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Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. Gonzalo Greif . Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo. 1. Un poco de historia 2. Secuenciación por método de Maxxam y Gilbert 3. Secuenciación por método de Sanger a. Avances en el método de Sanger (1986‐1996) b. Proyecto Genoma Humano 4. Algunos Métodos de secuenciado masivo a. Pirosecuenciación b. Secuenciado por hibridización (Illumina) c. Otro métodos d. Aplicaciones 1. Un poco de historia. Pasaron 15 años desde el descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN en 1953 hasta la determinación de la primera secuencia de ADN de forma experimental. Algunas de las razones que provocaron esta demora fueron: 1. Las propiedades químicas similares de las diferentes moléculas de ADN dificultaban su aislamiento. 2. El largo de las moléculas de ADN, mucho mayores que las cadenas polipeptídicas de las proteínas, hacían inabordable la secuenciación completa. 3. No se conocían ADNasas específicas. La secuenciación de proteínas se basaba en el uso de proteasas que cortaban en determinados aminoácidos. Sin embargo, algunas moléculas de ARN no ofrecían estas dificultades, en particular las moléculas de ARN de transferencia eran pequeñas y se podían purificar individualmente. Además se conocían ARNasas base‐específicas y se desarrollaron métodos análogos a los utilizados para proteínas. La primer secuencia de un ácido nucleico fue obtenida por Holley y sus colaboradores en 1965 y correspondía al ARN de transferencia de alanina de Escherichia coli. Un evento importante en el desarrollo de los métodos de secuenciación de ADN fue el descubrimiento de las enzimas de restricción de tipo II en 1970. Estás enzimas reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas (en general entre 4 y 6 bases de largo). Estas enzimas proporcionaron un método general para fragmentar largas moléculas de ADN en pequeñas piezas para luego ser separadas por electroforesis en geles de agarosa. A mediados de la década del 70, Frederick Sanger publica el método “más‐menos” (“plus‐minus” method) que permitía la secuenciación de fragmentos de ADN utilizando la enzima ADN polimerasa de E. coli. A fines de esta misma década, Maxxam y Gilbert publican un método alternativo de secuenciación de ADN (método químico) y el mismo Frederick Sanger publica el método que luego se convertiría en el más utilizado durante los siguientes 30 años (método enzimático), como veremos en el punto 3.
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Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.
Gonzalo Greif .
Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo.
1. Un poco de historia
2. Secuenciación por método de Maxxam y Gilbert
3. Secuenciación por método de Sanger
a. Avances en el método de Sanger (1986‐1996)
b. Proyecto Genoma Humano
4. Algunos Métodos de secuenciado masivo
a. Pirosecuenciación
b. Secuenciado por hibridización (Illumina)
c. Otro métodos
d. Aplicaciones
1. Un poco de historia.
Pasaron 15 años desde el descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN en 1953
hasta la determinación de la primera secuencia de ADN de forma experimental. Algunas de las
razones que provocaron esta demora fueron:
1. Las propiedades químicas similares de las diferentes moléculas de ADN dificultaban su
aislamiento.
2. El largo de las moléculas de ADN, mucho mayores que las cadenas polipeptídicas de las
proteínas, hacían inabordable la secuenciación completa.
3. No se conocían ADNasas específicas. La secuenciación de proteínas se basaba en el uso
de proteasas que cortaban en determinados aminoácidos.
Sin embargo, algunas moléculas de ARN no ofrecían estas dificultades, en particular las
moléculas de ARN de transferencia eran pequeñas y se podían purificar individualmente.
Además se conocían ARNasas base‐específicas y se desarrollaron métodos análogos a los
utilizados para proteínas. La primer secuencia de un ácido nucleico fue obtenida por Holley y
sus colaboradores en 1965 y correspondía al ARN de transferencia de alanina de Escherichia
coli.
