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ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES

POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana

(MELASTOMATACEAE)

TRABAJO DE GRADO

Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico

Presentado por:

NATALIA CARDONA CLAVIJO

MELINA SALAZAR OSORIO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

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Pereira, Noviembre de 2012

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(MELASTOMATACEAE)

TRABAJO DE GRADO

Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico

Presentado por:



Director

FRANCISCO JAVIER JIMÉNEZ GONZÁLEZ

Asesor

Esp. Microbiología Industrial JOSÉ RAFAEL RODRÍGUEZ

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE QUÍMICA

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Pereira, Noviembre de 2012

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NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO



(MELASTOMATACEAE)

Presentado por:



El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la

versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de:

______________________

Con la connotación: ______________________

Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy

_____________________________

El director: _________________________________

Francisco Javier Jiménez González

Jurado: _______________________________

Dr. Oscar Marino Mosquera

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DEDICATORIA

No me alcanzaría la vida para agradecer a mis padres por su apoyo incondicional

durante todo este tiempo, por su amor, y por su esfuerzo para que culminara esta etapa

en mi vida. Gracias por confiar en mí y por enseñarme hacer mejor persona cada día

¡LOS AMO!

A mi hermana, mi novio y las personas más allegadas a mí por apoyarme en los

momentos en que estuve a punto de desfallecer y alentarme para que saliera adelante

¡MUCHAS GRACIAS POR ESTAR A MI LADO!

A mi abuelita que aunque ya no está conmigo fue uno de mis motivos para seguir

adelante ¡SIEMPRE ESTARAS EN MI CORAZÓN!


A Dios, que es el gran motor de mi vida, lo más grande y sublime, lo inentendible e

inalcanzable, el mejor químico que me ha iluminado incondicionalmente.

A mi madre Liliana Osorio, quien me ha brindado el mejor ejemplo para ser una mujer

virtuosa, por sus consejos de aliento y por tantas noches de insomnio a mi lado. A mi

padre José Fernando Salazar, por siempre brindarme su apoyo e inculcarme el amor de

Dios, a mi abuela Nubia Ramírez, por alimentarme con el amor más puro que pueda

existir y por enseñarme con dulzura lo que significa la palabra disciplina.

A toda mi familia, por la cual siento un gran orgullo y agradecimiento, aquí incluyo a mi

amigo del alma Jhon Fredy Sánchez, por todos los momentos que vivimos juntos.

Y a Natalia Cardona, por ser una excelente compañera y apoyarme cuando más la

necesite.


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5

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar agradecemos a Dios por darnos la oportunidad de estudiar,

acompañarnos en este camino y poder lograr esta meta.

A nuestro director el profesor Francisco Javier Jiménez por su dedicación, apoyo y

asesoría en la realización de este proyecto.

A todos los profesores de la Escuela de Tecnología Química que contribuyeron a nuestra

formación académica y personal.

Por último al grupo Polifenoles por darnos la oportunidad de desarrollar este trabajo en

sus instalaciones y prestarnos todos sus servicios.

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6

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

RESUMEN ...................................................................................................................... 13

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 15

1. ANTECEDENTES ...................................................................................................... 17

1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 20

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................... 21

1.3 OBJETIVOS .......................................................................................................... 21

1.3.1 Objetivo general .............................................................................................. 21

1.3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 21

1.4 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 22

2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 23

2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae ................................... 23

2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae ............................................... 23

2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie

Henriettella trachyphylla ............................................................................................. 24

2.2.1 Henriettella Naudin ......................................................................................... 24

2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana. .................................................................... 25

2.3 Aleloquímicos ........................................................................................................ 25

2.3.2 Germinación .................................................................................................... 27

2.4 Actividad antibacteriana ......................................................................................... 29

2.4.1 Descripción de bacterias empleadas ................................................................ 29

2.4.2 Descripción de antibióticos empleados ........................................................... 31

2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ............................................... 32

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL ..................................................................................... 34

3.1 Materiales y reactivos ............................................................................................ 34

3.2 Disolventes ............................................................................................................. 34

3.3 Equipos ................................................................................................................... 34

3.4 Material vegetal ...................................................................................................... 34

3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate ....................... 36

3.5.1 Semillas ........................................................................................................... 36

3.5.2 Agua pretratada ............................................................................................... 36

3.5.3 Lavado ............................................................................................................. 36

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3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate ................................ 37

3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C, F1-

D y F1-F ....................................................................................................................... 39

3.6.1 Esterilización de las semillas ........................................................................... 39

3.6.2 Preparación de las fracciones .......................................................................... 39

3.6.3 Germinación .................................................................................................... 39

3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico ................................................................ 39

3.7 Actividad antibacteriana ......................................................................................... 40

3.7.1 Microorganismos ............................................................................................. 40

3.7.2 Antibiograma ................................................................................................... 40

3.7.3 Ensayo de actividad antibacteriana de las fracciones polares ......................... 40

3.7.4 Medio de cultivo .............................................................................................. 40

3.7.5 Preparación del inoculo ................................................................................... 40

3.7.6 Controles .......................................................................................................... 41

3.7.7 Preparación de antibióticos estándar ............................................................... 41

3.7.8 Preparación de las fracciones .......................................................................... 41

3.7.9 Evaluación de la actividad inhibitoria ............................................................. 42

3.8 Pruebas de caracterización para flavonoides .......................................................... 45

3.8.1 Prueba de cloruro férrico ................................................................................. 45

3.8.2 Prueba con acetato de plomo ........................................................................... 45

3.8.3 Prueba de Shinoda ........................................................................................... 46

3.8.4 Prueba con gelatina–sal ................................................................................... 46

3.8.5 Prueba de taninos hidrolizables ....................................................................... 47

3.8.6 Prueba de taninos condensados ....................................................................... 48

3.9 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................. 49

3.9.1 Análisis por cromatografía de capa delgada (CCD) ........................................ 49

3.9.2 Análisis por espectroscopía UV ...................................................................... 49

3.9.3 Separación cromatográfica en columna de la fracción F1-F ........................... 49

3.9.4 Cromatografía Preparativa ............................................................................... 50

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 51

4.1 Ensayo de germinación para semillas de lechuga y tomate ................................... 51

4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C, F1-

D y F1-F. ...................................................................................................................... 53

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8

4.3 Evaluación de la actividad antibacteriana .............................................................. 56

4.4 Pruebas de caracterización química ...................................................................... 58

4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F ............. 59

4.5.1 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 260 nm ....... 59

4.5.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 330 nm ....... 60

4.5.3. Análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) ....................................... 61

4.5.4 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides 61

4.6 Separación cromatografía en columna de la fracción F-1 F .................................. 63

4.7 Análisis de espectros de RMN 1H, 13C y HSQC .. ¡Error! Marcador no definido.

5. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 72

RECOMENDACIONES .................................................................................................. 78

ANEXOS ......................................................................................................................... 79

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9

Índice de Tablas

Pág.

Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C……………………….……………54

Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D.……………………….…...………55

Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F……………………………….……55

Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana……………………………………...……57

Tabla 5. Pruebas para caracterización química………………………………...……….58

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10

Índice de Figuras

Pág.

Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas. 18

Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis ........................................................... 25

Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006). ............. 28

Figura 4. Escherichia coli ................................................................................................ 30

Figura 5. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 30

Figura 6. Amoxicilina ...................................................................................................... 31

Figura 7. Ampicilina ........................................................................................................ 32

Figura 8. Equipo HPLC ................................................................................................... 33

Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et

al., 2005). ......................................................................................................................... 36

Figura 10. Lavado de semillas ......................................................................................... 37

Figura 11. Germinación de semillas en agua ................................................................... 37

Figura 12. Germinación de semillas en DMSO ............................................................... 38

Figura 13. Control con glifosato ...................................................................................... 38

Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga ............................................................ 39

Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos ............................................... 41

Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones ................................................. 42

Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad ........................................................... 43

Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos .................................... 44

Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición. ............................................... 45

Figura 20. Reacción de cloruro férrico ............................................................................ 45

Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo .................................................. 46

Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y

magnesio .......................................................................................................................... 46

Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal .......................................................... 47

Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable ............................. 47

Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados ............................................... 48

Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F ............................................. 50

Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua ............................................... 51

Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua .................................................. 52

Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato .......................................... 52

Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C .......................................... 54

Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D .......................................... 54

Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F ........................................... 55

Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba ................... 57

Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm ......................................................... 59

Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm ......................................................... 59

Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm ......................................................... 59

Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm ......................................................... 60

Figura 38. Cromatograma fracción F1-D a 330 nm ......................................................... 60

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11

Figura 39. Cromatograma fracción F1-F a 330 nm ......................................................... 60

Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH

(6:4) .................................................................................................................................. 61

Figura 41. Espectro fracción F1-C en MeOH .................................................................. 62

Figura 42. Espectro fracción F1-D en MeOH .................................................................. 62

Figura 43. Espectro fracción ............................................................................................ 62

Figura 44. Espectro fracción F1-C con CH3ONa ............................................................ 62

Figura 45. Espectro fracción F1-D con CH3ONa ............................................................ 62

Figura 46. Espectro fracción F1-F con CH3ONa ............................................................. 62

Figura 47. Espectro fracción F1-C con CH3COONa ....................................................... 62

Figura 48. Espectro fracción F1-D con CH3COONa ....................................................... 62

Figura 49. Espectro fracción F1-F con CH3COONa ....................................................... 62

Figura 50. Espectro fracción F1-C con AlCl3 .................................................................. 63

Figura 51. Espectro fracción F1-D con AlCl3 .................................................................. 63

Figura 52. Espectro fracción F1-F con AlCl3 .................................................................. 63

Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la

fracción F1-F .................................................................................................................... 63


fracción F1-F .................................................................................................................... 64


fracción F1-F .................................................................................................................... 64

Figura 56. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F1 ....................................... 65

Figura 57.Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F2 ......................................... 65

Figura 58. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F3 ........................................ 65

Figura 59. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F4 ....................................... 66




Figura 63. Porcentaje de rendimiento de las fracciones F1-F1 hasta F1-F7 .................... 67

Figura 64. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F3 ...................................................... 68

Figura 65. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F4 ...................................................... 68

Figura 66 Cromatoplaca preparativa fracción F1-F5 ....................................................... 69

Figura 67. Cromatoplaca de la fracción F1-F3 ............................................................... 69

Figura 68. Cromatoplaca de la fracción F1-F4 ............................................................... 70

Figura 69. Cromatoplacas de la fracción F1-F5 ............................................................. 70

Figura 70. Cromatoplaca revelada con luz UV a de 254 nm de la fracción F1-F5 ...... 70

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12

Índice de Anexos

Pág.

ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga. ......................... 79

ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate ........................... 87

ANEXO 3. Antibiograma ................................................................................................ 95

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13

RESUMEN

En este estudio, fueron evaluadas la actividad alelopática y antibacteriana de las

fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana.,

pertenecientes a la familia melastomataceae frente a semillas de lechuga (Lactuca sativa

L.) y cepas de las bacterias Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922) y

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

La fracción F1-F se separó en columna cromatográfica empacada sobre Toyopearl HW-

40C, utilizando como fase móvil isopropanol - agua- metanol en diferentes

proporciones. Obteniéndose siete fracciones, las cuales fueron monitoreadas por TLC en

fase reversa, y nombradas como F1-F1 hasta F1-F7.

La fracción F1-F5 mostró bandas características de color azul, las cuales fueron

recogidas por placa preparativa sobre sílicagel en fase reversa, siendo nombradas como

F1-F5-A hasta F1-F5-G. Las fracciones F1-F5-D, F1-F5-F y F1-F5-G fueron purificadas

y llevadas a análisis por CG/EM y RMN de protón para su posterior determinación

estructural.

La actividad alelopática frente a la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa

L.) de la fracción F1-C presentó a una concentración de 0,05 mg/mL un porcentaje de

germinación (75,56%), la fracción F1-D a una concentración de 0,8 mg/mL obtuvo un

porcentaje de germinación (31,11%), y la fracción F1-F a una concentración de 0,8

mg/mL obtuvo el mayor valor (44,44%) de germinación, lo que sugiere que esta fracción

puede actuar mejor como agente promotor de germinación mientras que F1-D inhibe la

germinación de las semillas. Esta evaluación se presentó a las 36 horas de iniciado el

ensayo.

En la evaluación de la actividad antibacteriana realizada a las fracciones F1-C, F1-D,

F1-F, no presentó inhibición frente al crecimiento de E. coli y P. aeruginosa a las

concentraciones de 1000, 500, 250, 125 y 62,5 mg/mL.

Palabras clave: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa,

Pseudomonas aeruginosa.

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14

ABSTRACT

In this study, were evaluated allelopathic and antibacterial activity of polar fractions F1-

C, F1-D and F1-F obtained from Henriettella trachyphylla Triana, belonging to

melastomataceous family against lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds and Gram negative

strain bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC

27853), respectively.

F1-F fraction was separated on chromatography column packed with Toyopearl HW-

40C, obtained seven fractions, which were monitored by reverse phase plate TLC,

namely as F1-F1 to F1-F7.

F1-F5 fraction showed blue color spots, which were collected after separated by

preparative plate on silice gel reverse phase, namely as F1-F5-A to F1-F5-G. F1-F5-E,

F1-F5-F and F1-F5-G fractions were purified and carried to GC/MS and proton-carbon

NMR structural determination.

