Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak: opiazeoekiko ...€¦ · Opiazeoen eragin kimikoak...
Transcript of Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak: opiazeoekiko ...€¦ · Opiazeoen eragin kimikoak...
Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak: opiazeoekiko menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan
Jakintza-arloa: Medikuntza
Egilea: GORKA LARRINAGA ENBEITA
Urtea: 2002
Zuzendariak: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN, JAVIER GIL GOIKURIA
Unibertsitatea: UPV-EHU
ISBN: 978-84-8438-354-3
Hitzaurrea
Nire ikerketaren ibilbidea EHUko Medikuntza Fakultateko Fisiologia Sailean hasi zen, Fisiologia Zelularreko Laborategian hain zuzen. Talde honek zelula komunikazioan eragina duten sistema peptidikoen ikerketan 25 urte dirau. Peptido bioaktiboak eta hauek eraldatzen dituzten entzimak (peptidasak) eragin zuzena dute hainbat prozesu fisiologikotan eta, ondorioz, sistema hauen desorekek hainbat patologiatan eragiten dute. Euren artean droga psikoaktiboek sortutako menpekotasun prozesuetan.
Opiazeoekiko menpekotasuna, droga-menpekotasunen artean gizartean galera handienak sortu dituena izan da. Morfina eta heroinak menpekotasun psikikoa (droga hartzeko premia kontrolagaitza) eta menpekotasun fisikoa edo abstinentzia eragiteko duten gaitasuna ezaguna da, baina gertaera hauen oinarri neurokimiko eta molekularrei dagokionez oraindik hutsune ugari daude. Interes honek bultzatuta, “Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak. Opiazeoekiko menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan” izenburua duen Tesia egin nuen. Lan honetan opiazeoak hartzeak menpekotasunarekin zerikusia duten garun ataletan peptidasa ezberdinei nola eragiten dion aztertu nuen. Tesia 2003ko uztailaren 16an defendatu nuen. Lanak bere hedapena izan zuen, nazioarteko aldizkarietan 5 artikulu argitaratu zirelarik. Hau dela eta, Tesi honek EHU-k banatzen duen Aparteko Saria jaso zuen 2005ean, Osasun Zientzien atalean.
Honen ostean, taldeak izan duen ikerketa azpilerroetariko batekin erlazionatuta (sistema peptidikoak eta zelula garapen prozesuak), gai berriarekin hasi nintzen: sistema peptidikoen erregulazioa gaixotasun neoplasikoetan. Hau da gaur egun nire ikerketa lerroa, eta honekin batera EHUko Medikuntza Fakultatean fisiologia ikasgaiko irakasle lana betetzen dut.
Gorka Larrrinaga2011
Gizakia eta arratoiaren garuneko peptidasak. Opiazeoekiko
menpekotasunaren eragina neuropeptidoen anderakuntzan.
Doktore-tesia:
Gorka Larrinaga Enbeita
Fisiologia Saila
Medikuntza eta Odontologia Fakultatea
Aurkibidea
Aurkibidea
Doktore-tesia
I. Sarrera
1. Opiazeoak eta barne sistema opioidea 1
1.1. Sarrera historikoa 1
1.2. Opioaren konposaketa 2
1.3. Hartzaile opioideak 3
1.3.1. Deskribapen historikoa eta klasifikazioa 3
1.3.2. Ezaugarri molekularrak 4
1.3.3. Hartzaile opioideen kokapena nerbio sisteman 6
1.3.4. Hartzaile opioideen aktibazioa. Ezaugarri
molekularrak eta efektu fisiologikoak 7
1.4. Barneko peptido opioideak 11
1.4.1. Neuropeptidoak. Orokortasunak 11
1.4.2. Deskribapen historikoa 13
1.4.3. Klasifikazioa, ezaugarri molekularrak, eta kokapena 14
2. Neuropeptidoen anderakuntza 18
2.1. Entzima proteolitikoak 18
2.2. Peptidasak. Deskribapen orokorra 19
2.2.1. Entzefalinen anderakuntza. Aminopeptidasak
eta endopeptidasa neutroa 24.11 22
2.2.2. Beste neuropeptido ezberdinen
anderakuntzan eragiten duten peptidasak 26
3. Opiazeoekiko menpekotasuna 32
3.1. Kontzeptuak 32
3.2. Menpekotasun psikikoa 33
Aurkibidea
Doktore-tesia
3.3. Menpekotasun fisikoa 36
3.4. Menpekotasuna eta barne sistema opioidea 43
3.5. Menpekotasuna eta BPO-en anderakuntza 49
3.6. Menpekotasuna, beste neuropeptidoak
eta hauen anderakuntza 52
II. Helburuak 55
III. Materiala eta metodoak
1. Materiala 59
1.1. Esperimentazio animaliak eta talde esperimentalak 59
1.2. Gizaki garun laginak, postmortem 60
1.3. Ekipamendua 61
1.4. Produktu kimikoak 62
1.5. Soluzioak 63
1.5.1. Soluzio indargetzaileak 63
1.5.2. Entseiu entzimatikoentzako substratu soluzioak 64
1.5.3. Beste soluzio batzuk 67
2. Metodoak 69
2.1. Tratamenduak 69
2.1.1. Morfinarekin egindako tratamendua 69
2.1.2. Abstinentzia sindromearen gogortasunaren
neurria arratoietan. Esperimentu konduktualak 70
2.2. Teknika kirurgikoak 70
2.3. Zatiki azpizelularren lorpena 71
Aurkibidea
Doktore-tesia
2.4. Zatiki azpizelularren purutasunaren froga 75
2.4.1. Entzima markatzaileak 75
2.4.2. Zatiki nuklearra 75
2.4.3. Zatiki sinaptosomala 76
2.5. Peptidasen aktibitatearen determinazio fluorimetrikoa 76
2.6. Proteinen neurketa 78
2.7. Metodo estatistikoa 78
IV. Emaitzak
1. Gizaki eta arratoiaren garun kortexeko
peptidasa ezberdinen banaketa azpizelularra 81
2. Gizaki eta arratoiaren NSZ-ko peptidasa
ezberdinen banaketa erregionala 111
3. Heroinaren efektua giza garunaren kortex
prefrontaleko eta nukleo kaudatuko peptidasa
ezberdinen gain 137
4. Morfinarekiko tolerantzia eta abstinentzi
sindromearen efektua arratoiaren NSZ-ko
gune ezberdinetako peptidasen gain 163
V. Eztabaida
1. Peptidasen banaketa azpizelularra
gizaki eta arratoiaren garun kortexean 213
Aurkibidea
Doktore-tesia
1.1. Peptidasa solugarriak 215
1.2. Mintzari lotutako peptidasak 217
2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren
eta arratoiaren garuneko atal ezberdinetan 222
2.1. Prolil endopeptidasa 223
2.2. Puromizinarekiko sentikorra
den aminopeptidasa (PSA) 225
2.3. Arginil aminopeptidasa edo APB 225
2.4. Beste peptidasak 226
3. Garuneko peptidasa aktibitateak
opiazeoekiko menpekotasunean 228
3.1. Opiazeoekiko menpekotasuna
eta BPO-en katabolismoa 229
3.2. Opiazeoekiko menpekotasuna eta
beste peptido batzuen anderakuntza 234
VI. Konklusioak 237
VII. Bibliografia 239
I. Sarrera
Sarrera
Doktore-tesia
1
1. Opiazeoak eta barne sistema
opioidea.
1.1. Sarrera historikoa:
Opioa, bere eragin psikoaktiboak direla eta, beste edozein narkotiko baino gehiago
erabili izan da historian zehar, alkohola alde batera utzita. Izan ere, opioak beti izan du toki
gailena medikuntzan, gutxienez azken 4000 urteotan terapeutikan ugari erabili da eta
(Snyder eta lank., 1993).
Baina bere erabilpena, baita helburu hedonistikoekin, XIX. Mendearen hasieran
asko zabaldu zen Europa osoan zehar, Britaniar Inperioaren zabalkuntzak Europa eta lo-
belarra ekoiztu eta erabiltzen zuten Ekialdeko herrialdeen arteko merkatal harremanak
hobetzea ekarri baitzuen.
Opiazeoen eragin kimikoak zientifikoki ulertzen, ordea, opioaren osagai aktiboak
isolatutakoan hasi ziren. 1805ean Friedrich Sertürner izeneko kimikari alemaniar batek lo-
belarretik morfina hutsa lortu zuen eta substantzia hau morphium izenaz bataiatu zuen,
Morfeo edo loaren jainko Grekoaren oroimenez. Morfinaren isolamenduak beste sendagai
askoren osagai puruak aurkitzera bultzatu zituen kimikari asko eta horrela joan ziren
agertzen kinina (paludismoaren tratamenduan aitzindaria), kokaina (lehenengo anestesiko
lokala), e.a. Normalean kimikoki puruak diren substantziak erabiltzeak abantaila izaten du
landare-estraktuen aldean, ur-disoluzioetan disolbatu eta zuzenean odol-zirkulaziora injekta
daitezke eta.
1853. urtetik aurrera, Alexander Woodek xiringa hipodermikoa asmatu eta gero,
morfina injektatzea posible bihurtu zen. Bide parenteralez morfinak duen ahalmen
analgesikoa azkarrago eta intentsitate handiagoz lortzen zen eta horregatik kontsumo-mota
hau asko zabaldu zen mende honetan zehar. Adibidez, ezaguna da Iparramerikako guda
Sarrera
Doktore-Tesia
2
zibilak eta guda Franko-Prusiarrak hainbat soldadu bidali zituela etxera morfinarekiko
izugarrizko menpekotasunarekin, “soldaduaren gaitza“ bezala ezagutua garai haietan.
XX. Mendean opiazeoekiko menpekotasuna izurrite bat izan dela esan genezake
baina arduradun nagusia heroina izan da eta ez morfina. Deribatu erdisintetiko hau 1875-an
sortu zen eta Bayer farmazi enpresak eztulkontrako botika bezala merkaturatu zuen
1898an. Ia 25 urtetan ez zen neurririk hartu heroina erabiltzearen aurka, beharbada ahotik
hartzen zen eztulkontrako botikak efektu psikoaktiborik sortzea espero ez zutelako.
60.hamarkadan Estatu Batuetan eta 70. hamarkadan Europan heroinaren erabilpena
asko hedatu zen. Garai haietan emandako drogekiko jarrera aldaketak eta hasiera bateko
heroinaren prezio baxuak heroinazale kopurua nabarmen handitzea ekarri zuen (%1000)
(Escohotado, 1999). Azkenengo hamarkadan heroinaren erabilpena asko jaitsi da. EAEan
adibidez, 1986an 15-24 urteko gazteen artean %2.8ak noizbait heroina probatu zuen,
1996an ordea, %0.6ak (Elzo eta lank., 2000).
Hala ere, hasi berria den XXI. mende honetan opiazeoekiko menpekotasunak
gizartearentzat arazo larri bat izaten jarraitzen du.
1.2. Opioaren konposaketa:
Opioa lo-belarraren (Papaver Somniferum) fruituetatik ateratako erretxina da eta bere
ondorioen arduradun nagusia, morfina (Lorenzo eta lank., 1999). Merkaturatze bide legalek
daramaten opio kantitatea munduko ekoizpenaren erdira baino ez da iristen. Asiaren
hegoekialdean dauden eta “Urrezko Triangelua“ izenaz ezagutzen ditugun lurraldeak
(Laos, Tailandiaren iparraldea eta Birmaniaren iparmendebaldea) dira legez kanpoko
opioaren ekoizle nagusiak.
Oro har lo-belar landare batek eman dezakeen opio gordineko kantitatea 5-10
gramokoa da. Opioaren % 75-80-a substantzi inaktiboak dira eta beste % 20-25a substantzi
aktiboek osatzen dute. Garrantzitsuenak morfina (% 10), narkotina (% 6), papaverina (%
1) eta kodeina (% 0.5) dira.
Sarrera
Doktore-tesia
3
Heroina, morfinari talde azetilo bi gehituz lorturiko eratorri erdisintetikoa da eta
talde horiei esker lipodisolbagarritasun handia du. Horren ondorioz garuneko ehunetara
errazago heltzen da eta sortutako efektuak morfinak sortutakoak baino biziagoak dira.
1.3. Hartzaile opioideak:
1.3.1. Deskribapen historikoa eta klasifikazioa:
Barne sistema opioideoa guztiz ezezaguna izan da 70. hamarkadaren hasiera arte.
