Gua Laboratorio de Bioqumica Nutricin y Diettica 2011 Docente Barbara Butendieck A. Introduccin Normas generales de proteccin, prevencin y comportamiento: Por todos los riesgos indicados, es necesario (y obligatorio) llevardelantal para protegerse de los productos qumicos. Como proteccin personal se puede utilizar, cuando sea necesario, guantes y mscara.Todaslasdamasycaballerosquetienenelpelolargo,debenrecogerloenforma completa en un moo con un collet, pinche o traba. En el laboratorio no se debe fumar, comer ni beber, para evitar el peligro de un envenenamiento o contagio por contacto accidental con algn producto txico o agente patgeno. El material de vidrio debe ser manipulado con precaucin para evitar roturas. Serecomiendafijarseenelnombredelasdisolucionesyproductosantesdeutilizarlos.Sise utilizan pipetas de vidrio o plstico, hay que pipetearcon el dedo ndice, nunca con el pulgar. No sedebepipeteardirectamentedelfrascodeaguadestiladaodelasdisolucionesquese comparten con otros grupos: debe pipetearse de la disolucin transvasada previamente a un vaso precipitado. Hayque manejarconprecaucinlassustanciaspeligrosas:cidos,lcalis,disolventesorgnicosy productos txicos. Estos productos no deben pipetearse nunca con la boca, sino con ayuda de una propipeta. Seguridad en el laboratorio Deben tener presente las reglas generales de seguridad. Se debe estar consciente que los reactivos utilizados en el laboratorio son potencialmente txicos, irritantes o inflamables. Sin embargo estas sustancias son peligrosas solo cuando no se manipulan correctamente. La gua y el cuaderno de laboratorio Esmuyimportantehacerundiagramadeflujoantesdeiniciarlasesin.Losprocedimientos, detalles,observacionesyresultadossedebenregistrarenlaguaocuadernodelaboratorio mientras el experimento se est llevando a cabo. Breve pautapara preparar el Informe de Laboratorio. Portada Logo institucional, facultad, escuela; nombre del laboratorio, integrantes del grupo, asignatura, docentes, fecha de entrega. Introduccin Breve resumen de conceptos y/o importancia del tema. La informacin debe tener relevancia para el prctico y no debe ser una copia de un libro, de la gua o de internet. Procurar que no exceda de una plana. Objetivo Aqu se debe incluir cual es el objetivo del prctico, porque, para qu?. Parte experimental Materiales y mtodos Se describen los reactivos, materiales y equipo que se utilizan, as como la metodologa empleada Se debe redactar en tercera persona. Resultados y discusin Sedescribenlosresultadosobtenidos,seindicanlosclculos,tablas,grficasofiguras,ascomo una explicacin con fundamentos cientficos del porqu se obtuvieron esos resultados.Losresultadosexperimentalesseresumenenformadetablaodegrfica.Lastablasygrficas debennombrarseordenadamenteeneltexto(Tabla1,Tabla2,etc.)ydebentenerunttulo.En algunoscasos,adems,puedeserinteresantedardetallesadicionalesenformadeunaleyenda colocadadebajodelttulo.Lasunidadesenqueseexpresanlosresultadosdebenindicarseenla parte superior de cada columna (y nunca en cada lnea de cifras). Estas unidades deben elegirse de maneraquepresentenunnmerolimitadodecifras(porejemplo,unaconcentracinde0.0072 mol/L se escribe ms fcilmente 7.2 mmol/L o 72 x 10-4 mol/L). En general, los valores obtenidos se presentanen forma de grfica y no de tabla. Para trazar una grfica se representan los valores de la variable independiente (parmetro conocido) en el eje de abscisas (eje x) y los de la variable dependiente (parmetro desconocido) en el eje de ordenadas (eje y). Cuestionario En caso de existir cuestionario, incluirlo en el informe. Bibliografa Reportarlasfuentesutilizadasconelformatoestndar:Para libros:Autor(s),aodepublicacin, ttulo, editorial y pginas consultadas, en el caso de internet sealar la direccin completa. Para el casoderevistascientficas:Autor(es),ao,nombredelartculo,nombredelarevista,volumen, nmero, pginas. LosInformesseescribirnamanoenuncuadernillodematemticascuadrochicoyse entregarn en la escuela el da lunes siguiente al prctico hasta las 12:00 hrs. Laentregadelinformefueradeplazodevengarautomticamenteenun1enla calificacin. Considereenelinformelaredaccinylaortografa.Sedescontarndecimasdenotapor estos errores. Laboratorio 1: Materiales y Equipos Objetivo: que el estudiante se familiarice con la metodologa, equipo y forma de trabajo dentro del laboratorio de Bioqumica. Material bsico de laboratorio. Agitador magntico: instrumento para agitar soluciones. El agitador tiene un potente imn que gira y hace girar a un pequeo imn en un recipiente. Balanzas de precisin: Sirven para pesar con exactitud los diversos reactivos y sustancias. Bao termorregulado: es un recipiente de agua de volumen relativamente grande (hasta 50 l), cuyatemperaturasepuederegularymantenerconstantecongranprecisin,graciasaun termostato.Seutilizaparallevaracaboreaccionesqueprecisandeuncontrolestrictodela temperatura. Botellas y frascos: se utilizan como recipientes de lquidos. Las hay de color topacio, especiales para proteger de la luz el contenido. Puede ser de vidrio o plstico y su utilizacin depende de las caractersticas fisico-qumicas de la solucin a almacenar. El rango de volmenes es muy amplio. Centrifugas:Aparatosquesirvenparasedimentarpartculasensuspensinsometindolasa elevadas fuerzas centrfugas por giro a rpida velocidad de un soporte. Cubetasdeespectrofotmetro:sonpequeoscontenedorescondoscarastransparentesy paralelas en los que se colocan las soluciones cuya absorcin de luz o color se desea determinar en elespetrofotmetro.Existendeplstico,vidrioocuarzo,segnlalongituddeondaalaquese mida,ascomodediferentesvolmenes,siendolasmsfrecuentesde1mLyde3mL.Estas cubetas se deben manipular siempre sujetando por las caras opacas o rugosas. Embudos:seempleanparafiltrarsoluciones,lavarsolutos,etc.,apresinatmosfrica,por intermedio de un filtro de papel o lana de vidrio. Estufadeincubacin:armariocerradoconcontroldelatemperaturadelairepara incubaciones. Frascoslavadores:seempleanparaenjuagar,aadiragua,lavar,etc.Funcionanporpresin manual.Generalmentecontienenaguadestiladayaquestaeslanicaqueseutilizaenel laboratoriodeBioqumica.Parapreparacionesdepurezamselevada,esimprescindibledestilar varias veces el agua o someterla a otros tratamientos de purificacin. Gradillas:sonestructurasmetlicasodeplsticoquepermitenladisposicinverticaldevarios tubos de ensayo, de modo que se pueden manejar con comodidad durante el experimento. Imanes: son pequeas barras magnticas, revestidas de tefln, que se colocan en el fondo de los recipientes en los que se disuelve un soluto. Estas barras giran impulsadas por un rotor magntico situado debajo del recipiente. Matracesaforados:seutilizanparacalcularvolmenescongranexactitud,puestoqueestn calibrados. El volumen es indicado por una lnea de envase. Cubren un rango usual de volmenes entre 5 mL y 1L. Matraces de Erlenmeyer: se utilizan para la preparacin de soluciones que se hayan de agitar. Nosirvenparadeterminarvolmenes.Puedenserdevidrioydeplstico,convolmenes habituales entre 25 mL y 2L. MatracesdeKitasato:seempleanparacrearvaco,conectadosconunsistemadesuccin. Sirvenpararecogerenelloslquidosdefiltrado,para lavarsustanciasslidasnosolubles(conun filtro intermedio) o para desgasear soluciones. MecherodeBunsen:esunfocodecalor,queutilizagasdeunainstalacincentralizadayse utilizaparacalentarlassoluciones.Engeneral,lostubosyrecipientesdevidrionosedeben exponer directamente al fuego, sino mediante un bao de lquido (agua o aceite) en un recipiente adecuado (bao de Mara). Pinzasparasujetartubos:seutilizanparaintroducirysacartubosdeensayodebaosa elevada temperatura. Pipetasautomticasomicropipetas:sondispositivosmecnicosdealtaprecisinque permiten medir y transferir muy pequeos volmenes de soluciones con elevada exactitud. Son un instrumentofundamentalenellaboratoriodeBioqumica.Porello,sumanejoycuidadosse describen con ms detalle en un apartado especial. Pipetas manuales: se emplean para medir y transferir pequeos volmenes de soluciones con buenaexactitud.Elvolumensedeterminapordiversasgraduacionesdeenrase,yexistendesde 0,1 mL a 10 mL. Pueden ser de vidrio, reutilizables, o de plstico, de un slo uso. La pipeta se llena por aspiracin bucal o mediante un sistema mecnico (propipeta), que se utilizar siempre que el material a aspirar sea txico, patgeno o peligroso. Probetas: se utilizan para la determinacin de volmenes con exactitud relativa. Pueden ser de vidrio y de plstico, con volmenes usuales entre 10 mL y 2 L. Propipeta:esundispositivomecnicodeaspiracinqueseconectaalapartesuperiordela pipeta para evitar la ingestin accidental de sustancias txicas. Puntas de pipetas automticas: son los contenedores desechables del volumen que se mide condichaspipetas.Engeneralsondedosdistintosvolmenes,codificadasporcolores:amarillo (2-20 y 20-200 L) y azul (200-1000 L). Tubosdeensayo:soncontenedoresdevidriooplstico,segnlaaplicacin,enlosquese suelendesarrollarlasreaccionesbioqumicasqueseestudianenellaboratorio.Sucapacidadse especifica indicando en mm el dimetro interno de la abertura y la longitud del tubo (Ejemplo 12 x 75 mm). Tubos Eppendorf: son pequeos viales cnicos, provistos de tapa, que se utilizan normalmente para centrifugar a gran velocidad pequeos volmenes o para almacenar cantidades pequeas de soluciones. Vasosprecipitados:seutilizanparadisolversustancias,comocontenedoresdelquidosy nunca para calcular volmenes. Existen de vidrio y plstico entre volmenes de 5 mL y 3 L. Uso correcto de las pipetas. Pipetas Manuales Existenbsicamentedostiposdepipetasmanuales:aquellasparaconteneropipetasdeaforoy aquellasparaverteropipetasgraduadas.Aquellasparacontenerdebenserenjuagadasconel solventedespusdehaberdispensadolasolucinencuestin.Estaspipetascontienenun volumenexactodelquido,elcualdebesertransferidocompletamenteparaquelamedidasea precisa. Existendostiposdepipetasgraduadas.Aquellaspipetasparaverteryquedebensoplarseestn calibradas hasta la punta por lo que deben llenarse con el lquido a medir, dispensarse, y el lquido remanenteenlapuntadebesoplarse.SontambinconocidascomopipetasOstwald-Folino pipetasserolgicas.Estaspipetaspuedenserdistinguidasfcilmenteyaquesusgraduacionesde escalaseextiendenhastalapuntadelapipeta.Adems,poseenunoodosanillosesmerilados cercadelaboquilla.Elotrotipodepipetagraduadaesaquellaquenosesoplayaqueest calibradaentredosmarcasquenoincluyenlapunta.Porlotanto,estaspipetasnuncadeben soplarsesinoqueelvolumenadispensardebeserreguladomanualmentedeformatalqueel lquidoadispensarseencuentreentreunamarcayotra.Algunosnombrescomunesquereciben