a resolverse por su tamaño desde el

inicio del gel resolutivo, y no desde la entrada en el pocillo. Tras la electroforesis,

retiramos el gel concentrador y trabajamos sólo con el resolutivo, el cual teñimos

con solución de Coomasie para revelar las bandas de proteínas presentes.

En este ejercicio se van a analizar muestras provenientes de la precipitación

fraccionada; 1.- Suero de Ternera diluído 1/5., 2.- Fracción 1 (precipitado

obtenido con 30 % de sulfato amónico); 3.- Fracción 2 (precipitado obtenido con

40% de sulfato amónico).; 4.- Fracción 3 (precipitado obtenido con 60% de

sulfato amónico). Se incluirá también un carril con marcadores de peso

molecular, que consisten en una mezcla de proteínas de peso molecular

conocido que nos servirán de referencia:

Bandas del Marcador Peso molecular

Miosina 207.000 Daltons

β-galactosidasa 118.000 Daltons

Albúmina de suero bovino 81.000 Daltons

Ovoalbúmina 52.500 Daltons

Anhidrasa carbónica 36.200 Daltons

Inhibidor de tripsina de

soja

29.900 Daltons

Lisozima 20.700 Daltons

Aprotinina 7.100 Daltons


- 21 -

Resultado de la Electroforesis: Presentación.

Se observan las bandas correspondientes a las cadenas pesadas en las tres fracciones. En la ST1/5, debido a la gran cantidad de proteína, aparece una mancha en la que no se puede distinguir la banda correspondiente a la cadena pesada. Las cadenas ligeras en la fracción I y II no se detectan debido a la baja concentración de proteínas. En la fracción II comienza a detectarse una banda muy tenue, mientras que en la ST1/5 se observa nítidamente pero en forma de mancha en lugar de en forma de banda.

Resultado de la Electroforesis: Ejercicio.

Se mide la distancia migrada en milímetros. Medir la distancia entre el inicio del gel resolutivo y el centro de cada banda, tanto para las bandas del marcador de peso molecular de proteínas como para las bandas correspondientes a las cadenas pesadas y ligeras.


- 22 -

Ejercicio

1.- Inserta aquí las medidas de migración de las bandas del marcador de peso

molecular y de las cadenas ligera (Cl) y pesada (Cp) de las inmunoglobulinas.

Bandas del Marcador Peso molecular Distancia Migrada

Miosina 207.000 Daltons mm

β-galactosidasa 118.000 Daltons mm

Albúmina de suero bovino 81.000 Daltons mm

Ovoalbúmina 52.500 Daltons mm

Anhidrasa carbónica 36.200 Daltons mm

Inhibidor de tripsina de soja 29.900 Daltons mm

Lisozima 20.700 Daltons mm

Aprotinina 7.100 Daltons mm

Fracciones Distancia migrada

Cadena Pesada

Distancia Migrada

Cadena Ligera

Fracción 1 mm mm

Fracción 2 mm mm

Fracción 3 mm mm

ST 1/5 mm mm

Diálisis mm mm

Intercambio 1 mm mm

Intercambio 2 mm mm

Intercambio 3 mm mm

Distancia Media Migrada CP = mm CL = mm

2.- Construir SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL la recta patrón que relaciona el

logaritmo decimal de la distancia migrada (en mm) DE CADA BANDA DEL

MARCADOR con su peso molecular. Sobre esta recta INTERPOLAR la distancia

media de migración de la cadena ligera y la cadena pesada de las

inmunoglobulinas para deducir su peso molecular. Representar sobre la

gráfica ambas interpolaciones. Presentar los pesos moleculares de ambas

cadenas.

Peso molecular Cadena Pesada Peso molecular Cadena Ligera

Daltons

Daltons


- 23 -

BORRADOR PARA LA GRÁFICA DE LOS PESOS MOLECULARES DE

PROTEÍNAS

3.- ¿Qué utilidad tiene la parte concentradora del gel de proteínas?

4.- ¿Qué ocurriría si no hubiésemos añadido SDS (cargado negativamente) a la

muestra de proteínas y las sometiéramos a electroforesis?

PREGUNTA.- Explica razonadamente la siguiente cuestión. Las inmunoglobulinas

están compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre

sí por puentes disulfuro. Este dato nos indicaría que la inmunoglobulina migraría

como una única proteína, detectando una sola banda. Sin embargo, en el gel

de electroforesis observamos que aparecen dos bandas diferenciadas (cadenas

pesada y ligera), y no una única proteína. ¿A qué se debe este hecho?


