Guía de bacteriología

CRITERIOS de CLASIFICACIÓN

• La identificación de bacterias puede basarse en muchos caracteres:

• Morfología celular • Presencia o ausencia de estructuras especiales:

flagelos, endosporas. • Reacción frente a colorantes (Tinción) • Fisiología: Condiciones necesaria para su

desarrollo / crecimiento (T°; Atm: O2, CO2, etc.) • Bioquímica: metabolismo (fermentación de

carbohidratos; fuente de carbono, etc.) • Morfología de las colonias

Morfología

Reacción de Gram

Metabolismo

Requerimiento de O2

Aerobias /anaerobias facultativas

GRAM (+)

Cocos

Catalasa (+)

Staphylococcus spp

Catalasa (-)

Enterococcus spp

Bacilos

GRAM (-)

Cocos Bacilos

Fermentadores de Glucosa

Enterobacteriaceae

No fermentadores de

Glucosa

Anaerobias

Esporuladas/No esporuladas

Cocos Gram (+) más frecuentes en infecciones humanas

GENERO ESPECIE

Catalasa (+) S. aureus

Staphylococcus S. epidermidis

S. saprophyticus

Otras especies

Micrococcus spp y otros gérmenes relacionados

Rothia (Stomatococcus) mucilaginosa

Cocos Gram (+) más frecuentes en infecciones humanas

GENERO ESPECIE

Catalasa (-) S. pyogenes

S. agalactiae

Estreptococos Grupo C-G

Streptococcus S. pneumoniae

E. Grupo viridans

Grupo S. bovis

S. Salivarius y S. uberis

Enterococcus E. faecalis

E. faecium

E. raffinosus

-74-

Catalasa (+)

• Micrococcus

• Kocuria*

• Nesterenkonia*

• Kytococcus*

• Dermatococcus*

• Arthrobacter*(>BGP)

• Alloiococcus (Cat.débil)

• Rothia mucilaginosa (Cat.∆)

Catalasa (-)

• Lactococcus

• Vagococcus

• Dolosicoccus

• Abiotrophia**

• Grabulicatella**

• Globicatella

• Leuconstoc

• Gemella

• Pediococcus

• etc

*Relacionados con Micrococcus

Cocos Gram (+): Otros géneros

** EVN

CPCatalasa +: Algoritmo

Bacitracina 0.04 UI

Resistente

Staphylococcus

Macrococcus*

Sensible

ClNa 6,5%

Rothia mucilaginosa

(Se adhiere al agar)

Micrococcus spp y géneros relacionados

*Aún no se aislaron en humanos // R: ausencia de halo de inhibición

Género Staphylococcus

Producción de Coaguasa

Sensibilidad a Novobiocina

Uso del medio Chapman

Diferenciación presuntiva del Gro. Staphylococcus

Staphylococcus spp

COAGULASA

(+)

S. aureus

(-)

NOVOBIOCINA (5µg)

R

S. saprophyticus

S (>16mm)

ECN

Diferenciación presuntiva del Gro. Staphylococcus

+ Frecuentes S. aureus

S. epidermidis

S. Saprophyticus

S. haemolyticus

S. hominis

S. lugdunensis

S. warneri

S. capitis

- Frecuentes S. simulans

S. auricularis

S. xylosus

S. schleiferi

S. cohnii

S. saccharolyticus

otros

Otras Pruebas Bioquímicas

Fosfatasa OH-

Ornitina Decarboxilasa

Hidrólisis de Urea

Producción de Acetoína

PYR

Acido de:

*D-Trehalosa

*D-Manitol

*D-Manosa

CPCatalasa -: …Algoritmo

• Frecuencia de los Géneros

Géneros más frecuentes Streptococcus

Enterococcus

Géneros menos frecuentes Lactococcus

Aerococcus

Gemella

Pediococcus

Leuconostoc

EVNutricionales

CPCatalasa -: Algoritmo

Hemólisis (A sangre carnero)

ß

Tabla A

No-ß (α – γ)

Morfología en m. líquidos

Cadenas Vancomicina (30 µg)

R (Tabla B)

S (Tabla C)

Grupos Vancomicina (30 µg)

R Pediococcus

S Otros géneros

Si es α

Optoquina «S»

S. pneumoniae

*Aún no se aislaron en humanos // R: ausencia de halo de inhibición

Tabla A: Estreptococos ß-H

Especie/Grupo

Reacción Bioquímica

BE ClNa Ba Hip PYR Grupo CAMP VP

S. pyogenes - - + - + A - -

S. agalactiae - V -* + - B + -

S. Grupo C - - -* - - C - -

S. Grupo G - - -* - - G - -

Enterococcus faecalis + + - V + D - -

Grupo S. anginosus V - -* - - ** - +

* Puede haber excepciones ; ** A,C,G,F, o no agrupable

-80-

Tabla C: no-ßH-Vanco-S

Especie/Grupo REACCIÓN BIOQUÍMICA

OPT SB BE ClNa Hip PYR HEM Grupo serológico

S. pneumoniae + + - - - -/+ α ------------

Grupo «S. bovis»1 - - + - - - γ/α D

S. agalactiae - - - V + - γ/α B

Grupo «S. viridans»2 - - -* - - - γ/α diversos

Enterococcus spp - - + + V + γ/α D

1-2 : Diferenciación: Tabla D

EGV: Grupos: S. anginosus S. mitis S. sanguinis S. mutans S. salivarius

Tabla D Diferenciación entre los Grupos S. bovis y G. viridans

PYR (-); BE (+); ClNa (-); ADH (-); VP (+)

Manitol

(+) /Sorbitol

(+) / S. mutans (-) /S. bovis I (Almidón +)

(-) / Polisacárido extracelular

(+) / S. slivarius

(Ureasa V)

(-) /S bovis II

Tabla B

CGP/ en cadenas / Catalasa (-) / Vanco-R

PYR

(+)

Enterococcus spp

(-)

Cadenas

Leuconostoc spp

Bacilos

Probable Lactobacillus spp

Género Enterococcus

BE (+); ClNa (+); PYR (+); LAP (+)