Morfina, heroina eta bere antzekoek sortutako antinozizepzioa eta menpekotasuna beste
neurotransmisore sistemen arteko elkarrekintza kontestupean ikasi ohi ziren, adibidez
sistema monoaminergikoa eta kolinergikoa (Akil eta lank., 1998). 50. hamarkadan,
ikertzaile batzuk bazegoela opiazeoekiko espezifikoa den hartzaile bat hipotetizatu zuten
(Beckett eta Casy, 1954) baina ezin izan zuten frogatu barneko “opiazeo antzeko” sistema
honen existentzia. Honela, 1973. urtean aldi berean hiru laborategi ezberdinetan ugaztunen
nerbio sisteman erradiaktiboki markatuta zeuden opiazeoak hartzaile batzuei espezifikoki
lotzen zitzaizkiela aurkitu zuten (Pert eta Snyder, 1973; Simon eta lank., 1973; Terenius,
1973). Aurkikuntza honek barneko substantzia opioideak egon behar zutenaren susmopean
jarri zituen ikertzaileak. 5 urteko epean barneko ligando ugari aurkitu zirenez (entzefalinak,
endorfinak eta dinorfinak), ez zen harrigarria hartzaile berriak ere deskribatzea.
Txakurretan eginiko in vivo ikerketa farmakologikoetan oinarrituz 1976an hiru
hartzaile opioide mota daudela postulatu zuten (Martín eta lank., 1976): µ (morfinarekin
espezifikoki lotzen zena), κ (ketoziklazozinarekin) eta σ hartzailea (SKF-10,047arekin).
Gero, saguaren hodi deferentean eta burmuinean entzefalineei afinitate handiz lotzen zen
δ hartzailea isolatu zen (Lord eta lank., 1977; Chang eta Cuatrecasas, 1979).
Gaur egun σ hartzailea ez da hartzaile opioide bezela onartzen eta beste hirurentzat
proposaturiko barne ligandoak β-endorfina (µ), dinorfina (κ) eta entzefalinak (δ) dira.
Gainera, irizpide fisiologiko eta farmakologikoetan oinarrituz, hartzaile hauen azpimotak
ere deskribatu dira: µ1, µ2, κ1, κ2, κ3, δ1 eta δ2 (Dhawan eta lank., 1996). Lehenengo biei
Sarrera
Doktore-Tesia
4
dagokienez, µ1 hartzaileak morfina eta entzefalinak afinitate handiz ezagutzen ditu eta µ2-a
morfinarekiko selektiboa da (Nishimura eta lank., 1984; Pasternak, 1986).
90. hamarkadan saguan, arratoian eta gizakian δ, κ eta µ hartzaileak klonatzea lortu
da (Dhawan eta lank., 1996). Gainera ORL-1 izena daraman beste hartzaile opioide bat ere
klonatu da (Fukuda eta lank., 1994) eta baita bere barne ligandoak aurkitu ere; orfanina-FQ
(Meunier eta lank., 1995) edo nozizeptina (Reinscheid eta lank., 1995).
Farmakologiako nazioarteko batasunak (Unión internacional de farmacología) beste
terminologia bat proposatu du hartzaile opioideak bereizteko; OP1 (δ), OP2 (κ) eta OP3
(µ) izenak erabiliz hain zuzen (Dhawan eta lank., 1996).
1.3.2. Ezaugarri molekularrak:
Hartzaile (µ, δ eta κ) opioideak G proteinari akoplatutako eta mintz zelularran 7
alfa helize tartekatuta dituzten proteinen superfamilian kokatzen dira. Heuren artean
aminoazido sekuentzi homologia %61-ekoa da (Akil eta lank., 1998).
Agonista opioide batek sortutako hartzaile/G proteina sistemaren kitzikapena,
adenilil-ziklasarengain (AZ) eta Ca2+ eta K+ erreten mota batzuengain eraginez (efektore
sistema deituak), zelula barnera bidalitako seinale batean bihurtzen da (Harrison eta lank.,
1998).
Hartzaile opioideen eta G proteina hauen akoplamendua eta adenilil-ziklasarekiko
ekintza mekanismoak ulertzeko NG108-15 hazkuntza zelulak oso baliagarriak izan dira
ikertzaileentzako (Childers, 1991), zelula hauek hartzaile opioideetan oso aberatsak baitira,
δ hartzaileetan hain zuzen ere (Chang eta lank., 1978). Zelula hauetan opioideek AZ-aren
inhibizioa eta, honen ondorioz, AMP ziklikoaren mailak jaistea eragiten zuten (Sharma eta
lank., 1975). Hain zuzen ere sustantzia opioideak prostaglandina E1, adenosina eta toxina
kolerikoak sortutako AZ-ren estimulazioa inhibitzeko gai direla ikusi zen (Propst eta lank.,
1981). Lerro zelular hau pertusis toxinarekin inkubatuz gero, opioideek sortutako AZ-ren
Sarrera
Doktore-tesia
5
inhibizioa deuseztu egiten zen. Beraz, inhibizio hau hartzaile opioideen Gi edo G0
proteinekiko akoplamenduaren ondorioa da (Hsia eta lank., 1984). Urte batzuk beranduago
eragin berbera konprobatu zen arratoien burmuinean (Duman eta lank., 1988).
Beste alde batetik, µ, δ eta κ hartzaile opioideek Gi/G0 proteina hauekiko
elkarrekintzaren ondorioz Ca2+-ren zelula barnerako konduktantzia jaitsi eta K+-ren zelula
kanporako fluxua handitu dezakete (Grudt eta lank., 1993).
ORL-1 hartzailea ere Gi/G0 proteinekin lotzen da eta AZ eta Ca2+ edo K+
erretenengain eragiten du (Calo eta lank., 2000).
80. hamarkadan hartzaile opioideak G proteina inhibitzaileekin (Gi/G0) lotzen
direla argi gelditu bazen ere, hurrengo urteetan Gs proteina aktibatzaileekin lotu
daitezkeelaren susmoa handituz joan zen (Harrison eta lank., 1998). Adibidez, Crain eta
lankideek opiazeo kontzentrazio oso txikiak erabiliz (nM) atzeko adarreko gongoiletako
hazkuntza neuronetan eintza potentziala luzatu egiten zela ikusi zuten; ekintza kitzikatzaile
bat (1990). Talde berberak, F-11 zelula hibridoetan (hazkuntza neurona berberetan eta
neuroblastoma zelulekin sortuak), hartzaile opioideak bai Gi eta bai Gs proteinekin lotuta
zeudela ikusi zuen (Cruciani eta lank., 1993).
1.3.3. Hartzaile opioideen kokapena nerbio sisteman:
Hartzaile opioideen klonazioa aurrerapausu handia izan da hauen kokapena nerbio
sistema zentralean (NSZ) zehar hobeto ezagutzeko. Izan ere, biologia molekularrezko
teknikek, adibidez in situ hibridazioa eta inmunozitokimika, ordura arte hartzaileen
kokapena ezagutzeko gehien erabili den autorradiografiak baino bereizmen hobea
aurkezten dute. Gainera teknika hauen xehetasuna maila zelularreraino heltzen da, posible
bihurtuz hartzaileak neuronaren zein partetan kokatuta dauden jakitea (Harrison eta lank.,
1998).
µ-hartzaileen lotura-guneen eta mRNA-ren kokapenaren artean elkarrekikotasun
(korrespondentzia) handia dago (Mansour eta lank., 19941).
Sarrera
Doktore-Tesia
6
Arratoietan eginiko autorradiografi ikerketetan, hartzaile hauen dentsitate handiena
kaudatu-putamenean agertzen da. Halaber, kortexean, talamoan, accumbens nukleoan,
hipokanpoan, amigdalan, locus coeruleus-ean, orno-muineko atzeko adarrean, e.a ere ikus
daitezke. Kortexaren kasuan, µ-hartzaileen dentsitatea handia bada ere, mRNA-ren
espresioa txikia da eta gainera banaketa laminar ezberdina du (Delfs eta lank., 1994).
Ezberdintasun hau hipokanpoan, nukleo koklearrean, usaimen bulboan, e.a. ikusi izan da
eta baliteke hartzaile hauek amaiera presinaptikora garraiatzearen ondorioa izatea (Mansour
eta lank., 19942).
µ-hartzaileak nerbio sistema periferikoan ere deskribatu dira; adibidez, arratoiaren
heste-meheko neurona mienterikoetan (Hutchinson eta lank., 1975) eta hodi deferentean
(Lemaire eta lank., 1978).
Giza garunean, µ-hartzaileen dentsitate nagusienak talamoan, amigdalan, kortex
frontalean (lamina I eta IV) eta kaudatu-putamenean daude (Frost eta lank., 1985; Pilapil
eta lank., 1987). µ-hartzaileen mRNA estriatuan, talamoan, hipotalamoan, kortexean,
zerebeloan eta orno-muinean markatu da (Peckys eta Landwehrmeyer, 1999).
δ-hartzaileen eta µ-hartzaileen mRNA banaketa nahiko antzekoa den arren, badira
ezberdintasunak. Adibidez kortexean δ-mRNA mailak handiak diren bitartean, µ-mRNA
nahiko eskasa da (klase bietako hartzaileak ugariak izan arren). Talamoan eta hipotalamoan
berriz, δ-mRNA gutxi (baita δ-hartzaileak ere) eta µ-mRNA ugari agertzen da. Estriatuan
(kaudatu-putamen) eta accumbens nukleoan, mRNA eta hartzaile mota biak azaltzen diren
arren, δ-mRNA lausotuago banatzen da (Mansour eta lank., 19941-2).
Gizakiaren garunean, δ-hartzaileen dentsitate handia ikus daiteke kortexean (lamina
I-II) eta kaudatu-putamenean (Pilapil eta lank., 1987). δ-mRNA, kortexean, kaudatu-
putamenean, hipokanpoan eta amigdalan banatzen da (Simonin eta lank., 1994).
Sarrera
Doktore-tesia
7
Karraskarietan, κ-hartzaile opioidea eta bere mRNA hipotalamoan, talamoan,
amigdalan, klaustroan, atzeko hipofisian eta mesenzefaloko hainbat nukleotan agertzen dira
(Arvidsson eta lank., 1995).
Gizakian κ-hartzaile opioideak kortexean (V eta VI. laminetan), amigdalan eta
klaustroan ikus daitezke (Pilapil eta lank., 1987). κ-mRNAren banaketa µ-mRNA-ren
antzekoa da (Peckys eta Landwehrmeyer, 1999).
Elde eta lankideek hartzaile hauek neuronaren zein alderditan kokatuta dauden
ikertu ondoren zera ikusi zuten: Alderdi batetik, δ-hartzaileak batez ere axoietan kokatzen
zirela, beraz, seguraski gune presinaptikoan funtzionatzen dute gehienetan. Bestetik, µ eta
κ- hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, seguruenik
postsinaptikoki funtzionatuz (Elde eta lank., 1995).
1.3.4. Hartzaile opioideen aktibazioa. Ezaugarri molekularrak eta
efektu fisiologikoak.
Orokorrean, esan daiteke opiazeo bat bere hartzailearekin lotzen denean neuronan
sortutako eragin akutua hau dela: zelularen aktibitate bioelektrikoaren inhibizioa eta
neurotransmisorearen askatzearen inhibizioa edo gutxitzea.
Lehen aipatu bezela, hartzaile opioideak gehienbat G proteina inhibitzaileei (Gi/G0)
lotuta daude. Hartzaile/G proteina sistema honen kitzikapenak adenilil ziklasa eta ioi
erretenez osatuta dagoen efektore sistema bat martxan jartzen du, eta honek zelularengan
aipatutako efektua sortuko du.
Alde batetik, jakina da opiazeoen eraginez boltai menpekoak diren Ca2+ erretenen
inaktibazioa ematen dela (North, 1993), hazkuntza zelula lerro ezberdinetan ikusi den
bezala (Suprenant eta lank., 1990; Seward eta lank., 1991; Schroeder eta lank., 1991; Chieng
eta Bekkers, 1999). Gainera kaltzioak morfinaren efektu analgesikoa gutxitu edo agonista
opioideek burmuineko Ca2+ edukina murriztu dezaketela ere ikusi da. Horrez gain ioi
Sarrera
Doktore-Tesia
8
honen kelanteek (EGTA) edota Ca2+ erretenen antagonistak diren farmako batzuk
(nimodipino, e.a) morfinaren ekintza analgesikoa indartu dezaketela deskribatu da,
arratoietan (Bongianni eta lank., 1986) eta gizakian (Santillán eta lank., 1998). Erreten hauen
inaktibazioaren eta ioi honen zelula barnerako fluxua jaistearen ondorioz mintzaren
potentzialean aldaketak eta neurotransmisore askapenaren inhibizioa ematen da (Lorenzo
eta lank., 1999).
Beste aldetik, ezaguna da µ eta κ-hartzaileen aktibazioak NSZ-ko gune
ezberdinetan K+ konduktantzia handitzen duela (North eta lank., 1987; Wimpey eta
Chavkin, 1991; Grudt eta Williams, 1993). K+ erretenen zabalkuntzak eta ioiaren irteerak
mintzaren hiperpolarizazioa eta neuronaren inhibizio bioelektrikoa sortarazten du.