Allelopathic activity against to lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds germination from F1-C

fractions presented percentage germination (75,56%) to 0,05 mg/mL concentration, F1-

D fraction presented germination percentage (31,11%) to 0,8 mg/mL concentration, and

the F1-F fraction at a concentration of 0.8 mg/mL had the lowest value (44.44%) of

germination, which suggests that this fraction can act better as promotor agent. This

assay was presented at 36 hours into the test.

The evaluation of the antibacterial activity F1-C, F1-D and F1-F fractions weren´t

showed inhibition against the growth of E. coli and P. aeruginosa to 1000, 500, 250, 125

and 62.5 mg/mL concentrations.

Keywords: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa, Pseudomonas

aeruginosa.

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15

INTRODUCCIÓN

Este estudio se centra en la evaluación de la actividad alelopática y antibacteriana

de fracciones polares obtenidas a partir del extracto en i-PrOH-agua (65:35) de

Henriettella trachyphylla Triana., especie perteneciente a la familia melastomataceae.

La alelopatía en su definición más tradicional, postulada por Rice, descrita como

“cualquier efecto directo o indirecto causado por una planta (incluyendo

microrganismos) sobre otras a través de la producción de compuestos químicos que se

escapan al medio ambiente” (Macías et al., 2009). Con el ánimo de englobar otras

interacciones, se ha orientado una definición más amplia, como ha sido la desarrollada

por la IAS (Sociedad Internacional de Alelopatía) en 1996, como “cualquier proceso que

involucre metabolitos secundarios producidos por plantas, algas, bacterias y hongos, que

influyan en el crecimiento y desarrollo de sistemas agrícolas y biológicos, tanto con

efectos positivos como negativos”.

En la parte experimental de este trabajo se llevó a cabo la actividad germinativa,

utilizando semillas de lechuga (lactuca sativa L) como una especie receptora. Esta

actividad germinativa se determina por la emergencia y el desarrollo de las estructuras

esenciales del embrión, manifestándose su capacidad de dar origen a una plántula

normal, bajo condiciones ambientales favorables.

Durante las últimas décadas, muchas investigaciones que se han realizado han

conllevado a explorar el potencial alelopático en cultivos y otras plantas, para controlar

las malas hierbas. Por ejemplo, Dzyubenko y Petrenko en 1971, encontraron que las

secreciones de raíces de maíz (Zea mays L.) inhiben el crecimiento de Chenopodium

album L., mientras Cheema et al. En 1988, demostró que los extractos acuosos de paja

de trigo inhiben significativamente la germinación y el crecimiento de correhuela ó

cahiruela (Convolvulus arvensis L.) (Javaid et al., 2006). Además, con esta actividad se

ha demostrado que gran variedad de plantas poseen efectos inhibitorios sobre el

crecimiento y la población de otras plantas vecinas o de sucesión por la liberación de

sustancias alelopáticas en el suelo, ya sea como exudados de tejidos de plantas vivas o

por descomposición de los residuos vegetales (Kato-Noguchi y Macías, 2005).

En la parte experimental se utilizaron semillas de lechuga (Lactuca Sativa L.), usadas

como material de bioensayo, para evaluar la actividad germinativa de las fracciones

polares.

La actividad antibacteriana se define como la actividad in vitro de un antibiótico frente

a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de

una bacteria o población bacteriana (Niño et al., 2006).

La permanencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas resistentes

es un problema de salud a nivel mundial. Las cepas patógenas resistentes han surgido

principalmente en los hospitales a consecuencia de varios factores, como son el amplio

uso de antibióticos, las dosis utilizadas, el tiempo de tratamiento, la eliminación de la

mitad de la droga que no se alcanza a metabolizar en su totalidad, otros elementos que

influyen son las altas posibilidades de transmisión o contagio y el estado

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16

inmunocomprometido de los pacientes que los hace susceptibles a infecciones con

patógenos oportunistas (Luján, 2006).

Las opciones de agentes antimicrobianos utilizadas en las terapias para el tratamiento de

las enfermedades infecciosas causadas por las bacterias con resistencia múltiple están

por lo tanto seriamente limitadas. Las compañías farmacéuticas están buscando drogas

alternativas de otras fuentes incluyendo las plantas y los animales. Las plantas

medicinales son consideradas como una fuente potencial de nuevas drogas

quimioterapéuticas debido a su contenido de fitoquímicos y a su poco o nulo efecto

tóxico. Ciertamente, las plantas poseen un enorme y desconocido reservorio de

sustancias derivado de sus sistemas de defensa en contra de microorganismos, insectos

y herbívoros. Aunque se han identificado algunas sustancias simples como fenoles,

derivados de los fenoles (quinonas, flavonas, flavonoides, flavonoles, taninos y

cumarinas, terpenoides, aceites esenciales, alcaloides lectinas y polipéptidos. Uno de los

mecanismos para la inducción de la resistencia es la presión selectiva a la que se

someten las bacterias, pero como el uso de extractos vegetales a nivel hospitalario es

limitado, las bacterias no han desarrollado mecanismos de resistencia en su contra.

Siendo esto posible que los extractos pueden inhibir el crecimiento de cepas con

resistencia múltiple (Luján, 2006).

Por lo anterior se busca valorar la actividad antimicrobiana in vitro de las fracciones

polares F1-C, F1-D, F1-F contra cepas Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922)

y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

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17

1. ANTECEDENTES

En los últimos años la actividad alelopática se ha presentado como una alternativa viable

para incrementar los niveles de producción por cosecha y prevenir el uso indiscriminado

de herbicidas sintéticos, los cuales generan costos elevados en la producción y conllevan

a problemas de contaminación por residuos de los mismos en el producto recolectado, o

como en otras ocasiones contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas

de actividad agrícola (Macías et al., 2000).

La manipulación adecuada de los cultivos, utilizando la alelopatía para la mejora de la

productividad de los mismos, ayuda a la protección del medio ambiente a través del eco-

amigable control de malezas y plagas, la conservación de nitrógeno en la tierra de

cultivo y la síntesis de nuevos productos agroquímicos a base de productos naturales,

han ganado la atención prominente del científico dedicado a esta investigación (Sang-Uk

et al., 2005).

Se ha confirmado que los metabolitos secundarios constituyen una fuente de productos

naturales con actividad biológica diversa, comprobándose su actividad antibacteriana,

antifúngica, antiviral, antineoplásica, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica entre

otras. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de

aplicación, ya sea aislados o usando directamente el extracto o infusión del compuesto al

que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándose como precursor

en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros

activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades prestablecidas.

El creciente interés por el estudio de los metabolitos secundarios ha dado origen a la

descripción de un gran número de compuestos. Esto ha sido motivado por inquietudes

farmacológicas en un principio y, posteriormente, por conocer el rol que estos

metabolitos desempeñan durante el ciclo vital de los organismos que los sintetizan, así

como, llegar a comprender cómo estos compuestos contribuyen al funcionamiento de los

sistemas ecológicos (Organization for Tropical Studies).

La naturaleza química de los agentes alelopáticos es muy variada. (Rivenshield, 2008)

Según estudios, los compuestos fenólicos tales como los ácidos ferúlico (Fig. a) y

caféico (Fig. b) identificados en los tejidos de las plantas y en los exudados de raíces de

tomate, pepino, alfalfa, arroz y avenilla pueden inducir efectos fitotóxicos en tomate,

lechuga y pepino (Loffredo et al.,2005).

Un compuesto que causa inhibición del crecimiento ha sido recientemente aislado de los

exudados de arroz, y su estructura química fue determinada por los datos espectrales

como momilactona B (Fig. c), la cual impidió el crecimiento de plántulas de berro y de

lechuga a concentraciones superiores de 3 y 30 mmol/L respectivamente (Kato-Noguchi

et al.,2005).

Un estudio más reciente, sugiere que la radiación UV no sólo aumenta la concentración

de la momilactona B en las semillas de arroz, sino también su secreción a la rizósfera,

proporcionándole una ventaja competitiva a través de la inmovilización local de los

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18

microorganismos del suelo, y la inhibición del crecimiento de las especies de plantas

competidoras (Kato-Noguchi et al., 2005).

CH3

OHO

O

CH3

CH3

OHO

OH

HO

O

H

O

O

(a) (b) (c)

Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas.

Krautmann et al., en 2001 demostraron como fracciones cromatográficas diferentes de la

especie Tridax procumbens L. (asteraceae), inhibían el crecimiento de semillas

pregerminadas de L. sativa. De esta manera se definió el efecto alelopático negativo.

Otra investigación sugerida por Waller et al., 1992, donde se evaluaron los extractos de

las hojas de la especie Vigna radiata L. (fabaceae) y encontraron actividad alelopática

positiva sobre el crecimiento de la radícula de L. sativa y de V. radiata, al observar que

las semillas crecieron más que en el testigo absoluto; con lo que se tuvo el concepto de

efecto alelopático positivo, que fue atribuido a una saponina triterpénica.

Del género Henriettella se tiene el reporte de H. fascicularis (Sw.), de la cual se aislaron

ácido palmítico, ácido betulínico, β-sitosterol, (-)-pinoresinol, 4´,5,7-trihidroxi-6-8-

dimetilisoflavona y taxifilina. La presencia de taxifilina, un glicósido cianogénico indica

la toxicidad potencial de esta planta en herbívoros (Calderon et al., 2003).

Estudios realizados por el grupo Polifenoles, para el extracto en i-PrOH-agua (65-35) de

H. trachyphylla, y sus respectivas fracciones frente a plántulas de lechuga (L. sativa L.),

mostraron actividad alelopática tanto inhibitoria como promotora del crecimiento;

algunas de sus fracciones activas presentaron compuestos de tipo flavonoide según

pruebas de caracterización (Isaza y Jiménez, 2005).

Un estudio más reciente realizado por este grupo evaluó la actividad alelopática del

extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana, el extracto en acetato de

etilo de Miconia coronata (BONPL.) D.C., pertenecientes a la familia melastomataceae

y sus respectivas fracciones, frente a plántulas de lechuga.

El extracto en cloroformo de H. trachyphylla fue separado en columna cromatográfica

empacada sobre sílicagel, obteniendo diez fracciones, las cuales nombraron como

HtCHF1 hasta HtCHF10.

GRUPO POLIFENOLES

19

Las fracciones HtCHF1, HtCHF2 y HtCHF3 provenientes del extracto en cloroformo de

H. trachyphylla, fueron separadas por cromatografía preparativa en capa fina sobre

sílicagel. De las cuales obtuvieron 5 subfracciones de HtCHF1 nombradas como (F1A,

F1B, F1C, F1D, F1E), 4 de HtCHF2 (F2A - F2D) y 6 subfracciones de HtCHF3 (F3B -

F3F).

Teniendo como resultado que el extracto en cloroformo de H. trachyphylla, presento un

máximo de actividad alelopática inhibitoria en hipocótilo (-38,8%), y del 6,8% como

promotor de crecimiento en epicótilo para el segundo día del ensayo, mientras que las

fracciones F10A1 y F10A2 exhibieron efecto inhibidor, tanto para el hipocótilo como

para epicótilo. Las fracciones Fr1, Fr3, Fr4 y Fr5 de M. coronata mostraron actividad

alelopática.

Inhibitoria de crecimiento en hipocótilo con máximo de -19,4% (quinto día), -7,1%

(quinto día), -64,5% (segundo día), -44,7% (segundo día), respectivamente; mientras que

para epicótilo se observó inhibición de crecimiento al tercer día del -20,3%, -33,3%,

47,8%y -43,5% (Erira y Jiménez, 2012).

En actividad alelopática se han empleado diversidad de semillas por otros

investigadores, entre las cuales se encuentran la especie L. sativa, R. sativus, Allium

cepa (alliaceae), O. basilicum L (lamiaceae) y O. sativa. A las semillas mencionadas se

les evaluó el crecimiento y desarrollo frente a un extracto determinado; los resultados

obtenidos permitieron concluir que dentro del grupo seleccionado L. sativa fue la que

mostró mayor sensibilidad a los aleloquímicos, elevado ritmo de crecimiento y de

absorción de nutrientes en el desarrollo del ensayo (Aportela et al., 2001; Chi-Ming et

al., 2002; Olaya, 2005).

A través del tiempo, las plantas son conocidas por producir moléculas bioactivas que

reaccionan con otros organismos en el medio ambiente (Basile et al., 2000). Estas

sustancias pueden inhibir el crecimiento de hongos y bacterias, atribuyendo propiedades

interesantes para su posible síntesis y/o semi-síntesis, además de convertirse en una

alternativa para el fortalecimiento de la investigación científica en el campo de los

antimicrobianos.

Actualmente, estos fitoquímicos están siendo empleados a escala comercial para

prolongar la vida humana y mejorar la seguridad en diversos aspectos. Es por esta razón

que se ha desarrollado un creciente interés en la búsqueda de extractos y compuestos

naturales de plantas, para sustituir los actuales agentes antimicrobianos sintéticos.

El uso de plantas medicinales se ha dado desde tiempos prehistóricos hasta los tiempos

actuales; el hombre por ensayo y error utilizó los elementos que la naturaleza le brindaba

para curar sus enfermedades y las de sus animales, este conocimiento se transmitió de

generación en generación y fue perfeccionándose con la experiencia (Hoogesteger,

1994).

GRUPO POLIFENOLES

20

1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA

Cada día los herbicidas sintéticos no representan un instrumento adecuado para el

control de algunas malezas en desarrollo de resistencia. El control de las malezas a

través de la alelopatía es una estrategia para solucionar los numerosos problemas

derivados de la insuficiencia de las prácticas de la cultura, y el abuso de herbicidas

sintéticos (Singh et al., 2003; Macías et al., 2003; Hao et al., 2007).