Especie REACCIÓN BIOQUÍMICA

Hemólisis Pir Arg Man Sorbi Sor Ara Raf

E. faecalis γ(ß/α) + + + + - - -

E. faecium γ/α - + + - - + -

E. raffinosus γ/α + - + + + + +

Identificación de Estreptococos del Grupo Viridans

Enterobacterias

Diferenciación entre Escherichia coli y Citrobacter feundii

Bacteria Levine TSI Citrato LDC Indol

E. Coli Colonias con brillo metálico

Ácido/gas - V +

C. freundii Ác./fondo negro/gas + - -

Diferenciación entre Escherichia coli lactosa (+) lenta y Morganella morganii

Bacteria Levine TSI IMViC LDC U F. Alc. ONPG

E. coli Sin cambio Alcalino ácido/gas

++-- V - - +

M. morganii ++-- - + + -

Enterobacterias

Diferenciación entre las distintas especies de los géneros Klebsiella, Enterobacter y Serratia

Bacteria TSI IMViC LDC ODC Motil. DNasa Polimixina

K. pneumoniae Ac/gas

--++ + - - - S

E. cloacae --++ - + + - S

E. aerógenes --++ + + + - S

S. marcescens Ac/Ac. con o sin gas

--++ + + + + R

Enterobacterias

Diferenciación bioquímica entre P. mirabilis, P. vulgris y P. penneri

Bacteria Invasión en Agar

Levine TSI IMViC LDC ODC

P. mirabilis +/-

S/C

OH fondo negro - + - V Desaminada

+

P. vulgris H fondo negro + + - V -

P. penneri Ac/con o sin gas

- + - - -

P. mirabilis, P. vulgris y P. penneri: Ureasa + / Fenil Alanina + / Polimixina R

Bacteria Invasion en Agar

Levine TSI IMViC LDC U F. A. ODC

M. morganii No S/C OH/H gas

++-- - + + +

Providencia spp

No S/C OH/H Sin gas

++-+ Desaminada V + -

Diferenciación entre Morganella morganii y Providencia spp.

Enterobacterias

F.A.= Fenil Alanina

Bacteria Levine TSI IMViC U

Ad

on

itol

Man

itol

Ino

sitol

Arab

itol

Treh

alosa

P. rettgeri S/C OH/H Sin gas

++-+

+ + + + + -

P. stuartii U+ S/C OH/H Sin gas

++-+ + - - + - +

P. suartii U- S/C OH/H Sin gas

++-+

- - - + - +

P. alcalifaciens S/C OH/H Sin gas

++-+

- + - - - -

Diferenciación entre las especies del género Providencia (LDC: desaminada; FA: +)

Enterobacterias

Las especies del género No invaden al agar

Bacteria Levine TSI LDC IMViC U

Salmonella entérica serovar Typhi *

S/C OH/H Anillo negro Sin gas

+ -+--

-

Salmonella entérica *(no Typhi)

S/C OH/fondo negro/ gas

+ -+-+ -

Shigella spp**

S/C OH/H Sin gas

- V+--

-

Diferenciación entre Salmonella entérica serovar Typhi , Salmonella entérica (no Typhi) y Shigella spp

Enterobacterias

Las especies del género No invaden al agar

*Se confirma empleando antisueros correspondientes. S. Typhi presenta el Ag Vi, **Requiere confirmación serológica

Bacteria Levine TSI IMViC LDC ODC U Acetato

E. Coli (inactivo)

Sin cambio

Alcalino ácido/sin gas

++-- V V - V

Shigella spp

V+-- - -* - -

Diferenciación entre Escherichia coli lactosa (+) lenta y Shigella spp

Enterobacterias

*S. sonnei es ODC +

Bacteria TSI LDC U IMViC

Proteus spp* OH/H Fondo negro con gas

Desaminada + V+-V

Salmonella entérica (no Typhi)

OH/fondo negro con gas

+ /SH2+

- -+-+

Citrobacter freundii OH/fondo negro con gas

- /SH2+

V

-+-+

Edwardsiella tarda* OH/fondo negro con o sin gas

+ /SH2+

- ++--

Diferenciación bioquímica de los géneros de Enterobacteriaceae fuerte productoras de SH2

Enterobacterias

* E. tarda y Proteus spp son R a Polomixinas / Colistín

Enterobacterias Diferenciación bioquímica entre las familias Vibrionaceae, Aeromonadaceae y Enterobacteriaceae

FAMILIA Pruebas Bioquímicas

Fermentación de la Glucosa (TSI)

Oxidasa

Vibrionaceae, Aeromonadaceae + +

Enterobacteriaceae

+ -

BGN-Fermentadores Oxidasa (+) GÉNEROS Especies más frecuentes

A. hydrophila

Aeromonas (Aeromonadaceae ) A. sobria

A. caviae

V. cholerae Serogrupo O1

No O1

V. parahemolyticus

Vibrio (Vibrionaceae) V. fluvialis

V. vulnificus

V. algynoliticus

Plesiomonas (Enterobacteriaceae) P. shigelloides

Diferenciación bioquímica entre los géneros de la familia Vibrionaceae, Aeromonadaceae y del género Plesimonas .

Género Hemólisis ClNa 6,5% ODC S a O129 DNAsa

Aeromonas ß - -* - +

Vibrio ß, α, γ

V V + / - +

Plesiomonas γ

- + + -

* Excepto Aeromonas veronii biotipo veronii

BGN-NO Fermentadores de Glucosa

Géneros más frecuentes

Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas Burkholderia, Achromobacter, Crhyseobacterium

TSI

Sin Cambio (Pico OH-/fondo neutro)

Oxidasa

-

Acinetobacter Stenotrophomonas

Burkholderia

+

Pseudomonas, Crhyseobacterium

Burkholderia, Achromobacter

Pseudomonas del grupo fluorescentes

Especie P. fenacínico1 P. fluorescente ADH Glu (Ox.) Gelatinasa 42°C

P. aeruginosa +* + + + + / - +

P. putida - + + + - -

P. fluorescens - + + + + -

1: Piocianina (verde); Piorrubina (rojo); Piomelanina (marrón) *Algunas cepas no producen pigmentos fenacínicos = P. aeruginosa apiociánicas