Azkenik, eta lehen azaldu bezela, opiazeoen akzio akutuaren ezaugarria den adenill
ziklasaren inhibizioa eta AMPz mailaren jaitsierak neurona barneko eta baita nukleoko
proteina askoren fosforilazio egoeran eragingo du. Ondorioz, transkripzio prozesu askoren
aldaketak gerta daitezke, epe batean opiazeoekiko tolerantzia edota abstinentzia sindrome
prozesuen errudun bihurtuz (Lorenzo eta lank., 1999).
Hartzaile opioideak aktibitate fisiologiko askoren modulazioarekin erlazionatu dira.
Orokorrean peptido opioideak edo morfina bezelako alkaloide opiazeoak NSZ edo NSP-an
ematean sortutako ekintza espektrua antzekoa da. Hala ere, eragin horien intentsitatea
ezberdina izango da eratorri opioide mota eta lotutako hartzailearen arabera.
Morfinak afinitate eta indar handiz aktibaturiko µ-hartzaileak oso ezaguna den
efektu analgesikoaren arduradunak dira. Antinozizepzio hau batez ere bai orno-muinean,
muingaineko eta SNP-an kokatutako µ-hartzaileen bitartez sortua da (Chaillet eta lank.,
1984; Stein, 1993). Arnas depresioa, opiazeoen sobredosiak sortutako heriotz-kausa
nagusia, µ eta δ-hartzaileen eraginez ematen da. Beheranzko aurkako akzio farmakologikoa
batez ere µ eta zertxobait δ-hartzaileen bitartez ematen da (Foz-Threlkel eta lank., 1994).
Menpekotasun eta tolerantzian hartzaile opioide mota guztiek dute erantzunkizuna (Civelli
eta lank., 1987). µ-hartzaileari dagokionez, µ1 azpimota opiazeoen akzio analgesikoaren
Sarrera
Doktore-tesia
9
arduraduna den bitartean, µ2-a opiazeoekiko menpekotasuna, abstinentzi sindromearen eta
arnas depresioaren arduraduna dela proposatu zuten Ling eta lankideek (1983; 1984; 1985).
Opioaren eratorriek (naturalek, sintetikoek eta barneko peptido opioideek) sor
ditzaketen efektuak eta parte hartzen duten hartzaileak 1. taulan deskribatzen dira. Gainera
tesiaren gaiarekin bat doalako morfina edo heroinak eragindako toxikapen akutuaren
sintomak 2.taulan aipatzen dira.
Opiazoen ekintzak eta hartzaileak Ekintza Hartzaileak
Minaren inhibizioa µ, δ, κ Arnas depresioa µ, δ Menpekotasun psikikoa µ > κ Menpekotasun fisikoa µ > κ; δ? Tolerantzia µ, δ, κ Euforia eta sedazioa µ Disforia κ Miosia µ, κ Gihar zurruntasuna µ Mugikortasun gastrointestinala µ, δ? Puxikaren mugikortasuna µ Diuresia Inhibizioa µ Aktibazioa κ Bradikardia µ > δ = κ Hipotentsioa δ = κ > µ Akzio endokrinologikoak Prolaktina askapena µ GH askapena δ > µ ACTH askapena µ, κ ADH inhibizioa κ LH inhibizioa µ, δ
1. Taula. Opiazeoen ekintzak eta hartzaileak. (Flórez, 1998).
Sarrera
Doktore-Tesia
10
Opiazeoek sortutako toxikapen akutua Sintoma neurologikoak
Logalea Konbultsioak Koma (dosi altuekin) Miosi simetrikoa Midriasia (anoxia egoeran)
Arnas sintomak Arnas depresioa eta hipoxia Birikietako edema akutua
Sintoma kardiobaskularrak Hipotentsioa Bradikardia Gutxiegitasun kardiakoa eta shock-a Heroinazaleetan substantzia aizuntzaileak eragindakoak Arritmiak (kinina) Gihar-uzkurdura larriak (estriknina)
2. Taula. Opiazeoek sortutako toxikapen akutua. (Lorenzo eta lank., 1999).
Bai terapeutikan eta jolas-kontsumoan erabilitako opiazeo gehienak hiru hartzaile
opioide motekin batu daitezkeen arren, batez ere µ-hartzaileen bitartez gauzatzen dira
eragin gehienak. Lehen aipatu den bezala, heroinak eta bere metabolito aktiboak (6-
monoazetil-morfina), gero morfinan hidrolizatzen dena, heuren egitura liposolugarriagoari
esker efektu analgesiko, euforia eta menpekotasun-sortzaile biziagoak eragiten dituzte. Bada
menpekotasuna sortzeko eragin bizi hau dela eta, heroina ez da terapeutikan erabiltzen eta
munduko farmakopea gehienetatik desagertu da. Bakarrik interes toxikologikoa aurkezten
du (Lorenzo eta lank., 1999).
Sarrera
Doktore-tesia
11
1.4. Barneko peptido opioideak:
1.4.1. Neuropeptidoak. Orokortasunak:
Orain 32 urte transmisio sinaptikoa neurotransmisore sistema klasiko bezela
ezagutzen diren molekula ez-peptidiko batzuen bitartez bakarrik ematen zela uste zen.
Adibidez azetil kolina, noradrenalina, serotonina, e.a.
70. hamarkadan zehar eginiko ikerketa askori esker peptidikoak ziren eta NSZ-ko
transmisore edo moduladore bezela jokatzen zuten sustantzien existentzia onartu zen.
Hauek neuropeptido izena hartu zuten eta hauek sintetizatu eta askatu zitzaketen neuronei
edo neurona taldeari neurona edo sistema peptidergikoa. Ornodunetan neurona peptidergikoak
hipotalamoan aurkitu ziren lehenengoz (Scharrer, 1978). Neurona talde honek bere
hormona peptidiko edukina neurohipofisian (basopresina, oxitozina) edo erdiko
eminentzian (TRH, LHRH eta somatostatina) askatzen zuen.
Orokorrean, neuropeptidoak, beste neurotransmisoreekin konparatuz, kokagune
espezifikoagoa dute, kontzentrazio askoz txikiagoekin aktuatzen dute, neuromodulatzaile
bezela joka dezakete eta sintesi-degradazio mekanismo ezberdinak dituzte.
Ezagutzen diren peptido guztiak (karnosina dipeptidoa eta glutation tripeptidoa
izan ezik) gorputz neuronaleko erribosometan (erretikulu endoplasmiko bikortsuan)
molekula aitzindari peptidiko handi edo pre-pro-proteina bezela sintetisatzen dira (Siegel eta
lank., 1993). Metalo-endopeptidasa batek hidrolizatu ondoren proproteina bezela garraiatzen
dira Golgi aparatura eta handik axoian zehar granulu batzuetan amaiera presinaptikoraino.
Bitartean, hidrolisi eta aldaketa berri batzuk jasaten dituzte metabolito peptidiko aktibo
bihurtu arte. Neurotransmisore klasikoekin deskribatu bezela (Douglas, 1973) neurona
peptidergikoa kitzikatzean, kaltzio-menpeko prozesua jartzen da martxan (Thorn eta lank.,
1978). Mintz presinaptikoaren despolarizazioak boltaiaren menpeko Ca2+-kanaleak zabaldu
eta ioi honen kontzentrazio zelularra igotzen da, neuropeptidoz beterik dauden bixikulak
exositozi bitartez gune sinaptikora askatuz.
Sarrera
Doktore-Tesia
12
Neuropeptidoen inaktibazioa batez ere degradazio metabolikoaren bitartez egiten
da, peptidasa izeneko entzimen bitartez hain zuzen, biologikoki aktiboak diren peptidoak
zatiki inaktibo bihurtuz (Iversen, 1987).
Peptido opioideak
Proopiomelanokortina (POMC)
β-Endorfina (1-31), (1-27)
N-azetil-β-endorfina (1-31, 1-
27)
Proentzefalina
Met-entzefalina
Leu-entzefalina
Metorfamida
Oktapeptidoa
Heptapeptidoa
Prodinorfina
α-Neoendorfina
β-Neoendorfina
Dinorfina A (1-8), (1-17)
Dinorfina B
Leumorfina (Dinorfina B, 1-29)
Hipofisiko peptidoak
ACTH (POMC-tik)
α-MSH (POMC-tik)
Hipotalamoko peptidoak
TRH
LHRH (Gn-RH)
Somatostatina
Kortikoliberina (CRH)
Basopresina (ADH)
Oxitozina
Neurofisina(k)
Peptido gastrointestinalak
P substantzia
Hesteko polipeptido basoaktiboa (VIP)
Kolezistokinina (CCK-8)
Gastrina
Neurotensina
Neuropeptido Y
Bombesina
Insulina
Glukagoia
Beste batzuk
Angiotensina II
Bradizinina
3. Taula. Nerbio sistema zentralean isolatutako neuropeptido nagusiak. (Florez, 1998)
Sarrera
Doktore-tesia
13
1.4.2. Barneko peptido opioideak (BPO). Deskribapen historikoa:
Lehen azaldu bezela, 1973an lehenengoz hartzaile opioideak aurkitu ondoren
barneko sustantzi opioideak egon behar zutenaren susmopean jarri zituen ikertzaileak. Izan
ere, urte bat lehenago, Akil eta lankideek (1972,1976) garuneko gune batzuetan elektrikoki
kitzikatuz lorturiko analgesia naloxonaren bitartez lehengoratu zitekeela ikusi zuten.
Terenius eta Whalström (1974) eta Kosterlitz eta Waterfield-ek (1975) ere garun-estraktuez
osatutako prestakin batzuk opiazeoen antzeko aktibitatea zutela egiaztatu zuten. 1975an
Hughes eta lankideek txerriaren burmuinean opiazeoek bezela jokatzen zuten neuropeptido
bi isolatu zituzten, entzefalina izenaz bataiatuak: Metionina entzefalina (met-entzefalina) eta
leuzina entzefalina (leu-entzefalina).
Hurrengo urteetan endorfinak (Li eta lank., 1976) eta dinorfinak (Goldstein eta
lank.,1979;1981) aurkitu ziren.
Barne peptido hauen arteko erlazio molekularra beren prekurtsore molekularrak
klonatu zirenean argitu zen. Lehenengoz karakterizatu zena, proopiomelanokortina (POMC), β-
endorfina eta ACTH aren prekurtsorea, izan zen (Nakanishi eta lank., 1979). Gero
entzefalinen prekurtsorea, proentzefalina, eta dinorfinena (prodinorfina) klonatu ziren (Comb
eta lank., 1982; Kakidani eta lank., 1982).
Beraz, hamar urte barruan opiazeo-antzeko barne sistema bat egon zitekeela
susmatzetik hartzaile opioideak, beren barneko ligandoak eta hauen prekurtsoreak direnen
hiru geneak identifikatzera pasatu zen.
1997an, endomorfina bezala ezagutzen diren peptido berri bi aurkitu ziren (Zadina eta
lank., 1997).
Sarrera
Doktore-Tesia
14
1.4.3. BPOen klasifikazioa, ezaugarri molekularrak, eta kokapena:
Gaur egun 20 peptido opioide ezagutzen dira. Guztien ezaugarria amino-muturretik
karboxi-muturrera errepikatutako aminoazido sekuentzia da:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
edo
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (met/leu entzefalinen egitura)
Era honetara, BPO-en familia 5-tik 32 aminoazidorainoko (β-endorfina) luzera
izan dezaketen peptidoz osatzen da, guztiek dutelarik gutxienez met edo leu-entzefalina
sekuentzi bat heuren barnean.
Peptido hauek lehen aipatutako hiru prekurtsoreen apurketaren ondorioz
sintetisatzen dira, opioide aktibitatezko molekula bihurtuz.
Met-entzefalina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
Leu-entzefalina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
β-endorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Gly-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-
Thr-Leu--Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu
Dinorfina A (1-17): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-
-Asn-Gln
Dinorfina B(1-13): Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe-Lys-Val-Val-Thr
α-Neoendorfina: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro-Lys
Nozizeptina: Phe-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Ala-
Asn-Gln
Endomorfinak: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2
4. Taula. Ugaztunen neuropeptido naturalak. (Florez, 1998)
Sarrera
Doktore-tesia
15
Proentzefalina (PE) NSZ-ean eta muin adrenalean sintetisatzen da. Tripsina,
endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motatako entzimen eraginez 243 aminoazidotako
proteina honetatik 7 peptido opioide ezberdin sor daitezke. Garrantzitsuenak entzefalinak
(met edo leu entzefalina) dira. Burmuinean isolatutako entzefalina konbertasa izeneko
karboxipeptidasa bat da pentapeptido hauen sintesiaren arduraduna (Hughes, 1983). PE-ak
met-E-ren lau kopia ditu (Akil eta lank., 1998).
Entzefalinez gain heptadekapeptido (Met-E-Arg6-Phe7) bat eta oktapeptido bat
(Met-E-Arg6-Gly7-Leu8) azpimarratu behar dira.