Un evento importante en el desarrollo de los métodos de secuenciación de ADN fue el
descubrimiento de las enzimas de restricción de tipo II en 1970. Estás enzimas reconocen y
cortan el ADN en secuencias específicas (en general entre 4 y 6 bases de largo). Estas enzimas
proporcionaron un método general para fragmentar largas moléculas de ADN en pequeñas
piezas para luego ser separadas por electroforesis en geles de agarosa. A mediados de la
década del 70, Frederick Sanger publica el método “más‐menos” (“plus‐minus” method) que
permitía la secuenciación de fragmentos de ADN utilizando la enzima ADN polimerasa de E.
coli. A fines de esta misma década, Maxxam y Gilbert publican un método alternativo de
secuenciación de ADN (método químico) y el mismo Frederick Sanger publica el método que
luego se convertiría en el más utilizado durante los siguientes 30 años (método enzimático),
como veremos en el punto 3.
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Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.Gonzalo Greif
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b. Proyecto Genoma humano: La secuenciación del genoma humano se volvió un objetivo realizable una vez establecidas las metodologías de secuenciación de ADN. La discusión formal comenzó en 1985 en Estados Unidos. En 1990, se presentó un proyecto de 5 años en el congreso de Estados Unidos (Human Genome Project). Se estimaba que el proyecto duraría 15 años y el costo rondaría los 3 mil millones de dólares. El proyecto establecía el objetivo de mapear y secuenciar diferentes organismos modelo además de humano. Entre ellos E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster y el ratón (Mus domesticus). El proyecto se convirtió en un esfuerzo de colaboración internacional entre diversos centros de secuenciación en Estados Unidos, Europa y Japón. Cada centro se focalizó en regiones particulares del genoma, que permitieran obtener un mapa. En 1994 se publicó un mapa detallado del genoma humano que incluía el mapeo de 5840 loci con una media de espaciado de 0,7 cM (1 centiMorgan = 106 bases). En 1998, el proyecto público, compitiendo ahora con la empresa Celera (propiedad de Craig Venter) adopta los secuenciadores capilares de Applied Biosystems (ABI3700). En 1999 el proyecto Genoma humano había secuenciado más de mil millones de bases y se publicó la secuencia completa de un cromosoma humano (el cromosoma 22). Para el mismo tiempo, Celera, comenzó a secuenciar el genoma humano con la estrategia de “whole genome shotgun sequencing” desarrollada por C. Venter (explicada más adelante). La secuenciación comenzó en setiembre de 1999 y en junio de 2000 se realizó un ensamblaje inicial de las secuencias obtenidas. Los datos de Celera permitieron el ensamblaje del genoma humano con una cobertura de 5X (ver Cobertura). Además se aumentó la cobertura 3X con los datos públicos. El 25 de junio de 2000, en la Casa Blanca, el
presidente Clinton junto a Francis Collins
(responsable del proyecto público, NIH) y Craig
Venter, anunciaron públicamente la versión
borrador del genoma humano realizada tanto
por el esfuerzo público como privado (Figura 7).
En febrero de 2001, se publicaron los borradores
del consorcio público y del privado en Science y
Nature (Figura 8). Finalmente en el año 2004 se
publicó la versión final del genoma humano.
Cobertura (Coverage):
La cobertura es el número promedio de
secuencias que representan a un
determinado nucleótido en la secuencia
total reconstruida. Puede ser calculada a
partir del largo original del genoma (G), el
número de secuencias (N) y el largo
promedio de las secuencias (L) como:
Cobertura = N x L/G
Ejemplo. Un genoma hipotético de 2000
bases, secuenciado con 24 secuencias de
350 bases de promedio de largo tiene
una cobertura de:
24 x (350/2000) = 4,2 X.
Este valor significa que el genoma fue
secuenciado 4,2 veces. Cuánto mayor
cobertura, menor posibilidades de
errores en la secuencia final.
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4. Algunos Métodos de secuenciado masivo
Pasaron cerca de 30 años desde la publicación del método de Sanger, hasta que apareciera una nueva tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos que no fuera el método de dideoxinucleotidos terminadores. La principal característica de estas nuevas metodologías es la posibilidad de secuenciado masivo de forma paralela, esto significa que el número de secuencias obtenidas durante una corrida supera muchas veces el máximo de 96 secuencias por corrida que se obtienen con los secuenciadores capilares de última generación que utilizan el método de secuenciado de Sanger.