Microorganismo

42°C Gela-tina

ADH LCD U Glu Lac Manit Xil

Complejo BC V V + V V + V + V P. aeruginosa + V + - V + - V + P. flurescens - + + - V + V V + P. putida - - + - V + V V + P. stutzeri V - - - V + - + + R. picketti V V - - + + V - + Brevundimonas spp V V - - - V - - V

Bacilos GNNF Oxidasa (+) / MacConkey (+)

Lac=Lactosa, Manit=Manitol, Xil=Xilosa

Diferenciación BQM de BGNNF Ox. (-) más frecuentes

Especie

Mo

rfolo

gía

Oxid

asa

Mo

tilidad

LDC

Esculin

a

DNAsa

Man

itol

ONPG

S. maltophilia bacilo -/+ + + + + - V

Acinetobacter spp coco - - - - - ND ND

Complejo B. cepacia bacilo +/- + + +/- - + +

ND: no determinado ONPG: ortofenil ß galactopiranósido +/-: mayoría de las cepas con reacción (+) -/+: mayoría de las cepas con reacción (-)

Microorganismo Movilidad LCD U Glu Maltosa Hidrólisis

de la Esculina

Complejo BC + V V + + V S. maltophilia + + - + + V

Acinetobacter spp sacarolítico

- - V + - V

Acinetobacter spp asacarolítico

- - V - V -

Burkholderia gladioli + - V + - - P. oryzihabitans + - V + + - P. luteola + - V + + +

Bacilos GNNF Oxidasa (-) / MacConkey (+)

Género Stenotrophomonas

Especie de importancia clínica: S. maltophilia

Características culturales y bioquímicas

Hemólisis: ß en zonas de desarrollo confluente Olor amoniacal Oxidasa (-) / algunas cepas pueden ser (+) Hidrólisis de la Esculina (+) Hidrólisis de DNA (+) LDC (+) Oxidación (+) de Maltosa y Manitol

Género Neisseria y relacionados Microorganismo

Mo

rfolo

gía (G

ram)

Oxid

asa

Catalasa

Sup

ero

xol

TM AN

Pigm

en

to

TSI D

Nasa GMLSF

(CTA)

N. gonorrhoeae Dc- + + +↑↑ + - - SD ND + - - - -

N. meningitidis Dc- + + +↓/- + V - SC/SD ND + + - - -

Neisseria spp Dc-* + + - -** + V H/OH - VVVVV1

Moraxella catarrhalis

Dc- + + - - + - SC + - - - - -

Acinetobacter spp

Dc-/b- - + - ND + - SC - VVVVV

Kingella spp B- + - - V + - H/SD - + V - - -

*Sólo N. enlongata tiene forma bacilar **Algunas especies pueden desarrollar 1N. lactamica utiliza L-S-F

Diferenciación de las especies del género Haemophilus

Especie Requerimiento de factores Hemólisis

X (protoprfirina) V (NAD o NADP)

Haemophilus influenzae1 + + -

Haemophilus parainfluenzae2 - + -

Haemophilus haemolyticus + + +

Haemophilus parahaemolyticus - + +

Haemophilus aegyptius + + -

Haemophilus ducreyi + - + débil

Aggregatibacter aphrophilus - V -

Aggregatibacter segnis - + -

1-2 Especies más frecuentes en patología humana -187-

BGP aerobios más frecuentes en muestras clínicas

Especie* Catalasa Hemólisis Pig. rosado Kinyoun Motilidad

Corynebacterium spp y especies relacionadas

+/- γ, ß - - V1

Listeria + ß - - +

Erysipelothrix - α - - -

Lactobacillus - α, γ - - -

Nocardia2 + γ - + -

Rodhococcus + γ + + -

Mycobacterium spp 3,4 + γ

- + -

*No producen esporas/ Bacillus spp: formas esporas internas 1:Las especies móviles, en general tienen pig. Amarillo-2: BGP ramificados 3,4: M. complejo fortuitum-chelonae (cto. Rápido), BGP no ramificado

BGPositivos: diferenciación: Listeria, Enterococcus y S. agalactiae

Especie Catalasa Hemólisis ClNa 6,5%

BE Movilidad CAMP PYR

Listeria monocytogenes

+ ß + + + + -

Enterococcus faecalis -

ß

+ + - - +

S. agalactiae - ß

V - - + -

Procesa-miento de la Muestra

Algoritmo de Trabajo

Muestra

Observación

Macroscópica: Consistencia, moco,

pus, sangre

Microscópica Fresco

/coloraciones

Siembra

M. sólidos: EMB - SS

AS –MKS* -(TCBS*)

M. enriquecidos Caldo selenito

Agua P. alcalina

EMB: búsqueda de EPEC-Salmomella spp y Shigella spp

EMB

Colonias Fermentadoras de LACTOSA: Brillo metálico

4 colonias al azar

TSI – CITRATO► 1

Colonias No fermentadoras de LACTOSA: Transparentes

4 colonias al azar

TSI – CITRATO-LIA-UREA-SIM ► 2

ESQUEMA ► 1

Bacteria Levine TSI Citrato LDC Indol

E. Coli Colonias con brillo metálico

H+/gas - V +

C. freundii H+/fondo negro/gas + - -

E. coli: Realizar serología de ECEP en pacientes menores de 2 años, gerontes e inmunosuprimidos.

ESQUEMA ► 2

Bacteria Levine TSI Citrato LDC SIM Urea

E. coli

CT

OH-/ H+/gas - V - + + -

Shigella spp OH-/ H+/gas (-) - - - - - -

Salmonella spp OH-/ H+/SH2/gas

+ + / SH2 + - + -

Edwarsiella tarda OH-/ H+/SH2/gas

- + + + V -

Proteus spp OH-/ SH2/gas +/- DesNH2 + V + +

Tablas de Identificación

Agar SS: Salmonella spp – Shigella spp

Agar SS (24-48h)

Colonias Centro negro/SH2 (+)

LIA

+ /SH2 (+) ► 4

Colonias Transparentes /SH2 (-)