La comprensión de los mecanismos de acción de los aleloquímicos permite la utilización

de estos compuestos para mejorar la producción de cultivos y el desarrollo de una

agricultura más sostenible, incluyendo el control de plagas y de malezas a través de la

rotación de los cultivos, manejo de residuos y una variedad de enfoques en bio-control

(Popaa et al., 2008).

La prevalencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas de bacterias,

ha surgido como respuesta al uso indiscriminado de los antibióticos. Esta resistencia es

debida en muchos casos a la utilización inadecuada de las dosis y al tiempo de

tratamiento que no es el recomendado por el médico. Esto ha llevado a promover la

resistencia de los microorganismos frente a antibióticos. La utilización de plantas

medicinales en nuestro medio, y el hecho que en gran cantidad de vegetales se

encuentran principios activos empleados en el tratamiento de diversas enfermedades, ha

incrementado el interés por su estudio.

La actividad antimicrobiana de los extractos vegetales y productos naturales ha revelado

el potencial de las plantas superiores como fuente de agentes anti-infectivos,

permitiendo de esta manera un avance al uso empírico de las especies vegetales

medicinales con una base científica (López et al., 1997). Los efectos negativos sobre

otras especies pueden deberse a una variedad de procesos, incluyendo la reducción de

división celular en las raíces, la reducción de la absorción de iones, la inhibición de la

fotosíntesis y la respiración, la inhibición de la síntesis de proteínas, la inhibición de

proteínas de la actividad enzimática y una menor permeabilidad de la membrana celular.

Algunos de los aleloquímicos con más frecuencia encontrados son los flavonoides, los

cuales, han sido frecuentemente implicados en la inhibición de la germinación de

semillas y crecimiento de raíces (Taylor et al., 2005).

Actualmente, a nivel mundial existe una problemática relacionada a la resistencia que

presentan algunos microorganismos frente a antibióticos que se consideran de amplio

espectro. Es por esta razón que se pretende buscar nuevas alternativas de

antimicrobianos naturales, logrando ser un aporte innovador en este campo.

GRUPO POLIFENOLES

21

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

La información anterior condujo a determinar el problema objeto de estudio de esta

investigación en las siguientes preguntas:

¿Poseen las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad antibacteriana frente a las

bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)?

¿Presentan las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad inhibitoria frente a la

germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.)?

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo general

Determinar la actividad alelopática y antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D

y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana (Melastomataceae).

1.3.2 Objetivos específicos

1.3.2.1 Realizar ensayos de actividad alelopática a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F

sobre la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L).

1.3.2.2 Desarrollar ensayos de actividad antibacteriana de las fracciones F1-C, F1-D y

F1-F frente a cepas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.

1.3.2.2 Separar por columna cromatográfica empacada con Toyopearl HW40 la fracción

más promisoria frente a su actividad alelopática o antibacteriana.

GRUPO POLIFENOLES

22

1.4 JUSTIFICACIÓN

La tendencia de volver a lo natural y el uso creciente de los fitoquímicos como agentes

terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, ha llevado desde hace

algunos años al grupo Polifenoles de la Universidad Tecnológica de Pereira a investigar

sustancias con potencial biológico obtenidas de algunas plantas de la Eco-región Eje

Cafetero, y en especial las pertenecientes a la familia melastomataceae.

En nuestra región, el uso tradicional de estos fitoquímicos ha llevado al descubrimiento

y obtención de estructuras que son reconocidas por tener alguna actividad biológica

frente a organismos, ya sea contra bacterias como antibacterianos, contra hongos como

antifúngicos, o los que intervienen en el proceso de inhibición del crecimiento y muerte

de otras especies vegetales, como pueden ser los agentes alelopáticos. En la actualidad,

este uso ha permitido en otras latitudes desarrollar muchos agentes farmacéuticos o

agroquímicos que tengan como base los compuestos naturales, además de las posibles

modificaciones de los mismos por medio de biosíntesis, síntesis química y/o semi-

síntesis.

Según la OMS (Gómez et al., 2011), se estima que el 80% de los habitantes de los países

en vía de desarrollo dependen de las plantas medicinales para satisfacer sus necesidades

de atención primaria en salud. Lo anterior, se basa en la confianza que producen los

tratamientos con fitoterapéuticos, al evitar los efectos secundarios producidos por

fármacos sintéticos, además de su alta disponibilidad y bajo costo (Mongeli et al., 2000).

Del mismo modo, estas sustancias podrían ser utilizadas como potenciadores de

germinación, controladores biológicos en el diseño de sistemas de cultivos intercalados

y en el manejo de la rotación de los mismos (Gliessman, 2002).

Por medio de esta investigación se busca proveer una alternativa para conseguir

antibacterianos, herbicidas o potenciadores de germinación que sean competitivos e

innovadores, que favorezcan el desarrollo de nuestro país y la Eco-región Eje Cafetero,

además de ser un aporte significativo para ampliar el conocimiento de nuestro recurso

natural.

De esta forma, y teniendo antecedentes de otras investigaciones llevadas a cabo a partir

de las plantas melastomatáceas, se pretende seguir contribuyendo al desarrollo en la

búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos y alelopáticos. Para este trabajo de

investigación se pretenden estudiar las fracciones polares F1C, F1D y F1F obtenidas de

Henriettella trachyphylla Triana, ya que esta ha sido poco estudiada frente a su

fitoquímica y farmacognosia.

.

GRUPO POLIFENOLES

23

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae

Melastomataceae Juss, comprende arbustos, trepadoras, leñosas, hierbas y árboles. Es la

séptima familia más diversa del planeta con 4570 especies en 150 a 166 géneros (Popaa

et al., 2008). Se reconoce fácilmente por el patrón de nerviación de las hojas. Muchas

especies se caracterizan por tener flores, siendo estas aprovechas por su importancia

como ornamentales (Quiñones. 2001).

La familia melastomatácea, se producen en todos los biomas tropicales, particularmente

de las regiones del Nuevo Mundo. En Suramérica se encuentran 166 géneros, ninguno

de ellos existe en el viejo mundo. Para Colombia se registran aproximadamente 900

especies y 61 géneros, distribuidas en los Andes, Chocó y Amazonía. En la Orinoquía se

encuentran 38 géneros y alrededor de 180 especies (Quiñones. 2001).

2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae

Las plantas melastomataceaes han sido usadas para medicina tradicional, especialmente

en Asia y Latinoamérica, como astringentes, hemostáticos, como remedios para diarrea,

disentería, leucorrea y enfermedades de la piel; contra afecciones respiratorias, malaria,

cálculos en la vejiga y otras enfermedades del tracto genitourinario, irritaciones en las

encías y como diurético. En Colombia, algunas especies de la familia son usadas como

medicina tradicional para el tratamiento de la malaria, infecciones, heridas en la piel,

enfermedades respiratorias, cálculos en la vejiga y otras dolencias genitourinarias, como

diurético, y como un remedio tópico para irritaciones en la encía (García. 1974 ).

Según información de pobladores en Riosucio Caldas, indican que Tibouchina ciliaris y

Monochaetum multiflorum han sido usadas tradicionalmente para el tratamiento de

infecciones en heridas de la piel.

2.1.2 Fitoquímica de la familia melastomataceae

Muchos de los constituyentes químicos de las plantas melastomatáceas son de tipo

polifenólico; sin embargo, también han sido reportados algunos triterpenoides y

aquilbencenos.

Se han detectado alcaloides en clidemia hirta D. Don. y Sonerila heterostemon Naudin,

pero aún no se han aislado. En la planta Clidemia floribunda Planch. Se ha detectado el

ácido caféico. Molisch, describió en 1928 la presencia de antocianinas en las raíces de

algunas especies de melastomataceaes, como Centradenia grandiflora Endl. Ex. Walp,

Monochaetum umbellatum Naudin, Tibouchina semidecandra Cogn, Medinillina

magnifica Linl, Bertolonia aenea Naudin, B. Marmorata Naudin, y B. Vittata.

GRUPO POLIFENOLES

24

La mayor parte de los constituyentes de las plantas melastomatáceas son taninos

hidrolizables. Hasta ahora los taninos hidrolizables aislados de especies de

melastomatáceas son representativos de grupos galotaninos y elagitinanos.

La composición de los taninos hidrolizables oligoméricos de Tibouchina multiflora

colectada en colombia, fueron similares a los de T. Semidecandra, incluyendo 1, 2, 3, 6

tetragaloiglucopiranosa, casuarictin, pterocarianin C, pedunculagin, y los nobotaninos

A-A-E aislados de las hojas de Monochaetum multiflora, junto con nueve nuevos

nobotaninos O-W, dimeros, trimeros y tetrámeros (Isaza y Jiménez, 2005).

2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie

Henriettella trachyphylla

2.2.1 Henriettella Naudin

El género Henriettella Naudin, se caracteriza por árboles o arbustos con flores

tetrámeras o pentámeras, hojas cartáceas a subcoriáceas, pétalos ovados a lanceolados,

obtusamente agudos a obtusos apicalmente, blancos o amarillentos (Tropicos.org. 2012).

Este género cuenta con alrededor 40 especies, que se distribuyen desde Guatemala hasta

Bolivia y el sur oriente de Brasil. En Colombia se registran 16 especies en las regiones

del Chocó, Magdalena Medio, Andes, Sierra Nevada, Orinoquía, las Guayanas y

Amazonía, entre los 0 y los 2800 metros de altitud (Mendoza et al., 2006).

De la fracción en acetato de etilo de Henriettella fascicularis condujo al aislamiento de

taxyphyllin (a) el cual ha mostrado potencial toxicidad en los herbívoros (Calderon et

al., 2003). A partir de la fracción en diclorometano de H. fascicularis se registraron el β-

sitosterol (b), 4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona (c) y ácido (3E,6S)-6-

[(1R,5Z,3aS,9R,10Z,12aR)-1,2,3,3a,4,7,8,9,12,12a-decahidro-9-hidroxi-3a-6,10-

trimetilciclopentamocicloundecano-1-il]-2-metil-hept-2-enoico (d).

O

HOHO

OH

OH

OCN

OH

Taxyphyllin

a.

HO

-sitosterol

b.

GRUPO POLIFENOLES

25

CH3

HO

H3C

OH

O

O

OH4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona

c.

HO

COOH

ácido sesterterpenoico

d.

Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis

2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana.

La especie de H. trachyphylla se caracteriza por árboles 4-5 m de altura; ramas y

pecíolos densa a moderadamente verrucoso-hirsutos, hojas elípticas a elíptico-obovadas,

flores densamente estrigosos, pétalos ovados, glabros en ambas superficies, blancos

(Tropicos.org. 2012).

El fraccionamiento guiado por bioensayos del extracto en i-PrOH–agua (65:35) de H.

trachyphylla sugieren la presencia de isoflavonas y flavonas (Isaza y Jiménez, 2005).

2.2.2.1 Indicios de actividad alelopática de Henriettella trachyphylla Triana

Estudios realizados de actividad alelopática del extractos en i-PrOH-agua (65:35) y

fracciones de las hojas de H. trachyphylla, mostraron un efecto inhibidor de crecimiento

de acción en hipocótilo, se debe a la presencia de compuestos con acción pesticida y se

evidencia un efecto promotor en epicótilo, esto sugiere que los compuestos presentes en

H. trachyphylla son potenciales de crecimiento, y sus productos de degradación actúan

como fitohormonas (Isaza et al., 2005).

2.2.2.2 Indicios de actividad antibacteriana de Henriettella trachyphylla Triana

No se han encontrado estudios pertinentes en cuanto a la evaluación de la actividad

antibacteriana sobre H. trachyphylla.

2.3 Aleloquímicos

Los aleloquímicos son en gran parte clasificados como metabolitos secundarios de

lasplantas, que juegan un papel importante en interacciones o defensas en las plantas y

en mecanismos ecológicos. Los aleloquímicos están presentes prácticamente en todos

los tejidos vegetales, incluyendo hojas, flores, frutos, tallos, raíces, rizomas, las semilla y

el polen. Pueden ser liberados de las plantas al medio ambiente a través de

GRUPO POLIFENOLES

26

volatilización, lixiviación, exudación de las raíces, y la descomposición de residuos

vegetales (An, 2003).

La producción de aleloquímicos en plantas vivas se ve afectada por: factores abióticos,

como alta temperatura, modificación en la calidad de luz, características del suelo (pH,

estructura, estado de los nutrientes, textura, presencia de contaminantes), la altitud y

latitud, factores bióticos, como agentes patógenos, plagas, parásitos o herbívoros. Sin

embargo, los efectos de las interacciones planta-planta son menos conocidos (Rivoal et

al., 2011).

Con los años se ha demostrado que las plantas producen sustancias con propiedades

químicas alelopáticas que afectan a algunas especies de plantas. Estas sustancias se

distribuyen en diferentes partes de la planta, durante su ciclo de vida.

Cuando estas sustancias se liberan en cantidades suficientes, tienen efectos alelopáticos

que se puede observar en la germinación, crecimiento y/o el desarrollo de la plantas. Los

principales agentes alelopáticos son metabolitos secundarios de naturaleza química muy

variada. A medida que avanza las investigaciones en el tema se incorporan nuevos

grupos de sustancias a las cuales no se les atribuía esta actividad biológica. Se conocen

alrededor de 10.000 metabolitos secundarios con acción alelopática como esteroides,

ácidos grasos de cadenas largas, lactonas, flavonoides, cumarinas, naftoquinonas,

antraquinonas, fenoles simples, taninos, terpenoides, aminoácidos (Santos, 2007;

Vyvyan, 2008).