PE eta honen eratorriak NSZ-ko gune askotako neuronek sintetisatzen dituzte.
Gehienak estriatuan, garun kortexean, usainmen tuberkuluan, hipokanpoan, septumean,
talamoan, sustantzia periakueduktal grisean (PAG) eta orno-muineko atzeko adarrean
kokatzen dira. Entzefalinak baita SNPko zuntzetan (neurona aferenteak gehienbat) ere ikus
daitezke (Roques, 1999).
Prodinorfinak (PD) dinorfina A (1-8) (1-17), B (1-13), β-neo-endorfina, e.a. peptido
gordetzen ditu. Proteina hau PE bezain hedatua dago NSZ-ean zehar (Roques, 1999).
Proopiomelanokortina (POMC) opioide aitzindarien artean barne opioideak ez diren
peptidoak gordetzen dituen bakarra da. Izan ere, β-endorfina peptido opioideaz gain,
hormona adenokortikotropoa (ACTH), α eta β-lipotropina (LPH), α eta β-melanotropina
(MSH), e.a. peptidoren prekurtsorea da. Kasu honetan ere molekula hauek sintetisatzen
dituen entzima ezagutzen da, POMC entzima bihurtzailea hain zuzen (Turner eta lank.,
1987). Batez ere neurona hipotalamikoek sintetisatzen duten arren, NSZ-eko hainbat
gunetara proiektatzen dituzte bere axoiak, adibidez nozizepzioarekin erlazionatutako gune
batzuetara (talamoa, formazio erretikularra eta PAG). Aurreko hipofisian ere (oinarrizko
guruin hormonala) POMC kantitate haundiak daudela azpimarratu behar da.
Entzefalinak, dinorfinak eta endorfinak nahiko espezifizitate baxuz lotzen zaizkie
hiru hartzaile opioideei. Entzefalinak δ-hartzailearen lotugai naturalak bezela ezagutzen
dira, baina µ-hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak κ-hartzaileari lotzen zaizkio eta β-
Sarrera
Doktore-Tesia
16
endorfinak µ-hartzailea eta baita δ-hartzailea ia afinitate berez ezagutu ditzake (Roques,
1999).
Gaur egun, bost aminoazidoko egitura amankomun gabeko eta opioide aktibitatea
duten peptido berriak ere ezagutzen dira.
Nozizeptina edo orfanina FQ (OFQ), ORL-1 hartzaile opioidearen lotugai naturala,
17 aminoazidoz osatutako peptidoa da. Bere amino muturreko lehen eta bostgarren
aminoazidoak tirosina eta leu/met izan beharrean, fenilalanina eta threonina dira (Phe-Gly-
Gly-Phe-Thr) (Meunier eta lank., 1995; Reinscheid eta lank., 1995). OFQ-aren prekurtsorea
pronozizeptina edo proorfanina FQ da. Gizakien eta karraskarien NSZ estraktuetan
(Reinscheid eta lank., 2000) eta baita gaizkatan ere klonatu izan da. Arrain espezie honetan
klonatu izanak opioide klase honen eta besteen arteko erlazio ebolutiboa ulertzeko
aurrerapausu bat izan liteke (Danielson eta lank., 2001).
Prekurtsore honen mRNA maila altuak sistema linbikoan deskribatu dira,
nozizeptinak duen estres-aurkako aktibitatea azpimarratuz; gero knock-out arratoietan ikusi
den bezela (Reinscheid eta lank., 2000).
Pronozizeptinak OFQ-z gain peptido biologikoki aktibo bi gorde ditzake. OFQ2-a
adibidez ahalmen analgesiko handia duela deskribatu da (Amodeo eta lank., 2000).
OFQ edo nozizeptina, azkenengo urteetan ikertzaile ezberdinek deskribatutako
opioideen aurkako familia barnean kokatzen dute (Harrison eta lank., 1998).
Endomorfina 1 eta 2 (EM 1 edo 2) µ-hartzaileari afinitate handiz lotzen zaizkion
arren, tetrapeptido hauen aminoazido sekuentziak Tyr-Pro-Trp-Phe edo Tyr-Pro-Phe-Phe
dira (Zadina eta lank., 1997). EM-1 NSZ gune askotan kokatzen da eta EM-2 orno-
muineko atzeko adarrean agertzen da gehienbat. Biak deskribatu izan dira µ-hartzaile
dentsitate handiko guneetan eta NSZ-ren funtzio askotan partaide direla ikusi da (Zadina
eta lank., 1999). Oraindik ez da bere aitzindaria klonatu.
Sarrera
Doktore-tesia
17
Lehen azaldu den bezela, bai barne peptido opioideak eta beste neuropeptido
motak peptidasa batzuen bitartez inaktibatzen dira. Hurrengo atalean, entzima hauen
deskribapen sakona egingo da tesiaren gaiarekin bat doalako.
Sarrera
Doktore-Tesia
18
2. Neuropeptidoen anderakuntza.
2.1. Entzima proteolitikoak:
Sistema biologikoetan ematen diren ia erreakzio guztiak entzimak deritzen
makromolekula espezifiko batzuen bitartez katalizatzen dira. Entzimen ezaugarririk
garrantzitsuenak bere ahalmen katalitikoa (gizakiak sorturiko katalizatzaileak baino askoz
boteretsuagoa) eta espezifizitatea dira.
Entzima proteolitikoak, lotura peptidikoen apurketa hidrolitikoaren katalizatzen
dutenak dira. Hauek sailkatzerakoan bi talde bereiz daitezke:
Proteinasak, bere ekintza proteinen gain egiten duten entzimak dira (ehun baino
aminoazido gehiagoz osatutako egituren gain). Hauek exoproteinasak edo endoproteinasak
(ugarienak) izango dira proteina katearen kanpokaldean edo erdian egiten badute bere
ekintza katalitikoa. Zelula kanpoan (tripsina, errenina, e.a.) edo barnean (katepsinak,
kalpaina,…) kokatuta egon daitezke.
Peptidasak, peptidoen (ehun unitate baino gutxiagoko katea) apurketa
hidrolitikoaren katalizatzaileak dira eta hauek ere exo eta endopeptidasetan sailkatzen dira.
Exopeptidasen barruan aminopeptidasak eta karboxipeptidasak aurkitzen dira. Lehenengoek
amino muturrean (karga positiboduna) eta besteek karboxilo muturrean (karga
negatiboduna) egiten dituzte bere ekintzak. Endopeptidasek peptido erdian ekiten dute,
adibidez; angiotensina eraldatzen duen entzima (AEE), kalpainak eta endopeptidasa
neutroa 24.11.
Entzima proteolitikoak neuropeptido ezberdinen sintesi eta anderakuntzarako
proposatuak izan dira. Sintesiari dagokionez, BPO-en deskribapena egiterakoan azaldu den
bezela, prekurtsore proteiko baten apurketaren ondorioz peptido aktiboak sortzen dira.
Sarrera
Doktore-tesia
19
Peptido aktibo hauen inaktibazioa berriz, peptidasen ekintzaren ondorioz ematen da, zati
inaktibo txikiagoak edo aminoazidoak askatuz (endo edo exopeptidasak diren arauera).
2.2. Peptidasak. Deskribapen orokorra.
70. hamarkadaren bukaeran, Ondetti eta lankideek AEE-ren inhibizioak
hipertentsio-kontrako efektua eragiten zuela ikusi zutenean (Ondetti eta lank., 1977)
peptidasekiko interesa asko suspertu zen. Hiru urte beranduago zink metalopeptidasa
konkretu baten inhibizioak analgesia sor zezakeela ikusi zuten. Entzima hori endopeptidasa
24.11 edo entzefalinasa izenaz bataiatu zuten (Roques eta lag., 1980).
Peptidoen anderatzaileak diren entzimei buruzko ikerketak aurrera joan ahala,
biomolekula hauek (baita beren sustratuak ere) gorputz osoan oso hedatuak daudela argi
gelditu zen. Gainera kontzeptu hau, “peptidasa bat, sustratu bat”, alde batera utzi zen
(Schwartz, 1983; Kenny, 1986). Gaur egun onartuta dago nerbio ehunetan zein besteetan
peptidoak sustratuarekiko espezifizitate nahiko zabala duten entzima kopuru mugatu batek
hidrolizatzen dituela.
Peptidasa hauen artean batzuk mintz zelularrean integratzen dira, bere gune aktiboa
alde extrazelularrean kokatuta dute (ektoentzimak), eta talde prostetikoan zinka daukaten
metaloproteinak dira (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987). Hala ere, badaude
zitosolikoak diren peptidasak (Wagner eta lank., 1981; Hersh, 1982) eta baita gune aktiboa
zelula barnera begira duten peptidasa integralak ere (Dyer eta lank., 1991).
Nerbio ehunetan ia ez da ezagutzen peptido neuroaktiboak birkaptatzeko
mekanismo espezifikorik. Amina biogenikoak edo neurotransmisore aminoazidoak bai
birkaptazioz eta bai anderakuntza azkar baten bitartez inaktibatzen diren bitartean,
neuropeptidoak batez ere peptidasen bitartez anderatzen direla esan daiteke (Iversen, 1987).
80. hamarkadan eginiko ikerketa askotan bai neuronen eta bai zelula glialen mintzetan
peptidasa ugari aurkitu dira, neuropeptidoen inaktibazioaren arduradun nagusiak direla
proposatuz (Turner eta lag., 1985; McKelvy eta Blumberg, 1986; Lynch eta Snyder, 1986;
Turner, 1986).
Sarrera
Doktore-Tesia
20
Aminopeptidasak peptido ezberdinen N-muturreko aminoazidoen lotura
peptidikoa hidrolisatzen dute. Egitura kimikoa argi egon ez arren gehienak talde prostetiko
bezala Zn2+-a daramaten metaloproteinak (Vallee eta Galdes, 1984) edo tiol proteinak
(O’Cuinn eta lank., 1990) direla dakigu. Peptidasa hauen tamaina oso aldakorra da, 25-300
kDa tartekoa (Taylor, 1993).
Orain arte eginiko ikerketa ezberdinek neuropeptido bakoitzarekiko espezifikoak
diren peptidasarik ez dagoela diote. Dirudienez, probableagoa da espektru zabaleko
peptidasa gutxi batzuk neuropeptido askoren anderakuntzaren arduradunak izatea. Hala
ere, oraindik beharrezkoak dira ikerketa gehiago ikuspuntu hau ziurtatzeko.
Sustratuekiko espezifizitate gutxi dutenez eta orokorrean ikertutako izaki bizidun
eta ehun mota gehienetan aminopeptidasa aktibitatea ikus daitekenez entzima hauen
sailkapen zehatza egitea ez da erraza (Taylor, 1993).
Gaur egun peptidasen sailkapena egiteko Enzyme Commission (EC) delakoaren
irizpideak dira onartuenak. Jarraian azaldutako taulan tesi honetarako aztertu diren
peptidasa ezberdinen EC sailkapena azaltzen da:
Sarrera
Doktore-tesia
21
5. Taula. (S) zatiki solugarria, (M) mintzari lotutakoa.
Peptidasak Izen murriztua EC sailkapena
Alanil Aminopeptidasa (S) PSA 3.4.11.14
Alanil aminopeptidasa (M) AP MII (baita PSA ere) 3.4.11.14
Alanil aminopeptidasa N APN edo APM 3.4.11.2
Arginil aminopeptidasa APB 3.4.11.6
Leuzil aminopeptidasa LAP 3.4.11.1
Aspartil aminopeptidasa (S) APA 3.4.11.21
Aspartil aminopeptidasa (M) APA 3.4.11.21
Prolil endopeptidasa (S) PEP 3.4.21.26
Prolil endopeptidasa (S) PEP 3.4.21.26
Piroglutamil peptidasa I (S) PG I 3.4.19.3
Piroglutamil peptidasa I (M) PG I 3.4.19.3
Sarrera
Doktore-Tesia
22
2.2.1 Entzefalinen anderakuntza. Aminopeptidasak eta
endopeptidasa neutroa 24.11:
Entzefalinen anderakuntzan parte hartzen duten entzimak aminopeptidasak,
endopeptidasa neutroa 24.11, karboxipeptidasak, katepsina C eta angiotentsina eraldatzen
duen entzima (AEE) dira, n. irudian ikus daitekeen bezala.
Katepsina C AEE Karboxipeptidasak
Tyr – Gly – Gly – Phe – met / Leu Aminopeptidasak Endopeptidasa neutroa 24.11 1. Irudia. Entzefalinen entzima anderatzaileak.
Hala ere azkeneko 30 urteetan egindako lan askok NSZ-ko entzefalinen
anderakuntzaren arduradun nagusiak aminopeptidasak eta endopeptidasa neutroa 24.11
(entzefalinasa) direla azpimarratzen dute.
