Guía de estudio para el tercer examen de cromatografía

1) Derivatizantes1.1. Definición: La derivatización es el proceso donde se transforma un analito químicamente, con la finalidad de obtener

compuestos derivados que poseean prop. Fq. distintas al original, para facilitar el proceso de análisis. En ella se mejora la volatilidad, estabilidad térmica y la detección del analito. En ellas, no se conoce las estructuras de los derivados obtenidos.

1.2. Características: Sus condiciones de elaboración son sencillas, el número de etapas es menor, generan alto rendimiento del compuesto derivatizado.

1.3. Tipos de derivatización1.3.1. Sililación: Reacción que reemplaza a un H+ de un analito por un grupo alquilsililo.

1.3.2. Acilación: Conversión de compuestos con hidrógenos activos como –OH, -SH, y –NH en esteres, tioesteres y aminas, respectivamente.

1.3.3. Alquilación: Reemplazo de un hidrógeno activo en R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH2 con un grupo alquilo o arilo.

1.4. Derivatización para GC/HPLC quiral: Cuando no es posible separar una mezcla de material quiral en un entorno quiral, se puede derivatizar con otro reactivo quiral que sea óptimamente puro para formar un par de diasteroisómeros, estos presentan diferente espectro. Para designar la utilización de esta derivatización, es necesario determinar la pureza enantiomética, la cual se puede obtener por dos vías:

1.4.1. Método directo: Se emplea una fase estacionaria quiral.

1.4.2. Derivatización quiral: Al utilizar un reactivo enantiométicamente puro, se obtiene una pareja de diastereoisómeros, los cuales pueden ser separados en columnas convencionales.

El analito a determinar requiere que sus funcionalidades sean las adecuadas para reaccionar rápido con los reactivos que se utilizarán. El quiral derivatizador debe contar con alta pureza enantiomérica, reaccionar rápidamente, llevar un cromóforo para su detección en UV o fluorescencia. Los alcoholes y grupos funcionales –OH se convierten en ésteres diasteroisómeros al reaccionar con reactivos enantiómeros como el ácido carboxílico, HCl y ácido anhidro.

En el caso de los grupos amono, pueden convertirse en amidas y urea al usar HCl o isocinato, respectivamente.

1.5. Derivatizantes utilizados

R OH R

R

R

S

O

OH

O

O

O

OH

O

OH

R

R

R

S

O

O

O

O

O

O

O

O

R

R

R

SULFONATO

ÉSTER

CARBONATO

R NH2

R

R

R

S

O

O

OH

O

O

OH

O

Cl

R

R

R

S

O

O

NHR

O

O

NHR

O

NHR

AMIDA

URETANO

SULFONAMIDA

CO2H

RH

H2N

R N C O

R N C S

NH

NH

O

R

R

CO2HH

NH

NH

S

R

R

CO2HH

UREA

TIOUREA

Tipo de derivatizante Estructura Características Reacción (S) Aplicaciones y tipo de Crom.

Tricloruro de Boro y Metanol

BCl3-CH3OH Su rxn varía según el analito a diveratizar, afectando a condiciones como el tiempo principalmente.

En caso de que no haya una derivatización completa, se recomienda utilizar exceso de metanol, en relación al ácido o al éster.

Esterificación:Un RCOOH se calienta con H2SO4 en un disolvente CH3OH. Esto provoca la formación de agua y un compuesto éster (RCOOCH3).TransesterificaciónEl BCl3 catalizar la reacción de un RCOOR´ en un disolvente CH3OH, obteniedo un producto alquilado (RCOOCH3) y un ROH.

Es útil para la preparación de ésteres metálicos y ésteres.Estos derivatizadores se utilizan para derivatizar ácidos carboxílicos y trasesterificar ésteres, principalmente en lípidos bacterianos y semillas.Se utiliza principalmente en la Cromatografía de Gases.

BSA (N,O-Bis (Trimetilsilil) Acetamida.

Sus derivados son muy volátiles, lo que beneficia al proceso cromatográfico, al no causar interferencias. Sus reacciones son muy rápidas y sus productos son muy estables. El grupo Si contribuye en la formación de cristales grandes para favorecer su manejo. Pueden usar otros solventes para mejorar su eficiencia, p. ej.

Sililación: En esta reacción, un hidrógeno activo de un compuesto se sustituye por un grupo alquilsililo.El grupo sufre un ataque nucleofílico debido al contacto con la muestra, esto provoca que el analito tenga una baja basicidad y se una al BSA por medio del grupo Si.Diveratiza fácilmente en el sig. Orden; alcohol>fenol>ác. Carb.> amina>amida. Entre más impedido esté un compuesto, será mal difícil derivatizarlo.