este tipo de pipetas son: pipeta volumtrica, tipo Mohr o bacteriolgica. Tcnica de pipeteo. El primer paso de una buena tcnica de pipeteo es seleccionar la pipeta ms apta para el volumen quesedeseamedir.Esprecisamenteestevolumenelquedeterminalapipetaautilizar:el volumen a pipetear debe ser lo ms cercano posible a la capacidad mxima de la pipeta. Adems, debeconsiderarsequeelvolumenmnimoqueunapipetapuededispensarconprecisines aproximadamente el 10 % de su capacidad. Manejo y cuidados de las micropipetas Los dispositivos de pipeteo automtico permiten realizar repetidas determinaciones y vertidos de volmenesiguales.Lamayoradelaspipetasautomticasqueseutilizanenellaboratoriode bioqumica son de tipo manual muy cmodas de manejar, permitiendo eliminar la fatiga, el tedio quepuedesuponereldistribuirmuchosvolmenesenlasbaterasdetubosquenormalmente pueden manejarse en el laboratorio. Lasmicropipetasautomticasqueutilizarnfuncionanpordesplazamientodeaire,medianteun mboloderecorridodeterminado,quealregresaralpuntodeorigen,arrastraporsuccinun volumen conocido de lquido. Este volumen puede ser constante, cuando la longitud del recorrido esfija,ovariable,cuandolalongituddelrecorridodelmbolosepuedemodificar.Laspipetas usadas en las prcticas son de este ltimo tipo (pipetas regulables). Se dispone de tres tipos de pipetas regulables, segn el rango de volmenes que pueden abarcar: 2 a 20 L, 20 a 200 L y 200 a 1000 L. Elvolumendelquidoseregulamedianteunaruedacalibrada,segnelrangodeutilizacin.La solucin es tomada en una punta de polipropileno intercambiable que se ajusta en el extremo de la pipeta. Segnelvolumen,laspuntassondecoloramarillo(2a200L)oazules(msde200L).Estas puntas se pueden expulsar mecnicamente de la pipeta, una vez utilizadas, sin tener que tocarlas con los dedos, evitando as el contacto con sustancias nocivas. Laspipetasautomticassoninstrumentosdegranprecisin,cuyoperfectofuncionamiento, exactitudymantenimientodependendequeseutilicencongrancuidado,teniendoencuenta varios factores Como manipular una pipeta automtica. 1.Ajustarcuidadosamenteelvolumenatomar,sincometererroresdelecturaenlaescala graduada de cada tipo de pipeta. 2. Colocar el mbolo al final de su recorrido antes de introducir la punta de la pipeta en la solucin a tomar, evitando as la formacin de burbujas en la solucin. 3. Tener en cuenta los dos topes del recorrido del mbolo. El primer tope (ofrece ligera resistencia al dedo) indica el volumen exacto a tomar. El segundo tope (recorrido extra) slo se emplea para expulsar la totalidad del lquido. Si se carga la pipeta apretando hasta el ltimo tope, se toma ms volumen del medido, producindose un error por exceso. 4.Devolverconsuavidadelmboloasuorigenalcargarlasolucin.Deestaforma,seevitala entrada de burbujas de aire en la punta de la pipeta, que producirn u error por defecto. Adems, y muy importante, el brusco retorno del mbolo puede arrastrar lquido al interior de la pipeta, lo que puede estropear su delicado mecanismo. 5. No invertir ni inclinar excesivamente la pipeta cuando est cargada con lquido. 6. No golpear ni dejar caer la pipeta. 7. No tocar la punta de la pipeta con los dedos al colocarla, ya que puede contaminar la solucin a medir (el sudor lleva disueltos muchos metabolitos !!). 8. Expulsar las puntas utilizadas en los contenedores dispuestos a tal efecto en todas las mesas. Procedimientos: 1.Dibuje en su cuaderno los materiales y equipos mostrados en el laboratorio, etiquetndolos con su nombre y funcin 2.Usted tiene tres pipetas cuyas capacidades mximas son de 0.1 ml, 1 ml y 2 ml. Cul pipeta usara para pipetear las siguientes cantidades: a) 100 l, b) 200 l y c) 1.1 ml? 3.Mida los siguientes volmenes 50 ml, 3,5 ml250 ml. Cuando tenga los materiales listos para esta actividad, avsele a su docente. Laboratorio 2: Preparacin de Soluciones Soluciones Una solucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. El componente que est en mayor proporcin se llama solvente y el o los componentes que estn en menor proporcin se llaman solutos. En soluciones lquidas, el solvente es lquido en tanto que los solutos pueden ser slidos, lquidos o gases. La mayora de las soluciones usadas en bioqumica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solucin no basta indicar sus componentes, sino que tambin la proporcin en que estos estn presentes en la solucin, es decir, la concentracin de cada uno de los solutos en la solucin. Unidades de concentracin Las ms usadas en la prctica son de dos tipos: -Unidades de concentracin referidas a volumen: Indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solucin. Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc. -Unidades de concentracin referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solucin o de solvente. Ej.: % p/p, molalidad. 1.-Molaridad (M): nmero de moles de soluto por litro de solucin. Para preparar una solucin de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Se usan las relaciones: Peso soluto (g) = nmero de moles de soluto PM (g/mol) N moles de soluto = M Volumen solucin (l) Ej.: Una solucin 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al nmero de Avogadro de molculas, que es 6,023 x 1023. La concentracin de iones en solucin tambin se indica en unidades molares, en este caso el in es la molcula. Ejemplos: Consideremos la solucin 1 M de NaCl. Los enlaces inicos de la red cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal. NaCl ------------- Na++ Cl- Por cada mol de NaCl slido se forma 1 mol de Na+ y un mol de Cl-. Luego: Concentracin de Na+= 1M Concentracin de cloruro= 1 M Para las molculas ms complejas como MgCl2 MgCl2 ------------- Mg+2 + 2 Cl- Una solucin de cloruro de magnesio 1M contiene: Concentracin de Mg+2 = 1 M Concentracin de cloruro= 2 M Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son submltiplos de M: Milimolaridad (mM): nmero de milimoles de soluto por litro de solucin. La milimolaridad y los otros submltiplos se definen en forma anloga: Milimolaridad (mM)1 mmol =10-3 moles, luego1mM= 10-3 M Micromolaridad (M)1mol=10-6 moles, luego1M= 10-6 M Nanomolaridad (nM)1 nmol=10-9 moles, luego1nM= 10-9 M 2. Normalidad (N): Nmero de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solucin. El peso equivalente de una sustancia es igual al peso molecular dividido por su valencia. Solamente para algunos compuestos se define un PE, y este siempre tiene relacin con la reactividad del compuesto. En general :PE = PM N cidos y bases: n = N de protones que puede ceder (el cido) o captar (la base) por molcula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N de electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molcula.Por ejemplo, 1 Eq de cido sulfrico (H2SO4; PM = 98) es 98/2 (dos H+ cedidos por el cido) = 49. Sin embargo 1 Eq de cido clorhdrico (HCl, PM=36) es 36/1 = 36. 3. Peso de soluto/volumen de solucin en g/l, mg/l: Esta es la forma ms sencilla de indicar la concentracin de una solucin, es la forma ms usual, aparte de la molaridad. 4. Porcentaje peso/volumen (% p/v):Peso de soluto en gramos por 100 ml de solucin (g%). Se habla de porcentaje ya que 100 ml de una solucin acuosa relativamente diluida pesan aproximadamente 100g. para soluciones muy diluidas se usa el submltiplo mg% = peso del soluto en mg por 100 ml de solucin. 5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por 100 gramos de solucin. La concentracin de la mayora de los cidos comerciales viene dada en %p/p. Aqu la proporcin de soluto puede ser mayor que la proporcin del solvente. Ej.: H2SO4 96%. Para poder transformar %p/p a concentracin molar o normal es necesario conocer la densidad (d) de la solucin. Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l). Primero calculamos cunto pesa 1 litro de la solucin. 1 l x 1,15 (kg/l) = 1,15 kg = 1150 g Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro: 100 g de solucin contienen 28 g, por lo tanto 1150 g de solucin contienen 1150g x 0,28 = 322g Finalmente, calculamos a cuntos moles corresponde este peso de HCl:PM del HCl = 36,5 (g/mol) 322 (g) = 8,82 moles 36,5 (g/mol) Hemos calculado que 1 litro del cido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es decir, su concentracin es 8,82 M. 6. Molalidad (m): Nmero de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Esta unidad de concentracin se usa solamente para ciertos clculos fsico-qumicos. Expresar la concentracin en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Al contrario, una concentracin expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, vara con la temperatura, ya que sta afecta el volumen. Para soluciones acuosas diluidas m es prcticamente igual a M. Preparacin de soluciones Para preparar una solucin de un soluto dado se puede usar el soluto puro (generalmente slido) o una solucin concentrada de l en el mismo solvente ( solucin stock). Este ltimo caso constituye una dilucin. Para diluciones rige la relacin: V1 x C1 = V2 x C2 V1 = volumen de la solucin concentrada C1 = concentracin de la solucin concentrada V2 = volumen de la solucin diluida C2 =concentracin de la solucin diluida C1 y C2 pueden ser unidades de concentracin de cualquier sistema referido a volumen. Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solucin2M de cloruro de sodio y se afor con agua. Cul ser la concentracin de la solucin resultante? Nuestro sentido comn nos dice que la respuesta ser 0,2 M, ya que la solucin se diluy 10 veces. El clculo segn la relacin dada sera: C2= V1 x C1=10 ml x 2M= 0,2 M V2100 ml Materiales: Balanza Esptula Vasos precipitados 100 ml Matraces aforados 100ml Frascos de 100 ml Pipetas volumtricas de 1, 2, 5 y 10 ml Procedimientos: Prepare las siguientes soluciones: 1.- Prepare 100 ml de una solucin de Na Cl al5% peso volumen. Realice los clculos aqu: 2.- A partir de la solucin preparada en el punto 1 prepare 100 ml una dilucin al 0,9% de una solucin de NaCl. Realice los clculos aqu: 3.- Calcule como se prepara100 ml de una solucin de 0,1 M de NaOH. Realicelos clculos aqu Apndice Problemas Soluciones 1.- a) Cuntos g de NaOH slido se requieren para preparar 500 ml de una solucin 0,04 M?b) Exprese la concentracin de la solucin preparada en a) en trminos de N, g/l, (% p/v).2.-Cuntosmililitros(ml)deH2SO43Mserequierenparapreparar500mldeunasolucinde H2SO4 de concentracin?a) 0,05 M b) 0,002 N3.