- 24 -

PRACTICA Nº 2.

DETERMINACIÓN DE LA Km DE LA FOSFATASA ÁCIDA PARA EL p-

NITROFENILFOSFATO Y DE LA Ki PARA LA INHIBICIÓN POR FOSFATO

La actividad enzimática se ve afectada entre otros factores, por la

concentración de sustrato inicial en la reacción [S]inicial. La constante de

Michaelis-Menten (Km) se define como la concentración de sustrato para la cual

la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima (Vmáx). Permite

conocer la concentración mínima de sustrato a la que hay que realizar los

ensayos de actividad enzimática.

Fig. 1a: Gráfica hiperbólica Vo frente a [S]; Fig 2b: Gráfica tipo Lineweaver-Burk (inversos).

La inhibición enzimática se define como la variación de los parámetros Km

o Vmáx del enzima provocada por la presencia de sustancias denominadas

inhibidores. Kap y Vmáx-ap hacen referencia a la Km y Vmáx del enzima

observados en presencia del inhibidor. Los enzimas pueden inhibirse

reversiblemente de manera competitiva y no competitiva. En la inhibición

competitiva, la unión del sustrato y del inhibidor al enzima son mutuamente

excluyentes, mientras que en la no competitiva el inhibidor se une a un sitio

regulador distinto del centro activo. La inhibición no competitiva implica la


- 25 -

disminución de la velocidad de la reacción catalizada por un enzima (Vmáx-ap

es menor que Vmáx), manteniendo Km constante. En la inhibición competitiva

Kap es mayor que Km, mientras que Vmáx se mantiene constante. En la inhibición

competitiva se observa que al incrementar la concentración de sustrato en la

reacción, el porcentaje de inhibición disminuye, mientras que en la no

competitiva el porcentaje de inhibición permanece constante e independiente

del incremento en la concentración de sustrato.

Fig. 2: Gráficas hiperbólica Vo frente a [S] y representación de inversos para inhibición reversible

competitiva (A) e inhibición reversible no competitiva (B).


- 26 -

La constante de inhibición (Ki) mide la afinidad del enzima E por el inhibidor I. Se define como:

En el caso de una inhibición no competitiva, Kap será igual a Km, pero en

el caso de una inhibición competitiva Ki debe deducirse a partir de la Kap la

cual se define como Km aparente del enzima en presencia del inhibidor.

Kap = Km {1+ ( [I]inicial / Ki )}

La fosfatasa ácida de la levadura Saccharomyces cerevisiae cataliza la

siguiente reacción: p-nitrofenilfosfato + H2O → p-nitrofenol + fosfato

Esta enzima, como su nombre indica, tiene un pH óptimo de actividad a

pH 4. La determinación de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la

cantidad de p-nitrofenol liberado por acción del enzima contenido en las células

de la levadura durante un período de tiempo determinado. La reacción se

detiene añadiendo carbonato sódico (Na2CO3) que provoca un cambio brusco

de pH alcalinizando el medio. La actividad de la enzima se puede estudiar

gracias a que el producto de la reacción (p-nitrofenol) en solución alcalina

posee un color amarillo característico que posee su máximo de absorbancia a

400 nm (mientras que el sustrato de la reacción, p-nitrofenil-fosfato, no absorbe a

esta longitud de onda).

E + I

EI

Ki =

[E] [I] [EI]


- 27 -

Propósito de la práctica: Determinación de Km, Kap y Ki.

La determinación de la Km de la fosfatasa ácida para el p-nitrofenil-fosfato

se realiza incubando el enzima (fosfatasa contenida en las células de levadura)

con diferentes concentraciones de sutrato (p-nitrofenil-fosfato) y midiendo el p-

nitrofenol liberado en cada caso mediante colorimetría a 400 nm.

La determinación de la Kap de la fosfatasa ácida en presencia del fosfato

monopotásico (inhibidor) se realiza incubando la enzima en las condiciones

anteriores y en presencia de una concentración constante del inhibidor.

Para los inhibidores de tipo competitivo, la determinación de Ki se realiza a

partir de los datos de Km y Kap obtenidos. Para los inhibidores de tipo no

competitivo, no es posible hallar Ki a partir de Km y Kap, siendo Kap=Km.


- 28 -

2.1 DILUCIONES SERIADAS DEL SUSTRATO

2.1.1 MATERIALES Y REACTIVOS.

1.- Dilución 50 mM PNPP (sustrato).

2.- Tampón Citrato pH 4.0

3.- Pipetas de Vidrio.

4.- Micropipetas y puntas de micropipeta.