Reacciona principalmente con grupos –OH (no est.imp.), aminas, amidas, ác. Carb. Y enoles.Es utilizada para muestras de compuestos no térmicamente sensibles, macromoléculas, proteínas pequeña (p. ej. fármacos, drogas).Son utilizados en la Cromatografía de Gases y la de HPLC.

DMF. (Dimetilfumarato).

Ácido sulfúrico y Metanol

H2SO4 y CH3OH Son compuestos utilzados para convertir ácidos grasos en esteres. En este caso, el ácido sulfúrico actúa como catalizador y el metanol como diluyente.

Esterificación:Un ROOH sufre una protonación del catalizador hasta formar agua. El medio R1-OH reacciona con la molécula, dejando un ROO+RH, el cual sufre una segunda protonación, hasta generar un éster (ROOR1).Trasesterificación:Un éster (ROOR1) sufre una protonación, causando que se genere una carta positiva en el O. El medio R2OH causa la formación de un producto inestable, el cual sufre una catálisis, formando un nuevo éster (ROOR2).

Esta derivatización se utiliza para esterificar ác. Carboxílicos y transestericar ésteres. En el medio, es utilizado para esterificar ácidos grasos y libres, asu vez, para transesterificar ácidos grasos en estado éster.Se aplica en la Cromatografía de

Anhidridos de ácidos perfluorados

1. Anhídrido de ácido trifluorurooacético (TFAA)

2. Anhídrido de ácido pentafluoropropiónico (PFPA)

3. Anhídrido de ácido heptafluorurobutírico (HFBA)

1. Es el más reactivo de los anhídridos. No se forman productos ácidos en su reacción. Se utilizan como catalizadores trietilamina y trimetilamina en su rxns. No se utiliza ECD (electron capture detector).2. Se usa en ECD o FID (Flame ionization detector).Se producen ácidos en las

Los tres compuestos realizan acilación, donde, un grupo acilo se introduce en una molécula que tiene un H reemplazable (OH, NH o SH). A excepción del TFAA, los reactivos forman subproductos ácidos que deben ser removidos antes del análisis para evitar anomalías. Suele usarlle en presencia en piridina, tetrahidrofurano. La humedad dificulta la reacción.

Reaccionan principalmente con grupos OH, NH y SH. Para el TFAA, se utilizan aminoácidos y esteroides como analitos, PFPA para alcoholes, aminas y fenoles (derivados en temp. Bajas) y el HFBA para analitos como alcoholes, aminas y fenoles.Son utilizados para preparar una captura de e- derivados cpor detección por

derivatizaciones, requiere de un eliminador de ácidos.3. Producen derivados sensibles al ECD y requiere eliminador de ácidos.

captura de GC. Se producen derivados volátiles, con la finalidad de utilizarlos en análisis como captura de electrones o para la detección de ionización de llama. Son aplicados en la detección de drogas.

Trifloruro de boro en metanol

El BF3 es un ácido de Lewis, el cual se utiliza como un bloque de construcción versátil. Mientras que el metanol interviene como disolvente. Al unirse ambos compuestos, forman un complejo catalizador. Puesto que el protón cuenta con un orbital 1s, lo hace bastante reactivo para donar electrones.Tiene una vida útil limitada a T.A. y debe refrigerarse. El complejo genera metóxidos a partir de su reacción con

Esterificación: Por si solo, el MeOH es usado para esterificar ácidos orgánicos (en presencia de HCl), en el cual se protona el ácido para que el ion H+ forme un intermediario, el cual pierde un protón y forme un éster. Por otro lado, los tiempos de la reacción son prolongadamente largos. En el caso del complejo, al usar como BF3, acorta la esterificación de ác. Grasos en dos minutos, en proporción del 12 al 14%.Trasnesterificación: Ocurre en las mismas condiciones donde se utiliza el ácido sulfúrico. En el caso del complejo, se puede usar como transesterificador en los lípidos que presenten enlaces éster, pero los tiempos de reacción son más largos.

En la esterificación con MeOH y en forma de complejo con BF3, se esterifican ácidos grasos libres o se transesterifican ácidos grasos con éster, variando entre ellas los tiempos de reacción y proporción de producto.Las condiciones preferidas para esterificación o trans-esterificación son por consiguiente un exceso del alcohol con el que se quiere esterificar y ausencia de agua.Es utilizado para HPLC y GC.

ác. Grasos insaturados por la adición de metanol.

Bromuro de pentafluorobencilo (PFBBr)

Es un compuesto conformado por radicales Fluor y con un Bromo. Este compuesto convierte los ác. Carboxílicos, mercaptanos, fenoles y sulfamidas a derivados halogenados, los cuales, son fácilmente detectado por la captura de e- La captura de electrones sirve como antesala al análisis de GC de ác. Grasos de cadena corta.