70. hamarkadan eginiko lan batzuk entzefalinen erdibizitza nahiko laburra zela bai
“in vivo” zein “in vitro” egoeran adierazi zuten, animaliei pentapeptido hauen dosi
altuekin tratatu eta analgesia ahula eta laburra azaltzen zela ikusi ondoren (Belluzi eta lank.,
1976 ). Gainera tyr–gly edo gly–phe lotura peptidikoak hidrolisiarengandik babestuta zuten
entzefalina sintetikoak eman ondoren analogo hauen botere analgesikoa handiagoa zela
frogatu zen (Pert eta lank., 1976; Fournié-Zaluski eta lank., 1979). Beraz zelulen mintzan
peptidasa aktibitatea zuten ektoentzimak egon behar zirenaren susmoa egiaztatzen hasi zen.
Honela, arratoiaren NSZ-ko estriatuko mintzetan tyr–gly–gly tripeptidoa askatzen zuen
entzima aurkitu zen (Malfroy eta lank, 1978). Entzefalinasa izena hartutako entzima honen
ekintza fisiologikoa frogatuta gelditu zen bere lehenengo inhibitzaile sintetikoa (tiorfana)
Sarrera
Doktore-tesia
23
erabili zenan, honek naloxonarekin itzulgarria zen propietate nozizeptiboa baitzuen
(Roques eta lank., 1980). 1983-an Zn2+-metalopeptidasa hau endopeptidasa neutroa 24.11
bezala deskribatu zen (NEP edo EC 3.4.24.11) (Relton eta lank., 1983).
Bestalde, entzefalinen tyr–gly lotura peptidikoaren apurketa fisiologikoaren
arduraduna aminopeptidasa N zela frogatu zen bere inhibitzailea den kelatorfanak
sortutako analgesiaren ondorioz (Waksman eta lank., 1985). Era berean, Hui eta lankideek
(1983) puromizina antibiotikoarekiko sentikorra zen beste aminopeptidasa bat (puromycin-
sensitive aminopeptidase edo PSA) deskribatu zuten, zeinek entzefalinak hidrolisatu eta tirosina
aminoazidoa askatzen zuen.
Gaur egun aminopeptidasa N eta entzefalinasaren inhibitzaile sintetiko berriak (RB
101) eta kelatorfana bera, animalietan lortutako nozizepzioaren aurkako efektuak direla eta,
etorkizunean opiazeoen alternatiba edo laguntzaile moduan erabil zitezkeen analgesiko
berri bezala proposatu dira (Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble eta lank., 1999). Izan ere,
inhibitzaile hauen eragin analgesikoa arnas-depresio arrisku gabeko efektua dela frogatu da,
opiazeoekin gertatzen ez den bezala (Boudinot eta lank., 2001).
Tesi honetan entzefalinak anderatzen dituzten aminopeptidasen deskribapen zabala
egin denez, hauen adierazpen berezia egingo dugu:
2.2.1.1. Puromizinarekiko sentikorra den alanina aminopeptidasa (PSA edo
EC 3.4.11.14):
Puromizina hazkuntza bakterianoetan isolaturiko antibiotikoa da (Porter eta lank.,
1952). Espektru antibakteriano zabaleko molekula hau entzefalinen anderakuntzaren
inhibitzailea zela ikusi zen orain dela 20 urte, nahiz eta lortutako eragina beste inhibitzaile
batzuena (bestatina adibidez) baino askoz eskasagoa izan (Chaillet, 1983). Urte gutxi
beranduago definituta gelditu ziren garun mintzetan entzefalinak anderatzen dituzten
aminopeptidasa mota bi. Bata, puromizinarekiko sentikorra zena (PSA) (Hui eta lank.,
1983; Hersh eta lank., 1985), eta bestea, ez zena antibiotiko honekin inhibitzen (alanina
minopeptidasa N edo M, APN) (Gros eta lank., 1985; Matsas eta lank., 1985). Hori dela eta
Sarrera
Doktore-Tesia
24
bestatinak, entzima bien inhibitzailea, puromizinak baino nozizepzio aurkako aktibitate
hobea aurkezten zuen.
Entzefalinak anderatzen dituen PSA-k isoforma bi ditu; hau da, egitura berbera
aurkezten duten entzima solugarri bat (alanil aminopeptidasa solugarria) eta mintzari
lotutako beste bat (alanil aminopeptidasa MII edo AP MII). Azken hau ez da mintzan
kokatutako proteina integral bat ez baitu aurkezten mintzari lotzeko domeinu berezirik,
proteina anfitropikoen taldean sartu dutelarik ikertzaile batzuk. Dirudienez, AP MII-ak
mintzean kokatzeko beste proteina integral batzuekin elkarrekiten du (Dyer eta lank., 1990).
PSA garunean azaltzen den aminopeptidasa ugariena da, APN-a baino 50-100 bider
ugariagoa (Hersh eta lank., 1987); aktibitatearen %80-a entzima solugarriari eta %20-a
mintzari lotutakoari dagozkielarik (McLellan eta lank., 1988). Orain dela 6 urte Tobler eta
lankideek (1997) giza PSA klonatu eta neuronetan (ezta glian, ezta garun basoetako
endotelioan) azaltzen zela agertu zuten. Izan ere, AP MII-a garunean espezifikoki agertzen
dela deskribatu den bitartean, forma solugarria oso hedatua dago ehun ezberdinetan,
(bihotza, gihar eskeletikoa, giltzurruna, gibela, e.a.) (McLellan eta lank., 1988).
PSA-k eta APN-ak oligopeptido eta proteina askoren N-muturreko alanina,
tirosina, fenilalanina eta metionina aminoazidoak hidrolisatzen dituzte. Fisiologikoki,
entzefalinez gain, beste oligopeptido batzuen anderakuntzan parte hartzen dutela
deskribatu da (Taylor A, 1993). Adibidez, barne peptido opioideen artean prodinorfinaren
eratorriak diren dinorfina antzeko peptidoak hidrolisatzen dituzte; beti, 13 aminoazido
baino gutxiago dituzten peptidoak direnean. Izan ere, 1989-an Gibson eta lankideak
(beranduago Safavi eta lankideak (1995)), dinorfina A (1-17) -k Leu-entzefalinaren hidrolisia
inhibitzen zuela ikustean, tamaina honetako peptidoak eta handiagoak zitosoleko alanina
aminopeptidasa aktibitatearen erregulatzaileak izan zitezkeela proposatu zuten. Beharbada
ordura arte animali ereduekin egindako garunbideko BPO tratamenduen efektuak zuzenak
eta ez-zuzenak izan litezke. Hau da, efektu ez-zuzena BPO-en anderatzaileak diren
aminopeptidasen inhibizioaren ondorioz gerta liteke.
Azkeneko emaitza hauek aminopeptidasa solugarrien papera nora arte heltzen
denaren eztabaidaren parte dira. Egia esan, gune sinaptikora askatutako BPO-en
Sarrera
Doktore-tesia
25
anderakuntzan gune aktiboa bertarantz zuzendurik duten mintzari lotutako peptidasek
parte hartzen dutela esaten da (Turner AJ, 1986; Tobler AR, 1997). Hala ere, posible
litzateke entzima solugarriek neuropeptidoen anderakuntzan parte hartzea hauek bere
hartzailearekin konplexu bat bezela zelulan barneratu ondoren edo baita entzima bera gune
sinaptikora askatu ondoren (Gibson eta lank., 1989).
PSA-ri dagokionez, Yamamoto eta lankideek (2002) orain duela gutxi entzima hau
nerbio bukaerara garraiatu eta bertan edo gune sinaptikoan bere aktibitatea ematen dela
ziurtatu dute. Baina oraindik ez dago batere argi hain aktiboa den AAP solugarriaren
funtzio fisiologikoa mintzari lotutakoaren berbera edo beste bat denentz.
2.2.1.2 Alanina aminopeptidasa N edo M (puromizinarekiko ez-sentikorra)
(APN edo EC 3.4.11.2):
Entzima hau 1985-an arratoi garun mintzetan isolatu eta entzefalinak anderatzen
dituen entzima dela frogatu zenetik (Gros eta lank., 1985; Waksman eta lank., 1985)
gorputzeko beste organo edo ehunetan ere deskribatu da (giltzurruna, gibela, hesteak, e.a)
(Hersh eta lank., 1987). Azkeneko urteetan, linfozitoen CD13 markatzailea dela ikusi
ondoren, inmunitatearekin erlazionaturiko ikerketa asko egiten ari dira entzima honi buruz
(Shimizu eta lank., 2002).
APN-aren inhibitzaile naturalei dagokionez, PSA eta dinorfina “luzeekin” gertatzen
den bezala, P substantziak eta bradikininak entzima hori inhibitzen duela deskribatu da (Xu
eta lank., 1995).
Giros-en taldeak (1985) APN-ak entzefalinen anderakuntzan PSA-k baino eragin
gehiago duela proposatu zuen eta, ideia honi jarraituz, gaur egun prestatzen ari diren
katabolismo honen inhibitzaile berriak APN-a eta entzefalinasaren inhibitzaileak dira
(Roques BP, 1999). Hala ere, NSZ-an APN-ak bere ekintza nola eta non egiten duen ez
dago argiegi. Egia esan, duela gutxi arte entzima honek bere ekintzaren zati handiena
garuneko endotelio baskularrean egiten duela uste izan da (Solhonne eta lank., 1987). Baina
entzima honen inhibitzaile markatuak erabiliz, APN-a NSZ-ko gune ezberdinetan azaltzen
dela ikusi da (Noble eta lank., 2001).
Sarrera
Doktore-Tesia
26
Beste peptido ezagunen artean APN-ak angiotensina III-a inaktibatu dezakeela ikusi
da (Reaux eta lank., 1999).
Beraz, tesi honen helburuetariko baterantz bideratuz, barne peptidoen
anderakuntzan benetako eragina duten aminopeptidasa bi ezagutzen dira:
Puromizinarekiko Sentikorra den Aminopeptidasa (PSA): Isoforma bi
ditu: Alanina aminopeptidasa solugarria eta AP MII (EC 3.4.11.14).
Alanina aminopeptidasa N: puromizinarekiko ez-sentikorra. (APN, APM
edo EC 3.4.11.2).
2.2.2 Beste neuropeptido ezberdinen anderakuntzan eragiten
duten peptidasak:
2.2.2.1. Prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26):
Prolina biologikoki aktiboak diren peptido askoren aminoazido sekuentzian
kokatzen da, hauen egitura molekularrean eta peptidasa ezberdinekiko erresistentzian
garrantzitsua delarik (Turner AJ, 1986). Lehenengoz 1971an deskribatutako prolil
endopeptidasak (PEP), askorentzako prolil oligopeptidasa, peptido hauek prolina
aminoazidoaren karboxil muturretik hidrolisatzen ditu (Walter eta lank., 1971).
Entzima hau gizaki edo arratoiaren garunaz gain (Kato eta lank., 1980; Wilk S,
1983; Kalwant eta lank., 1991) beste ehun eta organu ezberdinetan maila altuetan
deskribatu da (giltzurruna, testikuluak, gihar eskeletikoa, linfozitoak, fibroblastoak, e.a.)
(Kato eta lank., 1980; Goossens eta lank., 1996).
Hasiera baten bakarrik zitosolean aurkitzen den entzima dela pentsatu izan bada ere
(Dresdner eta lank., 1982) gaur egun mintzari lotutako isoforma bat dagoela dakigu,
Sarrera
Doktore-tesia
27
neuronen kasuan sinaptosoma mailan aurkitu daitekeena hain zuzen (O’Leary eta lank.,
1995 eta 1996).
Ekintza fisiologikoei dagokionez in vitro esperimentuetan P substantzia,
neurotensina, basopresina, angiotensina I eta II, TRH-a, bradikinina e.a peptido anderatu
ditzakeela ikusi da (Welches eta lank., 1993). Ekintza kataboliko honez gain, β-endorfinen
prekurtsorearen prozesamenduan eragiten duela aipatu izan da (Wilk, 1983).
Azkeneko hamarkadan prolil endopeptidasari buruzko ikerketa ugari argitaratu dira,
gaixotasun ezberdinen fisiopatologiarekin erlazionatuta baitago. NSZ-ren kasuan,
Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun neurologikoetan
entzima honen aktibitate aldaketak ikusi dira (Mantle eta lank., 1996). Izan ere, entzima
honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-ren inhibitzaileekin azterketa
preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian (Schneider eta lank., 2002;
Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertu direlarik.
Maila periferikoan entzima hau espermatozoideen mugikortasunarekin (Kimura eta
lank., 2002), glomerulonefritisarekin (Naghetinni eta lank., 2001), sprue edo gaixotasun
zeliakoarekin (Shan eta lank., 2002), e.a erlazionatu da.
Ikus daitekeenez PEP-ren ikerketan hainbat lerro ezberdin zabaldu dira eta, NSZ-ri
dagokionez, entzima honen benetako funtzioa (maila zelular edo azpizelularrean) zein den
ezagutzeko esperimentu asko behar izango direla argi dago.