El efecto alelopático que puede tener una planta sobre otra, puede clasificarse como

positivo, cuando estimula el crecimiento normal; negativo, cuando se inhibe el

crecimiento o nulo, cuando los aleloquímicos no tienen ningún efecto sobre el desarrollo

de la planta; dichos efectos dependen del comportamiento de cada aceptor frente al

aleloquímico y de las propiedades tanto del aceptor como del aleloquímico (Krautmann

et al, 2001; Waller et al, 1992).

2.3.1 Aleloquímicos como herbicidas naturales

Se denominan aleloquímicos a los herbicidas naturales obtenidos de diversas fuentes

vegetales. La obtención de estos agroquímicos basados en fuentes naturales son

atractivos por varias razones. Primero, la mayoría de ellos son solubles en agua, y como

resultado, es posible que sean activos a muy bajas concentraciones, reduciendo su

presencia en el ambiente. Los productos naturales tienen relativamente vida media corta.

Algunos productos naturales son explotados comercialmente como son los herbicidas

derivados de las tricetonas (Sampietro, 2008; Lopes et al., 2009).

Es importante señalar que los herbicidas sintéticos de amplio espectro, que son los más

comerciales, además de controlar las arvenses influyen negativamente en la salud de los

seres vivos, deterioran las fuentes hídricas y el suelo, puesto que muchos de ellos, por

sus características físico-químicas son difíciles de degradar. El uso indiscriminado de

estas sustancias ha generado efectos tóxicos en las comunidades aledañas a los cultivos,

GRUPO POLIFENOLES

27

por lo cual se deben plantear nuevas alternativas de control (Nivia, 2000; Cuenca et al.,

2004).

Los extractos vegetales con propiedades alelopáticas son de fácil degradación en el

control de las arvenses y se pueden obtener de tal manera que sean selectivos dentro de

los cultivos, lo cual regula las cantidades demandadas por el mismo. La importancia de

avanzar en el estudio de la actividad alelopática de extractos vegetales, se manifiesta en

la disminución de los costos de mantenimiento de los cultivos y en la reducción del

impacto ambiental que causa el uso de herbicidas (Macías et al.,2000).

Las estrategias alelopáticas apuntan a la reducción de la polución ambiental y a

mantener un balance ecológico en la flora y la fauna, con la disminución en el uso de

pesticidas (insecticidas, fungicidas, nematicidas y herbicidas) sustituyendo estos por

compuestos naturales (plantas y microorganismos); los aleloquímicos y fitoquímicos

están libres de todos estos problemas asociados con la presencia de pesticidas. Por esto

la alelopatía es un área prioritaria de investigación en la mayoría de los países del mundo

(Min et al., 1997).

2.3.2 Germinación

Durante las dos últimas décadas, la ciencia de la alelopatía ha atraído un gran número de

investigadores. Esto ha sido en gran medida, por las perspectivas de que la alelopatía es

válida en la agricultura y la calidad en la producción de alimentos para humanos. En

reducir los daños ambientales por la dependencia a los herbicidas sintéticos y los riesgos

generados, en ocasiones por contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en

áreas de actividad agrícola (An et al., 2003).

Compuestos que inhiben la germinación son llamados fitotóxicos, producidos por

plantas que tienen relación específica e inter-específica para la competición por

nutrientes del medio. La búsqueda de aleloquímicos es un campo de investigación

creciente, en relación a que dichos compuestos pueden ser desarrollados como

herbicidas en la agricultura. Uno de los bioensayos más comunes para aleloquímicos es

usar semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) en la prueba de germinación en cajas de

Petri, como esta es generalmente una especie sensible a los aleloquímicos, es de fácil

adquisición y su germinación es rápida y uniforme. El aislamiento de los compuestos

bioactivos es usualmente a partir del fraccionamiento de un extracto.

Para que el proceso de germinación ocurra es necesario que la semilla pase por tres fases

(Jean-Yves et al., 2006) la fase de hidratación, la fase de germinación y la fase de

crecimiento. La fase de hidratación, es donde todos los tejidos internos absorben agua y

la semilla aumenta su proceso respiratorio. En la fase de germinación, se producen

transformaciones bioquímicas y fisiológicas internas y se reduce el consumo de agua;

dentro de esta fase se encuentran cuatro etapas como se ilustra en la (Fig. 3), desde el

brote de la radícula hasta la formación de la primera hoja.

GRUPO POLIFENOLES

28

Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006).

La última es la fase de crecimiento en la cual se reactiva la absorción del agua, el

proceso respiratorio y la fotosíntesis, (Jean-Yves et al., 2006). Las fases mencionadas

anteriormente, son necesarias para la germinación de la semilla, y cuando se alteran, las

semillas pueden impermeabilizarse, evitando la entrada de sustancias, (Bradford, 1995)

o por el contrario, pueden absorber gran cantidad de agua, evitando su germinación

(Zalacain et al., 2005).

La germinación puede ser afectada por sustancias aleloquímicas, que la inhiben o la

favorecen. Entre las sustancias que inhiben la germinación, podemos encontrar los

alcaloides y coumarinas, porque interfieren en los procesos respiratorios, retardando el

desarrollo de la planta (Luzzet et al., 2004). Mientras que en el grupo de sustancias que

favorecen la germinación, los lupanos triterpénicos estimulan la actividad germinativa

(Macía et al., 1999). Por otra parte, la germinación de las semillas y su desarrollo rápido

está determinada por factores intrínsecos y extrínsecos; los intrínsecos son aquellos

referentes a la madurez y la viabilidad de las semillas (García et al., 2001). Esta

viabilidad depende de variaciones genéticas y determinan para una especie que algunas

variedades pueden adaptarse mejor a unas condiciones que a otras (Moreno et al., 2001).

Mientras que, los factores extrínsecos están determinados por las condiciones

ambientales, como la temperatura, la humedad relativa, la iluminación, entre otros;

GRUPO POLIFENOLES

29

propiedades que pueden acelerar o retardar los procesos de crecimiento de las semillas

(Bertín et al., 2011).

2.4 Actividad antibacteriana

La historia de los productos naturales bioactivos inició hace más de 100 años. En el

sentido más amplio, éstos se definen usualmente como los compuestos químicos

derivados y aislados de los organismos vivos de la naturaleza como las plantas,

animales, microorganismos y especies marinas, sintetizados durante el metabolismo

primario o secundario de los mismos ( Organization For Tropical Studies, 2012).

Por otra parte, estos componentes naturales exhiben tanto actividad antibacteriana como

otra actividad en la mayoría de los casos. Esta capacidad antimicrobiana en extractos, se

encuentra disponible en una serie de componentes de variadas estructuras, incluidos los

de funcionalidad aldehído y fenoles. Las combinaciones naturales de estos compuestos

son a menudo sinérgicos, dando lugar a una mayor actividad antimicrobiana en los

extractos crudos que en los compuestos puros individuales.

La aceptación de la medicina natural en plantas, como una alternativa para el cuidado de

la salud y la conservación de la calidad de vida para evitar la resistencia microbiana a los

antibióticos ha llevado a muchos autores a investigar la actividad antibacteriana en

plantas (Lou et al., 2001).

2.4.1 Descripción de bacterias empleadas

2.4.1.1 Estructura

Constan de un citoplasma y un material nuclear. Están separadas del exterior por una

membrana citoplasmática, que está rodeada por una pared celular. No posee membrana

nuclear, ni organelas celulares y el citoplasma está lleno de ribosomas. La membrana

citoplasmática es el lugar de obtención de energía por respiración o fotosíntesis; toda la

información genética del procariota se encuentra en un solo filamento de DNA. Esta

molécula de DNA se presenta como una hebra circular y cerrada; su contorno mide de

0,25 mm a 3 mm. En muchas bacterias se ha encontrado DNA extra cromosómico; los

cuales son moléculas pequeñas, igualmente circulares y cerradas, que se denominan

plásmidos (Schiegel et al., 1997).

2.4.1.2 Escherichia coli

Escherichia coli (Fig. 4) es una de las especies bacterianas más minuciosamente

estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato

y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole;

Forma parte de la familia Enterobacteriaceae y está integrada por bacilos Gram

negativos no esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles, aerobios-

GRUPO POLIFENOLES

30

anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con

o sin agregado de NaCl.

Son bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, agua, vegetales y

en gran variedad de animales.

Figura 4. Escherichia coli

Fuente: http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html

2.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonadaceae y es un bacilo Gram

negativo aerobio con un flagelo polar. Cuando se cultiva en medios adecuados produce

piocianina, un pigmento azulado no fluorescente. Muchas cepas producen también el

pigmento verde fluorescente pioverdina.

Al igual que otras Pseudomonas fluorescentes, produce catalasa y oxidasa, así como

amoniaco a partir de la arginina, y puede utilizar citrato como única fuente de carbono.

Pseudomonas aeruginosa (Fig. 5) es un microorganismo común en el medio ambiente y

puede encontrarse en las heces, el suelo, el agua y las aguas residuales. Puede proliferar

en ambientes acuáticos, así como en la superficie de materias orgánicas propicias en

contacto con el agua.

Figura 5. Pseudomonas aeruginosa

Fuente: http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html

http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html

GRUPO POLIFENOLES

31

2.4.2 Descripción de antibióticos empleados

2.4.2.1 Amoxicilina

La amoxicilina (Fig. 6) es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata

de una amino penicilina. Actúa contra un amplio espectro de microorganismos, tanto

Gram positivos como Gram negativos. Por esto se emplea a menudo como primer

remedio en infecciones de diferente gravedad, tanto en medicina humana como también

en veterinaria. Se utiliza por vía oral o parenteral, aunque la forma parenteral

(intramuscular ointravenosa) no está aprobada en todos los países debido a su

comprobado daño al sistema auditivo y renal, causando en algunos casos sordera.

Como las demás penicilinas la amoxicilina impide en las bacterias la correcta formación

de las paredes celulares. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas

peptidoglicáneas lineares que forman la mayor parte de las paredes de los

microorganismos Gram positivos. Al impedir que la pared celular se construya

correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su

muerte.

HO

N

O

NH2 H N

H H

O

S

COOH

CH3

CH3

Figura 6. Amoxicilina

2.4.2.2 Ampicilina

La ampicilina (Fig. 7) es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y

activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente

a las beta-lactamasa producidas por bacterias Gram positivas o Gram negativas. La

ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos

susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. Debido al aumento de

resistencias ya no se recomienda la ampicilina para el tratamiento de la gonorrea.

Los antibióticos beta-lactámicos como la ampicilina son bactericidas. Actúan inhibiendo

la última étapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas

específicas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular.

Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en

último término, la lisis de la bacteria y su muerte.

GRUPO POLIFENOLES

32

NH2

NH

N

H

O

S CH3

CH3

O

OH

O

Figura 7. Ampicilina

2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los

componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra

móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una

columna que contiene a la fase fija.

La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de

vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte

superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas

de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la

necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera,

nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de

instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

Para el presente estudio se utilizo esta técnica, pues en la actualidad ha llegado a ser una

de las más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos

químicos.

GRUPO POLIFENOLES

33

Figura 8. Equipo HPLC

Fuente: Autor

Sistema de elución

Bomba

Automuestreador inteligente

Detector Interfase

Columna

Horno

Software

GRUPO POLIFENOLES

34

3. SECCIÓN EXPERIMENTAL

3.1 Materiales y reactivos

El material de vidrio como cajas petri, cromatoplacas de sílica gel 60 F254 y en RP-18

F254s (Merck), así como reactivos DMSO grado analítico (Dimetil sulfóxido, Phyto

Technology Laboratories), Tween 20 y Glifosato comercial (648 g/L, Raundup Spectra,

transorb Technology). Los medios de cultivo, como agar Mueller Hinton, agar nutritivo

y caldo infusión cerebro corazón (BHI), se encuentran en el laboratorio del grupo

Polifenoles. Los medio de cultivo se prepararon según indicación del fabricante. Las

cepas de microorganismos empleadas Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomona

aeruginosa (ATCC 27853), estaban disponibles en el laboratorio de microbiología

(Escuela de Química, UTP).

3.2 Disolventes

Tanto en las separaciones cromatográficas, como en las cromatografías se utilizaron

disolventes grado analítico (Merck). Para HPLC, estos se filtraron y sometieron a

ultrasonido.

3.3 Equipos

Se utilizó un equipo de ultrasonido Fisher Scientific FS60H, balanza analítica OHAUS

Advance, rotaevaporador Heidolph Laborota 4003-control, cámara de revelado UV

Camag, incubadora Velp scientific FOC 225i y un espectrofotómetro UV/Vis Shimadzu

UV-1700 PharmaSpec (laboratorio de Fitoquímica).

Para el análisis por HPLC, se empleo un equipo Jasco HPLC 2000 Plus. Sistema

equipado con bomba de gradiente cuaternario PU-2089 Plus, automuestreador

inteligente AS-2059 Plus, horno para columna CO-2065 Plus, columna Cromolith

Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm), detector inteligente de arreglo de diodos

MD-2015 Plus y LC Net II/ADC, controlado por el Software EZChrom Elite.