5.- Tubos de plástico de 2ml con tapón.

2.1.2 METODO.

Preparar en tubos de 2 ml un banco de diluciones seriadas a partir de una

dilución inicial de PNPP 50 mM. Utilizar la fórmula Ci x Vi = Cf x Vf. Utilizar como

diluyente TAMPÓN CITRATO pH 4.0.

Inserta aquí los resultados de los cálculos de cada dilución.

Dilución de PNPP Volumen inicial Volumen de Tampón

Citrato pH 4.0

50 mM 2000 μl −−−−−−−−−−

40 mM μl del 50 mM μl








- 29 -

2.2 ENSAYOS ENZIMÁTICOS EN AUSENCIA Y EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR

2.2.1 MATERIALES Y REACTIVOS.

1.- Banco de diluciones de PNPP (sustrato).

2.- Dilución 15 mM Fosfato monopotásico (Inhibidor).

3.- Tampón Citrato pH 4.0

4.- Carbonáto sódico 0.1 M.

5.- Pipetas de Vidrio.

6.- Micropipetas y puntas de micropipeta.

7.- Tubos de plástico de 2m y de 12 ml.

8.- Cultivo líquido de levadura.

9.- Colorímetro y cubetas de colorímetro.

10.- Estufa a 30 ºC.

11.- Centrífuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.

2.2.2 MÉTODO.

IMPORTANTE: Realizar primero las reacciones sin inhibidor y medir su absorbancia.

Una vez comprobado que los valores obtenidos son aceptables, realizar las

reacciones con inhibidor y medir su absorbancia.

1. Numerar los tubos de centrífuga, colocarlos en una gradilla y poner en cada

uno de ellos las cantidades de tampón, sustrato e inhibidor que se indica en la

tabla. Añadir a cada uno de los tubos (excepto el blanco) 0.2 ml de la

suspensión de células de Saccharomyces cerevisiae (que contienen fosfatasa

ácida). Agitar la suspensión de células antes de pipetearla.

2. Incubar las reacciones durante 15 minutos a 30ºC en una estufa o baño.


- 30 -

Preparación de las reacciones sin inhibidor (sólo sustrato).

número de reacción Volumen de Tampón

Citrato pH 4.0

Volumen de sustrato

(p-Nitrofenilfosfato) Levadura

1 0.6 ml 0.2 ml del 2 mM 0.2 ml

2 0.6 ml 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml

3 0.6 ml 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml

4 0.6 ml 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml

5 0.6 ml 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml

6 0.6 ml 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml

7 0.6 ml 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml

8 0.6 ml 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml

Blanco s 0.8 ml 0.2 ml del 2 mM ----------

Preparación de las reacciones con inhibidor.

número de

reacción

Volumen de

Tampón

Citrato pH 4.0

Volumen de sustrato

(p-Nitrofenilfosfato)

Inhibidor (fosfato

monopotásico

15 mM)

Levadura

9 0.4 ml 0.2 ml del 2 mM 0.2 ml 0.2 ml

10 0.4 ml 0.2 ml del 4 mM 0.2 ml 0.2 ml

11 0.4 ml 0.2 ml del 8 mM 0.2 ml 0.2 ml

12 0.4 ml 0.2 ml del 10 mM 0.2 ml 0.2 ml

13 0.4 ml 0.2 ml del 20 mM 0.2 ml 0.2 ml

14 0.4 ml 0.2 ml del 30 mM 0.2 ml 0.2 ml

15 0.4 ml 0.2 ml del 40 mM 0.2 ml 0.2 ml

16 0.4 ml 0.2 ml del 50 mM 0.2 ml 0.2 ml

Blanco i 0.6 ml 0.2 ml del 2 mM 0.2 ml ----------

3. Tras incubar las reacciones durante 15 minutos a 30ºC, detener la reacción

con 3 ml de Carbonato sódico (Na2CO3 ) 0.1 M empezando en el mismo orden

en que se añadió la levadura. Añadir también 3 ml de carbonato sódico 0.1 M

al blanco.


- 31 -

4. Centrifugar para evitar la turbidez producida por las células y conservar los

sobrenadantes.

5. Programar el colorímetro a 400 nm de longitud de onda. Calibrar el

colorímetro a cero de absorbancia con el blanco. Medir la absorbancia de

cada una de las reacciones anotando el resultado obtenido en cada caso.

Por último, medir el blanco COMO SI FUERA UNA MUESTRA MÁS (sin reajustar a

cero) para comprobar el error en la medida de las muestras. Para medir, seguir

ESTRICTAMENTE el orden de concentración más baja a concentración más alta

de sustrato.