2.2.2.2. Piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3):
Badira neuropeptido asko bere amino muturrean piroglutamiko aminoazidoa
dutenak; adibidez hipotalamoko hormona jariaerazle (liberina) asko: TRH-a, LHRH-a,
Bombesina, Neurotensina, e.a. N-muturreko aminoazido ziklatu honi esker peptido hauen
erdibizitza tamaina berbereko beste peptidoena baino handiagoa da, peptidasa gehienak
mutur honen hidrolisia egiteko gai ez direlako (Gandarias eta lank., 2000). Hala ere, badira
lotura peptidiko hori anderatzen duten entzima bi:
Sarrera
Doktore-Tesia
28
Piroglutamil peptidasa I-ek, espektru zabaleko aminopeptidasa, piroglutamiko
hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne eta lank., 1983). Entzima hau,
gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean eta beste organo batzuetan isolatu da; baita
ugaztunak ez diren beste animalietan eta bakterioetan ere (Cummins eta lank., 1998). Oso
hurbileko ikerlan batean gizakiaren PG I klonatu da (Dando eta lank., 2003).
Autore gehienak soilik zitosolean aurki daitekeela dioten bitartean (Cummins eta
lank., 1998) badira mintzean entzima hau neurtu izan dutenak eta, beraz, isoforma biko
entzima dela (Alba eta lank., 1995).
Bere paper fisiologikoa neuropeptidoen metabolismoan ez dago oso argi, entzima
solugarri gehienekin gertatzen den bezala. Posible da minduta edo zahartuta dauden
bixikuletatik zelula barnera askatutako edo gehiegi ekoiztutako neuropeptidoen
katabolismoan parte hartzea (O’Cuinn eta lank., 1990; Bauer K, 1987) edota beste entzima
batzuekin ikusi den bezala hauek gune extrazelularrera askatzea eta bertan egitea beren
funtzioa (Vincent eta lank., 1996; Cummins eta lank., 1998).
Gure tesian entzima honen deskribapena egitea aukeratu genuenez beste
piroglutamil peptidasaren aipamena baino ez dugu eginen.
Piroglutamil peptidasa II-a, mintzari lotutako entzima, TRH hormonarekiko edo
antzeko tripeptidoekiko espezifikoa dela onartu da (O’Connor eta lank., 1985). Arratoi
garunean aspalditik isolatua izan den bitartean, lehenengoz 1999an klonatu eta deskribatu
da gizakian (Schomburg eta lank., 1999). Dirudienez, sueroan isolatutako isoforma seriko
bat ere badu (serum tiroliberinasa) eta forma biek dute jatorri genetiko berbera (Cumming eta
lank., 1998; Schmitmeier eta lank., 2002).
2.2.2.3. Aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.21):
Kelly eta lankideek orain 1983an saguaren garun homogenatuen zitosolean N-
muturrean aminoazido azidoak dituzten peptidoak hidrolisatzeko gai zen entzima purifikatu
zuten. 445 kD inguruko entzima honek glutamikoarekiko baino aspartikoarekiko afinitate
gehiago zuenez aspartil aminopeptidasa (APA) izena hartu zuen (Kelly eta lank., 1983). Duela
Sarrera
Doktore-tesia
29
5 urte metalopeptidasa honen DNA sekuentzia ezagutu eta berriro purifikatu zen untxiaren
garun zitosolean, entzima berbera zela ikusiz. Gaur egun bere gune aktiboak ere ezagutzen
dira (Wilk eta lank., 1998 eta 2002). Banaketari dagokionez, gorputzeko ehun ezberdinetan
hedatzen dela diote autore guztiek. Maila zelularrean berriz, entzima zitosoliko bezala
deskribatu izan bada ere mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa aktibitatea ere aurkitu da
(Ramírez-Exposito eta lank., 2000).
Badago aminoazido hondar berdinak anderatzen dituen beste peptidasa bat, glutamil
aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) hain zuzen. Entzima hau beste metalopeptidasa bat da eta
organo edo ehun ezberdinetako (heste meharra, giltzurruna, garuna, endotelioa, timoa, e.a.)
zelulen mintzan kokatzen dela dakigu (Mentzel eta lank., 1996).
Gaur egun, autore batzuk aminopeptidasa A aktibitateari buruz hitzegitean; alegia,
aminoazido azidoak anderatzen dituen aktibitatea aipatzean, entzima bi hauei buruz
hitzegiten dute (Mayas eta lank., 2002). Izan ere, entzima biek dute aktibitate fisiologiko
antzekoa, anderatutako peptidoen artean angiotensina II-a delarik aipagarriena. Peptido
honen hidrolisiaren ondorioz angiotensina III sortzen da, dirudienez garun mailan tentsio
arterialaren igoerarekin zerikusi handia duena. Gainera, azkeneko urteetan aminopeptidasa
A aktibitatearen inhibitzaileekin egindako frogak emandako emaitza itxaropentsuei esker,
molekula hauek (EC33-a adibidez) hipertentsioaren aurkako agente bezala proposatu dira
(Reaux eta lank., 1999).
2.2.2.4. Arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6):
Orain 30 urte gutxi gora behera arratoiaren hainbat ehunetan sustrato bezala
aminoazido basikoak (arginina eta lisina) zituen exopeptidasa aktibitatea identifikatu zen.
Propietate hau dela eta aminopeptidasa B (APB) izena eman zioten (Hopsu eta lank., 1964 eta
1966). Gaur egun zink2+ metalopeptidasa honen kokapen kromosomikoa eta egitura
gizakiaren zeluletan ezagutzen da (Piesse eta lank., 2002).
Bere kokapena zitosolikoa dela esan den arren orain 5 urte Balogh eta lankideak
(1998) arratoiaren feokromozitoma zelula mota berezi batean (PC12 zelulak) entzima hau
jariatu eta mintzaren kanpo alderdian kokatu daitekeela frogatu zuten. Aminopeptidasa
Sarrera
Doktore-Tesia
30
honen aktibitate egokia pH pixkat azidoan ematen da (pH 6.5-6.8) (O’Cuinn, 1997). Honek
konpartimentu azpizelularretara egokitzeko gaitasuna ematen dio, bertan gertaera
fisiologiko ezberdinetan parte har lezakeelarik (Foulon eta lank., 1999).
Lan ezberdinetan leukotrieno hidrolasarekin (LTA4-ren anderatzailea) egitura eta
funtzio erlazioa duela azaldu da, eta gainera Lys-bradikininatik (kalidina) bradikinina
eratzeko gai denez, aminopeptidasa B-ak hantura prozesuetan funtzioren bat joka lezakeela
proposatu da. Gainera beste propeptido edo prekurtsore ezberdinen prozesamenduan
(proentzefalina, prokolezistokinina, e.a) eragiten duela ere deskribatu da (Yasothornsrikul
eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999).
2.2.2.5. Leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1):
Espezifizitate zabaleko aminopeptidasa honek oligopeptido ezberdin asko hidrolisa
ditzake, N-muturrean ez direnean alanina, zisteina edo gly-gly sekuentzia azaltzen edota
azken aurreko aminoazidoa prolina ez denean (O’Cuinn, 1997).
1986an Kohno eta lankideak gizaki gibelaren zitosolean isolatu zuten, Mg2+ edo
Mn2+-arekin aktibatu eta, aminopeptidasa gehienak bezala, bestatinarekin inhibitu daitekeen
metaloentzima dela adieraziz. Kasu honetan LAP-ren pH egokia nahiko basikoa da, 9.5 -
10.5-ekoa hain zuzen. Autore batzuk prolil aminopeptidasa eta LAP entzima berbera dela
iradokitzen dute (Turzynski eta lank., 1990).
1991an Gibson eta lankideek giza garuneko LAP purifikatu eta neuropeptido
ezberdinen gain nola eragiten duen ikertu zuten. Guztien artean leu-entzefalina zen gehien
anderatzen zuena, baina hala ere peptido opioide honekiko espezifizitatea PSA-rena baino
8 bider txikiagoa da. Entzima solugarri honen benetako papera oraindik ez dago oso argi
baina, alanina aminopeptidasa solugarria bezala, ehun askotan hedatua dagoenez zelula
barneko proteinen bioeraldaketa edo turnoverrean erantzunkizun handia izan dezakela
proposatzen du talde honek.
Sarrera
Doktore-tesia
31
Sarrera
Doktore-Tesia
32
3. Opiazeoekiko menpekotasuna.
3.1. Kontzeptuak:
Opiazeoekiko menpekotasuna kausa eta ondorio psikologiko eta sozial
garrantzitsuko fenomeno konplexua da. Bertan substratu biologiko batek (garuna),
denboran zehar agente biologiko baten (opiazeoa) exposiziopean egotearen eraginez,
aldaketa fisiologiko edo biologikoak jasaten ditu. Beraz, menpekotasuna prozesu biologiko
bat dela onartu behar dugu (Nestler eta Aghajanian, 1997).
Droga, menpekotasuna sortzen duen edozein substantzia natural edo sintetikoari
deitzen zaio. Psikiatrek menpekotasun hau diagnostikatzeko Sistema bi onartzen dituzte.
Bata, Osasunerako Mundu–Erakundeak (OME) eratutako CIE-10; eta bestea, Psikiatria
Amerikarreko Batzordeak egindako DSM-IV-a (Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders). Azken honek, droga-menpekotasuna narriadura nabaria sortarazten duten
substantzia psikoaktiboekiko kontsumo-jokabide moldagabeari deritzo (American
Psychiatric Association, 2000).
Gainera bien artean menpekotasun diagnostikoaren irizpide nagusiak ezarri ziren.
ICD-10 (1992) eta DSM-IV-ean (1994) ikus daitezke 7 irizpide hauek:
1. Tolerantziaren sorrera.
2. Abstinentzia sindromearen agerpena.
3. Opiazeoaren erabilpena hasieran nahi izandakoa baino kopuru handiagoan
edo denboraldi luzeagoan.
4. Opiazeo kontsumoa kontrolatu ezina edo kontsumitzeko premia
kontrolagaitza.
5. Opiazeoa lortzeko edo bere efektuak lortzeko denbora asko erabili.
6. Opiazeoaren kontsumoaren ondorioz lan, gizarte edo solas aktibitateen
murrizketa.
Sarrera
Doktore-tesia
33
7. Opiazeo kontsumoaren jarraipena bere efektu kaltegarrien kontzientzia izan
arren.
Irizpide hauetatik hiru edo gehiago agertu badira 12 hilabete jarraian
menpekotasuna bezala katalogatu daiteke. Gainera, lehenengo eta/edo bigarren irizpideak
azaltzean, asaldura horri osagai fisikodun menpekotasun bezala dei diezaiokegu.
Beraz, drogazalea gaixo bezala eta menpekotasuna entitate nosologiko konkretu
bezala onartu eta aztertu behar dira (Leshner, 1997).
Sortzen duten menpekotasun mailari jarraituz OME-ak drogak klasifikatzen ditu
taldeka.
6. Taula. Menpekotasun graduaren arabera eginiko drogen sailkapena (OME).
Menpekotasunaren esanahia ulertzeko beharrezkoa da prozesu biologiko konplexu
hau osatzen duten gertaera bi bereiztea. Menpekotasun psikikoa eta menpekotasun fisikoa.
3.2. Menpekotasun psikikoa:
Drogazaletasuna ondoen definitzen duen ezaugarria menpekotasun psikikoa da.
Morfina eta heroina substantzia menpekotasun sortzaileen adibide klasikoak dira,
garrantzitsuenak OME-ren sailkapena ikusiz gero. Beren eragin akutu edo kronikoen
ondorioz periodikoki edo era jarraian substantzia hartzeko beharrizan konpultsiboa sortzen
dute. Bada jokabide edo premia kontrolagaitz honi (ingeleses craving bezala ezagutua)
1. Taldea Opioa eta eratorriak
2. Taldea Barbiturikoak eta alkohola
3. Taldea Psikoestimulagarriak (kokaina, anfetaminak), extasia, fenciclidina, e.a.
4. Taldea Kannabis-a eta eratorriak, meskalina, LSD, nikotina.
Sarrera
Doktore-Tesia
34
menpekotasun psikikoa deritzogu. Egoera patologiko hau ezarri ahala opiazeoaren
kontsumoa erregularra izatera pasatzen da, drogazalearen saiaketak droga kontsumoa
gutxitu edo gelditzeko ezerezean geratzen direlarik; eta nahiz eta efektu onuragarriak
bakoitzean gutxiago izan eta kontrako efektuak ugariagoak, opiazeoa hartzeko jokabide
konpultsibo horrek jarraitu egiten du.
Eskala ebolutiboan zehar garunak gizakiaren edo espeziearen biziraupenerako
beharrezkoak diren mekanismoak garatu ditu; garuneko sari-zirkuituak hain zuzen ere.