Sistema de elución isocrático con ácido fosfórico 0.05%-isopropanol (95:5), flujo 0.5

µL/min, volumen de inyección 15 µL, presión (0-250) bar, temperatura del horno 35 °C,

tiempo de corrido 10 minutos.

3.4 Material vegetal

Henriettella trachyplylla Triana, se encontró disponible en el Laboratorio del grupo

Polifenoles, la cual fue recolectada en la vereda Laguneta, vía Pereira-Armenia, e

identificada por el Dr. Frank Almeda de la Academia de Ciencias de California.

GRUPO POLIFENOLES

35

3.4.1. Fracciones polares empleadas

Para este trabajo las fracciones polares se obtuvieron en investigaciones anteriores,

realizando un fraccionamiento por cromatografía en columna de la fase acuosa F-1, la

fase acuosa F-1 (2,2 L, 15,422 g) fue pasada por columna cromatográfica (d.i. 5 cm, 17

cm de largo) empacada con DIAION HP-20 (Mitsubishi Japón; resina de intercambio

iónico), utilizándose como gradiente isopropanol-agua (0:100 ;10:90; 15:85; 20:80

;30:70; 40:60; 50:50; 70:30; 100:0), finalizando con isopropanol-n-hexano (70:30),

recogiendo 4 fracciones de 500 mL por cada etapa, para un total de 46 fracciones.

Cada fracción fue monitoreada por espectrofotometría UV a 280 nm (espectrofotómetro

Génesis 10, laboratorio de análisis instrumental, UTP) midiendo en una celda de cuarzo

y agua como blanco. Con base a las lecturas de absorbancia se realizó un cromatograma

que permitió reunir las fracciones acorde con los picos cromatográficos y estas fueron

nombradas desde F-1A hasta F-J. Las fracciones así reunidas (Fig. 9) se secaron en

evaporador rotatorio (Buchi R-205, laboratorio de Fitoquímica) y monitoreadas por

cromatografía en capa fina en fase normal, usando como fase estacionaria silica gel 60

(F254, Merck) y como sistema eluente n- hexano- acetato de etilo (7:3); n-hexano-acetona

(7:3) y en fase reversa (RP-18 F254s, Merck) con el sistema isopropanol-agua (60:40)

(Isaza et al., 2005).

GRUPO POLIFENOLES

36

Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et al., 2005).

3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate

3.5.1 Semillas

Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y tomate (Lycopersicum esculentum Mill.)

fueron compradas a Fercon Ltda, estas se mantuvieron y trataron a condiciones de

laboratorio (laboratorio de Fitoquímica).

3.5.2 Agua pretratada

Se calentaron 300 mL de agua potable hasta ebullición por 5 minutos y se dejó enfriar

hasta temperatura ambiente.

3.5.3 Lavado

Las semillas de lechuga y tomate se lavaron con agua pretratada (Fig. 10).

GRUPO POLIFENOLES

37

Figura 10. Lavado de semillas

3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate

3.5.4.1 Germinación de semillas de lechuga y tomate en agua

Se depositaron 10 semillas de lechuga en forma radial sobre papel filtro, el cual se

encuentra en una caja de petri impregnado con 5 mL de agua pretratada (Fig. 11a). El

mismo procedimiento se realizó para las semillas de tomate (Fig. 11b). Los

experimentos preliminares de germinación se realizaron por triplicado.

SEMILLAS DE LECHUGA

EN AGUA PRETRATADA

a.

SEMILLAS DE TOMATE

EN AGUA PRETRATADA

b. Figura 11. Germinación de semillas en agua

3.5.2.2 Germinación de semillas de lechuga y tomate en solución de DMSO

Se adicionaron 14,95 mL de H2O y 0,05 mL de DMSO sobre una hoja de papel filtro

colocada dentro de una caja de petri, para llegar así a una concentración final en DMSO

del 0,33% esto con el fin de evaluar a esta concentración la actividad germinativa del

DMSO para ser empleado como solubilizador de las fracciones a evaluar. Después de

esto, se colocaron 10 semillas de lechuga sobre del papel (Fig. 12a). Se lleva a cabo el

mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 12b). Este procedimiento se

realizo por triplicado.

GRUPO POLIFENOLES

38

SEMILLAS DE LECHUGA

EN AGUA PRETRATADA

a.

SEMILLAS DE TOMATE

EN AGUA PRETRATADA

b.

Figura 12. Germinación de semillas en DMSO

3.5.2.3 Control con glifosato

Se utilizó como control glifosato comercial a una concentración de 3,7x10-2

M. Esta se

preparó disolviendo 0,7 mL de glifosato comercial en 49,3 mL de agua pretratada.

Después, se adicionaron 10 semillas de lechuga sobre el papel de filtro (Fig. 13a). Se

lleva a cabo el mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 13b), Este

procedimiento se realizó por triplicado.

SEMILLAS DE LECHUGA

EN AGUA PRETRATADA

a.

SEMILLAS DE TOMATE

EN AGUA PRETRATADA

b.

Figura 13. Control con glifosato

Después de tener las semillas en caja Petri para su germinación en agua, DMSO y

glifosato se dejaron germinar durante 5 días (120 horas) a condiciones ambiente del

laboratorio y privadas de la luz solar.

GRUPO POLIFENOLES

39

3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,

F1-D y F1-F

3.6.1 Esterilización de las semillas

Las semillas de lechuga se esterilizaron en una solución al 5% (v/v) de hipoclorito de

sodio durante 15 minutos, y se enjuagaron por cuatro veces con agua destilada estéril

(Fig.14).

lavar con H2O

Semillas con hipoclorito al 5 %

Agua pretratada

Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga

3.6.2 Preparación de las fracciones

Se prepararon las soluciones de cada fracción a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1

mg/mL, 0,5 mg/mL, y 0,8 mg/mL en metanol (Kato-Noguchi et al., 2005).

3.6.3 Germinación

Las soluciones preparadas a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL,

0,8 mg/mL. Se adicionaron sobre dos hojas de papel filtro colocadas dentro de una caja

de Petri. Posterior a esto se mantuvieron en cámara de flujo laminar 25 °C hasta

sequedad. Luego se adiciono a cada caja de Petri 4 mL de Tween 20 al 0.05%. El Tween

20 es utilizado a concentraciones menores de 0,05% en volumen en ensayos de actividad

alelopática, sin que se presente alguna acción inhibitoria o promotora de germinación

sobre las semillas de prueba. Por último se procedió a colocar 15 semillas bien

distribuidas por caja, estas se dejaron en oscuridad por 36 horas a temperatura ambiente.

Este ensayo se realizo por triplicado. Después de esto se contaron las semillas

germinadas y se tomó el registro para su análisis posterior (Kato-Noguchi et al., 2005).

3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico

Los resultados obtenidos a partir de las semillas germinadas por horas se reportan en las

tablas de los anexos 1 y 2. Los datos obtenidos de las semillas germinadas se representan

mediante signo positivo (+), las semillas que no germinan por signo negativo (-) y el

GRUPO POLIFENOLES

40

acumulado de semillas por horas con cero (0). Los datos obtenidos se trataron con

estadística clásica para determinar porcentaje de germinación y desviación estándar, así

como las gráficas en las que se muestra la información será llevado a cabo por medio del

programa GraphPad Prism versión 6.00 (Trial), versión libre para descarga en la página

web: http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

3.7 Actividad antibacteriana

3.7.1 Microorganismos

Para la actividad antibacteriana se usaron cepas liofilizadas, replicadas en BHI, de los

microorganismos Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC

27853).

3.7.2 Antibiograma

Se evaluó por el método de difusión en agar (Ramírez y Díaz, 2007) frente a los

antibióticos: ampicilina sódica y amoxicilina a concentraciones recomendadas de 1000,

500, 250, 125 y 62,5 ppm, y un blanco de una solución de DMSO al 5%.

Con este ensayo se determina la sensibilidad o resistencia de los microorganismos frente

a los antibióticos de prueba, tomando como base el promedio de las réplicas de medición

del halo de inhibición a la menor concentración. Según este criterio de selección, las

fracciones que presenten halos de inhibición mayores en relación al antibiótico de

prueba se tomarán como fracción activa frente a los microorganismos.

3.7.3 Ensayo de actividad antibacteriana de las fracciones polares

Se determinó la actividad antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D, F1-F, a

1000, 500, 250, 125 y 62,5 ppm, utilizando las cepas de E. coli y P. aeruginosa,

empleando el método de difusión en agar.

3.7.4 Medio de cultivo

Se utilizó agar Mueller-Hinton, teniendo en cuenta que en este medio gran parte las

bacterias con características patógenas desarrollan un crecimiento óptimo.

3.7.5 Preparación del inoculo

La preparación del inoculo se realizó tomando de 3 a 5 colonias aisladas del

microorganismo, se trasfirieron a un tubo con 4 a 5 mL de un medio de cultivo

adecuado, tal como infusión cerebro corazón (BHI) y se incubó durante 24 h a 37 °C;

transcurrido este tiempo, 1 mL del inoculo se transfirió a 4 mL de caldo y se midió la

GRUPO POLIFENOLES

41

absorbancia a 540 nm, dependiendo de este resultado y del tiempo de generación

característico de la bacteria, se calculó el tiempo de incubación para obtener una

turbidez de 0,100 de absorbancia óptimamente comparable a un estándar de 0,5

McFarland, de forma que las bacterias estuvieran en fase exponencial al momento de

realizar el ensayo (Ramírez et al., 2011).

3.7.6 Controles

Para la actividad antibacteriana se utilizo como control amoxicilina y ampicilina anhídra

sódica, y como blanco DMSO al 5% (Wadhwani et al., 2009)

3.7.7 Preparación de antibióticos estándar

El blanco utilizado fue una solución de DMSO al 5%. Los controles fueron los

antibióticos evaluados en el antibiograma. La ampicilina se preparó disolviendo 0,051 g

en una solución de DMSO al 5%, en un volumen final de 50 mL.

Para la amoxicilina se disolvió 0,052 g en una solución de DMSO al 5%, en un volumen

final de 50 mL. Para ambos antibióticos la concentración final fue de 1000 ppm. A partir

de esta solución madre se realizaron las respectivas diluciones (Fig. 15). Para llegar a

concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos

3.7.8 Preparación de las fracciones

Las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, provenientes de la separación cromatográfica en

columna sobre DIAION HP-20, se disolvieron en una solución de DMSO al 5% con

ayuda del ultrasonido, preparando para cada una de las fracciones, soluciones iniciales

GRUPO POLIFENOLES

42

de 1000 ppm, y a partir de estas se realizaron las diluciones respectivas (Fig.16) hasta

llegar a concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones

3.7.9 Evaluación de la actividad inhibitoria

En una caja petri se agregaron 100 µL de la bacteria a evaluar, la cual estaba en (caldo

BHI) a una absorbancia de 0,1 a 540 nm. Luego se agregaron 25 mL de agar Mueller

Hinton a 25 °C y se mezcló suavemente en forma de ocho hasta solidificación (Fig.17).

GRUPO POLIFENOLES

43

25 mL de agar a 45 °C

Homogenizar en forma de 8 y dejar solidificar

100 uL de cultivo0,1 de abs a 540 nm

Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad

Con ayuda de un sacabocados se hicieron 5 pozos (5 mm de diámetro), sobre la placa de

agar sólido (Fig.18). Los pozos se realizaron hasta el fondo, y para sellarlos se

adicionaron 15 µL de agar a 45 °C, dejando reposar hasta solidificación.

GRUPO POLIFENOLES

44

15 uL de agar a 45 °C en cada pozo dejar enfriar

1: Control2: Blanco DMSO3: Fracción C: 1000 ppm4: Fracción D: 1000 ppm5: Fracción F: 1000 ppm

1 2

5

3 4

Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos

Por último se aplicaron 10 µL del blanco, control y muestra problema, a tres

concentraciones diferentes en cada uno de los pozos (Fig.18), dejando en incubación a

37 °C por 24 horas. Este procedimiento se realizó por triplicado y se realizó para cada

uno de los microorganismos y antibióticos. De esta misma manera se realizó para las

diferentes concentraciones de 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

La lectura se realizó midiendo el diámetro del halo de inhibición con regla milimetrada

(Fig.19), tomando tres medidas en forma radial en cada pozo. Cada uno de los ensayos

será realizado por triplicado. Suministrando los datos en una tabla de recopilación de

medidas en milímetros (mm) (tabla 1); estos datos se promedian determinando el

porcentaje de desarrollo del halo de la muestra a evaluar y del halo de control, según se

muestra en la siguiente fórmula (Ramírez y Díaz, 2007):

% Inhibición = (Diámetro del halo muestra/Diámetro del halo control)*100

GRUPO POLIFENOLES

45

Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición.

3.8 Pruebas de caracterización para flavonoides

A las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F se les realizaron las siguientes pruebas de

clasificación química.

3.8.1 Prueba de cloruro férrico

Se realizó esta prueba para determinar la presencia de fenoles. Los taninos reaccionan

con solución acuosa de tricloruro férrico al 1% (Fig.20) dando coloración azul (taninos

derivados del ácido gálico) o verde (taninos derivados del ácido protocatéquico) (Calle y

Jiménez, 2002).

+ FeCl3 + 3HCl

OH

O-

Fe

3

Complejo coloreado

Figura 20. Reacción de cloruro férrico

A 0.2 mL de la fracción disuelta en etanol, se agregó una gota de solución de tricloruro

férrico. Se empleó ácido tánico al 5% como solución patrón y se compararon los

resultados.