Inserta aquí las medidas colorimétricas obtenidas.

Número de reacción Densidad óptica (u.a.)

1 u.a.

2 u.a.

3 u.a.

4 u.a.

5 u.a.

6 u.a.

7 u.a.

8 u.a.

Blanco s (última) u.a.

9 u.a.

10 u.a.

11 u.a.

12 u.a.

13 u.a.

14 u.a.

15 u.a.

16 u.a.

Blanco i (última) u.a.


- 32 -

Inserta aquí los valores de concentración de sustrato e inhibidor INICIALES en

cada reacción (volumen final de la reacción: 1 ml).

Número de

reacción

Volumen de sustrato

usado en la reacción

[S] inicial en la

reacción

Volumen de Inhibidor

usado en la reacción

[I] inicial en la

reacción

1 0.2 ml del 2 mM mM ---------- ----------

2 0.2 ml del 4 mM mM ---------- ----------

3 0.2 ml del 8 mM mM ---------- ----------

4 0.2 ml del 10 mM mM ---------- ----------

5 0.2 ml del 20 mM mM ---------- ----------

6 0.2 ml del 30 mM mM ---------- ----------

7 0.2 ml del 40 mM mM ---------- ----------

8 0.2 ml del 50 mM mM ---------- ----------

9 0.2 ml del 2 mM mM 0.2 ml del 15 mM mM









- 33 -

Inserta aquí los valores de concentración de sustrato INICIALES y absorbancia en

cada reacción y sus correspondientes inversos.

Número de

reacción [S] inicial 1/[S] inicial Vmax (Abs) 1/ Vmax (Abs)

1 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

2 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

3 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

4 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

5 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

6 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

7 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

8 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

9 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

10 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

11 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

12 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

13 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

14 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

15 mM 1/mM u.a. 1/u.a.

16 mM 1/mM u.a. 1/u.a.


- 34 -


1.- Representa gráficamente SOBRE PAPEL MILIMETRADO ORIGINAL las gráficas

hiperbólica y de inversos correspondientes a las reacciones en ausencia y en

presencia del inhibidor. La representación se construye relacionando la

absorbancia obtenida para cada reacción con la concentración INICIAL de

sustrato en esa reacción. (en abscisas, concentraciones INICIALES de p-

nitrofenilfosfato ensayadas; en ordenadas, absorbancias a 400 nm). Deducir

gráficamente Km, Vmáx, Kap y Vmáx-ap tanto en la representación

hiperbólica como en la de inversos.

Inserta aquí los valores de Km, Vmáx, Kap y Vmáx-ap obtenidos.

Gráfica Km Vmax (Abs) Kap Vmax-ap (Abs)

Hiperbólica mM u.a. mM u.a.

Gráfica -1/Km 1/Vmax (Abs) -1/Kap 1/Vmax-ap

(Abs)

Inversos (mM)-1 (u.a.)-1 (mM)-1 (u.a.)-1

Km Vmax (Abs) Kap Vmax-ap (Abs)

mM u.a. mM u.a.


- 35 -

2.- Calcular el % de actividad e inhibición producido por el fosfato monopotásico

para cada concentración de sustrato INICIAL utilizada.

% actividad = (Abs con inhibidor/ Abs sin inhibidor) x 100.

% inhibición = 1- % actividad.

Número de

reacción [S] inicial % actividad % inhibición

9 mM % %

10 mM % %

11 mM % %

12 mM % %

13 mM % %

14 mM % %

15 mM % %

16 mM % %

3.- Determinar el tipo de inhibición reversible (competitiva o no competitiva)

ejercida por el fosfato monopotásico sobre la fosfatasa ácida, considerando:

1) los porcentajes de inhibición obtenidos; 2) las variaciones entre Kap y Km y

entre Vmáx ap y Vmáx observados en la representación de inversos. Razona tu

respuesta.

4.- En el caso de resultar que el fosfato monopotásico ejerce sobre la fosfatasa

ácida una inhibición reversible competitiva, calcular el valor de Ki de la

fosfatasa ácida. Utilizar los valores de Km y Kap obtenidos mediante la

representación de inversos.

Km Kap [I] inicial Ki

mM mM mM mM


- 36 -

BORRADOR PARA LA GRÁFICA HIPERBÓLICA DE ACTIVIDAD E INHIBICIÓN

DE LA FOSFATASA.