El PFBBr se utiliza en la alquilación extractiva (extracción y derivatización), en conjunto con sulfato de tetrabutilamonio de hidrógeno como el contraanión. El analito se separa como un ion a través del uso de un catión de amonio cuaternario. El anión se mueve desde la fase acuosa a la fase orgánica cuando hay un pH específico. Una vez en la fase orgánica, el anión entra con el PFBBr, el cual lo deriva fácilmente.

Se puede utilizar para la identificación y detección de cantidades traza de ácidos carboxílicos, mercaptanos, y fenoles en potable aguaAdemás, permite analizar la extracción / derivatización de fármacos a partir de matrices biológicas. Es utilizado para GC.

1,4,7,10,13,16-hexaoxaciclooctadecano (18 crown 6)

Es un anillo de éter de 18 miembros, con 6 átomos de oxígeno. Es un catalizador de transferencia de fase, forma de complejos con muchos cationes, especialmente potasio, en disolventes orgánicos no polares.

Cuando reacciona con la sal de potasio de un ácido el ion de potasio, está complejado en el centro de la anillo, principalmente a través de las fuerzas electrostáticas.Esto hace a la porción aniónica de la molécula de analito muy reactiva a un haluro de alquilo, que conduce a alquilación en condiciones suaves.

PFBBr y 18 crown 6 se utilizan en combinación para preparar derivados pentafluorobencilo-fenol para Protección Ambiental de EE.UU.

Ácido trifluoroacético (TFA)

Presenta dos desventajas que afectan los resultados:

• La necesidad de emplear reactivos completamente secos debido a que los reactivos de sililación y los derivados TMS son inestables hidrolíticamente

• La deposición de sílice es diferente partes del detector cromatógrafico, causando un incremento en los niveles de ruido y una disminución en la sensibilidad

Es un reactivo muy versátil, el cual es usado como catalizador silio, el cual derivatiza carbohidratos, iones reactivos de par, etc. Participa como un catalizador ácido, donde se debilita el grupo saliente X del Si, favoreciendo la derivatización del analito. directa GC. Los analitos más atacados se encuentran los ácidos, alcoholes, tionles, amidas, aminas, cetonas y aldehídos.

Este compuesto realiza la reacción de sililación, donde sustituye al hidrógeno activo de la molécula por un el grupo alquilsililado (R-OH + Cl-Si(CH3)3 —> R-O-Si(CH3)3 + HCl), en los cuales se pueden usar piridina como disolvente, y ocurre muy rápidamente. Estos compuestos tienen una gran afinidad por elementos muy electronegativos.En termino generales la sililación reduce la polaridad de las moléculas para facilitar, su análisis mediante la espectroscopia de masas y la cromatografía de gases.

El TFA se usa en la fase reversa de par iónico en una columna no iónica. Se emplea para diferenciar la polaridadde los analitos, principalmente entre proteínas o péptidos en una muestra mezclada, con la finalidad de mejorar la separación cromatográica. Al usarse como adivitivo en la FM del HPLC, proporciona prop. Detectables y le confiere afinidad a la base sólida. No es sugerible para determinación

Hidróxilo de trimetilanilinio (Trietilanilinio)

El hidróxido de trimetilanilinio al 0.2M es un reactivo esterificante. Es usado para moléculas que tienen protones remplazables adjuntos a nitrógeno.

Realizar reacciones de esterificación y transesterificación.

Particularmente es utilizado para metilación de barbitúricos, sedantes, bases xantinas alcaloides fenólicos, anticonvulsivos y ácidos grasos.También puede ser utilizado para alquilación Flash.

Trifloruro de Boro

Reacción limpia (sin reacciones secundarias) con subproductos volátiles.Resultantes de n-butilo son estables, volátiles, y solubles en agua.

Se utiliza para preparar monocarboxílicos de cadena corta (C1-C10 y ácidos dicarboxílicos para GC.Cómoda, rápida, esterificación cuantitativa de ácidos grasos o transesterificación de esteres.

2. Espectroscopia de masas: Es una técnica microanalítica usada en la identificación de compuestos, cuantificarlos y elucidar la estructura y propiedades químicas de la misma. Esta técnica requieres cantidades pequeñas de muestra, con la finalidad de obtener la información de características como el peso y la estructura del mismo. Los procesos realizados por el aparato destruyen la muestra y no puede recuperarse, debido a que la ioniza.

En ella se proporciona información acerca de la composición de la muestra (orgánicas, inorgánicas y biológicas), verifica la composición cualitativa y cuantitativa de muestras complejas, etc. Este aparato obtiene iones a partir de moléculas orgánicas en fase gaseosa, separándolos de acuerdo con su masa y carga, para luego ser detectadas por el dispositivo adecuado. La

El equipo encargado debe realizar 4 funciones; 1. Ser capaz de vaporizar sustancias de volatilidades distinas, 2) Al volatilizar la muestra, debe ser capaz de originar iones a partir de la muestra en fase gaseosa, 3) Tras generar los iones, debe separarlos en función masa/carga y 4) Tras separarlos, el espectro debe ser capaz de detectar los iones formados y registrarlos adecuadamente.