3.8.2 Prueba con acetato de plomo

Esta prueba se realizó con el fin de identificar fenoles, en caso de haberlos. Los taninos

reaccionan con solución de acetato de plomo (Fig. 21), produciendo turbidez o

precipitado blanco (Calle y Jiménez, 2002).

GRUPO POLIFENOLES

46

OH

+ (CH3COO-)2Pb

O-

2

Pb

Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo

A 1 mL de solución etanólica de las fracciones se le adicionó 1 mL de solución de

acetato de plomo al 10%, y se registraron los resultados.

3.8.3 Prueba de Shinoda

Esta prueba se hace para reconocer la existencia de flavonoides, los cuales son anillos de

gama benzopirona que reaccionan en presencia de ácido clorhídrico concentrado y

magnesio (Calle y Jiménez, 2002).

OH

OH

O

O

OH

OH

Mg/HCl

OH

OH O+

OH

OH

Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y magnesio

A 1 mL del extracto etanólico en un tubo de ensayo se agregó magnesio en polvo y gotas

de ácido clorhídrico. Se utilizó como patrón de reacción el extracto etanólico de las

hojas de Rosácea.

3.8.4 Prueba con gelatina–sal

Los taninos precipitan las proteínas de sus soluciones. Se agregó 1 mL del extracto

etanólico en un tubo de ensayo, 1 mL de solución acuosa de gelatina-sal, y 100 g de

cloruro de sodio por litro. Se empleó solución de ácido tánico al 10% como patrón para

comparar los resultados (Calle y Jiménez, 2002).

GRUPO POLIFENOLES

47

OH

-O

HO CO2

OH

HO CO2-

HO

R-CO-NH-R'-CO-NH-R´´+RCO-NH-R´-CO-NH-R''

O2C

CO2-

OH

HO

-O

HO

Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal

3.8.5 Prueba de taninos hidrolizables

Esta prueba sirve para detectar taninos del tipo esteres fácilmente hidrolizables,

formados por una molécula de azúcar en general glucosa ligado a un número variable de

ácidos fenólicos como gálico ó elágico (Fig. 24) (Calle y Jiménez 2002).

OH

OHHO

COOH

Ácido gálico

OH

HO

OHHOOC

OH

OH

COOH

Taninos hidrolizables

Ácido elágico

HO

Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable

A una gota de la muestra se le adiciono 3 gotas de etanol, luego una poca cantidad de

nitrito de sodio, y por último unas gotas de ácido acético.

GRUPO POLIFENOLES

48

3.8.6 Prueba de taninos condensados

Esta prueba sirve para detectar taninos del tipo proantocianidina. Se adiciono una gota

de la muestra, una gota de n-butanol y por último una gota de ácido

clorhídrico concentrado con calentamiento (Calle y Jiménez, 2002).

OHO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

HO

OH

O

OH

R1

OH

R2

HO

OH

O

R1

OH

R2

OH

HCl-n-butanol Calor

n

Subunidad terminal

Su

bu

nid

ad

es d

e e

xte

nsió

n

Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados

GRUPO POLIFENOLES

49

3.9 Análisis fitoquímico preliminar

3.9.1 Análisis por cromatografía de capa delgada (CCD)

A las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, se les realizó una serie de placas en fase normal y

en fase reversa con el fin de encontrar el mejor eluente, que permitiera una buena

separación en los compuestos (Isaza et al., 2006).

3.9.1.1 Revelado UV

Al emplear una lámpara ultravioleta, cualquier sustancia orgánica que contenga un

grupo cromóforo (una parte de la molécula que absorbe la radiación UV) aparecerá

sobre la placa como una mancha oscura sobre un fondo luminoso. La mayoría de los

adsorbentes en CCD contiene un compuesto fluorescente, que cuando se expone a la

radiación UV aparece como un fondo luminoso. Teniendo en cuenta que el material

orgánico se deposita sobre la superficie del adsorbente (Durst y Gokel, 1985).

3.9.2 Análisis por espectroscopía UV

Se tomo 0,1mg de cada una de las muestras se disolvieron en metanol y esta solución fue

transferida a una celda de cuarzo que fue llevada al equipo de UV–vis para realizar un

barrido espectral; como blanco se utilizó metanol. Para realizar las reacciones de

desplazamiento se emplearon los siguientes reactivos: metóxido de sodio (NaOMe), que

hidroliza todos los grupos hidroxilo de la molécula; cloruro de aluminio y la mezcla de

este con HCl, estos proporcionan información sobre los hidroxilos en las posiciones 3 y

5 del flavonoide a la vez que permiten determinar la posición de otros posibles

sustituyentes en los anillos A y B; acetato de sodio, ioniza los hidroxilos más ácidos de

la molécula (3,7 y 4´) y la mezcla de este con borato de sódico que ayuda a formar

quelatos con todos los grupos o-(OH)2 exceptuando lo que se encuentra en las posiciones

5 y 6 (Harbone. 1980).

3.9.2.1 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides

Los espectros UV de los flavonoides en metanol presentan bandas características

debidas a los sistemas conjugados de los anillos aromáticos, por esta razón se procedió a

utilizar esta técnica para facilitar la determinación de estos componentes en las

fracciones en caso de haberlos.

3.9.3 Separación cromatográfica en columna de la fracción F1-F

La fracción F1-F (80 mg) fue pasada por una columna cromatográfica (d.i. 2.0 cm, 17

cm largo) sobre Toyopearl HW-40C (TSK gel, Tosoh Corporation), como fase

estacionaria, con gradiente por etapas metanol-agua (10:90 hasta 80:20), y agua-

isopropanol (5:95 hasta 40:60). Se colectaron las fracciones en tubos de ensayo con un

GRUPO POLIFENOLES

50

volumen de 10 mL por etapa, recogiendo 94 fracciones en total. Las fracciones

recogidas fueron monitoreadas por TLC en fase reversa se reveló con luz UV a

longitudes de onda de 254 y 366 nm, según los resultados obtenidos en las placas se

decidió recoger 7 fracciones nombradas F1-F1 hasta F1-F7 (Fig. 26). Las fracciones

fueron secadas y tomado su rendimiento en peso. Del mismo modo las fracciones

recogidas fueron monitoreadas por cromatografía en fase reversa en isopropanol–agua

(6:4) (Isaza et al., 2005).

Fracción F1-F (80 mg)

CC-Toyopearl HW40C

F1-F1 F1-F2 F1-F3 F1-F4 F1-F5 F1-F6 F1-F7

MeOH- Agua (10-90 hasta 80-20)Agua- i-PrOH (5-95 hasta 40-60)

15,0 mg 4,0 mg 3,1 mg 7,0 mg 22,0 mg 20,0 mg 8,0 mg

Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F

3.9.4 Cromatografía Preparativa

Esta técnica se utiliza para purificar cantidades pequeñas de sustancias y así

posteriormente determinar su estructura molecular (Wasmundzk et. al., 2008). Para la

fracción F1-F5 (34,23 mg), se realizó cromatografía preparativa en fase reversa, en placa

de 10x10 cm utilizando como sistema eluente isopropanol-agua (6:4).

GRUPO POLIFENOLES

51

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Ensayo de germinación para semillas de lechuga y tomate

Los resultados obtenidos (ver tablas de anexos 1 y 2, cajas 2a, 2b y 2c), muestran una

tendencia de germinación mayor en horas para las semillas de lechuga (Fig. 27) que para

las semillas de tomate (Fig. 28), utilizando como medio de germinación agua pretratada.

En estas figuras se hace una lectura de las semillas germinadas a 38, 47, 63, 72, 111 y

120 horas, a su vez del acumulado de semillas germinadas a la misma hora de lectura. Se

cuentan como semillas germinadas aquellas cuya raíz se haya desarrollado, es decir,

desde el brote de la radícula. La selección de semillas de lechuga y tomate como

material vegetal de prueba se ha basado en investigaciones previas (Macías et al., 1999),

las cuales sugieren que estas son sensibles frente a diversos metabolitos procedentes de

extractos y fracciones vegetales, así como un gran número de herbicidas comerciales

utilizados como controles.

38 47 63 72 111

120

0

10

20

30Acumulado semillas germinadasen horas (por todas las cajas)

Semillas germinadas en horaspor cada caja

Tiempo (Horas)

Sem

illa

s g

erm

inad

as

Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua

En la figura 27 (barra azul), se muestra como las semillas de lechuga inician su

germinación a las 38 horas, con un porcentaje de germinación del 13,3% y a las 47 horas

con un porcentaje del 36,7%. En comparación con las semillas de tomate (Fig. 28) que

germinaron a las 63 horas con un porcentaje de germinación del 26,7%. Según estos

resultados, se seleccionaron las semillas de lechuga como especie receptora para evaluar

la actividad germinativa de las fracciones, debido a su corto tiempo de germinación en

agua. Para los ensayos de germinación con las fracciones se tomaron 15 semillas, esto

con el objetivo de ampliar el rango de germinación y así su porcentaje de germinación.

13%

37% 43%

57%

83%

93%

GRUPO POLIFENOLES

52

38 47 63 72

0

10

20

30Acumulado semillas germinadasen horas (por todas las cajas)


Tiempo (Horas)

Sem

illa

s g

erm

inad

as

Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua

Por el contrario, al someter las semillas a germinación frente a una solución de DMSO

al 0,33% v/v (ver anexos 1 y 2, cajas 1a, 1b y 1c), el cual se utiliza para disolver los

metabolitos que difícilmente se solubilizan en agua, marca una tendencia de inhibición

de la germinación en ambas especies receptoras durante las 120 horas del ensayo. Por

este motivo, se decide utilizar Tween 20 al 0,05% como medio para solubilizar las

fracciones a evaluar (Kato-Noguchi & Macías, 2005).

Al utilizar glifosato como control de inhibición de la germinación en ambas especies a la

concentración de 3,7x10-2

M (ver anexos 1 y 2, cajas 3a, 3b y 3c), evidenció una

tendencia de inhibición de germinación para las semillas de lechuga, pero en las semillas

de tomate potenció la germinación (Fig. 29), siendo un resultado promisorio para este

estudio.

El resultado obtenido con el glifosato muestra como hay una germinación atribuible

posiblemente a que el glifosato en bajas concentraciones actúa como potenciador de

germinación y crecimiento en plántulas de distintas especies.

63 72 111

120

0

10

20

30 Acumulado semillas germinadasen horas (por todas las cajas)


Tiempo (Horas)

Sem

illa

s g

erm

inad

as

Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato

27%

47%

73%

83%

27%

50%

83%

93%

GRUPO POLIFENOLES

53

Con este ensayo se demuestra como algunas especies receptoras son sensibles frente a

algunos herbicidas, los cuales a muy bajas concentraciones funcionan como

potenciadores de la germinación o crecimiento en especies receptoras. Los bioensayos

de germinación son probablemente los más comunes al momento de evaluar

aleloquímicos. La germinación (usualmente definida como la emergencia de la radícula),

como en este caso es determinada a intervalos de tiempo expresados como el porcentaje

de germinación de las semillas a un periodo o valor de germinación.

Aunque según Williams y Hoagland, debido a la solubilidad limitada en agua de algunos

aleloquímicos, sugieren la disolución de cantidades adecuadas de estas sustancias

inicialmente en DMSO, y luego diluir en agua hasta la concentración deseada (Macías et

al., 2003). Contenidos de 0,05% v/v de DMSO no tendrían efectos sobre la germinación.

Según esto, se deben realizar ensayos preliminares de germinación en una solución de

DMSO para determinar la concentración adecuada para la disolución de los

aleloquímicos.

De igual manera, el glifosato a concentraciones de entre 10-2

y 10-3

M no ocasionaría

falsos resultados en la germinación o crecimiento de plántulas. Aunque es posible, que

efectos aditivos o sinérgicos entre testigos de los ensayos pueden evaluarse usando

combinaciones de varios aleloquímicos.

4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C,

F1-D y F1-F.

Después de elegidas las semillas de lechuga como especie receptora, se procedió a

realizar la evaluación de la germinación a las 36 horas después de iniciado el ensayo.

Las fracciones se disolvieron en metanol hasta alcanzar concentraciones finales de 0,05,

0,1, 0,5 y 0,8 mg/mL, esta solución se añadió sobre dos hojas de papel de filtro en caja

de Petri. El metanol se evaporo en cámara de flujo laminar, posteriormente el papel filtro

se humedeció con 4 mL de Tween 20 al 0,05% (v/v). El Tween 20 se utiliza como

tensoactivo y no causa ningún efecto tóxico ( Pokclai & Noguchi, 2011). Como control

de germinación se utilizó glifosato a una concentración de 3,7x10-2

M. Este ensayo se

realizó por triplicado.

Las cajas de Petri que contienen las diluciones de prueba y las semillas (15 semillas por

caja) se incubaron bajo la oscuridad a 25 °C, con lectura de la germinación a las 36

horas de iniciado el ensayo.

Con la información obtenida se construyeron las curvas de porcentaje de germinación de

semillas en función de las concentraciones evaluadas.

Los resultados obtenidos señalan que las fracciones F1-C, F1-D y F1-F (Fig. 29, 30 y

31) presentan a una concentración de 0,05 mg/mL una tendencia de germinación mayor

que a las demás concentraciones evaluadas. De esta manera a bajas concentraciones las

fracciones actúan como agentes promotores de la germinación, y por el contrario, altas

concentraciones actúan como inhibidores leves de la germinación.