TSI – CITRATO-LIA-UREA-SIM

Búsqueda de Salmonella spp. S. Parathyphi A y

Shigella spp ► 3

ESQUEMA ►3

Bacteria SS TSI LDC IMViC U

Salmonella entérica serovar Typhi *

CT OH/H Anillo negro

Sin gas +

- + - -

-

Salmonella entérica *(no Typhi)

CT OH/fondo negro/ gas

+ - + - + -

Salmonella paratyphi A CT OH/H/ gas

-/anillo negro

- + - + -

Shigella spp**

CT OH/H Sin gas -

V + - -

-

*Se confirma empleando antisueros correspondientes. S. Typhi presenta el Ag Vi, **Requiere confirmación serológica

Bacteria TSI LDC U IMViC

Proteus spp* OH/H Fondo negro con gas

Desaminada + V+-V

Salmonella entérica (no Typhi)

OH/fondo negro con gas

+ /SH2+

- -+-+

Citrobacter freundii OH/fondo negro con gas

- /SH2+

V

-+-+

Edwardsiella tarda* OH/fondo negro con o sin gas

+ /SH2+

- ++--

Diferenciación bioquímica de los géneros de Enterobacteriaceae fuerte productoras de SH2

ESQUEMA ►4

*E. tarda y Proteus spp son R a Polomixinas / Colistín

3- F-AISLAMIENTO DE E. coli PRODUCTOR DE VEROCITOTOXINA Asociado a Diarrea Hemorrágica y Síndrome Urémico Hemolítico

Suspensión de M. Fecal

AGAR EMB LEVINE AGAR MACCONKEY-SORBITOL

INCUBAR 24 HS 37ºC

10 colonias Ferment. de Lactosa 10 colonias No Ferm. De Sorbitol

TSI, CITRATO SEROLOGIA O157

SEROLOGIA POSITIVA

E. coli O26, O111

Confirmación Bioquímica

De E. coli y Sorbitol en tubo(-)

Y Beta Glucuronidasa (-)

INFORME PRESUNTIVO DE

E. coli O157

ENVIAR A LABORATORIO DE REFERENCIA PARA CONFIRMAR

PRODUCCIÓN DE VEROCITOTOXINA EN CULTIVO DE TEJIDO

Búsqueda de E. coli enterohemorrágica (ECEH)

Agar Mc Conkey con Sorbitol

10 colonias NO fermentadoras de Sorbitol

Confirmación BQM de E. coli

ß- glucuronidasa (-) // Serología O157 (+)

E. Coli O157 ► Posible productor de shiga toxina

Detección de Toxina (LNR) O157 Toxigénico o no Toxigénico.

-155-

Búsqueda de Vibrio cholerae AGUA PEPTONADA ALCALINA

INCUBAR 6-8 HS A 37 ºC

REPIQUE A AGAR TCBS

INCUBAR 18-24 HS A 37ºC

COLONIAS AMARILLAS (Ferm. de Lactosa)

TSI AS

INCUBAR 18-24 HS INCUBAR 18-24 HS

ALC/AC SIN GAS REAC. DE OXIDASA

AC/AC SIN GAS POSITIVA

SEROLOGIA PARA V. chloreae O1

POSITIVA

PRESUNTO AISLA MIENTO DE Vibrio cholerae O1

ENVIAR A CENTRO DE REFERENCIA PARA SU CONFIRMACION

Oxidasa (-)

No Vc

Búsqueda de Vibrio cholerae: BQM

Características BQM Resultado

Hemólisis ß o γ

TSI H+ / H+ / sin gas

Citrato de Simmons +

LDC +

ODC +

Motilidad +

Indol +

Voges-Proskauer V

ClNa 0% +

S a O129 (150 µg) + (Halo de inhibición)

Diferenciación de Vc

Diferenciación serológica

Especie Aglutinación Con antisuero O1

Clínica

Vibrio cholerae O1 + Causa el «cólera»

Vibrio cholerae NO O1

- No causa epidemias

Diferenciación BQM de Vibrio cholerae O1 en sus biotipos

Prueba BQM V. cholerae O1 Biotipo clásico

V cholerae O1 Biotipo El Tor

Hemólisis γ ß o γ

VP - +

Sensibilidad a Polimixina (50 µg)

S R

Búsqueda de Aeromonas spp Medio de siembra: Agar Sangre(AS) o AS con Ampicilina 30 Ug/ ml.

AS

Colonias Beta hemolíticas (o eventualmente No hemolíticas)

Reacción de oxidasa (3 ó más colonias al azar)

POSITIVA NEGATIVA: No Aeromonas spp

TSI

Fermentador No Fermentador (Alc./Ac. ó Ac./Ac.) (sin cambio)

Presunt. Aeromonas spp Evaluar según Huésped

(Ver Tablas de Identificación)

DIFERENCIACIÓN DE LOS GENEROS DE LA FAMILIA VIBRIONACEAE

VIBRIO AEROMONAS PLESIOMONAS

Hemólisis ,, ,

Dnasa + + -

ODC D -* +

ClNa 6% D - -

Sensibilidad al

O129(150g)

+ - +

* Aeromonas veronii biogrupo veronii es ODC +

DIFERENCIACIÓN DEL GENERO VIBRIO DE AEROMONAS

VIBRIO

HALOFILICOS

VIBRIO NO

HALOFILICOS

AEROMONAS

ODC D + -*

ClNa 6% + D -

ClNa 0% - + +

Sensibilidad al

O129(150g)

+ + -

* Aeromonas veronii biogrupo veronii es ODC +

Esculina Gas de

Glucosa

ODC LDC VP Manitol Sacarosa Indol

Grupo hydrophila* + + - + + + + +

Grupo

caviae*

+ - - - - + + +

A. veronii

bg. sobria

- + - + + + + +

A. veronii bg.

veronii

+ + + + + + + +

A. schubertii

- - - + D - + -

A. handaei

- + - + + + - +

A. trota

- + - + - D D +

* Son Resistentes a Cefalotina

Diferenciación BQM de las especies de Aeromonas spp más frecuentes

Algoritmo de Fauces: A.S.carnero

Colonias ß-Hemolíticas

BCITRACINA - PYR

1:S/ (+) – 2:R / (+) – 3:R / (-)