-Describalapreparacinde3litrosdeHCl0,25M,utilizandounasolucincomercial concentrada de HCl ( 32% p/p, d= 1,16 kg/l).4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua. Calcule la normalidad de la solucin.5. a) Cuntos ml de NaCl 0,5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2 mM?b) Cuntos ml de KCl 0,3 M se necesitan para preparar 2 litros de solucin 50 mM?6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM; MgCl2 100 mM y CaCl2 1,3 M. A partir de esto, describa la preparacin de 2 l de una solucin que contenga NaCl 120 mM, KCl 35 M, MgCl2 0,03mM y Na2SO4 0,06 M.7.-Respectodelasolucinpreparadaen6,calculelaconcentracinparaelaninCl-yparael catin Na+. Bibliografa: Caterina Guzmn Verri, MQC, PhD Manual de prcticas de laboratorio de Bioqumica 2010. Dr. J. Eleazar Barboza-Corona, Dra. Guadalupe Ortiz, Dr. Rubn Salcedo-Hernndez, Manual de Prcticas de Bioqumica, Universidad de Guanajuato. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA. Douglas A. Skoog and Donald M. West.1971.Principles of Instrumental Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc.Rodney F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press Laboratorio 3: Equilibrio Inico cido Base DETERMINACION DE pH OBJETIVOS: Determinacin de pH a distintas muestras y preparacin de una solucin buffer. INTRODUCCION: Los solutos disueltos en agua pueden clasificarse como electrolitos y no electrolitos en funcin de sucapacidaddeconducirlacorrienteelctrica.Conrelacinaestapropiedad,sedenomina electrolito a una sustancia que disuelta en agua conduce la corriente elctrica, mientras que un no electrolito es una sustancia que disuelta en agua no conduce la corriente elctrica. Los electrolitos pueden disociarse total o parcialmente en iones, segn lo cual se clasifican a su vez enelectrolitosfuertesaaquellosquesedisociancompletamenteeniones(100%)ensolucin acuosa y electrolitos dbiles a los que se disocian parcialmente en iones en estas condiciones. Un tipo especial de electrolitos son los cidos y las bases. Lacapacidaddeconducirlacorrienteelctricasemideconuninstrumentollamado conductmetro,enelcualsemidelaresistenciaelctricaentredosplacasmetlicasdeun electrodo,sometidasaunadiferenciadepotencialelctrico.Otraformadeestimarlaextensin de la ionizacin es utilizar un medidor de pH, segn se explica ms adelante. Segn la Teora de Arrhenius un cido es una sustancia que libera uno o ms iones hidrgeno (H+) porcadamolcula,yunabaseesunasustanciaqueliberaunoomsioneshidroxilos(OH-)por cada molcula, como uno de los productos de disociacin inica, encontacto con el agua. Estos conceptos se limitaron solamente a soluciones acuosas, porque estn basadas en la liberacin de iones H+ y OH-. La Teora de Brnsted-Lowry define un cido como cualquier especie que tiene tendencia a ceder unionhidrgenoaotraespecie,yunabasecomounasustanciaquetiendeaaceptarunion hidrgenodeotrasustancia.Estosconceptosnoslosepuedenaplicaraloscidosybasesde Arrhenius, sino que a otras especies, como por ejemplo agua (H2O) y amoniaco (NH3). Finalmente, la Teora de Lewis define un cido comouna sustancia que puede aceptar un parde electrones para formar un nuevo enlace y una base como una sustancia capaz de entregar un par de electrones para formar un enlace nuevo. FUERZA RELATIVA DE LOS CIDOS Y BASES En solucin acuosa, algunos cidos entregan protones ms fcilmente y algunas bases los reciben con mayor facilidad que otras, esto es lo que llamamos fuerza relativa de cidos y bases. Un cido fuerte es aquel que en solucin acuosa se disocia totalmente liberando iones hidrgeno (por tanto es un electrolito fuerte). Ejemplo: HCl, HBr, HI, HNO3, HClO4, H2SO4, entre otros. Un cido dbil es aquel que en solucin acuosa se disocia parcialmente liberando iones hidrgeno (por lo tanto, es un electrolito dbil). Ejemplo: CH3COOH, H3PO4, HCN, H2S, etc. El grado en el que un cido se ioniza en un medio acuoso se puede expresar por laconstante de equilibriopara lareaccindeionizacin.En general, podemosrepresentarcualquiercidoporel smbolo HX, donde el equilibrio de ionizacin est dado por: HX(ac)H+(ac) + X-(ac) La expresin de la constante de equilibrio correspondiente es: Kc =[H+] [X-] [HX] LaconstantedeequilibrioseindicaconelsmboloKa,ysellamaconstantededisociacincida. Cuanto ms pequeo sea su valor ms dbil es el cido, menos disociado se encuentra. Unabasefuerteesaquellaqueensolucinacuosadisociatotalmenteliberandoioneshidroxilos (por lo tanto, es un electrolito fuerte). Ejemplo: NaOH, KOH. Una base dbil es aquella que en solucin acuosa disocia parcialmente liberando iones hidroxilos (porlotanto,esunelectrolitodbil).Laconstantedeequilibrio,Kb,sellamaconstantede disociacinbsica. Cuantomspequeoseaelvalor deKbmsdbileslabase,situacinsimilar para el cido. En cualquier equilibrio cido - base, ambas reacciones, la que va hacia adelante (a la derecha) y la reaccin inversa (a la izquierda) comprende transferencia de protones. Ejemplo: NH3 (ac) + H2O (l) NH4+ (ac) + OH- (ac) Un cido y una base como el H2O y OH- que slo difieren por la presencia o ausencia de un protn se denominan par cido - base conjugada. Todocidotieneasociadoalunabaseconjugadaformadacuandoelcidocedeunion hidrgeno. En forma similar cualquier base tiene asociado a ella un cido conjugado, que se forma cuandoestacaptaunionhidrgeno.Cuantomsfuerteseauncidomsdbilsersubase conjugada; cuanto ms dbil sea un cido ms fuerte ser su base conjugada. IONIZACIN DEL AGUA Y ESCALA DE pH El agua puede aceptar o donar un protn, dependiendo de las circunstancias. La transferencia de un protn entre dos molculas de agua es llamada Autoionizacin. 2H2O (l) H3O+ (ac) + OH- (ac) o bien, H2O(l)H+(ac) + OH-(ac) La constantecorrespondiente al equilibrio de Autoionizacin, Kw, constante de autoionizacin del agua, tiene la forma: Kw=[H+] [OH-]= 1,0 10-14(a 25 C) Este valor es importante ya que establece que en agua pura, la concentracin de ion H+ y ion OH- son muy pequeas (1,0 x 10-7 molar) y no vara en forma independiente, sino queestnreguladasporlaconstanteKw.Siunadeestasconcentracionesaumenta,laotranecesariamentedeber disminuir para que el producto de las concentraciones de estos iones mantenga el valor de dicha constante. Por cuanto la concentracin de H+ en una solucin acuosa suele ser muy pequea y vara en varios rdenesdemagnitud,seexpresaentrminosdeun parmetrodenominadopH.ElpHsedefine como el logaritmo negativo en base diez de la concentracin molar de iones hidrgeno, es decir: pH=- log [H+] Debidoalsignonegativo,elpHdisminuyeamedidaqueaumentalaconcentracindeiones hidrgeno de modo tal que: Soluciones cidaspH [OH-] Soluciones neutraspH =7,0 [H+] = [OH-] Soluciones bsicaspH >7,0 [H+] < [OH-] Ellogaritmonegativotambinesunaformadeexpresarlasmagnitudesdeotrascantidades pequeas. Por ejemplo, se puede expresar la concentracin de ion hidroxilo como pOH y definirlo segn: pOH=- log[OH-] Usandoestanotacinpuededemostrarsequeenunasolucinacuosa,a25C,siempredebe cumplirse que: pH+pOH=14,0 Existen varios mtodos para medir la concentracin de iones hidrgenos de una solucin, los ms usados: 1.Matemticamente, conociendo la concentracin de iones H+. 2.Con papel indicador de pH. 3.Por potenciometra, mediante el uso del instrumento llamado pHmetro. Papel indicador de pH: La determinacin de pH con papel indicador es casi directa y se realiza agregando una o dos gotas de la solucin problema sobre un trozo de papel impregnado en un indicador, el que adquiere una coloracin que se compara con la gama estampada en el envase del papel indicador. Estos indican el valor con una incerteza de +/- una unidad de pH. El papel tornasolindica slo el carcter cido o bsico de la solucin (no mide pH). Rojo en medio cido y azul en medio bsico pH-metro o potencimetro: Consiste en dos electrodos, uno denominado electrodo de referencia que mantiene un potencial y elotrodenominadoelectrododevidriooelectrodoindicadorqueessensiblealoscambiosde concentracin de iones hidrgenos. El pHmetro posee una escala con valores entre 0 y 14 con una incerteza de +/- 0,1 unidades de pH. Aunque existen otros con graduaciones menores. Los pHmetros ms modernos constan de un electrodo mixto el cual trae incorporado en una sola unidad el electrodo de referencia y el electrodo de vidrio. Antes de usar un pHmetro lave cuidadosamente con agua destilada el electrodo de vidrio, squelo suavementeconpapelabsorbenteysumrjaloenunasolucinamortiguadoradepH7, encindalo y ajuste la aguja de la escala a pH 7. Lave y seque de nuevo el electrodo. Luego sumerja elelectrodoenla muestracuyopHdeseadeterminar.Agitesuavemente el vasoy esperequese estabilice para leer el valor. SOLUCIONES BUFFER Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE pH: Las soluciones tampn tienen una importancia fundamental en los organismos vivos, ya que ellas mantienen el pH constante en las clulas y fluidos corporales para que las reacciones bioqumicas procedan exitosamente. Una solucin tampn se define como una solucin que es capaz de mantener el pH constante por adicin de protones (H+) o iones hidroxilos (OH-). Un buffer est constituido por un cido dbil y su sal derivada (base conjugada del cido dbil), buffer cido o por una base dbil y su sal derivada (cido conjugado de la base dbil), buffer bsico. Aladicionarunasgotasdecidoobasefuertesobreaguapuraosobresolucionesdesales,de cidosybasesfuertes,elpHdellquidosemodificaenformanotable.Perosisetieneuna solucindecidoacticoen laqueademshaydisueltaacetatodesodio,lasolucinofreceuna granresistenciaa modificarsupH,as,siseagregaalamismaunasgotasdecidofuerte,elpH cambia muchsimo menos de lo que podra esperarse. Todas las soluciones de un cido dbil y de una sal que contenga el anin del cido, as como todas lassolucionesdeunabasedbilydeunasalquecontengaelcatindelabase,secomportan anlogamenteenlaaccindeamortiguaroatenuarelsupuestocambioenelpHdelamisma. Estassolucionesrecibenelnombrede:Solucionesbuffer,amortiguadoras,reguladorasdepHo soluciones tampones. ElpHdeunasolucinreguladorapuedecalcularsetericamenteapartirdelaexpresindela constante de equilibrio del cido o base dbil. Porejemplo,sisepreparaunasolucinreguladoracompuestaporcidoacticoyacetatode sodio, en la solucin existirn los siguientes iones: H+, Ac-, Na+ y HAc sin disociar. LosionesAc-provienentantodelasalcomodelcidodisociado,perosisepiensaquela concentracindeAc-queproporcionalcidoesmuybaja,dadalapocadisociacindeeste, puedeconsiderarsequelaconcentracindeAc-esprcticamenteigualalaconcentracindela sal, en consecuencia se tiene que: Ka = [H+] [Ac-] como:Ac- = concentracin de sal [HAc]HAc = concentracin de cido se tiene: de donde: Ka = [H+] concentracin de sal[H+] = Ka concentracin del cidoconcentracin de cidoconcentracin de sal EstaexpresinpermitecalcularelpHdelbufferyaquelaconcentracindelasalyla concentracin del cido son valores conocidos, luego aplicando Log se tiene: pH = pKa+Logconc. de la sal conc. del cido Ecuacin que recibe el nombre de Ecuacin de Henderson-Hasselbalch, donde pKa = - log Ka