GRUPO POLIFENOLES

54

En términos de porcentaje de germinación, la fracción F1-C (Fig. 30) evaluada a una

concentración de 0,05 mg/mL presenta un porcentaje de 75,56%, mayor que el evaluado

a una concentración de 0,8 mg/mL (42,22%). Indicando que esta fracción se encuentra

como un potenciador efectivo de la germinación a bajas concentraciones.

c o n c e n tra c ió n (m g /m L )

% d

e g

erm

ina

ció

n

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C

Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C

Fracción F1-C

CONCENTRACIÓN

DS

X

0 mg/mL 3,849 62,22

0,05 mg/mL 3,849 75,56

0,1 mg/mL 10,184 62,22

0,5 mg/mL 7,698 51,11

0,8 mg/mL 7,698 42,22

Para la fracción F1-D (Fig. 31) el resultado del porcentaje de germinación a una

concentración de 0,05 mg/mL es 64,44% y el obtenido a una concentración de 0,8

mg/mL corresponde a 31,11%.


% d

e g

erm

ina

ció

n

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D

GRUPO POLIFENOLES

55

Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D

Fracción F1-D

CONCENTRACIÓN

DS

X

0 mg/mL 3,85 62,22

0,05 mg/mL 7,70 64,44

0,1 mg/mL 7,70 57,78

0,5 mg/mL 3,85 37,78

0,8 mg/mL 3,85 31,11

Para la fracción F1-F (Fig. 32), evaluada a una concentración de 0,05 mg/mL el

porcentaje de germinación corresponde al 75,56% y un porcentaje de germinación del

44,44% a una concentración de 0,8 mg/mL.


% d

e g

erm

ina

ció

n

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F

Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F

Fracción F1-F

CONCENTRACIÓN

DS

X

0 mg/mL 13,88 62,22

0,05 mg/mL 10,18 75,56

0,1 mg/mL 7,70 71,11

0,5 mg/mL 20,00 53,33

0,8 mg/mL 3,85 44,44

De esta forma, se puede deducir que para las tres fracciones en estudio, la mejor

concentración evaluada para obtener altos porcentajes de germinación fue de 0,05

mg/mL. Por el contrario si se desea obtener bajos porcentajes de germinación, es decir

buenos agentes inhibitorios, se deben usar altas concentraciones, para este estudio la

mayor fue de 0,8 mg/mL.

GRUPO POLIFENOLES

56

De aquí se toman las fracciones F1-C y F1-F como promisorias para su fraccionamiento

en columna, aunque debido a su mayor rendimiento en masa se elige la fracción F1-F

como promisoria para separación cromatográfica en columna empacada sobre Toyopearl

HW40C.

De igual forma, al examinar el efecto de las fracciones evaluadas sobre las semillas de

lechuga se detecta una sensibilidad significativa (a concentraciones conocidas), pues las

variaciones en los porcentajes de germinación son pequeños. Un inconveniente común

en este bioensayo de germinación sugiere que algunas variedades de especies receptoras

no son tan sensibles a los metabolitos presentes en los extractos de las plantas o

fracciones de interés. Estos ensayos pueden llevarse a cabo bajo la oscuridad, en

condiciones que permiten un alargamiento del tallo más rápido, aumentando su

sensibilidad. Si la germinación de las semillas es retardada por los aleloquímicos, esto

refleja un retraso en el desarrollo de la plántula, generando un efecto directo negativo

sobre la especie receptora atribuido al compuesto activo.

4.3 Evaluación de la actividad antibacteriana

En la siguiente (Fig. 33), (tabla anexo 5), se muestra el comportamiento de inhibición de

los microorganismos evaluados frente a los antibióticos de prueba al medir su halo de

inhibición. Por medio de un antibiograma se muestra una tendencia de inhibición mayor

a una concentración de 1000 ppm, y a una concentración de 62,5 ppm esta tendencia se

ve disminuida al tratarse P. aeruginosa frente a ampicilina, sugiriendo que este

microorganismo adquirió cierta resistencia al antibiótico de prueba.

Un antibiograma nos da una idea sobre la presencia o ausencia de sustancias con

actividad antimicrobiana. Esta técnica cualitativa, puede ser evaluada por diversos

métodos para determinar antimicrobianos con buena sensibilidad, reproducibilidad,

utilizando cantidades pequeñas de la sustancia a evaluar, además de la facilidad para

trabajar con diferentes cepas de microorganismos (valgas et al., 2007).

GRUPO POLIFENOLES

57

62.5

125

250

500

1000

0

10

20

30

40

50E. Coli - Amoxicilina

E. Coli - Ampicilina

P. Aeroginosa - Ampicilina

P. Aeroginosa - Amoxicilina

Concentración de antibióticos (mg/mL)

Pro

me

dio

ha

los

de

in

hib

ició

n (

mm

)

Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba

Los resultados obtenidos para la evaluación de la actividad antibacteriana (tabla 4) frente

a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F evidencian que estas no presentaron actividad alguna

frente a la inhibición de los microorganismos estudiados.

Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana

Concentración 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 125 ppm 62,5 ppm

Esc

her

ich

ia c

oli

Amoxicilina + + + + -

Ampicilina + + + + -

F1-C - - - - -

F1-D - - - - -

F1-F - - - - -

Pse

ud

om

on

as

aer

ugin

osa

Amoxicilina + + + + -

Ampicilina + + + + +

F1-C - - - - -

F1-D - - - - -

F1-F - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

58

(+): Presenta halo de inhibición; (-): no presenta halo de inhibición.

El comportamiento de las fracciones polares obtenidas de H. trachyphylla sugiere que

estas no son promisorias frente a la actividad antibacteriana. Esto debido a que

posiblemente no cuentan con antimicrobianos potenciales o, los que allí se podrían

encontrar están en muy bajas concentraciones. Esto concuerda con trabajos previos, en

los cuales se ha determinado la actividad antibacteriana de el extracto isopropanol-Agua

(65:35), y algunas fracciones apolares obtenidas de H. trachyphylla frente a cepas de

Salmollena gallinarum y Salmonella thyphymurium, evaluadas por el método de

perforación en placa de agar. (Isaza y Jimenez, 2005).

Otro estudio sobre esta planta realizado por el grupo Polifenoles, sugiere la presencia de

compuestos tales como alcanos, esteres y ácidos como 6-octadecanoico y octadecanoico

a los cuales no se les atribuye acción antimicrobiana alguna (Erira y Jiménez, 2012).

Con lo anterior se corrobora que no existen hasta el momento antecedentes que sugieran

actividad antimicrobiana alguna a extractos o fracciones obtenidas de la planta H.

trachyphylla.

Aunque en este estudio se buscaron compuestos del tipo flavonoide, taninos, fenoles y

ácidos fenólicos, sustancias a las cuales se les atribuye alguna actividad antibacteriana,

estas si se han encontrado en algunas especies de la familia melastomataceae.

4.4 Pruebas de caracterización química

Se realizaron pruebas químicas coloreadas a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F, dando

positiva la prueba del cloruro férrico a las fracciones F1-D y F1-F con una coloración

verde claro que es confirmatoria para compuestos del tipo taninos derivados del ácido

protocatéquico. De igual forma, también se utiliza para determinar la presencia o

ausencia de compuestos de tipo fenoles.

Tabla 5. Pruebas para caracterización química

Fracción Cloruro

férrico

Acetato

de plomo

Shinoda Gelatina -

sal

Taninos

hidrolizables

Taninos

condensados

F1-C - - - - - -

F1-D + (verde) - - - - -

F1-F + (verde) - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

59

4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F

4.5.1 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 260 nm

Según los perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F tomados a 260

nm,( Fig. 34, 35, 36) muestran picos de absorción a 3,187, 3,460 y 3,513 minutos. Sus

espectros de absorción entre los 200 y 400 nm no mostraron absorciones significativas,

en las que se puedan correlacionar estas bandas a compuestos del tipo fenólico como

taninos, flavonoides o ácidos fenólicos.

Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm

Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm

Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm

GRUPO POLIFENOLES

60

4.5.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 330 nm

De igual forma, los perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F

tomados a 330 nm, (Fig. 37, 38, 39) muestran picos de absorción a 3,187, 3,433, 3,467 y

3,513 minutos. Los espectros de absorción entre los 200 y 400 nm no mostraron

absorciones significativas, en las que se puedan correlacionar estas bandas a compuestos

del tipo fenólico como taninos, flavonoides o ácidos fenólicos.

Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm

Figura 38. Cromatograma fracción F1-D a 330 nm

Figura 39. Cromatograma fracción F1-F a 330 nm

GRUPO POLIFENOLES

61

4.5.3. Análisis por cromatografía de capa delgada (TLC)

Los sistemas utilizados fueron los siguientes: n-hexano-acetato de etilo (7:3),

cloroformo-metanol (9:1), n-hexano-THF-ácido fórmico (60:11:20), acetato de etilo-

diclorometano-metanol (4:1:1), n-hexano-THF-metanol-ácido fórmico (47:11:41:1),

acetato de etilo-diclorometano-metanol (3:1:2), acetato de etilo-diclorometano-metanol

(2:1:3) acetato de etilo-diclorometano-metanol (1:1:4). En estas primeras placas no se

observó una buena separación por parte de los compuestos, por ende se procedió a

ensayar con otros sistemas los cuales fueron: agua-isopropanol (2:8) (fig.a), (4:6) (fig.b),

(6:4) (fig.c), (7:3) (fig.d), (8:2) (fig.e) de las Cromatoplacas de la fracción F1-F

obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4) (Fig. 40).

C D F C D F C D F

C D F C D F

(a) (b) (c)

(d) (e)

Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4)

4.5.4 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides

Se realizaron pruebas de desplazamiento químico a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F

con metóxido de sodio (MeONa; fig. 42, 46, 50), acetato de sodio (AcONa; fig. 42, 46,

50), cloruro de aluminio (AlCl3; fig. 44, 48, 52) con y sin HCl, y ácido bórico (H3BO3)

en comparación con el espectro tomado en metanol de la muestra problema

(Harbone,1980). Estas reacciones representan modelos característicos para análisis de

flavonoides glicosilados y no glicosilados presentes en hojas o flores de algunas plantas.

GRUPO POLIFENOLES

62

Según la literatura estudiada la presencia de hidroxilos fenólicos en posiciones 3 y 4´ es

debida a la interacción con NaOMe que es una base muy fuerte la cual ioniza estos

grupos hidroxilos. Por el contario NaOAc es una base muy débil, que ioniza solo los

grupos fenólicos más ácidos en posiciones 3, 4´ y 7. Con AlCl3 se forman quelatos con

flavonoides o-dihidroxilados, 3-hidroxilados y 5-hidroxilados. En el caso de los o-

dihidroxilados el quelato es inestable a pH ácido, mientras que los quelatos formados

con 3- y/o 5-hidroxilados son estables.

Los resultados obtenidos de los espectros realizados muestran poca información frente a

cada uno de los reactivos de desplazamiento. Aunque se muestra un leve desplazamiento

en las fracciones F1-D y F1-F figuras 48 y 52, respectivamente, al realizar el ensayo con

cloruro de aluminio. Esto puede ser debido a la presencia de compuestos de tipo fenolico

al ser evaluadas las mismas fracciones frente al reactivo de cloruro férrico.

Espectros fracción F1-C Espectros fracción F1-D Espectros fracción F1-F

Figura 41. Espectro fracción

F1-C en MeOH

Figura 42. Espectro fracción F1-D

en MeOH


F1-F en MeOH


F1-C con CH3ONa


con CH3ONa

Figura 46. Espectro fracción F1-F

con CH3ONa


F1-C con CH3COONa

Figura 48. Espectro fracción F1-

D con CH3COONa


con CH3COONa

GRUPO POLIFENOLES

63


F1-C con AlCl3


con AlCl3


con AlCl3

4.6 Separación cromatografía en columna de la fracción F-1 F

La separación cromatografía realizada a la fracción F1-F (Fig. 26) se desarrolló

mediante el sistema de elusión MeOH-agua-i-PrOH por etapas.

Las cromatoplacas de las fracciones obtenidas de la columna se muestran a

continuación:

2 4 6 8 10 12 14 16 18F-1F

Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F

De acuerdo al resultado obtenido en la anterior cromatoplaca (Fig. 53) se procedió a

juntar las fracciones 1 y 2, convirtiéndose está en la fracción F1-F1 (15,0 mg), lo mismo

para la fracción 3 y 4 llamándose F1-F2 (4,0 mg), y de igual forma para la 5,6 y 7 para

formar la fracción F1-F3 (3,1 mg).

GRUPO POLIFENOLES

64

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56


Teniendo en cuanta la cromatoplaca anterior (Fig. 54) se decidió juntar las fracciones de

la 8 y 28 puesto a que no se evidencia ningún compuesto, convirtiéndose esta en la

fracción F1-F4 (7,0 mg), por lo contrario de la 29 y 38 al revelar en luz UV a 254 y 366

nm se observaron compuestos de interés (manchas de color azul), y se juntaron

convirtiéndose en la fracción F1-F5 (22,0 mg), y de la 39 y 52 F1-F6 (20,0 mg) , de la

54 y 94 (Fig. 54) es la fracción F1-F7 (8,0 mg).