- 37 -

BORRADOR PARA LAS GRÁFICAS DE TIPO LINEWEAVER-BURK DE

ACTIVIDAD E INHIBICIÓN DE LA FOSFATASA.


- 38 -

BORRADOR PARA LA REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL PORCENTAJE DE

ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA EN PRESENCIA DEL INHIBIDOR RESPECTO A

LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE SUSTRATO.


- 39 -

PRÁCTICA Nº 3

PURIFICACION VIRTUAL DE PROTEINAS CON ACTIVIDAD ENZIMATICA

En esta sesión se utilizará un programa de ordenador, ProtNLab, que simula

el proceso de purificación de un enzima. Este programa ha sido creado por el Dr.

A. G. Booth de la Facultad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad

de Leeds (Reino Unido). Las versiones del programa para distintas plataformas

(Windows, Mac y Unix) se encuentra disponible en la página web

http://home.btconnect.com/agbooth/archive/. La versión para entorno Windows

está depositada como material de prácticas en el Campus Virtual de la

asignatura y en las páginas web docentes de los profesores del Área de

Bioquímica y Biología Molecular del Departamento de Ciencias de la Salud III

Dres. Antonio Coloma (http://docentes.cs.urjc.es/~acoloma) y Oscar de Luis

(http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis).

3.1 PRESENTACIÓN DEL PROGRAMA INFORMÁTICO .

El programa permite simular la purificación de 20 enzimas diferentes. Cada

enzima se identifica con un número del 1 al 20. Elegir el número deseado. A

continuación nos indican una serie de características generales del enzima:

estabilidad térmica, estabilidad frente al pH, etc. Esta información no suele ser útil

para diseñar las primeras etapas del proceso de purificación. Es posible elegir

entre las siguientes técnicas de separación.

3.1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROGRAMA

1.- Tratamiento con calor. En general es un paso de utilidad limitada debido a

que la gran mayoría de las proteínas son sólo estables en un rango de

temperatura determinado, generalmente cercano al fisiológico.

2.- Precipitación con sulfato amónico. Define el porcentaje de saturación inicial y

final. Prueba tres condiciones para intentar conseguir el máximo de la actividad

enzimática en una de las fracciones (sobrenadante o sedimento) y el máximo

posible de proteína total en la fracción opuesta. Para definir nuevos porcentajes

de saturación inicial y final usa la tecla Escape. Si no consigues una buena

separación, utiliza otra técnica.


- 40 -

3.- Cromatografía de intercambio de iones. El programa da a escoger entre los

siguientes tipos de intercambiadores de iones:

MATRIZ CARGA NETA CONTRAION DEAE-Celulosa POSITIVA Anión

CM-Celulosa NEGATIVA Catión

Q-Sepharosa POSITIVA Anión

S-Sepharosa NEGATIVA Catión

La elución de las proteínas en la cromatografía de intercambio de iones se

realiza mediante un gradiente lineal de concentración creciente de sal (ver

figura 1). En las fracciones obtenidas se determina la presencia de proteínas

midiendo la absorbancia de las fracciones a 280 nm y la actividad enzimática. A

continuación, reúne todas las fracciones en las que se detecta actividad

enzimática (pool fractions) y continúa con la siguiente etapa del proceso de

purificación.

4.- Cromatografía de filtración en gel. El programa ofrece la posibilidad de utilizar

distintas matrices para cromatografía de exclusión, en función del tamaño

molecular de la proteína que pretendemos purificar:

MATRIZ RANGO DE FRACCIONAMIENTO ( kDa )

Sephadex G50 1.5 - 30

Sephadex G100 4 - 150

Sephacryl S-200 5 - 250

Ultrogel ACA 54 5 - 70



Biogel P 60 3 - 60

Biogel P 150 15 - 150

Biogel P 300 60 - 400


- 41 -

5.- Cromatoenfoque e Isolectroenfoque preparativo: Estas técnicas permiten

separar las proteínas por diferencias en su punto isoeléctrico (pI).

El programa permite estimar el enriquecimiento y el rendimiento obtenido en

cada etapa de la purificación (purification record). Se incluyen los siguientes

datos en forma de Tabla:

1.- Enzyme (units). Se refiere a la actividad enzimática total.

2.- Proteina total (mg). Incluye el enzima que estás purificando y todos los

demás enzimas contaminantes.

3.- Rendimiento (yield): (enzyme units FINAL / enzyme units INICIAL ) X 100. El

rendimiento estima la pérdida de actividad enzimática a lo largo de la

purificación. Debe ser lo más próximo posible al 100%.