Cuando se trabaja con los sistemas de GC-MS, la identificación se basa en utilizar el espectro obtenido como “Huella química”, comparando los resultados obtenidos con espectros de compuesto patrón. Como se ha indicado anteriormente cuando se introduce una molécula en la cámara de ionización y se bombardea con una corriente de electrones esta sufre la ionización, es decir pierde un electrón dando lugar a la formación de un ión-radical. Este estos equipos se pueden detectar tres tipos de iones.

a) Ion molecular: Son los iones moleculares que presentaran la misma masa que la molécula neutra y se registrará en el espectro como “M+”. La primera forma ionizada será la que tenga el pico más alto en el registro, la cual se origina a partir de un compuesto. Para separar un ion molecular de una molécula, se requieren alrededor de 70 Ev por cada electron.

b) Ion isotópico: Son los compuestos encontrados en estado natural, que tienen la capacidad de formar mezclas con otros isotopos.

c) Fragmentos moleculares: Son fragmentos moleculares de la muestra ionizada.

El registro de una molécula puede detectarse por medio de la fórmula R= m/z, donde R es el registro obtenido por el espectro, m es el peso molecular del ión y z es el número de cargas obtenidas en el espectro.

Además, este espectro se rige por dos reglas para detectar analitos:

A) Regla del nitrógeno: Moléculas sin o con núm. par de N, tienen peso molecular par. Si tiene o cuenta con número impar de atomos de N, la estructura tiene un PM impar.

B) Reglas de fragmentación: Se basan en la estabilidad de iones y fragmentos neutros. En ella, se establecen distintos tipos de rupturas; La ruptura olefinica corresponde a una fragmentación secundaria a partir de un carbocatión. La Ruptura alílica ocurre cuando los enlaces dobles favorecen la escisión homolítica de los enlaces en posición alfa, para tomar iones arílicos,

conduciendo a la formación de un bencílico. La ruptura becílica ocurre con la presencia de un anillo aromático, el cual induce la ruptura de los enlaces simples en posición alfa, conduciendo a la formación de un ión bencílico.

En el registro, el pico base (el más alto) es el más abundante en el espectro, mientras que el ion molécular (M+) es aquel que la mayor cantidad de masa en un espectro.

El espectro tiene una gran cantidad de aplicaciones, principalmente para la determinación de PM de péptidos, proteínas y oligonucleicos. Además, ayuda en la identificación de compuestos de cromatogramas en capa fina y papel. Interviene en la identificación de drogas de abuso y sus metabolitos.

3. Reglas de Woowar-Fieser: Son reglas empíricas que permiten predecir la absorción máxima en el espectro UV de; 1) Dienos conjugoados con sustituyentes alquilo sobre enlaces insaturados y 2) Grupos carbonilos conjugados como acetonas. En ella influyen entre los factores que influyen destacan la naturaleza del disolvente, pH de la solución, la temperatura y la presencia de sustancias interferentes.

4. Detectores: Los componentes que salen de de la columna, es necesario contar en la salida de la muestra con un sistema de detección, capaz de señalar la

elución de un componente de la muestra y ofrecer, una señal proporcional a la cantidad de sustancia por él. Por otro lado, los detectores usados en la GC son de tipo diferencial, los cuales responden ante alguna propiedad que pueda variar cuándo éste se encuentra mezclado con alguna sustancia eluida de la columna.

A) FID: Conocido como el Detector de ionización de llama es un detector utilizado en GC, es uno de los detectores más usados. Básicamente es un quemador de hidrógeno/oxígeno, donde se mezcla el eluyente de la columna (gas portador y analito) con hidrógeno. Inmediatamente, este gas mezclado se enciende mediante una chispa eléctrica, produciéndose una llama de alta temperatura.

B) Fluorescencia:

C) UV-Visible:

D) Conductividad:

Características, en especial UV-Vis y Fluorescencia.

Inyectores: Dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del gas portador. Existe una cierta variedad de diseños según el tipo de muestra que se trata de analizar. El más común es el inyector de líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases (mediante jeringas especiales). El inyector se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada independientemente de ésta, que suele tener una membrana de caucho a través de la cual se introduce la muestra con ayuda de una jeringa hipodérmica.

inyectores de GC, permite inyectar volúmenes superiores a lo que entra a la columna:

A) ECD

B) NPD

C) Split/Splitless

D) On column

y esto, en este documento encontraran los tipos de inyectores