3-Otros Estreptococos ß H

VP

(+): Flora habitual

(-): Serología C G

1 -2: Streptococcus pyogenes

Esputo: Criterio de aceptación

Células Epiteliales Planas

PMN Criterio

< 10 > 25 Aceptable

10 - 25 > 25 Aceptable

> 25 > 25 No aceptable

> 25 10 - 25 No aceptable

> 25 < 10 No aceptable

Esputo: Procesamiento

Esputo

Ex. macroscópico

Aspecto: salivoso,

mucopurulento, hemoptoico

Ex. microscópico

Celulas en fresco Gram / ZN

(Kinyoun-Giemsa-Grocott)

Cultivo

AS / Ach Medio para

BGN

Aspirado traqueal: Procesamiento

Aspirado traqueal

Ex. macroscópico

Aspecto: salivoso,

mucopurulento, hemoptoico

Ex. microscópico

Celulas en fresco Gram / ZN

(Kinyoun-Giemsa-Grocott)

Cultivo (*)

AS / Ach Medio para

BGN

(*) Diluciones

Aspirado traqueal: Procesamiento

0,5 ml Secreciones + 0,5 ml Sol. Fisiol. = 1 (1/2)

0,1 ml de 1 + 0,9 ml Sol. Fisiol. = 2 (1/20)



Sembrar 0,1 ml de 3 y 4

Lavado Bronco Alveolar

BAL

< 1% CEE / Macrófagos alveolares

Homogeneizar en Vortex 1 - 2’

Mx. sin centrifugar

Siembra: 0,5 ml + 4,5 SF (1/10)=1 0,5 ml de 1 + 4,5 ml SF (1/100)= 2

Centrifugar 10 ml ►Sedimento

Fresco Coloraciones

Sembrar 0,1 ml de 1 y 2

Cepillo Protegido

Cepillo Protegido

Homogeneizar en Vortex 1 ’ en 1 ml de BHI

Mx. sin centrifugar

Sembrar 0,1 ml

AS + Ach + Medio para BGN+ ANA

Centrifugar ►Sedimento

Coloraciones (↓S)

Utilidad de las Muestras Mx E At BAL Cepillo Bx. Pulmón

Contaminación orofaríngea

+++ ++ + NO NO

Mx representativa

< 10 CEP // >25 PMN < 1% CEP Siempre

FBCopio NO NO SI SI NO

G. comunes SI SI SI SI SI

Hongos SI SI SI NO (esc.) SI

Micobacterias SI SI SI NO (esc.) SI

ANAE NO NO NO SI SI

Rto. Sign 3° - 4° Estría ≥ 106 ufc/ml ≥ 104 ufc/ml

≥ 103 ufc/ml

≥ 104 ufc/gr.

S ↓ ↑ ↑ (86%) +/- (75%) +/-

E ↓

↓

↑ (82%) ↑↑ (100%) ↑↑

Micobacterias patógenas oportunistas y saprófitas Velocidad de Crecimiento

Pigmentación Pat. oportunistas No o rara vez patógenos

Lento > 7 días

Fotocromógenas M. kansasii M. marinum M. simiae M. asiaticum

Escotodromógenas M. scrofulaceum M. szulgai M. xenopi

M. gordonae M. flavescens

No cromógenas M avium M intracellulare M ulcerans M malmoense M haemophilum

M gastri M terrae M triviale

Rápido < 7 días

No cromógenas

M fortuitum M abscessus M chelonae

M smegmatis

Cromógenas

M vaccae M phlei

Estudio del exudado vaginal (FSP)

FV

pH

(FSMedio) SF

Obs. En Fresco

Levaduras Trichomonas

vaginalis

Test con KOH

Medio de Transporte

Siembra en A-Sangre*

Saburaud (Levaduras)

Coloraciones

GRAM/Giemsa

-129-

Estudio de Endocervix

Endocervix

M. de Transporte

Siembra en A-Sangre*

Thayer Martin

Oxidasa (+)/dc(-)

Coloraciones / GRAM

Dc (-)

-129-

TSI / H2O2 30% / AS sin CO2

ND / + ↑↑ / ND

Probable Neisseria gonorrhoeae Azúcares

Investigación de EBH

Hisopado introito vaginal + hisopado perineal

Caldo Todd-Hewitt (Ac. Nal 15 µg/ml + Colistin (10 µg/ml)

Medio de cultivo sólido «Adecuado»

Colonias «sospechosas»

Pruebas confirmatorias

Diferenciación: Listeria, Enterococcus y S. agalactiae

Especie Catalasa Hemólisis BE CAMP PYR

Listeria monocytogenes

+ ß + + -

Enterococcus faecalis -

ß

+ - +

S. agalactiae* - ß

- + -

Partimos del Agar Sangre Ovina

Partimos de Agar Cromogénico

*Eventual confirmación serológica

Vaginosis Bacteriana: Criterios 1-Amsel y col.: 3 ó más de los siguientes criterios

*Presencia de flujo vaginal abundante, fino y homogéneo *pH > 4,5 *Pruebas de aminas (+) *Presencia de células guía («Clue cells»)

2-Nugent:

Morfotipos en la coloración de GRAM

SCORE

0 1 2 3 4

Lactobacillus spp > 30 5 - 30 1 - 4 < 1 0

GV y Bacteroides spp 0 < 1 1 - 4 5 - 30 > 30

BGN «curvos» 0 1 - 4 5 > 30 - -

VB=puntaje total ≥ 7; 4 – 6: corresponde a un estado intermedio de desbalance; Muestra normal: puntaje total de 0 a 3. 97% S-100% E

Vaginosis bacteriana

Infecciones Vs. Dx. Diferecial Criterio Dx Normal VB Vaginitis x TV Vaginitis por

Candida

pH 3.8 – 4.2 > 4.5 > 4.5 < 4.5

Secreción Transparente ↑homogénea y gris

↑amarilla, verdosa

↑blanco, leche cortada

«Fishy odor» - + +/- -

Síntoma No ↑flujo, mal olor, ardor

↑flujo, mal olor, ardor,

picazón, disuria

↑flujo, ardor, picazón

Microscopía (fresco 400X)

Flora lactobacilar,

cel epiteliales

Clue cells leucocitos

(< 10/cpo.)