A partir del desarrollo del método de pirosecuenciación (primer método de secuenciado masivo utilizado, 2005), surgen nuevas alternativas de secuenciación que utilizan el mismo principio de dideoxinucleotidos terminadores en sus protocolos, aunque con mejoras innovadoras.
Estos nuevos métodos de secuenciado masivo no ofrecen lecturas tan largas como el método clásico de Sanger, aunque en pocos años se ha mejorado sustancialmente el largo de las secuencias obtenidas y en algunos casos alcanzan longitudes comparables a Sanger.
a. Pirosecuenciación:
El primer método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS), fue publicado en 2005 en Nature, y llevado al mercado por la empresa 454 (luego adquirida por Roche). El resumen de este artículo explica: “Describimos un método escalable, un sistema de secuenciación altamente paralelizable con un rendimiento significativamente mayor que los instrumentos de electroforesis capilar. El aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 99% de precisión en una corrida de 4 horas” (este rendimiento es 100 veces superior a la cantidad de bases secuenciadas en ese tiempo en un secuenciador de 96 capilares).
En el primer artículo, publican la secuenciación de novo del genoma de Mycoplasma genitalium alcanzando cubrir el 96% del genoma y con una precisión de 99,96% en una corrida.
El método consiste en 4 pasos: 1. Fragmentación del ADN (o ARN). 2. Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos. 3. Amplificación clonal (mediante PCR en emulsión). 4. Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en un
soporte sólido y en escala de picolitros. Más en detalle, luego de fragmentar el ADN, se ligan oligonucléotidos adaptadores a cada extremo del ADN. Estas secuencias adaptadoras comunes a todos los fragmentos serán utilizadas, tanto para ligar cada fragmento a las esferas, como secuencias donde se unirán los cebadores de la PCR y además presenta la secuencia donde se unirá el cebador de secuenciación. Una vez ligados los adaptadores, se ligan a las beads (esferas que contienen el complementario a uno de los adaptadores en su superficie), por un método de dilución límite, de modo de obtener un único fragmento unido a una esfera. Se busca, entonces, obtener en cada bead un único fragmento de ADN, el mismo es amplificado mediante PCR en emulsión.
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b. Illumina:
La segunda tecnología de secuenciación masiva que salió al mercado (2006) fue la de Solexa (luego adquirida por Illumina). En esta tecnología, se utilizan nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes al igual que en la Secuenciación de Sanger. Además de la paralelización masiva (es decir la capacidad de realizar millones de secuencias en cada corrida), la diferencia con el método convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen, y desbloquear carbono 3’ de modo que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de secuenciación, haciendo que la incorporación de un nucleótido terminador sea reversible. En este caso, las longitudes obtenidas son menores que los secuenciadores 454 (en la actualidad hasta 150 bases), sin embargo la capacidad de realizar secuencias en paralelo es mucho mayor que en 454 (hasta 250 millones de secuencias). Como resultado es posible obtener hasta 6 x 1012 en una sola corrida. Para dimensionar este número, el genoma humano tiene aproximadamente 3 x 109 bases de largo. Al igual que el método de secuenciación de Roche, los primeros pasos consisten en la fragmentación del ADN y ligación de adaptadores. Luego hay un paso de amplificación (en este caso, la amplificación es en una superficie sólida: “flow cell”, dónde también se dará luego la reacción de secuenciación). Amplificación y Reacción de secuenciación: En el primer paso, la librería se deposita en la flow cell por complementariedad con los adaptadores (1). Luego se produce la amplificación en puente (2 y 3) en sucesivos ciclos (4,5,6,7,8) hasta obtener un cluster con la amplificación clonal del fragmento inicial (8) (Figura 13). Figura 13. Amplificación en puente. Ver descripción en el texto.
En la reacción de secuenciación, se bloquea uno de los adaptadores (1), y se comienza la reacción de secuenciación desde el otro extremo (2) mediante un cebador específico (Figura 14).