4.- Enriquecimiento (enrichment factor): actividad específica FINAL / actividad

específica INICIAL. Actividad específica = enzyme units / proteína total. El

enriquecimiento estima el grado de purificación obtenido. Cuanto mayor

sea su valor numérico, mayor será el grado de pureza.

El grado de pureza también se puede determinar mediante técnicas de

electroforesis. El programa permite realizar electroforesis monodimensional en

condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE, ver fundamento en la

práctica 3) y bidimensional ( 2D SDS-PAGE ).

La electroforesis bidimensional consta de dos electroforesis consecutivas:

1.- Isoelectroenfoque. Destruye la estructura cuaternaria de las proteínas

(incluyendo los puentes disulfuro), con lo que separa los distintos polipéptidos,

monómeros o subunidades de un enzima multimérico. Separa los polipéptidos

por sus puntos isoeléctricos en un gel de poliacrilamida en el cual se establece

un gradiente de pH utilizando una mezcla de tampones. Los polipéptidos se

mueven en función de su carga neta hasta la zona del gradiente donde el pH es


- 42 -

igual a su punto isoeléctrico (pI), en la cual su carga neta será cero y por lo tanto

su movilidad será nula. El isoelectroenfoque es la primera dimensión (figura 2).

2.- Electroforesis SDS-PAGE. El gel de isoelectroenfoque se sitúa perpendicular a la

dirección de migración de la segunda electroforesis en un gel de poliacrilamida

en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) (figura 2). Las proteínas

migran en esta segunda dimensión en función de su peso molecular y se

detectan como manchas discretas en una posición que se corresponde en la

dimensión horizontal con su peso molecular y en la vertical con su punto

isoeléctrico ( pI ). La electroforesis bidimensional tiene una alta resolución,

permitiendo separar incluso 2000 proteínas diferentes en un solo gel.

3.1.2 MÉTODO.

Nuestro objetivo es purificar a homogeneidad (sin ningún otro enzima

contaminante) el enzima contenido en el material de partida. Para ello, a partir

de una muestra determinada se irán realizando secuencialmente las pruebas

indicadas en la descripción del programa, variando las condiciones de cada

ensayo para optimizar la purificación de la proteína problema.


Purificación virtual de dos muestras.

El profesor ó la profesora de prácticas asignarán a cada grupo de trabajo

el número de dos muestras que deben procesar. Se anotarán todos los pasos

dados durante la purificación en su orden correspondiente y las condiciones de

cada uno de éstos, así como su rendimiento. El resultado final de cada

purificación virtual debe ser una sola mancha en un gel bidimensional

(homogeneidad), alcanzar un rendimiento lo más próximo al 100 % (mínima

pérdida de actividad enzimática) y un enriquecimiento lo más alto posible (alto

grado de pureza). Cada purificación debe ser realizada con el mínimo número

de pasos posible.


- 43 -

Problema

Se dispone de una mezcla de tres proteínas A, B y C que deseamos

purificar. La proteína A es una enzima, por lo que utilizaremos la medida de su

actividad enzimática para seguir su separación. En primer lugar, realizamos

precipitación con sulfato amónico hasta saturación final del 45% y conservamos

la fracción soluble. Teniendo en cuenta los resultados de valorar la mezcla inicial

y la fracción soluble presentados en la tabla, calcular la actividad total y el

enriquecimiento de esta fracción.

Como segundo paso del proceso de purificación, realizamos cromatografía

de intercambio de iones en DEAE-Celulosa a pH 8,5 y elución en un gradiente de

Cl Na. Los resultados de valorar la actividad enzimática y la cantidad de proteína

en cada una de las fracciones obtenidas se muestran en el siguiente gráfico,

mientras que las mismas medidas realizadas en una mezcla de las fracciones 4 a

9 se presentan en la tabla. Calcular el rendimiento y el enriquecimiento para este

paso.

PROTEINA

MG

ACTIV ENZ

UI

RENDIMIENTO

%

ENRIQUECIMIENTO

N

INICIAL 511 6.000 100 1

Sulfato amónico 121 94

DEAE-CELULOSA 19 5.600

205 1510 3025 4035 45 50Número de fracción

0.5

0

_________________Cantidad de proteína

. . . . . . . . . . . . . . . . . . Actividad enzimática de A

--------------------Concentración molar de Cl Na


- 44 -

Para purificar las proteínas B y C, se juntan las fracciones 35 a 43 y el

“pool” resultante se analiza por electroforesis bidimensional. La separación en la

dimensión horizontal es por isoelectroenfoque. La separación en la dimensión

vertical es por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones

desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE). El resultado es:

pH5 6 7

kDa

94

68

45B

C

Si se sabe que la proteína B es un homotrímero cuyas tres cadenas

polipeptídicas idénticas están unidas por puentes disulfuro y la C es un

monómero, ¿qué técnica usarías para separar la proteína B de la C? ¿Por qué?