TV, leucocitos (>10/cpo.)

Levaduras con pseudoh.

GRAM (1000x) B+ rectos Cb (-) y/ fl. ANAE.

- Levaduras con pseudoh.

GIEMSA ↑↑ - - TV -

Investigación de CT en nuestras clínicas

Muestra Clínica

Detección por (Ag) Serología (Ac)

Cultivo celular

PCR Elisa IFD

Hisopado Endocervical SI SI SI SI

H. uretral SI SI SI SI

Semen NO SI* NO SI

1°chorro miccional NO SI SI* NO**

H. conjuntival SI SI SI SI

L. Peritoneal (Mujer) SI SI NO NO

Aspirado de bubones (LGV) SI SI SI SI +/- Suero

H. anal SI NO NO NO

H. / ANF SI NO NO NO + (IgM MIF)

*No es la Mx ideal por su ↓↓ S// ** si en varones CT: Chlamydia trachomatis

Micoplasmas

Especies Cuadro clínico Diagnóstico

M. pneumoniae NMN atípica Cultivo Elisa Sondas de DNA PCR IFD / Ac

M. hominis Ureaplasma urealyticum

Cervicitis-Uretritis-Prostatitis-Esterilidad-Aborto-EIP-Fiebre post parto-PLNfritis

Cultivo PCR

M. genitallium Uretritis-Cervicitis-Salpingitis-EPI PCR

Procesamiento de las Mx.

Especie Ferment. de GLU H. de ADH H. De UREA

M. hominis

- + -

U. urealyticum

- - +

M. hominis

+ - -

T. De Muestra -Abstinencia sexual por 72 h. -Obtención de material ↑↑ celular

o Endocérvix - H. uretral o Orina – Esperma o Sangre - Tejidos – Esputo o Otros fluidos corporales

Características de LCR en MNG Etiología Citología Química Aspecto

Células mm3

L (%) PNM (%) Glu (mg%)

∏ (mg%)

Cl (mEq/l)

V.N. 1 - 5 90 - 100 0 - 3 50 - 70 15 - 40 120-130 Cr de Roca

MNG vi A A* N** N o A A N

SIFILIS A A N N A N

TBC y Cn A A N o A D A D

Absceso cerebral

A N A N A N

MNG B. A N A D A D TURBIO

MNG Leucémicas

A A. blastos

N D A N TURBIO

Hem. SAc A A A N o A A N o A Hemorr.

LCR: Etiología según la edad Huésped Agente Neonatos (0 – 2 meses) ENTB (Escherichia coli)

Streptococcus agalactiae Listeria monocytognes

Lactante 2 m – 6 a Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

Adultos y > 6 a Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis

Adultos / Ancianos Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis ENT / Listeria monocytognes (↓↓)

Asociados a shunt Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus BGN

LCR: Etiología en Inmunosuprimidos

Alteración en la Inmunidad Celular

Cryptococcus neoformans Mycobacterium tuberculosis Listeria monocytogenes

Pacientes VIH (+)

Cryptococcus neoformans Mycobacterium avium-intracelllare Mycobacterium tuberculosis Listeria monocytogenes Candida spp Virus Parásitos

Líquido de derrame pleural

Características

Trasudado

Exudado Empiema

Derrame PN no complicado

Derrame PN complicado

Aspecto Claro/límpido Variable (V.) Variable (V.) Purulento

Leucocitos/mm3 < 1000 V. (>1000) V. (>1000) > 15000

Rto. diferencial Variable PMN PMN PMN

∏ (g/dl) < 3,0 > 3,0 > 3,0 > 3,0

Glu (mg/dl) ≈ suero > 60 40 - 60 < 40

pH ≈ suero > 7,2 7,0 – 7,2 < 7,2

LDH < 200 < 1000 > 1000 > 1000

Bacterias No No No Presentes

Tipos de medios Medio Características

Basal Permiten crecer casi todas las bacterias.

Selectivos Favorecen el crecimiento de algún tipo de bacteria e inhiben el de otras.

Enriquecido Líquidos o sólido: se obtiene a partir de un medio basal suplementado con nutrientes.

Diferenciales Sirven para evaluar las propiedades bioquímicas de las bacterias y así identificar una población bacteriana.

De transporte Permiten conservar las bacterias evitando la pérdida de viabilidad.

Medio (S) Componentes Utilidad/Aplicación Agar sangre Agar tripticasa –soja, agar brucella o

infusión de carne y corazón con 5% de sangre ovina

Nutritivo, detección de la capacidad hemolítica

Agar chocolate

Base de peptona enriquecida con una solución de hemoglobina al 2%

Desarrollo de Haemophilus y Neisserias.

Agar eosina azul de Metileno (EMB)

Base de peptona con lactosa y sacarosa. La eosina y el az. De metileno actúan como indicador

Crecimiento y diferenciación de BGN entéricos ferm. y no ferm. de lactosa

Agar manitol salado

Base de peptona, manitol y rojo de fenol como indicador. La CC. De sal de 7,5% inhibe a la > de las bacterias

Aislamiento y diferenciación selectiva de estafilococos.

Agar Salmomella-Shigella

Base de peptona con lactosa, citato férrico y citrato de Na. Contiene rojo neutro como indicador. Sales biliares y verde brillante para inhibir coliformes

Selectivo para el rescate de Salmonella spp y Shigella spp

Medio (S) Componentes Utilidad/Aplicación Agar de Skirrow

Agar base de peptona y proteína de soja, con lisado de sangre de caballo Vancomicina para inhibir G(+), Polimixina B y TMS para inhibir G(-)

Selectivo para el crecimiento de Campylobacter spp.

Agar Thayer-Martin

Base agar sangre enriquecido con hemoglobina y enriquecedor; Colistín, nistatina, vancomicina y TMS.