58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94


Posterior a esto se procedió a tomar los siguientes espectros UV para cada fracción final,

adicionalmente se muestran las cromatoplacas respectivas:

GRUPO POLIFENOLES

65

Rf = 3,7cm

Figura 56. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F1

Rf = 3,4cm

Figura 57.Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F2

Rf = 2,9cm


GRUPO POLIFENOLES

66

Rf = 2,8cm


Rf = 1,6cm

Rf = 1,9cm


Rf = 2,5cm


GRUPO POLIFENOLES

67

Rf = 1,9cm


De esta manera se obtuvieron de esta separación 7 fracciones, nombradas desde la F1-F1

hasta la F1-F7, con un rendimiento mayor en masa para la fracción F1-F5 (Fig. 63). Al

realizar placa sobre TLC en fase reversa a las fracciones obtenidas, se reveló una

mancha de interés la cual presentaba una coloración azul en las fracciones F1-F3, F1-F4

y F1-F5.

F ra c c io n e s

% d

e r

en

dim

ien

to

F-1

F1

F-1

F2

F-1

F3

F-1

F4

F-1

F5

F-1

F6

F-1

F7

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

Figura 63. Porcentaje de rendimiento de las fracciones F1-F1 hasta F1-F7

Como se tenia tampoca cantidad de las fracciones obtenidas se procedió a realizar

cromatografía preparativa a las fracciones F1-F3, F1-F4 y F1-F5; (Fig. 64, 65, 66) las

cuales presentaban manchas de interés en la cromatografía de capa fina.

Las fracciones se diluyeron en metanol y cada una se sembró en placas de 10x10 cm. El

sistema utilizado fue agua-i-PrOH (6:4). Se reveló con luz UV a longitudes de onda de

254 nm y 366 nm, y se procede a raspar por encima de la placa, donde se podían

observar manchas.

Los resultados obtenidos se ilustran a continuación:

GRUPO POLIFENOLES

68

F1-F3 d

F1-F3c

F1-F3 b

F1-F3 a

Rf =8,2cm

Rf =7,4cm

Rf =5,4cm

Rf =4,1cm

Rf =2,7cm

F1-F3 e

Figura 64. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F3

Rf =8,1cm

Rf =7,9cm

Rf =5,2cm

Rf =3,9cm

Rf = 2,2cm

F1-F4 e

F1-F4 d

F1-F4 c

F1-F4 b

F1-F4 a

Figura 65. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F4

GRUPO POLIFENOLES

69

Rf =7,7cm

Rf =5,0cm

Rf =3,4cm

Rf =2,4cm

Rf = 1,6cm

F1-F5 e

F1-F5 d

F1-F5 c

F1-F5 b

F1-F5 g

F1-F5 a

Rf =7,5cm

Rf =8,4cm

F1-F5 F

Figura 66 Cromatoplaca preparativa fracción F1-F5

Cuando se rasparon las manchas, se coloco cada una en un viales, se les adicionó

metanol y el sobrenadante se paso a otro vial, antes de evaporar el metanol se tomaron

placas en fase reversa (Fig. 67, 68, 69) y en un sistema agua-i-PrOH (6:4) de las tres

fracciones, las cuales se revelaron con luz UV a longitudes de onda de 254 nm y 366

nm.

Las placas se muestran a continuación:

1 2 3 4 5

F-1F3

Figura 67. Cromatoplaca de la fracción F1-F3

GRUPO POLIFENOLES

70

Rf =2,9cm

1 2 3 4 5

F-1F4

Rf =2,5cm

Figura 68. Cromatoplaca de la fracción F1-F4

1 2 3 4 5 6 7

F-1F5

Rf =1,8cm

Figura 69. Cromatoplacas de la fracción F1-F5

Como se puede observar en las placas anteriores (Fig. 68, 69) solo se evidencia

desplazamiento por parte de los compuestos en las placas F1-F4 y F1-F5, los cuales

muestran manchas de color azul, estas manchas se pueden observar mejor en la fracción

F1-F5, como se muestran a continuación:

1 2 3 4 5 6 7

F-1F5

Rf =1,8cm

Figura 70. Cromatoplaca revelada con luz UV a de 254 nm de la fracción F1-F5

De la fracción F1-F3 se recogieron 5 fracciones nombradas como F1-F3A hasta F1-F3E,

de F1-F4 se recogieron 5 fracciones nombradas como F1-F4A hasta F1-F4E y de F1-F5

se recogieron 7 fracciones nombradas como F1-F5A hasta F1-F5G. Según se observó, se

eligieron las fracciones F1-F5D (7,0 mg), F1-F5F (6,0 mg) y F1-F5G (8,0 mg) para su

GRUPO POLIFENOLES

71

posterior análisis por RMN unidimensional de protón 1H y carbono

13C, y

bidimensional HSQC.

GRUPO POLIFENOLES

72

5. CONCLUSIONES

Para el ensayo de germinación frente a semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y

tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) en presencia de agua, se evidencia una

tendencia de germinación mayor, mientras que la germinación frente a DMSO al

0,33% presentó inhibición de la germinación durante el tiempo del ensayo.

Al emplear glifosato a una concentración de 3,7x10-2

M como control de

inhibición de la germinación en ambas especies receptoras, se presentó una

tendencia de inhibición de la germinación para las semillas de lechuga, mientras

que para las semillas de tomate potenció la germinación.

Las fracciones F1-C, F1-D y F1-F provenientes de la fase polar de Henriettella

trachyphylla Triana., a bajas concentraciones (0,05 mg/mL) actúan como agentes

promotores de la germinación. Por el contrario, a medida que las concentraciones

de las fracciones aumentan (hasta 0,8 mg/mL), se presenta disminución en la

germinación de las semillas, actuando como inhibidores leves de la germinación.

Los resultados obtenidos a frente a la actividad antibacteriana de las fracciones

polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana.,

evidencian que estas no son promisorias como antibacterianos. Esto debido

posiblemente a que no cuentan con metabolitos que tienen acción antimicrobiana

o, que se encuentran presentes a muy bajas concentraciones.

GRUPO POLIFENOLES

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GRUPO POLIFENOLES

78

RECOMENDACIONES

Evaluar la actividad antibacteriana de las fracciones polares frente a Escherichia

coli y Pseudomonas aeruginosa, empleando concentraciones más altas.

Determinar la actividad alelopática de las fracciones con plántulas de lechuga,

observando comportamiento de inhibición o estimulación en hipocótilo y

epicotilo.

GRUPO POLIFENOLES

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ANEXOS

Los resultados de la germinación ubicados en las tablas de los anexos 1 y 2, que tienen

el signo (-) representan las semillas que no germinaron, el signo (+) las semillas que

germinaron, y el (0) se coloca como valor acumulado de las semillas ya germinadas en

la hora anterior.

ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga.

H ora 3 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

80

Hora 6 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 9 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

81

Hora 13 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 16 Semilla

1

Semilla

2

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4

Semilla

5

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7

Semilla

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9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

82

Hora 20 Semilla

1

Semilla

2

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3

Semilla

4

Semilla

5

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6

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9

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10

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Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 22 Semilla

1

Semilla

2

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3

Semilla

4

Semilla

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Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

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GRUPO POLIFENOLES

83

Hora 24 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

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Semilla

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Semilla

10

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Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 30 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

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Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

84

Hora 38 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

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9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - + - + -

Caja 2c - - + + - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 47 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

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9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - + + + - + -

Caja 2b - - - - - + 0 + 0 +

Caja 2c - - 0 0 - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

85

Hora 63 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - 0 0 0 - 0 -

Caja 2b - - - - - 0 0 0 0 0

Caja 2c - + 0 0 - + - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 72 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

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5

Semilla

6

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8

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9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - + - 0 0 0 - 0 -

Caja 2b + - + - - 0 0 0 0 0

Caja 2c 0 0 0 - 0 - + - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

86

Hora

111

Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - + 0 + 0 0 0 - 0 -

Caja 2b 0 + 0 + + 0 0 0 0 0

Caja 2c + 0 0 0 - 0 + 0 + -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora

120

Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - 0 0 0 0 0 0 - 0 +

Caja 2b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Caja 2c 0 0 0 0 + 0 0 0 0 +

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Caja 1 DMSO

Caja 2 Blanco

Caja 3 Glifosato

GRUPO POLIFENOLES

87

ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate

Hora 3 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 6 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

88

Hora 9 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 13 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

89

Hora 16 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 20 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

90

Hora 22 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 24 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

91

Hora 30 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 38 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

92

Hora 47 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - - - - - - - - - -

Caja 2b - - - - - - - - - -

Caja 2c - - - - - - - - - -

Caja 3a - - - - - - - - - -

Caja 3b - - - - - - - - - -

Caja 3c - - - - - - - - - -

Hora 63 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a - + + - - - - - + -

Caja 2b + - - - - - - - + -

Caja 2c - + - - + + - - - -

Caja 3a - + - - - - - - - -

Caja 3b + + + + + - - - - -

Caja 3c - - + - + - - - - -

GRUPO POLIFENOLES

93

Hora 72 Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a + 0 0 - - + - - 0 -

Caja 2b 0 - + + - - - - 0 -

Caja 2c - 0 + - 0 0 0 + - -

Caja 3a + 0 - + - + 0 - - +

Caja 3b 0 0 0 0 0 - - - - -

Caja 3c + - 0 - 0 - + - + -

Hora

111

Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a 0 0 0 + + 0 - + 0 +

Caja 2b 0 - 0 0 0 + - - 0 -

Caja 2c - 0 0 + 0 0 0 0 + +

Caja 3a 0 0 - 0 + 0 0 + - 0

Caja 3b 0 0 0 0 0 + + + - +

Caja 3c 0 - 0 + 0 - 0 + + +

GRUPO POLIFENOLES

94

Hora

120

Semilla

1

Semilla

2

Semilla

3

Semilla

4

Semilla

5

Semilla

6

Semilla

7

Semilla

8

Semilla

9

Semilla

10

Caja 1a - - - - - - - - - -

Caja 1b - - - - - - - - - -

Caja 1c - - - - - - - - - -

Caja 2a 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0

Caja 2b 0 + 0 + 0 0 + - 0 -

Caja 2c - 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Caja 3a 0 0 + 0 0 0 0 0 - 0

Caja 3b 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0

Caja 3c 0 + 0 0 0 - 0 0 0 0

Caja 1 DMSO

Caja 2 Blanco

Caja 3 Glifosato

GRUPO POLIFENOLES

95

ANEXO 3. Antibiograma

Escherichia coli con amoxicilina

Diámetro de halo de inhibición en mm

Blanco

DMSO

Amoxicilina

1000 ppm

Amoxicilina

500 ppm

Amoxicilina

250 ppm

Amoxicilina

125 ppm

Amoxicilina

62,5 ppm

Replica #1 5% 46 40 32 20 0

5% 44 36 32 20 0

5% 44 40 32 20 0

5% 48 28 28 20 0

Promedio 5% 45,5 36 31 20 0

Replica #2

5% 44 28 24 16 0

5% 32 28 24 10 0

5% 32 32 20 16 0

5% 24 28 24 14 0

Promedio 5% 33 29 23 14 0

Replica #3 5% 48 28 28 20 0

5% 44 32 28 20 0

5% 44 36 32 20 0

5% 40 36 28 20 0

Promedio 5% 44 33 29 20 0

GRUPO POLIFENOLES

96

Escherichia coli con ampicilina


Blanco

DMSO

Ampicilina

1000 ppm

Ampicilina

500 ppm

Ampicilina

250 ppm

Ampicilina

125 ppm

Ampicilina

62,5 ppm

Replica #1 5% 36 32 24 20 0

5% 38 28 24 20 0

5% 32 32 24 24 0

5% 36 28 24 24 0

Promedio 5% 35,5 30 24 22 0

Replica #2 5% 36 32 24 20 0

5% 32 24 24 20 0

5% 36 28 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

Promedio 5% 35 29 24 20 0

Replica #3 5% 36 32 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

5% 36 32 24 20 0

5% 40 28 28 16 0

Promedio 5% 37 31 25 19 0

GRUPO POLIFENOLES

97

Pseudomonas aeruginosa con ampicilina


Blanco

DMSO

Ampicilina

1000 ppm

Ampicilina

500 ppm

Ampicilina

250 ppm

Ampicilina

125 ppm

Ampicilina

62,5 ppm

Replica #1 5% 60 80 64 10 0

5% 40 40 20 10 0

5% 36 40 10 10 0

5% 24 24 10 10 0

Promedio 5% 40 46 26 10 0

Replica #2

5% 60 40 24 10 0

5% 24 24 24 10 0

5% 28 36 20 10 0

5% 32 28 20 10 0

Promedio 5% 36 32 22 10 0

Replica #3 5% 40 36 24 10 0

5% 28 28 24 10 0

5% 32 20 24 10 0

5% 28 20 28 10 0

Promedio 5% 32 26 25 10 0

GRUPO POLIFENOLES

98

Pseudomonas aeruginosa con amoxicilina


Blanco

DMSO

amoxicilina

1000 ppm

Amoxicilina

500 ppm

amocixilina

250 ppm

Amoxicilina

125 ppm

Amoxicilina

62,5 ppm

Replica #1 5% 32 32 24 24 24

5% 28 28 20 20 20

5% 36 28 20 24 24

5% 36 24 24 24 24

Promedio 5% 33 28 22 23 23

Replica #2

5% 36 40 36 24 20

5% 32 28 28 24 20

5% 40 24 28 24 20

5% 36 28 24 20 20

Promedio 5% 36 30 29 23 20

Replica #3 5% 40 40 40 28 20

5% 36 36 32 24 20

5% 36 28 28 40 20

5% 36 36 32 24 20

Promedio 5% 37 35 33 29 20

GRUPO POLIFENOLES

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