(Ka constante de acidez) De manera similar se deduce la ecuacin para calcular el pH de una solucin tampn formada por una base dbil y su correspondiente sal. Por ejemplo: NH4OH/NH4Cl. En este caso tenemos: Kb = [ NH4+] [OH-] como: NH4+ = concentracin de la sal [NH4OH]NH4OH = concentracin de la base se tiene: pOH = pKb + Logconc. de la sal conc. de la base pH = 14 pKb + Logconc. de la base conc. de la sal LamedidadeefectividaddelbufferotampnparaconservarelvalordesupHaladicionarse cidos o bases, se denomina capacidad reguladora. Se define como el nmero de moles de cido o base fuerte que se requieren para cambiar en una unidad el pH de un litro de solucin. As para un buffer formado por un cido dbil y su sal, como es la solucin HAc /NaAc, de donde Ka = 1.8 10-5 se tiene que: pH = 4,74+Logsalaplicando la definicin de capacidad reguladora: acido

pH = 4,74 +- 1 Estosignifica que este buffer tiene capacidadreguladora solo entre loslimites depH =3,74 y pH =5,74 como es de suponer, dentro de los limites conocidos, debe existir una relacin ptima. Dicha relacin se cumple cuando [sal] = [cido]; esto es, cuando: _[sal]_=1se tiene entonces pH = pKa + log. 1 |cido| por lo tanto: pH = pKa La dilucin de un buffer no afecta al pH, pero si disminuye la capacidad de amortiguacin Actividades Experimentales Actividad N1: Medicin de pH con distintas tcnicas. -Con una pinza introduzca un trocito de papel tornasol en cada una de las muestras luego retrelo y observe el cambiode color.-Evite contaminar las muestras -Registre lo observado.-Usepapel nuevo para cada muestra -Repita el procedimiento anterior usando papel indicador de pH.-Registre los valores.-Finalmente determine el pH de las mismas soluciones usando el pH-metro. -Considere las instrucciones en relacin con el uso de este instrumento. -Registre sus observaciones en el siguiente cuadro: N muestracontenido Papel Tornasol Solo carcter Papel pH UniversalpH-metro N1HCl 0,1MN2NaOH0,1 MN3CH3COOH 0,1 MN4NH4OH 0,1 MN5Bebida gaseosa colaN7Leche Preparacin de Soluciones Buffer Actividad N 2: Preparacin de una solucin buffer. HAc/NaAc -Prepare 50 ml de una solucin buffer de pH 4,0acetato de sodio en cido actico 0,1 M. -Realice los clculos necesarios. -Pese la cantidad requerida de acetato de sodio. -Disuelva lacantidad deacetatodesodioenunvasodeprecipitadoquecontengaunos 25 ml de cido actico 0,1 M -Trasvasije al matraz de aforo de 50 ml. -Enrase con cido actico 0,1 M hasta la marca del aforo. -Mida el pH del buffer resultante. Actividad N3: Comportamiento de una solucin buffer frente a un acido o una base -En un vaso de precipitado de 100 ml de capacidadcoloque 50 ml del buffer preparado en la actividad 2 y mida elpH. -En otro vasoaada 50 ml de agua destilada ymida elpH. -Aada a ambosvasos 0,5 ml de NaOH 0,1 M o HCl 0,1 M -Volver a medir el pH a ambas muestras -Explicar lo sucedido. Cuestionario: 1.Cul de las tcnicas le ha permitido medir el pH en forma ms exacta? Indique las precauciones en el uso del pH-metro 2.Cmo se calibra un pH-metro? 3.Con cuantas cifras significativas se puede obtener una lectura de pH al usar el pHmetro. 4.Cul es la incerteza de la medida con el papel pH5.Cul es la incerteza de la medida de pH con el pHmetro. 6.Averigesolucionesamortiguadorasrelacionadasconnuestroorganismoeindiquesu importancia a nivel biolgico. 7.Cmoprepararas250mldeunbufferdepH5formadoporCH3COOHyCH3COONa utilizando acido actico0,15 M? 8.Cul es el pH de una disolucin buffer que es 0,1 M en acido actico y 0,1 M en acetato de sodio Ka=1,8x10-5? MuestraspH Buffer Buffer + NaOH 0,1 M Buffer + HCl 0,1 M Agua pura Agua + NaOH 0,1 M Agua + HCl Laboratorio 4: Espectrofotometra: AbsorciometriaMontaje de una Tcnica Fotocolorimetrica PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA DE UV/VISIBLE Laabsorciometraaprovechalapropiedaddeciertoscompuestosdeabsorberradiacin electromagntica.Losdiferentestiposderadiacinelectromagntica,comoserrayosX,luz ultravioleta(UV),luzvisible,luzinfrarroja,ondasderadio,etc.,sepropaganavelocidadcomn pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Se cumple que: c = x u c= velocidad de la luz en el vaco = longitud de onda u= frecuencia Elojohumanodetectalaradiacindelrangodelongitudesdeondade400a800nm, llamada luz visible(1nm =10-9 m).La luzdelespectro visibleydelUVcercano(200a400nm) posee la energa necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menorenergaaotrodemayorenergadeciertoscompuestos,llamadoscromforos.Las sustanciascoloreadasabsorbenluz visible,sucolorcorrespondealaradiacinnoabsorbida.La luzsolaresblanca,yaquecontieneradiacindetodoelespectrovisible,apartedeotras radiaciones. LEY DE LAMBERT-BEER LaleydeBeer-Lambert(oLambert-Beer)eslaleyfundamentaldelaabsorciometra,ya que relaciona la absorcin de la luz con la concentracin de soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio. El siguiente esquema ilustra la situacin: cubeta solucinde concentracin c I0I luz incidenteluz transmitida l Io = intensidad del haz incidente I= intensidad del haz transmitido l = camino ptico (ancho interior de la cubeta medido en cm). c = concentracin Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, I es menor que Io. Cuanto mayor es el nmero de molculas de este cromforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor ser la intensidaddelaluztransmitida.Dichonmerodemolculasdependedeladistanciarecorridaa travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin. La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert-Beer: I = Io x 10- c lc(1) Laformadeestaleyusadaenlaprcticaesmssencillayseobtienedelasiguiente manera: Reordenando y aplicando logaritmos: logI= - c l c Io Se define como absorbancia (A) de una solucin: A = logIo(2) ----- I Luego: A = c - l - c(3) ley de Beer-Lambert (forma lineal) Por convencin se usa el siguiente sistema de unidades: l = camino ptico en cm c = concentracin en M c = coeficiente de extincin molar, en cm-1 x M-1 Sinnimos de absorbancia: densidad ptica, extincin. El coeficiente de extincin molar: es una caracterstica propia del cromforo a una longitud de onda dada y representa la probabilidad de que el cromforo absorba la radiacin. Para explicar el significado se suele sealar que c es igual al valor numrico de la absorbancia que tendra una solucin 1 M del cromforo si el camino ptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carcter hipotticodeestaafirmacin,yaquenormalmentenoesposibleprepararsolucionesde concentracin 1 M de los cromforos (si el PM es alto, 1 M es una concentracin extremadamente alta),yporotraparteelrdendemagnituddeloscoeficientesdeextincinmolarimportantes correspondeavaloresmuysuperioresalintervalodeabsorbanciasmediblesenlaprctica.Los coeficientes de extincin pueden tomar valores hasta 100.000 cm-1 M-1, aproximadamente. Paracompuestosdepesomoleculardesconocidoseusaenvezdelcoeficientede extincinmolarlaabsorbanciadeunasolucindeconcentracinestndarexpresadaen%P/V, medida en una cubeta de camino ptico dado como referencia. Ejm.: para protenas se usa A0,1% (l = 1 cm), y para protenas tpicas a 280 nm tiene valores cercanos a 1. Por otra parte, se define como transmitancia (T) de una solucin: T = I (4) Io Esdecir,latransmitanciaeslafraccindelaintensidadincidentetransmitidaporla solucin. T se puede expresar como porcentaje (%T). %T = Ix 100 Io Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene:A = - log T(5) Ejm: Si %T = 50, entonces T = 0,50 y A = 0,301 LaleydeLambert-Beerindicaqueparauncromforoaunalongituddeondadadala absorbanciaaumentaenformalinealconlaconcentracin(conl=cte),mientrasquela transmitancia disminuye en forma exponencial. (Fig. 1 y 2). A A = c l cTT = 10 -c l c pendiente = c x l cc Fig. 1Fig. 2 El grfico de la absorbancia de un cromforo en solucin en funcin de la longitud de onda se denominaespectro de absorcin. Un espectro deabsorcinse obtiene variando la longitud de ondaparalycconstantes,yporlotantorepresentalavariacindeAconlalongituddeonda (segn (3)). Acontinuacinsemuestracomoejemploelespectrodeabsorcinderiboflavina(en fosfato de sodio, a pH 7,0). A 260340420500nm longitud de onda () ElespectrodeabsorcindeUV/visibleescaractersticoparauncromforodeterminado, por lo tanto se puede usar parasu identificacin. Las caractersticas espectroscpicassepueden resumir,indicandolaposicindelosmximosdelasbandasdeabsorcin(mx)conlos correspondientes coeficientes de extincin. Por ejemplo, para riboflavina a pH 7,0: mx (nm)c (M-1 cm-1) 26631.800 37310.400 44512.500 La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su nica bandaen la regin del visible a 445 nm, corresponde a absorcin de luz azul. CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA De la ley de Lambert-Beer se puede deducir: a)Para diluciones, si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda, en la misma cubeta: A1V2 A2V1 b)En un espectro: A1c1 A2c2 La aditividad de la absorbancia: Laabsorbanciadeunasolucinaciertalongituddeondaesigualalasumadelas absorbancias de todos los cromforos que contiene. AT = A1 + A2 + A3 + ... INSTRUMENTOS DE MEDIDA Loscomponentesbsicosdetodoslosinstrumentosqueseusanenabsorciometrade UV/visible son: - Fuente de luz - Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda - Compartimento de muestra - Detector - Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a)Fotmetrosdefiltro:Laseleccindelalongituddeondaserealizamediantefiltros intercambiables. b)Espectrofotmetros:Poseenunmonocromador,sonmssofisticadosquelosfotmetrosde filtro. Porotrapartesedistingueninstrumentosqueoperanenelrangovisiblesolamenteyotros queabarcanelUVyelvisible(tienen2fuentesdeluz).Ademsexisteninstrumentosde1 solo haz y de doble haz. El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotmetro que opera con luz visible: I0I 0.532 lmpara deMonocromador Cubeta en FototuboPantallaTungstenoportacubetas de lectura 1. FUENTE DE LUZ: No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral UV/visible de suficiente intensidad, por consiguiente se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lmpara de tungsteno.Sirvepara340-850nmaproximadamente.FuentedeluzUV:lmparasdeH2oD2. Sirven para 200-375 nm aproximadamente. 2. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA: 2.1. Filtros No proporcionan luz realmente monocromtica sino que permiten el paso deun cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de mxima transmitancia del filtro. 2.2. Monocromadores Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de difraccin. El elemento dispersorseparaloshacesdeluzdediferentelongituddeonda.Unsistemadeespejospermite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida: 493 nmranura 492 nm 491 nm 491 nm 490 nm 490 nm 489 nm 489 nm 488 nm487 nm luz monocromtica 486 nm Monocromador Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasar un cierto rango de longitudes de onda. Lamonocromaticidad de esta luz se mide a travs del "ancho de banda" del espectrofotmetro (tpicamente es de 1 a 10 nm). En la prctica se considera que un espectrofotmetro opera con luz prcticamente monocromtica. Unmonocromadorpermitevariarlalongituddeondaenformacontinua,condicin necesaria para obtener espectros de absorcin. Conun fotmetro de filtro no esposibleobtener espectros de absorcin. 3. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS: All se ubica la o las cubetas con lassoluciones de muestra y dereferencia. Las cubetas son de vidrio o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV). 4. DETECTOR: Losdetectoressondetipofotoelctrico:alincidirluzproducencorrienteelctrica,de intensidadproporcionala la intensidaddela luz.Losdetectoresmsusualessonlosfototubosy los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores. 5. LECTURA O REGISTRO: Lamayorpartedelosinstrumentosindicanoregistranelvalordelaabsorbancia.Siel instrumentoinformalatransmitanciasecalculaAusandolaecuacin(5).Laabsorbancia normalmentesemidecon3cifrasdespusdelacoma.Elrangofotomtricodelos espectrofotmetrosnormalmenteesdesdeA=0,000hastaA=2,0003,000,dependiendodel modelo. APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO 1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO Midiendo la absorbancia de la solucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el correspondiente coeficiente de extincin molar se puede calcular la concentracin. Normalmente se usa la longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura. Un mtodo alternativo es construir una curva de calibracin de A en funcin de c, que ser unarectasisecumplelaleydeLambert-Beer(verfig.1).Interpolandoenlarectaconla absorbanciadelasolucinproblemasepuededeterminarsuconcentracin.Unaventajadel mtodo con curva de calibracin es que permite usar tambin un fotmetro de filtro. La pendiente de la curva de calibracin se ha llamado factor de calibracin, k. Luego: A = k - c(6) Si se ha usado un espectrofotmetro de buena calidad: k = c x 1 Si el nmero de muestras es alto, ser ms prctico determinar k, desde el grfico y usar la ecuacin (6) que interpolar. 2. DETERMINACIONES A TRAVES DE UNA ENSAYO O "TEST" Muchoscompuestosquenopuedenserdeterminadosdirectamente(midiendosupropia absorbancia),sepuedendeterminarporabsorciometrausandounensayoo"test".Enelensayo seagregaunoovariosreactivoscromognicosqueinteraccionanoreaccionanespecficamente con el compuesto a determinar, generndose un compuesto o complejo que absorbe. Normalmente enlostestsegenerauncolor(absorbanciadeluzvisible),porloquesedenominanensayos colorimtricos. Casos en los cuales se realiza un test: 1.El compuesto no absorbe en todo el UV/visible: Ejemplo: Determinaciones de azcares, determinacin de fosfato. 2.El compuesto absorbe en una regin espectral (generalmente UV), pero no se puede efectuar la determinacin directa porque la muestra o "solucin problema" es una mezcla que contiene otroscompuestosqueabsorbenenlamismareginqueelcompuestoadeterminaro/yla absorbancia es demasiado baja Ejemplo:Determinacin de protenas. En este caso adems es indispensable un test, si se analiza una muestra con varias protenas, de coeficientes de extincin desconocidos. Eltestserealizaenparaleloconlamuestraproblema,conunaovariassolucionesdel compuestoadeterminar,deconcentracinconocida(solucionespatrnoestndar)yconel solvente(blancodeltest).Posteriormentesemiden lasabsorbancias"contra"elblanco,esdecir, en instrumentos de 1 solo haz, se calibra A = 0 con el blanco en el haz. Alternativamente se pueden medir contra agua, y restar la absorbancia del blanco de todas las absorbancias. Esta A ser proporcional a la concentracin del compuesto que se va a determinar dentrodeciertorangodeconcentraciones,especficoparacadatest.Siseussolamenteuna solucin, se calcula la concentracin por proporcin directa: C (problema) =A (problema) C (estndar) A (estndar) Si se usaron varias soluciones estndar se construye la curva de calibracin del test. Para determinar la concentracin del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta o usar el factor de calibracin, como se explic anteriormente. Es necesario destacar que para un test k no es igual a unproductoc x 1. Al usar un test, debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra decompuestos que interfieran con el test, sealados normalmente en la literatura, junto al mtodo. BIBLIOGRAFIA (Espectrofotometra) 1.H.Willard, L.Merrit, J.Dean "Instrumental Methods of Analysis". 2.G.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis". 3.D. Freifelder, "Physical Biochemisty". 4.S.B.Brown, Ed. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists". Parte Experimental: En el presente prctico se estudiar la validez de la ley de Lambert Beer para soluciones acuosas depermanganatodepotasio.Estecompuestopresentaenelespectrovisibleunabandade absorcin ancha, provista de hombros, cuyo mximo est a 525nm (c = 2.500M-1 cm-1). Para la determinacin fotocolorimtrica de sustancias que no absorben en la regin del visible, se usa una reaccin especfica que lleva a la formacin de un producto (o productos) coloreado. En estoscasosesindispensableconstruirunacurvadecalibracinparaladeterminacin.Ejemplos tpicos son las determinaciones de protenas (mtodo de Biuret, Mtodo de Bradford, etc). Materiales: Solucin de permanganato de potasio 0.1M Buretas, matraces aforados de 100 ml Pipetas. Procedimiento: 1.- Prepare 100ml de una solucin de KMnO4 que tenga absorbancia cercana a 1 a 525 nm. No es necesarioefectuarunadilucinrigurosamentecuantitativa.Estasolucinseusarcomo muestra problema 2.-Traceelespectrodeabsorcindelasolucinproblemaenelrangoespectral400-600nm Efectuar las lecturas a intervalos de 10, 5, 2 o 1 nm, determinando la posicin de los mximos con mayor exactitud posible. Grafique los valores en papel milimetrado. 3.- Prepare 7 soluciones estndar cuya absorbancia en el mximo cubra en el rango entre 0 y 1.4Utiliceparaellounasolucinprediluidadepermanganato1mM.Midalaabsorbanciadelas soluciones en el mximo y a dos longitudes de onda situados en los flancos. En forma previa al prctico: Efecte los clculos necesarios para 1 y 3 y prepare una tabla de la siguiente forma: Tabla 1 Solucinml KMnO4 1mM ConcentracinA (medida) N525nm___nm_____nm 1 2 3 4 5 6 7 Contenido del informe adicional: Espectro de absorcin del KMnO4 -Clculo de la concentracin de la solucin problema -Tabla N 1 -Curvasdecalibracin:GrficodeAenfuncindeCparacadalongituddeonda(enel mismo grfico) -Determinacindelaconcentracindelasolucinproblemausandolacurvadecalibracin ms adecuada. Laboratorio 5Cuantificacin de Protenas INTRODUCCION: Sehandescritomuchosmtodosdiferentesparaladeterminacincuantitativade protenas. Estos mtodos difieren entre s en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez.Laseleccindelmtodoadecuadoserealizaconsiderandolascaractersticasdelas muestrasquesedeseananalizar,quepuedenserextractosdetejidosanimalesovegetales, lquidos biolgicos de inters en bioqumica clnica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso delapurificacindeunaprotena,fraccionesdeunacolumnacromatogrfica,muestrasdeuna protena pura, etc. En general los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de protenas consisten enladeterminacinabsorciomtricadirectaoenensayosdetipocolorimtrico,turbidimtricoo fluoromtrico. Absorciometra de protenas Lamayoradelasprotenaspresentanunmximodeabsorbanciaa280nm aproximadamente,debidoprincipalmentea lapresenciaderesiduosdetriptfanoytirosina,yen menorproporcinfenilalanina.Losresiduosdehistidina,cistenaycistinatambinpresentan bandasdeabsorbanciaenelultravioletacercano,peroseencuentranamenoreslongitudesde ondaysondemenorintensidad.Laposicinexactadelmximodeabsorbancia,ascomoel coeficientedeextincinmolardeunaprotenadependedesucomposicinaminoacdica.Por consiguiente,solamenteparasolucionesdeunaprotenapura,conocida,cuyocoeficientede extincinsehadeterminadopreviamente,sepuedecalcularlaconcentracinapartirdesu absorbancia. Se han efectuado estimaciones de la concentracin total de protenas en mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razn A 280/A 260 (mtodo de Warburg), que permite corregir el error debido a la contaminacin por cidos nucleicoslos cuales presentan un mximo deabsorbanciaa260nm.Lasprotenastambinabsorbenfuertementealongitudesdeonda menoresa240nm,debidoprincipalmentealacontribucindelosresiduosdeaminocidos aromticos, as como de los enlaces peptdicos (bajo los 220 nm). La literatura describe mtodos paraefectuarestimacionesdeconcentracinutilizandolaabsorbanciaenestaregin.Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una composicin aminoacdica atpica. Ensayos colorimtricos LosensayosmsusadossonlosdeBiuret,deBradford,deLowryyelensayousando cido bicinconnico. El ensayo de Biuret se utilizar en el presente prctico. El ensayo de Lowry es desensibilidadalgomenoraldeBradford(0,025-0,5mg/ml),esmsconfiable,peroesms complicado. Cuantificacion de protenas por el mtodo de Biuret ElreactivodeBiuret(sulfatocpricoenmedioalcalino),reaccionaconcompuestosque contienendosomsenlacespeptdicosdandounacoloracinvioleta.Elcolordesarrolladose debe a un complejo de coordinacin entre el Cu++ y cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas peptdicas. El mtodo de Biuret sirve para la determinacin de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. Losdipptidosylosaminocidos(exceptoserinaytreonina)nodanestareaccin. Interferencias:Pptidos,Tris,sacarosaypigmentosbiliarestambingeneranelcolor,salesde amonio y sacarosa afectan el color. PARTE EXPERIMENTAL 1.ENSAYO DE BIURET MATERIALES Reactivo de Biuret: Preparacin: Colocar 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x4H2O)enunvasode1000ml.Agregaralrededorde500mldeaguadestiladayagitarhasta disolucin.Agregarlentamenteyagitandoconstantemente,300mldehidrxidodesodio2.5N. Lasdossolucionesdebenestaratemperaturaambiente.Agregar1.0gdeiodurodepotasioy agitar hasta que est totalmente disuelto. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente. (Se entregar preparado). -Espectrofotmetro. -Solucin patrn de albmina 10 mg/ml PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACION Atencin: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva de calibracin. -Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de solucin estndar que contengan 2; 4; 6; 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco, coloque 1 ml de agua destilada en vez de albmina. -Complete a 1 ml con agua destilada (De esta forma Ud. ha preparado soluciones de albmina de la concentracin correspondiente al rango del test). -Agregue 4 ml del reactivo de Biuret-Deje desarrollar color durante 30', luego mida A a 540 nm contra el blanco. (En forma previa la prctico, prepare una tabla que indique para cada tubo: volumen de agua, volumen de solucin estndar, mg/ml (protenas), A. DETERMINACION DE PROTEINAS EN UNA MUESTRA -Enuntubocoloque1mldelamuestraadeterminar.Siesnecesario,uselamuestra prediluda. -Agregue 4 ml del reactivo de Biuret. -Deje desarrollar color durante 30' y mida A a 540 nm. INFORME Contenido (aparte de lo habitual): -Tablas de valores -Curva de calibracin: grfico de absorbancia en funcin de concentracin.-Calculo de la concentracin de la muestra, considerando prediluciones. BIBLIOGRAFIA Methods in Enzymology Vol. 3 pg. 447 Bradford, M.M., Analytical Biochemistry 72, 248 - 254 (1976). Laboratorio 6: Reconocimiento de Enzimas 1.Objetivos:PonerdemanifiestolapresenciadelaenzimaCATALASAentejidosanimalesy vegetales. Comprobar la accin de la temperatura sobre la actividad de las enzimas y comprobar la accin hidroltica de la AMILASA. 2. Introduccin Lasenzimassonbiocatalizadoresdenaturalezaproteica.Todaslasreaccionesqumicasdel metabolismo celular se realizan gracias a la accin de catalizadores o enzimas. La sustancia sobre la que acta una enzima se denomina substrato. Pasteur descubri que la fermentacin del azcar mediantelevaduras,consuconversinenalcoholetlicoyanhdridocarbnicoescatalizadapor fermentos o enzimas. En 1897 Buchner logr extraer de las clulas de levadura las enzimas que catalizan la fermentacin alcohlica. Sumner en 1926, aisl en forma cristalina la enzima ureasa, a partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis (Fabaceae) la que hidroliza la urea segn la siguiente reaccin:UREASA (NH2)2 CO + H2O CO2 + 2 NH3 En1930,Northropaislenformacristalinalasenzimasdigestivas:pepsina,tripsinay quimotripsina. En la actualidad se conocen ms de 2000 enzimas que han sido aisladas en forma cristalina.En trminos generales los catalizadores se caracterizan por las siguientes propiedades: 1 Son eficaces en pequeas cantidades. Tienen un nmero de recambio alto, que vara entre 100 y 36 millones (anhidrasa carbnica). El nmero de recambio o actividad molar, se define como la cantidad de substrato transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de enzima, por ej. la catalasa hidroliza 5,6 x 106 molculas de H2 O2 por molcula de enzima por minuto, por lo que su nmero de recambio es 5,6 x 106. 2 No se alteran durante las reacciones en que participan.3 Aceleran el proceso para la obtencin del equilibrio de una reaccin reversible.4 Muestran especificidad. La accin de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato especfico.Las enzimas tienen pesos moleculares que oscilan entre 12.000 y un milln. Algunas enzimas son protenasconjugadas;yaqueposeenungruponoproteicooprosttico,porEj.unazcar-glucoprotenas, un lpido-lipoprotenas, un cido nucleico -nucleoprotenas. Una enzima completa sedenominaholoenzima,yestformadaporunaparteproteica(apoenzima)yuncofactorno proteico (coenzima). HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA Entreloscofactoresquerequierenlasenzimasparasufuncionamientoestnlascoenzimas: NADPH+H(nicotinamidaadeninadinucletidofosfatoreducido),NAD(nicotinamidaadenina dinucleotido), FAD (flavina adenina dinucletido), piridoxal, biotina, tiamina, cido tetra hidroflico, cobalamina,etc.Asmismo,muchasenzimasrequierenactivadoresmetlicos,yhedeallla importancia de los minerales para el buen funcionamiento y crecimiento de las plantas. 3. MATERIAL Y METODOS Gradilla Pipetas Soluciones de Fehling A y B Trocitos de hgado Tubos de ensayo Agua oxigenada Bao Mara Trocitos de tomate Mechero Solucin de Lugol Almidn 1.- Reconocimiento de la Catalasa La Catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula toxica que es el perxido de hidrogeno o agua oxigenada. (H2 O2). Laenzimadescomponeelperxidodehidrogenoenaguayoxigeno,porloquesesolucionael problema. La reaccin de la Catalasa sobre el H2 O2, es la siguiente: 2 H2 O2 2 H2 O+ O2 Catalasa REACCION: La existencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echasobre unaherida. Como muchas de las bacterias patgenassonanaerobias mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada. En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia: 1.Colocar en tubo de ensayo unos trocitos de hgado 2.Aadir 5 ml de agua oxigenada 3.Se observar un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno. Nota:Sedeberepetirestaexperienciacondiferentestejidosanimalesyvegetales.Puedeser interesanteirobservandolamayoromenoractividad,segneltejidoconelqueserealicela experiencia. 2.- Desnaturalizacin de la catalasa. Medianteestaexperiencia,vamosaverunapropiedadfundamentaldelasprotenas,queesla DESNATURALIZACION. Yaquelacatalasaqumicamenteesunprotena,podemosdesnaturalizarlaalsometerlaaaltas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. 1.colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado. 2.Aadir agua para hervir la muestra. Hervirdurante unos minutos. 3.Despus de este tiempo, retirar el agua sobrenadante. 4.Aadir 5 ml de agua oxigenada. 5.Observar el resultado. 3.- Hidrlisis del Almidn. Medianteestaexperiencia,vamosaverlaactividaddeotraenzima,laAMILASAoptialina, presente en la saliva. Esta enzima acta sobre el polisacrido Almidn, hidrolizando el enlace o-glicosdico, por lo que el almidn se terminara por transformar en unidades de glucosa. Esimportantequerecuerdenlasreaccionescaractersticasdeglcidosparacomprenderesta experiencia. Procedimiento: 1.Poner en una gradilla 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4. 2.Aadir a cada tubo 5 ml de una solucin diluida de almidn 3.A los tubos 3 y 4 aadir una pequea cantidad de saliva. En el tubo 1 hacer reaccin de Fehling. Reaccin de Fehling:- Tomar la muestra que se quiera analizar (normalmente una cantidad de 3 ml.)1.Aadir 1 ml. de Fehling A y 1 ml. de Fehling B. El lquido del tubo de ensayo adquirir un fuerte color azul.2.Calentar el tubo al bao Mara o directamente en un mechero de Laboratorio.3.La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo.4.La reaccin ser negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso. Fundamento:Sebasaenelcarcterreductordelosmonosacridosydelamayoradelos disacridos(exceptolasacarosa).Sielglcidoqueseinvestigaesreductor,seoxidardando lugaralareduccindelsulfatodecobre(II),decolorazul,axidodecobre(I),decolorrojo-anaranjado. En el tubo 2 realicen la reaccin de Lugol Reaccin del Lugol: Estemtodoseusaparaidentificarpolisacridos.Elalmidnencontactoconunasgotasde Reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico. 1.Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml del glcido a investigar.2.Aadir unas gotas de Lugol.3.Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva.Fundamento:LacoloracinproducidaporelLugolsedebeaqueelyodose introduceentrelasespirasdelamolculadealmidn.Noesportanto,unaverdaderareaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta.Los resultados son los esperados para un polisacrido como el almidn Los tubos 3 y 4 contienen el almidn, al que se le ha aadido saliva. Colocar los tubos precipitados al bao mara, controlando la temperatura del agua que no hierva, ya que lo que intentamos es que la enzima de la saliva actu a 37 C. Mantener por 15 minutos. Despus de este tiempo realizar las siguientes reacciones: -En el tubo 3 realice la reaccin de Fehling -En el tubo 4 realizar la prueba de Lugol El resultado positivo obtenido en el tubo 3 nos indica que la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidn transformndolo en glucosa, por eso la reaccin de de Fehling es ahora positiva. Deformasimilar,sepuedeinterpretarelresultadodeltubo4,ahoranosdalareaccinde polisacridos negativa, ya que el almidn se ha hidrolizado. Laboratorio 7: Efecto temperatura y pH sobre la actividad enzimtica 1.-OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos; 1.Conozcanalgunosprocedimientosparadeterminarlaactividaddeunaenzimaenmuestras biolgicas. 2.CompruebenelefectoquetieneenlaactividaddeunaenzimalasvariacionesdepHy temperatura. 2.-INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidadescompatiblesconlavida,contribuyendoademsasuregulacin.Debidoasu naturaleza proteica las enzimas pueden modificar suactividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalizacin. Engeneralunareaccinqumicaaumentasuvelocidaddereaccinalaumentarlatemperatura, pero en el caso de lasreacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa slo entre 0 y 40 C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno y la prdida de su conformacin nativa. Debido tambin a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivandelosradicalesdesusaminocidosconstituyentes.LasalteracionesdelpHpueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. Actividades Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1-4 de los polisacridos.Lahidrlisisdelalmidnporamilasasalivaldacomoproductounamezclade maltosa,maltotriosa(dextrinas)yglucosa.Elalmidnesunpolisacridoformadopor2tiposde cadena: amilasa (lineal), que presenta slo enlaces 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4y1-6Elalmidnsereconocequmicamenteporelcolorazulintensoquedesarrollaen presenciadeyodo,porloquelahidrlisisenzimticadelalmidnsepuededeterminarporla prdida del color azul de una mezcla de reaccin. 3.-REACTIVOS Y MATERIALES 1. Preparacin enzimtica: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. 2. Tampn fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH 6.0 y pH 8.0 3. solucin de Cloruro de sodio 0.03 M 4. solucin de almidn 1% p/v 5. solucin de lugol 6. Bao termorregulado y de agua hirviendo PROCEDIMIENTO A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn. Numere4tubosdeensayoyagregueacadauno2mldelapreparacinenzimtica,1mldela solucindeclorurodesodio,1mldelasolucintampnfosfatopH7.0y2mldesolucinde almidn. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0C (sobre hielo), el tubo 2 a 37C en un bao termorregulado, el tubo 3 a 100C (bao mara) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reaccin a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Tubo12345 Solucin Almidn 2 ml2 ml2 ml2 ml2 ml Tampn fosfato pH 7.0 1 ml1 ml1 ml1ml1 ml Sol. cloruro de sodio 1 ml1 ml1 ml1ml- Preparacin enzimtica 2 ml2 ml2 ml2 ml2 ml Temperatura incubacin 0C37C100CTATA Lugol (gotas) 11111 B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparacin enzimtica, 1 ml de solucin de cloruro de sodio y 2 ml de solucin de almidn. Posteriormente adicione 1 ml de tampn fosfato pH 5.0 al tubo 1, 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 7.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al tubo4.Mezcleydeje incubandoatemperaturaambientepor15minutos.Alcabodeesetiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Tubo1234 Solucin Almidn 2 ml2 ml2 ml2 ml Tampn fosfato1 ml pH 5.01 ml pH 6.01 ml pH 7.01ml pH 8.0 Sol. cloruro de sodio 1 ml1 ml1 ml1ml Preparacin enzimtica 2 ml2 ml2 ml2 ml Temperatura incubacin TATATATA Lugol (gotas) 1111 Laboratorio8 y 9: Reconocimiento de Hidratos de Carbono Mtodoscualitativosparalaidentificacindecarbohidratos(Monosacridos,Disacridosy Polisacridos) 1. Objetivos: Identificar por mtodos colorimtricos cualitativos los principales monosacridos, disacridos y polisacridos. 2. Introduccin Loscarbohidratosestndistribuidosampliamenteenvegetalesyanimalesenloscualestiene participacinestructural,funcionalymetablica.Loscarbohidratosseclasificandependiendodel nmerodetomosdecarbonoqueposeeylafuncinaldehdicaocetonia,estasasuvezle confiere la base para la mayora de las reacciones usadas parasu identificacin y cuantificacin. Cuandoelcarbohidratoestformadoporunasolamolculadecarbohidrato,sedenomina monosacrido, por dos, disacrido y por ms de dos, polisacrido. Losdisacridossonazucaresformadosporlaunindedosmonosacridosmedianteelenlace glucosdico.Siesteenlaceseefectaentredoscarbonosanomricos,eldisacridonotendrel potencial aldehdo o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participacindeestosgrupos,recibiendoelnombredeazcarnoreductor,lasacarosayla trealosasonejemplosdelosdisacridosnoreductores(veranexos).Todoslosdisacridosque poseanuncarbonoanomricolibre,darnpositivasestasreacciones,llamndoseazucares reductores,debidoaquepromuevenlareduccindelreactivousadoyellosmismosseoxidan. Aunquelamayoradelosdisacridoscarecendeimportanciaparaelhombre,conalgunas excepcionescomolasacarosa,suestudiosedebeaquedisacridoscomolamaltosayla celubiosa, se originan como producto de la hidrlisis de polisacridos, la maltosa, por ejemplo, es elproductodelahidrlisisdelglucgenoyelalmidn.Lospolisacridos,sisonabundantesy representan para el hombre la principal fuente de energa metablica de fcil aprovechamiento, el almidn,constituidoporsolomolculasdeglucosaessinlugaradudaslabasealimenticiadel globo terrestre, especialmente en la poblacin de bajos recursos.En el anexo, se muestran las estructuras de los principales mono, di y polisacridos. 3. Material y Metdos A.- Prueba de MolishEsunareaccingeneralparacarbohidratosquecontienenmsde5tomosdecarbono,la reaccin se muestra en la siguiente figura: Fig. 1: Reaccin de Molish B.- Prueba de Barfoed:Es una reaccin para identificar monosacridos, aunque algunos disacridos (los reductores)dan positiva la reaccin, pero con mas tiempo de calentamiento, ya que as se hidroliza el disacrido. El fundamento radica en la reduccin del acetato cprico a oxido cuproso. C.- Prueba de Bial o de Orcinol-HClEsunapruebaespecficaparapentosaslacualsemuestraenlafigura2.Lapositividadse reconoce por la formacin de una coloracin verde botella brillante. Fig. 2: Reaccin de Bial D.- Prueba de Seliwanoff:Esespecificaparacetosasquecontengan5omstomosdecarbono,peroseusacasi exclusivamente para identificar fructosa. La reaccin se presenta en la figura 3. Fig. 3: Reaccin de Seliwanoff E.- Prueba de Lugol:Esunapruebaqueseusaparaidentificaralmidn.Elcolorazul,sedebe,posiblementeala formacin de un complejo: Ioduro de almidn.G.- Prueba de Benedict:Es una prueba especfica para las sustancias reductoras con grupos carbonilos libres. Fig. 4 Reaccin de la prueba de Benedict cualitativo H.- Prueba Fenilhidrazina Es una prueba para distinguir asas (y oligosacridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en sustomosdecarbono1y/o2darnlamismaosazona,comoeselcasodelaglucosayla fructosa, que son isomeros de funcin. La figura 5 muestra la reaccin. Fig. 5 Reaccin de la prueba de Fenilhidrazina Procedimiento: Materiales Tubos de ensayo, mechero, pinzas de madera PruebaProcedimiento: En un tubo de ensayo colocar:Volumen de MolishSustancia problema1 ml Reactivo de molish:2 gotas MEZCLAR Agregar H2SO4 concentrado Dejarcaerlentamenteporlasparedesdeltuboelcido.La aparicindeunanillovioleta-rojizoenelsitiodecontactodelos dos lquidos indica que la muestra contiene carbohidratos. 0.50 ml de BarfoedSustancia problema1 ml Reactivo de Barfoed:2.5 ml Mezclar y calentar en bao de agua hirviente, contando los minutos ysacradelbaocadatuboinmediatamentedespusquehaya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparicin de un precipitado rojo antes de los 6 minutos indica la presenciadeunmonosacrido.Laaparicindeunescaso precipitadorojo,entrelos9y12minutosindicalapresenciade LACTOSA o MALTOSA. de BialSustancia problema1 ml Reactivo de Bial:1.5 ml MEZCLAR Llevar a bao mara hirviente durante 3 minutos. La aparicin de un colorverdebotella,brillanteytotalmentetransparenteindicala presencia de una PENTOSA. Algunos azucares dan con el Bial una coloracin verde, pero sta es opaca. de SeliwanoffSustancia problema1 ml Reactivo de Seliwanoff:2 ml Llevar a bao mara hirviente durante 10 minutos. La formacin de un color rojo cereza indica la presencia de FRUCTOSA. de LugolSustancia problema2 ml Reactivo de Lugol:1 gota Mezclaryobservar.Laaparicindeunacoloracinazulindicala presenciadelALMIDONyunacoloracinrojaindicael GLUCOGENOoEritrodextrina.Sielcolornocambia,el carbohidrato es un monosacrido o un disacrido. de BenedictSustancia problema0.5 ml Reactivo de Benedict cualitativo:2 ml MEZCLAR Llevarabaomarahirvientepor5minutos.Laaparicindeun precipitadoverde,amarilloorojoindicalapresenciadeun AZUCAR REDUCTOR. FenilhidrazinaSustancia problema2 ml Reactivo de Fenilhidrazina:5 ml MEZCLAR BIEN ColoquelostubosenaguadebaoMarahirviendodurante10 minutos.Al finaldelperiododecalentamiento,enfrelostubosen chorro de agua. DEJAR EN REPOSO POR 5 MINUTOS Examinar al microscopio la forma caracterstica de los cristales de osazona colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando daar loscristales con movimientos bruscos o exceso de muestra. Marcha analtica para monosacridos, disacridos y polisacridos INFORME RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS 1. Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. En la casilla N Muestra, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para reportarlapositividadonegatividaddelareaccin.Sobrelabasedelosresultadosdesus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema. NMuestraMolishBarfoedBialSeliwanoffLugolBenedict 1 2 ANEXO 1.- REPRESENTACIN DE FISCHER DE MONOSACRIDOS Representacin de Fischer de los monosacridos ms frecuentes en la naturaleza: 2.- REPRESENTACIN DE HAWORTH Representacin en estructuras de Haworth: 3.-DISACRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO. Disacridos ms importantes:

4.- ANMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIN EN SILLA Laboratorio 10: FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS (Sacharomyces cereviceae) Fundamento: Laglucosaesuncarbohidratofermentableporlaslevaduras.Lafermentacinalcohlicaesun procesoanaerbicorealizadoporlaslevadurasyalgunasclasesdebacterias.Estos microorganismostransformanlaglucosaenalcoholetlicoydixidodecarbono.La fermentacin alcohlica,comienzadespusdequelaglucosaentraenla clula.Laglucosasedegradahasta cido pirvico, en el proceso denominado gluclisis. Este cido pirvico se convierte luego en CO2 y etanol. Losseres humanoshanaprovechado este procesopara hacer pan, cerveza, y vino. En estostresproductosseempleaelmismomicroorganismoqueeslalevaduracomnoSaccharomyces cerevisae. Reactivos: Solucin de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de Benedict. Levadura de panadero seca activa. Procedimiento 1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. agregar 10 ml de la solucin de glucosa y aadir0.3 g (la puntadeunaesptula)delevadura.Agitarhastaquelamezclaseahomognea.Incubea37 grados. Realizar la prueba de Benedict a esa mezcla a: los 30 min., y a la hora y media de incubacin. 2.- Para verificar que la solucin de glucosa es un azcar reductor, realice una prueba de Benedict a la solucin de glucosa. 3.-Paraverificarquelalevaduranocontieneningnazcarreductor,realizarunblancode reaccin (control) de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una esptula) de levadura con 10 ml de agua destilada.Efecte una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solucin de levadura. Nota: La prueba de Benedict se efecta de la siguiente manera: 1.- Pipetear 0.5 ml. de la solucin problema en un tubo de ensayo2.- Aadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. 3.- Calentar en bao de agua hirviente durante 3 min. Si la muestra cambi de color azul a rojo ladrillo, hay presencia de azcares reductores. Laboratorio 11 Determinacin de Glicemia 1.Objetivo:Determinarlaconcentracindeglucosasangunea(Glicemia)enunamuestrade Sangre. 2. Introduccin: Laglucosaeselprincipalmonosacridodelorganismoyconstituyeunmetabolitoque aporta energa vital para las funciones celulares. El catabolismo de la glucosa se realiza durante la gliclisis.Sudeterminacinensangreestilparaeldiagnsticoymonitoreodetrastornosenel metabolismo de los hidratos de carbono, como la Diabetes Mellitus, hipoglicemias, tumores de los islotes pancreticos y otras patologas. 