Selectivo para Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis

Agar de Bordett-Gengou

Medio con base de papa y glicerol más 15-20% de sangre ovina desfibrinada y 2,5 µg/ml del meticilina.

Aislamiento de Bordetella pertussis

Agar MacConkey con sorbitol

Base peptona con lactosa, cristal violeta y sales biliares (inh. G+), rojo neutro como indicador. Puede reemplazarse lactosa por sorbitol.

Aislamiento y diferenciación de BGN fermentadores y no ferm. de lactosa. E. coli O157

Medio (L) Componentes Utilidad/Aplicación Caldo Selenito

Caldo base de peptona con sales biliares y citrato férrico.

Medio selectivo para Salmonella y Shigella.

Caldo Tioglicolato

Digerido pancreático de caseína, caldo de soja y glucosa.

Favorece el crecimiemto de aerobios, anaerobios y microorganismos con requerimientos especiales.

Caldo Todd-Hewitt

Es un caldo de enriquecimiento de estreptococos, se suplementa con Ac. Nalidíxico y colistín

Selectivo y de enriquecimiento para estreptoccos.

Caldo tripticasa-soja

La tripteína y la peptona de soya aportan péptidos, aa, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya contiene alta CC’ de HdC. El ClNa mantiene el balance osmótico. El fosfato diK otorga capacidad buffer y la glucosa es la fuente de energía

Permite en general el desarrollo de gérmenes Gram (+) y (-).

Catalasa Determina la capacidad de producir la enzima catalasa.

Staphylococcus spp catalasa (+) Streptococcus spp y Enterococcus spp(-) Se adiciona H2O2 sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.

2H2O2 Catalasa

2H2O+ O2

Burbujas de O2

OXIDASA Identifica bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiración). Enterobacteriacae (-) Pseudomonadaceae, Neisseria spp(+)

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un dador (phenylenediamine) hacia el aceptor final de la respiración (O2) Si la enzima esta presente se observara una coloración purpura.

Discos comerciales – Papel de filtro - Tubo

Coagulasa Determina la capacidad de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Permite diferenciar S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus. La prueba en tubo se puede leer tras incubación de 2h, si es (-) debe incubarse hasta 24h.

Hidrólisis del DNA

Detecta la enzima termoestable «DNAsa», capaz de romper los enlaces Fosfodiéster de la molécula del DNA. Luego se revela con ClH.

Si el DNA se degradó el complejo ADN-ClH no se forma, dando un halo claro alrededor del desarrollo bacteriano.

Pos

Neg

Pos Neg

Ensayo de ureasa Para diferenciar organismos capaces de hidrolizar urea con la ureasa (Tribu Proteae). El medio contiene U y el indicador de pH rojo fenol (rosa oscuro a pH > 8.4)por el amonio liberado.

Neg Pos. Neg Pos.

Prueba de PYR

Detecta la actividad de la enz. l-pirrolidonilarilamidasa (PYRasa), que hidroliza el sustrato pirrolidonil-ß-naftil amida, (en los discos) y liberan un grupo pirrólico que reacciona con el reactivo cinamaldehído dando un compuesto de color rosado-rojizo. Se la utiliza para la identificación de cocos Gram (+) catalasa negativa.

Pos. nEG. Positivo

Prueba de LAP Determina la presencia de la enzima leucino aminopeptidasa (LAP). Los discos contienen el sustrato: leucina-ß-naftilamida, que hidroliza la enzima, con liberación de ß-naftilamina, que reacciona con el reactivo revelador: N-N dimetilamino cinamaldehído, dando un compuesto rojo-rosado.

Positivo PYR (+) LAP (+)

Fenilalanina deaminasa Detecta la acción de la enzima fenilalanina deaminasa. Diferencia Morganella, Providencia, y Proteus (+) de otras Enterobacteriaceae. El medio contiene el aa fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y libera ácido fenil-pirúvico, que puede ser detectado por la adición de un Cl3Fe 10% (oxidante) con un cambio de color al verde.

Negativo Positivo

Sensibilidad a Bacitracina Se usa en la confirmación presuntiva de Streptococcus pyogenes, ya que, a diferencia de la mayoría de los estreptococos, suelen ser sensibles a bajas concentraciones de bacitracina (0.04 U). La pueba NO tiene punto de corte.

Sensibilidad a Novobiocina

Esta prueba puede utilizarse para la identificación diferencial de Staphylococcus saprophyticus (Resistente) del resto de los Estafilococos. Sensible > 16 mm

Se usan discos con 5 µg de ATM

Sensibilidad a Optoquina

Esta prueba puede utilizarse para la identificación diferencial de Streptococcus pneumoniae dentro de los Estreptococos alfa hemolíticos. Sensible > 14 mm

Discos con 5 μg de clorhidrato de etil-hidrocupreína

Factor CAMP

Permite detectar una proteína extracelular difusible, «Factor CAMP» Que actúa en forma sinérgica con la betalisina de Staphylococcus aureus, potenciando la lisis de los eritrocitos.

CAMP (+) en S. agalactiae

Hidrólisis de la Bilis Esculina (BE) Medio de cultivo contiene extracto de carne, peptona de carne (nutrientes), bilis de buey (selectivo para coco+), esculina (glucósido) e iones hierro (indicador).

La bacterias degradan la esculina a esculetina, que se combina con el Fe, dando un compuesto férrico de color pardo oscuro.

Neg Pos.

Tree Sugar Iron Agar (TSI)

Diferencia bacterias por su capacidad para fermentar glucosa, lactosa y/o sucrosa, y para producir SH2.

Fermentación (medio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas) SH2 + iones férricos Sulfuro ferroso (↓↓ negro insoluble)

Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)

Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)

El medio contiene peptona, Glu, Sac, Lac, tiosulfato y una sal férrica. El indicador es rojo fenol (amarillo a pH< 6,8 / rojo pH > 6,8) Se siembra en profundidad con aguja y luego se estría el pico de flauta.