- 45 -

PRACTICA Nº 4.

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS.

Muchas de las técnicas que se utilizan en Bioquímica para la separación de

los componentes de una mezcla de moléculas biológicas, se basan en las

diferencias que existen en las propiedades físicas y/o químicas de sus

componentes. Los componentes con propiedades físico-químicas muy diferentes

son fácilmente separables, sin embargo,si presentan propiedades muy similares,

los métodos de separación tendrán que ser más complejos.

En todas las cromatografías existen una fase móvil y una fase estacionaria.

La velocidad a la que cada componente atraviesa la fase estacionaria depende

de la suma de la fuerza de transmisión que produce el movimiento de la fase

móvil y de la fuerza de interacción del componente con la fase estacionaria que

tiende a frenar este desplazamiento.

La interacción de los componentes con la fase estacionaria puede consistir

en un reparto entre la fase estacionaria y la fase móvil o en una adsorción a la

fase estacionaria. Un tipo particular de cromatografía de reparto lo constituye la

cromatografía de filtración en gel (o también denominada de exclusión). Otras

cromatografías se basan en la adsorción, como la cromatografia de intercambio

de iones y la cromatografía de afinidad.


- 46 -

4.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

En esta práctica se utilizará la cromatografía en papel para separar por

polaridad verde luz, hemoglobina y azul dextrano. Sobre un soporte físico (papel)

embebido en agua (fase estacionaria) depositaremos en la base una muestra de

la mezcla de pigmentos. A continuación pondremos la base del papel en

contacto con un disolvente orgánico (fase móvil), permitiendo que ascienda a lo

largo del papel por capilaridad. La fase móvil ascenderá por el papel sin

mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irán separando en

función de su polaridad. Los pigmentos más polares (hidrofílicos) se retendrán

más en la fase estacionaria, mientras que los más apolares (hidrofóbicos)

avanzarán más rápido junto con la fase móvil. La movilidad de cada compuesto

respecto al frente del disolvente tiene un valor característico, en unas

condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficiente o

factor de reparto (Rf). Aquél pigmento que resulte más hidrofóbico conseguirá

avanzar más lejos sobre el soporte sólido, consiguiendo un valor de Rf más alto.

Los tres componentes que queremos separar absorben en la región visible del

espectro y ello nos permitirá visualizar su separación a lo largo del papel.

Figura 1: Resultado de una cromatografía en papel.


- 47 -


1.- Tira de papel Whatman.

2.- Placa de Petri.

3.- Fase móvil: disolvente apolar mezcla de éter de petróleo/acetona/benceno

en proporción 85/10/5.

4.- Fase estacionaria: agua destilada.

5.- Mezcla de pigmentos.

6.- Tubo Falcon de 50 ml.

7.- Regla (con escala en milímetros) y lapicero.

4.1.2 MÉTODO.

1.- Recortar una tira de papel Whatman de 15 cm de largo por 2,5 cm de ancho.

Dibujar sobre el papel Whatman 2 líneas con lápiz. Una a 2 cm de uno de los

extremos y otra a 6 cm del otro extremo.

2.- Embeber el papel Whatman en fase estacionaria (agua) dentro de la placa

petri, procurando eliminar el exceso.

3.- En un tubo Falcon de 50 ml, añadir 3 ml de fase móvil (mezcla de disolvente).

Depositar el Falcon cerrado en una gradilla.

4.- Situar la tira de papel embebida en agua sobre la tapa seca de la placa de

petri. Sobre la línea situada a 2 cm del papel de celulosa, depositar un par de

muestras de la mezcla de pigmentos. Cada muestra será de 5 μl y deben estar

suficientemente separadas entre sí.

5.- Abrir el Falcon, tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos e

Introducirla en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente

moje el extremo inferior de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra. A


- 48 -

continuación, doblar el extremo superior por fuera del Falcon (por encima de la

marca de 6 cm) y cerrarlo con la tapa.

6.- Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente

la marca superior del papel. Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de

cada mancha de pigmento que aparezca.

Figura 2: Medición de la distancia migrada por cada pigmento

Rf = DA / DS

DA= distancia alcanzada por el

pigmento.