3. MATERIAL Y METODOS: - Gluco tester - Lancetas - Tiras reactivas para determinacin Glucosa en sangre - Algodn (trulas) - Alcohol 70% - Guantes desechables - Actividades : Determinacindeglicemia.Seutilizaruninstrumentoparaladeterminacinenzimticadela concentracin de glucosa en una muestra de Sangre Discuta los resultados obtenidos y realice un informe, pudiendo considerar el anexo proporcionado a continuacin: ANEXO: METABOLISMO GLUCIDICO La glicemia normalmente se encuentra en el rango de 70 110 mg/dL. Normalmente una glicemia en ayunas superior a 126 mg/dl es francamente sospechosa de diabetes Mellitus. Pueden encontrarse hiperglicemias severas (400 mg/dl). r LaprincipalcausadehiperglicemiaeslaDiabetesMellitus,unaenfermedadendocrina altamenteprevalenteennuestropas,afectandoauna5%delapoblacin. Sinembargopueden existir otras causas de hiperglicemia. OtrascausasdeHiperglicemia:Hipofisiarias,suprarrenales,tiroideas,infeccinaguda, encefalopata, txicos, infarto miocardio, pancreatitis aguda, diabetes gestacional. CausasdeHipoglicemia:Esfuerzosmuscularesagotadores,hiperinsulismo,tratamiento insulnico, insuficiencia suprarrenal, hipotiroidismo, afecciones hepticas, trastornos de la nutricin y digestivos, afecciones nerviosas, alcoholismo agudo. Cualquieralteracinmetablicarelacionadaconlaglicemiapuedeasociarsealaalteracinde otrosanalitoscomo:hemoglobinaglicosilada,insulina,glucagn,pptidoC,glucosuria (concentracin de glucosa en orina),proteinuria, albuminuria, etc. INSULINA:Hormonaproducidaporelpncreasqueesesencialparalautilizacindelaglucosa porlaclula.Estahormonaseencuentraenconcentracionesnormalesenelplasmaentre25 U/mL.Encondicionespatolgicascomolaobesidadyenlosdiabticosobesosadultos,la insulinemiabasalsueleseraltayluegodelaadministracindeglucosasuaumentoestardoy alcanzacifrassuperioresalonormal(250U/mLoms).Enladiabetesjuvenilseobservauna disminucindeinsulinaenayunas,perosobretodounafaltaderespuestadesecrecindeinsulina frente a la ingesta de glucosa. PEPTIDOC:Lainsulinaesunaprotenaquesesecretacomounapro-hormona.Enelplasma sufre una hidrlisis que conduce a la hormona activa ms un pptido denominado PPTIDO C, el cual tiene una vida media biolgica superior a la de la insulina. La determinacin de este pptido es tilparadeterminarlaactividadsecretoradelasclulasbetadelpncreas,anenlosenfermos tratadosconinsulinaesunndiceindirectodelasecrecindeinsulinaendgenaresidualdel paciente diabtico. Valores ayuno:2,10 ng/mL Post-prandial:4,2 ng/mL HEMOGLOBINA GLICOSILADA HbA1c: Los prolongados estados de hiperglicemia que presentan lospacientesdiabticos,conducenalaglicacinno-enzimticadelasprotenas.Unaprotena susceptible a glicarse es la hemoglobina, cuya vida media es de 120 das, por lo tanto, la glicacin de la hemoglobina indica que el paciente no ha tenido un buen control de su glicemiadurante los 120 das previos a la evaluacin de este parmetro. Enotras palabras es una forma indirecta de evaluar la glicemia promedio de los 2 a 3 meses previos Valores referencia: 6.2% a 8.2% PROTEINURIA:Lospacientesdiabticossuelenpresentarduranteelcursodesupatologa,la denominadaNefropatadiabtica,queesuntipodeinsuficienciarenal.Laproteinuriao concentracin de protenas en la orina es un buen indicador de la funcin del rin. Normalmente laexcrecindeprotenasporlaorinapuedealcanzarunos200mg/24horaso20mg/dL.Las protenasqueencondicionesnormalesaparecenenlaorinason:laprotenadeTamm-Horsfall (40-70mg)ylaalbmina(10-20mg).Rangossuperioresa20mg/dlrequierenexploracin adicional y cifras superiores a 250 mg/24 requieren exploracin uronefrolgica. . Sobre 1000-2000 mg/24 hay que sospechar de insuficiencia renal avanzada. MICROALBUMINURIA:Lamicroalbuminuriasedefinecomopequeascantidadesdealbmina quesonexcretadasenlaorina,porsobrelosnivelesconsideradosnormales.Estosvalores puedenocurrirentre30a300mg/24hr.,cifrassuperioressonconsideradascomo macroalbuminuria y se asocian a insuficiencia renal severa. La nefropata en la diabetes insulino dependientepuedeserreconocidaensusfasesinicialesatravsdelapesquisadela microalbuminuria.AdemsdeladiabetesMellitus,laHipertensinArterialesotracondicinque puede conducir a microalbuminuria. La microalbuminuria es considerada como un marcador precoz de dao renal. Valores normales: hasta 10 mg/L NOTA Emia:sufijoconelcualsedenominalaconcentracindeundeterminadoanalitoenelsueroo plasma Uria : sufijo con el cual se denomina la concentracin de un determinado analito en laorina. Procedimiento: Se entregar con anticipacin el protocolo del Kit a utilizar para este procedimiento. Laboratorio 12: Reconocimiento de Lpidos 1. Objetivos: Identificar por mtodos cualitativos las caractersticas de los lpidos. 2. Introduccin: Los lpidos son un grupo heterogneo de sustancias que se encuentran tanto en animales como en vegetales.Desdeelpuntodevistanutritivo,constituyenunadelasreservasenergticasms importantesdelosseresvivos.Ademsdelafuncinenergticacumplenotrasfuncionesenel organismo: estructural, aislante trmico y regulador del metabolismo. Lasgrasaylosaceitessoninsolublesenaguaperosolublesendisolventesorgnicoscomo benceno, ter, gasolina o acetona. Clasificacin de lpidosLoslpidospuedenclasificarsedeacuerdoasuestructuraqumica,aquellosquepresentan enlacessterypuedenserhidrolizados,talescomoceras,glicridossedenominanlpidos hidrolizablesylosquenopresentanenlacesster,denominadosnohidrolizablesenlosquese encuentran los esteroles, esteroides, terpenos y terpenoides. Los lpidos hidrolizables, se clasifican en: lpidos simples, compuestos, los lpidos no hidrolizables se clasifican en isoprenoides y esteroides. Loslpidosseclasificanendependenciadelasreaccionesqumicasqueexperimentan,deesta manera aquellos que reaccionan condisolucin de NaOH al 40%, originando sales, se denominan lpidossaponificables,ylosquenoexperimentanestetipodereaccinseconsideranlpidosno saponificables. LosLpidossepuedenclasificarendependenciadelasfuncionesquerealizaenlosorganismos vivos,encontrandoenlanaturalezaaquellosquerealizanlafuncindereservaylpidos citoplasmticos (presentes en orgnulos celulares, mitocondrias y membrana celular). Loslpidostambinseclasifican considerandosiaportancidosgrasosquenosonsintetizados porlosorganismosanimales,losquerecibenelnombredeesenciales;ylosnoesencialesson producidos por el metabolismo animal no necesitan ser ingeridos, son producto del metabolismo. Saponificacin Es una reaccin tpica de los cidos grasos, en la cual reaccionan con lcalis o bases y dan lugar a una sal de cido graso que se denomina jabn. La formacin de jabones favorece la solubilidad y la formacin de micelas de cidos grasos. Laclasificacindeloslpidossepuedehaceratendiendoalcriteriodesiproducenonoesta reaccin y as se habla de lpidos saponificables y no saponificables. 3. MATERIAL Y METODOS: - Tubos de ensayo - Gradilla - Varillas de vidrio - Mechero o bao mara - Vasos de precipitados - Pipetas - Solucin de NaOH al 20% - Solucin de Sudn III - Tinta china roja - Cloroformo - Aceite comn SAPONIFICACIN:Lasgrasasreaccionanencalienteconelhidrxidosdicoopotsico descomponindoseenlosdoselementosquelasintegran:glicerinaycidosgrasos.stosse combinan con los iones sodio o potasio del hidrxido para dar jabones, que son en consecuencia lassalessdicasopotsicasdeloscidosgrasos.Enlosseresvivos,lahidrlisisdelos triglicridosserealizamediantelaaccindeenzimasespecficos(lipasas)quedanlugarala formacin de cidos grasos y glicerina. Procedimiento: - Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%. - Agitar enrgicamente y colocar el tubo al bao Mara de 20 a 30 minutos. - Pasadoestetiempo,sepuedenobservareneltubo3fases:unainferiorclaraquecontienela solucindesosasobrantejuntoconlaglicerinaformada,otraintermediasemislidaqueesel jabn formado y una superior lipdica de aceite inalterado. TINCIN: Los lpidos se colorean selectivamente de rojo -anaranjado con el colorante Sudn III. Procedimiento: - Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite. - Aadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solucin alcohlica de Sudn III. - Al otro tubo aadir 4-5 gotas de tinta roja. - Agitar ambos tubos y dejar reposar. - Observarlosresultados:eneltuboconSudnIIItodoelaceitetienequeaparecerteido, mientras que en el tubo con tinta, sta se ir al fondo y el aceite no estar teido. SOLUBILIDAD:Loslpidossoninsolublesenagua.Cuandoseagitanfuertementeenellase dividenenpequesimasgotasformandounaemulsindeaspectolechoso,queestransitoria, puesdesapareceenreposoporreagrupacindelasgotitasdegrasaenunacapaque,porsu menor densidad, se sita sobre el agua. Porelcontrario,lasgrasassonsolublesendisolventesorgnicos,comoelter,cloroformo, acetona, benceno, etc. Procedimiento: - Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo. - Aadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de cloroformo u otro disolvente orgnico, - Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar. - Observar los resultados: Se ver cmo el aceite se ha disuelto en el ter y, en cambio no lo hace en el agua y el aceite subir debido a su menor densidad. Observe y anote sus resultados Laboratorio 13: Determinacin de Colesterol 1. Objetivos: Determinar colesterol en una muestra de sangre 2. Introduccin: El Perfil lipdicoconsta de la determinacin de Colesterol Total, triglicridos y colesterol-HDL. Adicionalmente, con estos parmetros se puede calcular el colesterol de LDL. ElColesterolesunamolculadenaturalezaesteroidalconungrupohidroxilosecundarioenla posicin C3. Se sintetiza principalmente en el hgado y se absorbe aquel que proviene de la dieta. Se estima que aproximadamente tres cuartos de colesterol se forman por neo sntesis y una cuarta parte proviene de la dieta. Lostriglicridossonsteresdeglicerol,unalcohol trivalentecontrescidosgrasosdecadena larga.Unapartedeellosseingiereporladietaysetransportaatravsdelosquilomicrones (triglicridosexgenos).Elhgadoademssintetizatriglicridos,loscualessontransportadosa travs de la VLDL (triglicridos endgenos). El colesterol de HDL o lipoprotenas de alta densidad representa el transporte de colesterol desde los tejidos perifricos hacia el hgado, para su posterior excrecin por la va biliar. Este proceso de denomina,transportereversodecolesterol,unarutaesencialmenteantiaterognica.Valores elevados de HDL protegen contra las cardiopatas coronarias, mientras que valores disminuidos de HDL,especialmenteencombinacincontriglicridoselevadosseasocianaunelevadoriesgo cardiovascular. ElcolesteroldeLDLolipoprotenadebajadensidadesprovenientedelcatabolismodelas VLDL(lipoprotenademuybajadensidad)yconstituyeunafuentedeaportedecolesterolpara ciertosrequerimientoscelularescomoson:lasntesisdemembranas,sntesisdehormonas esteroidales, sntesis de cidos biliares y sntesis de vitamina D. Ladeterminacindelperfillipdicosirveparaelscreeningdelriesgoaterognicodeun determinado paciente. 3. MATERIAL Y METODOS: - Kit Para medicin de Colesterol y LDL - Muestra de Suero - Guantes desechables -4. Procedimiento: Se les entregar el Protocolo del Kit a utilizar con anticipacin.