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Figura 14. Reacción de secuenciación de Illumina. Ver descripción en el texto.
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Durante la reacción, a diferencia de la pirosecuenciación, se ofrecen los cuatro nucleótidos terminadores marcados cada uno con un fluorocromo diferente (1), al igual que el método de Sanger. Luego de un lavado (2), se obtienen las imágenes y se obtiene la primera base de cada cluster (3). Luego, se elimina el fluorocromo y se desbloquea el Carbono 3, permitiendo que un nuevo nucleótido pueda extender la cadena de ADN naciente (4). Otra vez los cuatro nucleótidos terminadores marcados son ofrecidos a los clusters, comenzando un nuevo ciclo (Figura 15).
Figura 15. Reacción de secuenciación de Illumina. Primer ciclo de secuenciación (1), incorporación de dideoxinucleótidos marcados (2), adquisición de imagen (3), y lavado, desbloqueo, y eliminación de marcado (4).
Los últimos modelos de Illumina permiten secuenciar en paralelo más de 3000 millones de clusters con largos desde 35 a 150 bases (www.illumina.com).
c. Otros métodos:
Desde 2005 hasta la fecha, otras tecnologías de secuenciación masiva han sido desarrolladas y
otras se encuentran en desarrollo y constituyen una nueva generación de secuenciadores
(Tabla 1). Es imposible en este capítulo el desarrollo en profundidad de cada una de ellas, por
lo tanto en la siguiente tabla se muestran otras tecnologías y las fuentes dónde obtener mayor
información de cada una de ellas.
Algunas de estas tecnologías (SMRT, Helicos) proponen la secuenciación a partir de una única
molécula de ADN en tiempo real. Una de ellas (Pacific Biosciences) en teoría no tiene límite en
cuánto al largo de las secuencias generadas y eventualmente podría secuenciar cromosomas
enteros en una única lectura (www.pacificbiosciences.com).
Otras, como Oxford nanopore e Ion Torrent (recientemente lanzada al mercado) ofrecen
novedosas soluciones y no requieren marcación fluorescente ni cámaras registradoras de
imágenes. En particular, Ion Torrent (ver recuadro J. Rothberg), se basa en el registro de los
cambios de pH producidos durante la incorporación de bases durante la síntesis de ADN. Se
trata de micropHímetros que reducen notablemente los costos de secuenciación
(www.iontorrent.com) y prometen ser herramientas útiles en el área de diagnóstico.
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Genoma Humano y Secuenciación masiva:
Como ya vimos antes, la secuencia del genoma humana se publicó en 2004. La secuenciación de este
genoma tuvo un costo aproximado de 3000 millones de dólares y cerca de 20 años de trabajo. En
octubre de 2007, se publica el primer genoma de un único individuo (J. Craig Venter), realizado por el
método de shotgun y secuenciación Sanger. El costo de este genoma fue aproximadamente 70 millones
de dólares y una duración de 4 años.
El primer genoma humano secuenciado con la tecnología 454 fue el del Dr. James Watson, a un costo
de 1 millón de dólares y en dos meses (2008). El costo ha continuado bajando y se han reportado la
secuenciación de un genoma humano por menos de 100.000 dólares.
Varios proyectos tienen como objetivo la secuenciación de más individuos, entre el ellos “The Cancer
Genome Atlas” y “1000 Genome project”.
Hace tan solo 10 años, 2 dedos eran suficientes para contar el número de genomas secuenciados. En
2009, alcanzaban los dedos de ambas manos. Hoy, es difícil de saberlo exactamente, pero un
relevamiento realizado por la revista Nature, indica que cerca de 30.000 genomas humanos estarán
secuenciados para finales de 2011.