DS= distancia alcanzada por el

disolvente


- 49 -

4.2 DEMOSTRACIÓN: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIÓN.

La cromatografía de filtración en gel separa moléculas por tamaño, que

es función de su peso molecular. La fase estacionaria la forma un gel, que se

introduce en una columna. El gel está constituido por esferas con poros de un

determinado diámetro (ver figura 1). La fase estacionaria es en realidad la parte

de la fase móvil que está en el interior de los poros. Las moléculas grandes no

entran en los poros de las esferas del gel y por ello son arrastradas (“eluyen”) muy

rápidamente por la parte de la fase móvil exterior a las esferas, el volumen de

exclusión de la columna. Las moléculas pequeñas entran en los poros de las

esferas del gel y por ello eluyen más lentamente. De esta forma, las moléculas se

separan en función de su tamaño, eluyendo fuera de la columna en orden

decreciente de peso molecular.

Figura 1. Principio de la cromatografía de exclusión

A)

B)


- 50 -

Considerando este modelo, se definen los siguientes parámetros :

VE= volumen de elución de una molécula. Es el volumen de fase móvil que es necesario hacer fluir por la fase estacionaria para que la molécula salga eluida de la columna. Vo = volumen de fase móvil fuera de las esferas del gel o volumen de exclusión Vi = volumen de fase móvil en el interior de los poros del gel. Se determina como

diferencia entre el volumen máximo de elución y el volumen mínimo de elución ó volumen de exclusión.

VG = volumen de las esferas del gel, menos el volumen de los poros VS = Vi + Vg = volumen de sephadex hodratado. Vt = Vo + Vi + Vg = volumen total de la columna.

El coeficiente de distribución, KD, de una molécula entre la fase estacionaria y la

fase móvil representa la fracción de la fase estacionaria (Vi) que es accesible

para la molécula y se define como: Kd = ( Ve – Vo ) / Vi.

El volumen de exclusión Vo es el volumen de elución de una molécula de muy

alto peso molecular que se excluye de los poros del gel (por ejemplo azul

dextrano de peso molecular mayor de 106 Da).. Para esta molécula Ve=Vo, lo

que implica que su Kd = 0 y el volumen de elución es el mínimo posible. Para

moléculas de peso molecular muy pequeño Ve = Vo + Vi, lo que implica Kd = 1,

siendo entonces el volumen de elución el máximo posible. Por lo tanto, el

coeficiente de distribución Kd está comprendido entre cero y uno.

Para proteínas globulares existe una relación lineal entre el logaritmo de sus

pesos moleculares y su volúmenes de elución de la forma.

log Pm = a – b Ve

en la que a mayores valores de Pm (y log Pm) corresponderán a menores valores

de Ve y viceversa. Los términos a y b son constantes y sus valores dependen del

gel y de las dimensiones de la columna. Si separamos varias moléculas patrones

de pesos moleculares conocidos, la determinación de sus volumenes de elución

permite establecer una recta patrón del logaritmo del peso molecular frente al

volumen de elución Ve.


- 51 -

Si queremos determinar el peso molecular de una molécula, bastará con

separarla utilizando la misma columna en las mismas condiciones que con los

patrones, determinar su volumen de elución e interpolar en la recta patrón.

En esta demostración se utilizará la cromatografía de filtración en gel

Sephadex G-100, para separar por peso molecular verde luz, hemoglobina y azul

dextrano. Los tres componentes que queremos separar absorben en la región

visible del espectro y ello nos permitirá visualizar su separación a lo largo de la

columna y en las diferentes fracciones recogidas.


- 52 -


Cromatografía en papel.

1.- En la cromatografía en papel, identifica qué mancha se corresponde con

cada pigmento en el ensayo realizado. Completa el cuadro y calcula la Rf

media para cada pigmento. Ordena los pigmentos entre sí de mayor a menor

hidrofobicidad.

Pigmento Muestra

aplicada Valor DA Valor Rf

Valor medio

Rf

Verde Luz Muestra 1 mm mm mm

Muestra 2 mm mm

Azul dextrano Muestra 1 mm mm mm

Muestra 2 mm mm

Hemoglobina Muestra 1 mm mm mm

Muestra 2 mm mm

Valor Ds:______________mm

1er Pigmento más hidrofófico:

2do Pigmento más hidrofófico:

3er Pigmento más hidrofófico:

2.- Razona en función de la práctica realizada qué factores pueden afectar al Rf.

Justifica la incidencia de cada factor propuesto.


- 53 -

ANOTACIONES


- 54 -

ANOTACIONES


- 55 -

ANOTACIONES

Guion

Documents

Transcript of Guion