Fermentación Medio acidificado

Fermentación (-) Medio OH- x uso de las peptonas

Fermenta Glu: pico OH- /Fondo H+

Fermenta Glu + SH2

Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación

Rojo/Amarillo K/A Solo fermenta la Glucosa, y luego utiliza las peptonas

Amarillo/Amarillo A/A Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa

Rojo/Rojo K/K No hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas

Rojo/sin cambio K/NC No hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas aeróbicamente

Amarillo/Amarillo con disrupción del agar

A/A,G Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con producción de gas

Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación

Rojo/Amarillo con disrupción del agar

K/A,G Solo fermenta la Glucosa, con producción de gas

Rojo/Amarillo con disrupción del agar y PP negro

K/A,G, H2S Solo fermenta la glucosa con producción de gas y H2S

Rojo/Amarillo y PP negro K/A, H2S Solo fermenta la glucosa y produce H2S

Amarillo/Amarillo y PP negro

A/A, H2S Fermentación de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con producción de H2S

Sin cambio/ Sin cambio NC/NC No hay crecimiento

Prueba de I.M.V.iC 1-Indol 2-Rojo de Metilo 3-Voges Proskauer 4-Citrato

Producción de Indol (1) Identificar bacterias por su capacidad de producir indol usando la enzima triptofanasa, la cual convierte el aa triptofano en Indol, ácido pirúvico y amonio.

Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio

triptofanasa

Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo) HCl

Alcohol isoamilico

Reactivo de Kovacs

Para detectar el metabolito Indol se utiliza el reactivo de

Kovac, que contiene ácido clorhídrico,

dimetilaminobenzaldehido y alcohol amílico. Una coloración

roja indica resultado positivo.

Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio

triptofanasa

Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo) HCl

Alcohol isoamilico

Reactivo de Kovacs

Para detectar el Indol producido, se utiliza el rvo de Kovac, que

contiene ácido clorhídrico, dimetilamino-benzaldehido y

alcohol amílico. Una coloración roja indica resultado positivo.

El triptofano se adiciona al medio en una concentración 1%. Esta presente en peptonas obtenidas por digestión enzimática. Se adicionan 1 a 2 gotas del reactivo de KOVACS.

Positive positive negative control.

Glucosa Piruvato Lactato

Acetil-CoA

Formiato

Etanol

CO2

Acetato

H2

Succinato

+

CO2

Fermentación acido-mixta

Voges-Proskauer (VP - 3)

Algunos microorganismos no producen suficientes ácidos estables que bajen el pH. El producto final de la fermentación de la glucosa es acetoina y 2,3-butanediol. Después de 48 hs de incubación.

Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo y se agita ligeramente. Rojo positivo

Prueba (-) - Prueba (+)

Prueba (-) - Prueba (+)

Glucosa Piruvato Lactato

Acetil-CoA

Formiato

Etanol

CO2

Acetato

H2

Succinato

+

CO2

Glucosa Piruvato

2.3 Butanodiol + CO2

Etanol Lactato Succinato Acetato CO2 + H2

Fermentación acido-mixta

Fermentación butanediolica

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato como

única fuente de carbono.

Citrato (4)

Citrato de Sodio Acido piruvico + Acido oxalacetico + CO2 Citrato premeasa

Citrasa

Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3

(liberado luego de usar el citrato) (Alcalino --> pH)

Agar Citrato (de Simmons): Es un medio definido que contiene Citrato de Sodio como única fuente de C y amonio como fuente de nitrógeno. Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH, azul de bromofenol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.

Citrato (4)

Reducción de nitrato

Muestra la capacidad de Reducir NO3 a nitrito NO2 / o

N2 por acción de la enzima Nitrato Reductasa.

Nitrato (NO3) puede ser Reducido a diferentes compuestos por respiración anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como sustrato. Si el organismo Reduce el nitrato a nitrito este reaccionara con ácido sulfanilico y a-naftilamina (presentes en el reactivo o en el medio para Nitrato) para producir un color rojo. Si no hay color: 1-el nitrato no se Redujo 2-se redujo a otros compuestos. (N2)

NO3 + 2 H + 2e- NO2 + H2O Nitrato reductasa

Si no hay color: 1-el nitrato no se Redujo 2-se redujo a otros compuestos. (N2)

Test (-): El Zn0 reduce el nitrato a nitrito, dando color. Si al agregar Zn se produce el complejo coloreado, la bacteria NO usó el NO3

Si no hay color: 1-el nitrato no se Redujo 2-se redujo a otros compuestos. (N2)

Test (+): El Zn0 reduce el nitrato a nitrito, dando color. Si al agregar Zn no se produce color la bacteria usó el NO3 y también el NO2

Ensayo de decarboxilasas Muestra la capacidad para decarboxilar un aminoácido. En esta reacción se remueve el grupo carboxylo (COOH) del aa produciendo amina y CO2. Como indicador de pH se usa púrpura de bromocresol. Se emplea aceite mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentación. pH alcalino el indicador cambia a purpura (+)

ADH(-) ODC(+) LDC(+) Control

LIA (Lysine Iron Agar)

Pone en evidencia: *la decarboxilación de Lisina (aa), en diamina cadaverina *la desaminación de la Lisina en un alfa cetoácido. Ambas reacciones se evidencian por el cambio de color del púrpura de bromo cresol.

La produción de SH2 se evidencia por la conversión de Tiosulfato sódico a Sulfato férrico

S/inocular


S/inocular

Desaminación Decarboxilación (+) (-)

Descarboxilación SH2 (+)


S/inocular

Proteus spp Escherichia coli Shigella spp

Salmonella Proteus spp

SIM (Sulfídrico – Indol – Motilidad) Tiene peptona como sustrato principal, adicionado de tiosulfato sódico, Fe y amonio.

Pos. nEG.

POS: turbidez difusa en todo el medio NEG: crecimiento en el punto de siembra


Pos. nEG.

POS: Formación de SFe que ennegrece la zona de crecimiento NEG: el medio no cambia de color.


Pos. nEG.

POS: Formación de un anillo rojo luego de agregar el reactivo Kovacs NEG: sin color


1 2

Combinación de los resultados: 1-Móvil, SH2 (+) e indológena 2-Inmóvil, SH2 e indol (-)

Guía de bacteriología

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