Zirkuitu hauek jokaera erabilgarriak sendotu eta mingarriak direnak ezabatzen dituzte;
honela, bide neuronal hauek plazerrak eta minak, asetze emozionala edo sexualak, goseak,
egarriak eta asetasunak aktibatzen dituzte. Aktibazio honek estimulazio edo asebetetze
egoera mantentzeko premia eragiten du.
Nahiz eta molekularki oso ezberdinak diren droga adiktibo asko egon eta
hauentzako espezifikoak diren hartzaile barietate handia izan arren, guztiek dute ezaugarri
fisiopatologiko amankomun bat, bide mesolinbiko dopaminergikoaren aktibazioa; hau da, sari-
zirkuituen aktibazioa (Nestler, 2001). Sexua, janaria eta edaria era naturalean sari-sistema
honen errefortzatzaileak diren bezala, drogak berdin jokatzen dute baina era patologikoan
(Fernández-Espejo, 2002).
Sari-sistema edo zirkuitu honen osagai nagusiak mesenzefaloko barneko gune
tegmentela (ventral tegmental area edo VTA) eta prosenzefaloko (forebrain) accumbens nukleoa
(estriatuko barnekaldea edo NAC), garun kortex frontala edo prefrontala (PF) eta amigdala
dira (Koob eta Nestler, 1997). VTA-an neurona dopaminergikoen somak aurkitzen dira eta
hemendik NAC-era doaz bere axoiak. Era berean, NAC-etik PF-ra eta amigdalara doaz
bere projekzio gehienak. Gainera, sari-sistema honek beste konexio neuronal asko ditu bai
hipokanpoa, estriatua eta mesenzefaloko edo kortexeko beste gune batzuekin (Fernández-
Espejo, 2000). Sistema konplexu eta integratu honetan neurotransmisore nagusia dopamina
izan arren, beste neurotransmisore erregulatzaile askok parte hartzen dutela deskribatu da
laborategiko ikerketa ezberdinetan (Koob eta lank., 1998; Wickelgren, 1998). Honela,
sistema mesolimbikoan neurona glutamatergikoak, GABAergikoak, serotoninergikoak,
noradrenergikoak eta opioidergikoak aurki daitezke. Azkeneko hauen artean zirkuitu
entzefalinergikoak dira ugarienak eta orokorrean laburrak izaten dira. Hala ere, badaude
Sarrera
Doktore-tesia
35
abstinentzia sindromearen egoera higuingarriarekin (NAC–VTA) edota minaren
erregulazioan zerikusia duten guneekin (hipotalamo laterala–periacueductal grey edo PGA)
loturak dituzten neurona dinorfinikoak eta endorfinikoak hurrenez hurren,
entzefalinergikoak baino zirkuitu luzeagoak osatzen dituztenak (Nestler, 2001).
Lehen esan bezala, menpekotasuna bide mesolinbikoan drogak sortutako asaldura
da eta bertan helburu bezala droga-kontsumoa duen aztura patologikoa ezartzen da. Bide
dopaminergiko honen aktibazioak, VTA-n hasi eta NAC-en bitartez PF-arekin lotzen dena,
garun kortexeko atal honetan hiperaktibitate dopaminergikoa eragiten du. Gertaera honen
esanahia ez dago oso argi baina droga-kontsumoaren ikaste eta garapenarekin erlazioa duela
uste da (Fernández-Espejo, 2002). Izan ere, orain 1980an Mogenson eta lankideek
accumbens nukleoa motibazioa eta ekintza motorearen integrazioarekin erlazionatzen dela
deskribatu zutenetik gaur egunera arte gauza bera frogatu eta osatzen duten ikerketa ugari
egin dira droga ezberdinak erabiliz. Hauen artean animaliekin egindako ikerketa
konduktualak (droga autohornikuntza, lekuarekiko lehentasun baldintzatuaren froga,
autokitzikapen intrakraneala, e.a.) oso erabilgarriak izan dira abusu drogekiko
menpekotasunaren oinarri neurobiologikoak ulertzeko (Wise, 1996).
Ikerketa tresna hauek erabiliz opiazeoek eta beste abusu-drogek sistema
mesolinbiko dopaminergikoa non eta zein eratan aktibatzen duten ezagutu da. Oraindik gai
honetan hainbat hutsune gelditu arren, nahiko ondo definitzen ari da morfina edo heroinak
nola eragiten dioten sari-sistema honi bai drogaren erabilpenaren hastapenetan (akutuki) eta
baita epe luzean (kronikoki).
Shippenberg eta lankideek (1992) opiazeoak VTA-ko neurona dopaminergikoak era
ez zuzenean aktibatzen zituztela proposatu zuten. Izan ere, gune horretan badira neurona
hauek modulatzen dituzten beste neurona gabaergiko inhibitzaileak eta hauen µ
hartzaileekin lotuz opiazeoek azkenengoen inhibizioa eragiten dute. Beraz, morfina edo
heroinak, neurona inhibitzaileen inhibizio honi esker, VTA-ko zelula dopaminergikoen
aktibitatea handitzen dute.
Beste atal batean aipatuko den bezala, drogaren erabilpen kronikoaren ondorioz
neuroegokitze bat gertatzen da. Sari-sistema mailan egokitze hau opiazeoen efektu
Sarrera
Doktore-Tesia
36
higuingarriaren eragilea bihurtzen da, drogazaleak substantzia hartzeko premia azaltzen
duelarik. NAC-etik VTA-ra doazen zuntz gabaergikoak, neuroegokitze hori dela eta,
dinorfinak expresatzen dituzte eta BPO hauen eraginez VTA-ko zelula dopaminergikoen
inhibizioa gertatzen da, abstinentzia sindromearen sentsazio higuingarriaren kausa bihurtuz,
behintzat bere sindromearen lehenengo egunetan (Nestler, 2001). Drogazaleak egoera
motibazional hau ekiditzeko beraz, droga hartzen jarraitu beharko du.
Heroina menpekotasun animali ereduak erabiliz Chang eta lankideek (1998) NAC-
aren erdian (core deritzon gunean) eta PF-an elektrodoak jarriz animaliak droga hartzeko
duen jokabide motorea eta gune hauen aktibitate neuronalaren arteko harreman hestua
dagoela frogatu zuten. Dirudienez droga hartzeko mugimendu sekuentzia NAC-ean eta PF-
an prozesatzen dira. Ez da ahaztu behar NAC-ak sistema extrapiramidalarekin duen
erlazioa eta PF-ak kortex premotorearekin konexioak dituela (Fernández-Espejo, 2000).
Beraz menpekotasun psikikoa, eta menpekotasun fisikoaren alderdi emozionalaren
substratu neuronalak sistema mesolinbiko dopaminergikoan kokatzen dira.
3.3. Menpekotasun fisikoa:
Opiazeoak etengabe edo kronikoki hartzeak bai gizaki edo animalia ereduetan
neuroegokitze fenomeno bat eragiten du, non beharrezkoa bihurtzen den organismoan
droga maila determinatuak mantentzea, organismo eta drogaren artean lokarri bat sortuz
(Lorenzo eta lank., 1999). Neuroegokitze egoera honen osagai nagusiak tolerantzia eta
menpekotasun fisikoa definitzen duen abstinentzia sindromea dira:
3.3.1. Tolerantzia opiazeo dosi berdinekin efektu txikiagoa sortzea edo, beste
era batera esanda, hasierako efektu berberak lortzeko dosiak igo beharrari deritzogu
(Harrison eta lank., 1998). Morfina edo heroinaren kasuan, hauek era jarraian erabiltzean
azaldutako tolerantzia ez da gradu berberean gertatzen opiazeoek sortutako efektu
guztietan. Adibidez analgesia, euforia, loa eta arnas depresioarekiko tolerantzia nahiko azkar
azaltzen da. Berriz, idorreria eta miosia bezalako efektuekiko tolerantzia agertzea askoz
zailagoa da.
Sarrera
Doktore-tesia
37
Substantzia opiazeo batekiko tolerantzia dagoenean, hartzaile berdinarekin lotzen
diren beste opiazeoekin gauza bera gertatzen da (tolerantzia gurutzatua), horregatik
fenomeno honen oinarria farmakodinamikoa dela esan daiteke; hau da, tolerantziak
hartzailea bera, efektore sistema edo azken erantzunarekin zerikusia izan beharko du
(Pineda-Ortiz, 2001). Zentzu honetan ikerketa ugari egin dira neuroegokitze honen
mekanismo molekularrak eta zelularrak azaltzeko eta proposaturiko fenomeno ezagunenak
hauek izan direlarik: hartzaile opioideen desentikortzea (hartzaile eta G proteinen arteko
banantzea), hartzaile opioideen beherantzako erregulazioa edo down-regulation delakoa
(hartzailearen barneratze edo bahiketarengatik edo kopuruaren txikitzearengatik) eta
hartzaile-osteko fenomenoak (adibidez sistema efektoreko entzima ezberdinen gorantzko-
erregulazioa) (Nestler, 1992; Nestler eta Aghajanian, 1997).
Hartzaileen desentikortzea eta bahiketa dira onartuenak azkar azaltzen den
tolerantzia fenomenoari dagokionez (ordu gutxitan hasitakoa) (Palczewski eta Benovic,
1991). Hartzaile opioideen kopuru txikitzeak edo dentsitate galtzearen argumentuak
(Dingledine eta lank., 1983; Tempel eta lank., 1988) gero eta indar gutxiago dauka ez baita
argi ikusten in vivo egoeran eta ez dituelako tolerantziaren ezaugarri klabeak azaltzen
(Harrison eta lank., 1998). Azken urteotan gizaki heroinazaleetan (postmortem) kortex
frontalean ikusitako µ eta δ-hartzaile opioideen dentsitate galtze ezak susmo hori berresten
du (Schmidt eta lank., 2000 eta 2001).
G proteina eta hartzaile opioidearen arteko banantzea azaltzen duten mekanismo
ezberdinak daude. Hartzaile hauen desentikortzea ikertzeko proteinkinasa ezberdinez
fosforilatzen diren hartzaile β-adrenergikoak erabili dira eredu bezala: AMPZ-ren menpeko
kinasak (PKA) eta β-hartzaileen kinasak (G proteinei lotutako hartzaileen kinasak edo GRK).
Bada GRK-k egoera aktiboan dagoen hartzailea fosforilatzean β-arrestina izeneko proteina
baten lotura eragiten da, eta ondorioz hartzaile eta G proteina arteko elkarrekintza
deusezten da, hurrengo fase batean hartzaile fosforilatuaren bahiketa eta barneratzea
eraginez (Freedman eta Lefkowitz, 1996). Kovoor eta lankideek µ-hartzaileen eta G
proteinen banantzea GRK ezberdinen bitartez gertatzen dela deskribatu zuten orain 5 urte
(1998). Hurrengo urtean Appleyard eta lankideak (1999) κ-hartzaile opioideen
Sarrera
Doktore-Tesia
38
desentikortzea kinasa berdinen bitartez gertatzen zela frogatu zuten. Era berean Terwilliger
eta lankideak (1994) opiazeoekin eginiko tratamendu kronikoen ondorioz, GRK eta β-
arrestina mailak NSZ-ko gune ezberdinetan igotzen direla deskribatu zuten. Gizaki
heroinazaleen kortex frontalean mintzari lotutako kinasa hauen maila altuagoak deskribatu
dira ere (Ozaita eta lank., 1998). Baita ere β-arrestina 2-arekiko knock out saguetan
morfinaren efektu analgesikoa luzatu egiten dela frogatu izan da (Bohn eta lank., 1999).
Duela oso gutxi, lehenengoz arratoietan morfinak β-arrestinen mRNA mailak erregulatzen
dituela ikusi da NSZ-ko atal batzuetan, proteina hauen 1 eta 2 isoformen erregulazio
ezberdina ikusi delarik, opiazeoekiko tolerantzia prozesuan funtzio ezberdina joka
lezaketela proposatuz (Fan eta lank., 2003).
µ-hartzaileen eta bere G proteinaren banantzea azaltzen duen beste mekanismo bat,
G proteina hauen azpiunitateen maila aldaketa litzateke. Honi lotuta opiazeoen tratamendu
kronikoak αi/0 azpiunitateen edota β azpiunitateen gutxitzea eragiten duela deskribatu da
(Terwilliger eta lank., 1991; Ventayol eta lank., 1997).