d. Aplicaciones
La producción de un gran número de lecturas a bajo costo permite la aplicación de las plataformas de secuenciado masivo en muchas aplicaciones, y es imposible describir todas ellas aquí. La primera aplicación obvia es la secuenciación de genomas (ver recuadro Genoma Humano y Secuenciación masiva) y la precisa anotación de genes (sitios de splicing, poliadenliación, secuencias 5’ y 3’ UTR, etc). Dentro de las primeras aplicaciones encontramos la secuenciación de ARN (ej. descubrimiento de ARN pequeños, nuevas variantes génicas, nuevos genes, etc.) y amplicones de PCR (secuenciado de ARNr16S y su aplicación en metagenómica como veremos en el siguiente párrafo). Asimismo, la posibilidad de cuantificación de transcriptos que ofrece esta tecnología (RNA‐seq), la vuelve una alternativa a los experimentos de microarreglos. La secuenciación para identificar marcadores epigenéticos, identificar interacción ADN‐proteína, determinar estructura de cromatina (ChIP‐Seq, Methyl‐seq, DNase‐seq) son aplicaciones cada vez más utilizadas. La metagenómica es el estudio genómico de microorganismos por la extracción directa de ADN de una comunidad microbiana. La aparición de la secuenciación masiva ha facilitado a los investigadores la tarea de identificación y caracterización de diferentes microogranismos, en diferentes ambientes. En la sección de lecturas recomendadas se ofrecen revisiones bibliográficas de cada una de estas aplicaciones para que el lector profundice en ellas.
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.Gonzalo Greif
16
Lecturas recomendadas: 1. Sanger F. Coulson R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed
synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., 94, 441‐448 (1975). Método “más‐menos” de Sanger.
2. Maxam A. and Gilbert. A new method for sequencing DNA. PNAS, 74 (2), 560‐564, (1977). Articulo dónde se describe método químico de secuenciación de ácidos nucleicos.
3. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. DNA sequencing with chain‐terminating inhibitors 4. PNAS, 74 (12), 5463‐5467 (1977). Artículo de Sanger dónde describe el método de
secuenciación utilizando dideoxinucleótidos. 5. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Nobel lecture, 8 December
1980. 6. Venter, C. et al. The Diploid Genome Sequence of an Individual Human. PLOS Biology, 5
(10), (2007). Publicación de genoma de Craig Venter. 7. International Human Genome Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the
human genome. Nature 431, 931–945 (2004). 8. Margulies, M. et al. Genome sequencing in microfabricated high‐density picolitre reactors.
Nature 437, 376–380 (2005). Los autores describen el desarrollo de la primer tecnología de secuenciado masivo, y realizan el ensamblaje de novo del genoma de Mycoplasma genitualium utilizando pirosecuenciación.
9. Bentley, D. R. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature 456, 53–59 (2008). Artículo de los desarrolladores de Illumina, reportando el uso de esta tecnología para la secuenciación de un cromosoma humano.
10. Wang, Z., Gerstein, M. & Snyder, M. RNA‐Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev. Genet. 10, 57–63 (2009). Review sobre uso de tecnologías de secuenciado masivo para análisis de transcriptomas (RNA‐seq).
11. Park, P. J. ChIP–seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Rev. Genet. 10, 669–680 (2009). Revisión sobre ChIP‐seq.
12. Morozova, O.,Hirst, M., Marra, M. Applications of New Sequencing Technologies for Transcriptome Analysis. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 10,135–51 (2009). Revisión NGS.
13. Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A. & Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55, 856–866 (2009). Se trata de un review sobre metagenómica.
14. Zhou, X., Ren, L., Meng, Q., Li, Y., Yu, Y., Yu, J. The next‐generation sequencing technology and application. Protein Cell, 1(6), 520–536 (2010). Revisión NGS.
15. Metzker, M.L. Sequencing technologies — the next generation. Nature Reviews Genetics 11, 31‐46 (2010). Revisión NGS.
16. Human genome: Genomes by the thousand. Nature 467, 1026‐1027 (2010). Revisión secuenciadores instalados y genomas secuenciados.
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Otros recursos interesantes: 1000 Genomes Project: http://www.1000genomes.org The Cancer Genome Atlas: http://cancergenome.nih.gov The Exome Project: http://www.nhlbi.nih.gov/resources/exome.htm Human Microbiome Project: http://nihroadmap.nih.gov/hmp Personal Genome Project: http://www.personalgenomes.org Craig Venter Institute: www.jcvi.org