Era berean G proteinen funtzionamenduari eragiten dioten beste proteina batzuk,
fosducina (βγ azpiunitateak α-rekin lotzeko gaitasuna modulatzen duena) edo RGS proteinak
(α azpiunitatearen GTPasa aktibitateari eragiten diotenak) adibidez, tolerantzia mekanismo
honen atzean egon daitezke. 2001ean RGS-2 edo 3 proteinen (ia 20 isoforma ezagutzen
dira) sintesia blokeatuz morfinak edo β-endorfinek sortutako analgesia eskasagoa dela ikusi
zuten Garzón eta lankideek. Bishop eta lankideek (2002) berriz, abstinentzia
sindromearekin erlazio zuzena duen locus coeruleusean RGS-4 proteinen RNAm-ren
modulazio bifasikoa ikusi zuten. Alegia, morfina akutuki ematean RNAm-ren maila
gutxitzea, eta erabilpen kronikoan maila handitzea. Fosduzina edo antzekoei dagozkionez,
proteina hauek antigorputzekin blokeatuz opiazeoen nozizepzio aurkako boterea gutxitzen
dela ikusi da (Garzon eta lank., 2002).
Hartzaileen bahiketa prozesuari dagokionez agonista opiodeak akutuki erabiliz
hartzaile opioideen barneratzea (endozitosia) gertatzen dela deskribatu da (Sternini eta
lank., 1996). Autore batzuk bahitze honek agonistaren eraginkortasun farmakologikoarekin
zerikusia ez duela azpimarratzen dute (Alvarez eta lank., 2002).
Sarrera
Doktore-tesia
39
Kronikoki morfinarekin tratatutako animalien locus coeruleuseko neurona
noradrenergikoen aktibitate elektrikoa neurtuz, potasio korronteen errazte efektuarekiko
µ-hartzailearen desentikortzea gertatzen dela aspaldi frogatu zen (Christie eta lank., 1987).
Efektu honen ondorioz opiazeoak sortutako aktibitate biolektrikoaren inhibizioa eskasagoa
da (tolerantzia). In vitro entseiuetan agonista opioideak akutuki baina kontzentrazio altuetan
jarriz gero µ-hartzaile bitartezko potasio konduktantziaren gutxitzea ikusi zen (Harris eta
Williams, 1991). Opiazeo agonistek sortutako tolerantzia azkarra G proteinei lotutako
potasio erretenen asaldurekin ere erlaziona dagoela uste da (Kovoor eta lank., 1995).
Hartzaile osteko fenomenoei dagokionez, opiazeoak kronikoki ematean zirkuitu
neuronal ezberdinetan maila molekularrean azaldutako aldaketa konpensatzaile ezagunena
AMPz bidearen aktibazioa (up-regulation edo hipertrofia) da. Sharma eta lankideak
neuroblastoma eta glia lerro zelularretan morfina akutuki eta kronikoki erabiltzean AMPz-
ren maila aldaketak aurkitu zituztenetik (1975) hainbat ikerketa egin dira prozesu hau
baieztatuz. Opiazeoak akutuki ematean AMPz-ren bidea (efektore sistema nagusia)
inhibitzen da, baina droga emate hau kronifikatzean bide honen errebote bat gertatzen da
neuroegokitze prozesu berezi baten bitartez (Nestler eta Aghajanian, 1997). Mekanismo
hau menpekotasun fisikoa definitzen duen abstinentzia sindromearen lokarri
nagusienetarikoa da eta sakonki ikertu da sindrome honetan eragina duen NSZ-ko nukleo
noradrenergiko nagusian, locus coeruleusa.
Beraz tolerantzia fenomenoaren mekanismo molekular nagusiak hartzaileen
desentikortzea, bahiketa eta hartzaile-osteko fenomenoak dira.
3.3.2. Abstinentzia sindromea opiazeoa kronikoki hartzeari uztean edo
naloxona bezalako antagonista opioidea hartzean azaldutako seinu eta sintoma taldeari
deritzogu (Lorenzo eta lank., 1999). Hauek, opiazeoak akutuki sortutako efektuen
alderantzizkoak dira, eta heroina edo morfina nahiko azkar iraizten direnez, abstinentzia
sindromea agerpen azkarrekoa, intentsitate handikoa eta luzapen txikikoa izaten da. Hala
ere, efektuen epeei dagokionez, badira ezberdintasunak sindromea antagonista bat
ematearen ondorioz edo berezkoa denean. Lehenengo kasuan, abstinentzia sindromea
antagonista hartu eta zuzenean hasten da, efektuen gailurra ordu batetan azalduz. Berriz,
Sarrera
Doktore-Tesia
40
berezkoa denean, morfina eta heroinaren kasuan, efektuak 12. orduan azalduz doaz, 24-48
ordutan gailurra, eta ia 5 egun iraun ditzake.
Gizakian, seinu eta sintomei dagokionez, lehenengo fase bat dago rinorrea,
aharrausiak, antsietatea eta negar-jarioarekin. Fase gailurrean ile-tentetzea, midriasia, izerdia,
takikardia, urduritasuna, antsietatea, dardarak, insomnioa, min artikularra eta mialgiak
azaltzen dira. Azken fasean sukarra, tripalak, beherako eta gorakoak, berezko eiakulazioa
eta pisu galtzea dira ugarienak.
Animalietan suminkortasuna, urduritasuna, hiperalgesia, jauziak, gorputz-astintzea,
pisu-galtzea, beherakoak, berezko eiakulazioa, garrasiak, agresibitatea, e.a seinu ikus
daitezke (Pineda-Ortiz, 2001).
Sintomatologia zentral eta begetatibo honetan locus coreuleus (LC) izeneko gune
mesentzefalikoaren erantzunkizuna handia zela deskribatu zenetik (Aghajanian, 1978)
badira 25 urte. Abstinentzia sindromean gune noradrenergiko honetako hiperaktibitatea
gertatzen dela frogatzeko α2-hartzaile adrenergikoen agonista den klonidina erabili zuten,
errebotezko efektu hoiek baretu egiten zirela deskribatuz.
NSZ-ko neurona noradrenergikoen ia erdia dituen gune honetan µ-hartzaileen
dentsitatea nahiko altua da (Foote eta lank., 1983). Bertan, sarrera honen 1.3.4 atalean
azaldu bezala, opiazeoak neurona mailan akutuki neuronen aktibitate bioelektrikoa eta
neurotransmisore askapenaren inhibizioa eragiten dute. Efektu hau Gi/G0 proteinei
lotutako µ-hartzaileen bitartez sortzen da, G proteina hoiekin erlazionatutako potasio
erretenak zabaldu (North eta lank., 1987) eta AMPz menpeko sodio erretenak ixten baitira
(Alreja eta Aghajanian, 1993). Opiazeoak akutuki ematean adenilil ziklasaren (AC)
inhibizioa eragiten da (Beitner eta lank., 1987) proteina askoren AMPz-aren menpeko
fosforilazioa gutxitz (Guitart eta Nestler, 1989), eta ondorioz expresio genikoa bezalako
hainbat funtzio zelularri eraginez. Zentzu honetan, CREB (cAMP response element binding)
edo c-Fos bezalako transkripzio faktoreen fosforilazioa gutxitzen dela deskribatu da
(Guitart eta lank., 1992; Hayward eta lank., 1990). Opiazeoekiko menpekotasunean
azaldutako egokitze molekularrak gene espezifikoen transkripzio aldaketen ondorioz izan
litezke.
Sarrera
Doktore-tesia
41
Opiazeoaren tratamendu kronikoaren eraginez AMPz bidearen up-regulation delakoa
gertatzen da, opiazeoek zelulan sortutako inhibizio konstantearekiko mekanismo
konpentsatzaile bezala. Bide honen “hipertrofiak”, kanale kationiko ez-selektiboen
aktibazioa dela medio, neurona noradrenergikoen aktibitate intrinsekoa handitzea eragiten
du (Alreja eta Aghajanian, 1993). Barneko aktibitate hau opiazeoa hartzen jarraituz gero
“baretuta” agertzen da, baina bakoitzean dosi handiagoak behar dira hiperaktibitate hori
ekiditzeko (tolerantzia); eta opiazeoa uztean edo antagonista opioide bat hartzean
abstinentzia sindromea agerian jartzen da.
Goranzko erregulazio fenomeno honetan adenilil ziklasa, protein kinasa A, tirosina
hidroxilasa, Giα eta CREB transkripzio faktorearen expresioa handituta azaltzen dira
(Duman eta lank., 1988; Nestler eta Tallman, 1988; Guitart eta lank., 1992). Protein kinasa
A inhibitzen duten farmakoak zuzenean LC-an jartzean opiazeoekiko abstinentzia
sindromea leundu eta aktibatzaileekin okerragotu egiten dela ikusi da (Punch eta lank.,
1997). Hildo berberean, AC VIII azpimota eta tirosina hidroxilasaren kontzentrazio igotzea
– eta ez PKArena – CREB-aren igotzearekin zuzenean erlazionatuta dagoela frogatu zuten
Lane-Ladd eta lankideek (1997). Urte bat lehenago CREB-a kodifikatzen duen genea ez
zeukaten animalietan abstinentzia sindromearen gogortasuna asko murrizten zela
deskribatu zen (Maldonado eta lank., 1996). Emaitza hauek eta beste batzuk up-regulation
honetan CREB-aren papera funtzezkoa dela adierazten digute (Nestler, 2001). Dirudienez
opiazeoa akutuki hartzean emandako CREB-aren fosforilazio gutxitzeak autoerregulazio
geniko bitartez transkripzio proteina honen sintesia haunditzea dakar (Coven eta lank.,
1998). Hala ere, CREB-aren indukzio honek zein eratan eragiten duen hiperaktibitate
noradrenergikoan zerikusia duten beste entzima edo proteinen transkripzioan ez dago
batere argi. Baliteke fosforilatuta egon ez arren transkripzioa posible izatea edota mailaka
igotzen dagoen PKA-k fosforilatzea (Nestler, 2001).
Menpekotasun psikikoaren mekanismo molekularrak azaltzean esan den bezala,
CREB-aren indukzio hau NAC-eko neuronetan ere agertzen da (Nestler eta Aghajanian,
1997). Transkripzio faktore honen gehitzea NAC-eko neurona talde batean (eta estriatuko
beste atal batzutan) azaldutako dinorfina expresioarekin erlazionatzen da (Shippenberg eta
Rea, 1997). Neurona talde honek VTA-ko neurona dopaminergikoen inhibizioa eragiten du
Sarrera
Doktore-Tesia
42
(κ-hartzaile bitarteko ekintza) eta feed-back mekanismo honen ondorio nagusia
abstinentzia sindromearen sentsazio higuingarria da. Orain urte bi Kish eta lankideek
(2001) heroinazaleen estriatuan eginiko postmortem analisietan dopamina, bere metabolitoa
den azido homobalinikoa, eta tirosina hidroxilasa mailak neurtu zituzten. Kasu guztietan
maila hauek kontrol taldeenak baino heren bat txikiagoak ziren (27-33%). Datu hauek
heroina kronikoki hartzean animali ereduetan gertatutako prozesu berbera adieraztera
ematen digute, heroinazaleetan motibazio egoeraren eta droga beharrizanaren joerari eragin
diezaiokeela proposatuz.
Abstinentzia sindromean LC-a kontrolatzen duen kanpoko osagai garrantzitsu bat
ere badago. Gune honetara entzefalo-enborreko nukleo paragigantozelularretik (PGi) neurona
talde biren aferentziak heltzen dira. Hauek abstinentzia egoeran hiperaktibitatea azaltzen
dute eta molekula ezberdin biren bitartez LC-aren kanpoko eragileak dira egoera
patologiko honetan.
Alde batetik, neurona glutamatergikoak LC-an glutamatoa, aminoazido kitzikatzaile
nagusia, askatzen dute. Hau frogatzen duten lan asko daude: kronikoki morfinarekin
tratatutako animalietan naloxona eman ondoren glutamato mailaren igoerak (Aghajanian
eta lank., 1994), PGi-aren lesioak edo neurotransmisore honen antagonistak (azido
kinurenikoa) sortutako LC-aren hiperaktibitate leuntzea (Rasmussen eta Aghajanian, 1989),
e.a.
Bestetik, beste neurona taldeak oxido nitrikoa askatzen du LC-an gune hau
kitzikatuz. Hildo honetan eginiko ikerketak ere oso ugariak dira: Oxido nitriko sintetasaren
(NOS) inhibitzaile inespezifikoak erabiliz abstinentzia sindromearen intentsitatea leuntzen
dela ikusi da (Kimes eta lank., 1993) baina bere inespezifikotasuna dela eta sortutako
hipertentsioak abstinentziaren tratamendurako deusezten ditu molekula hauek. Vaupel eta
lankideak1-2 (1995) NSZ-ko espezifikoa den NOSnc-arekiko inhibitzaile selektiboak (7-
nitroindazola) abstinentzia era berberean gutxitzeko gai direla eta presio arterialean eraginik
ez dutela ikusi ondoren, terapeutikarako interesgarriak direla proposatu zuten.
Beraz menpekotasun fisikoan emandako aldaketa fisiopatologikoak kanpoko eta
barneko osagai birengatik gertatzen dira: Kanpokoari dagokionez, glutamatoa eta NO-a
Sarrera
Doktore-tesia
43
LC-an askatzen duten neuronen hiperaktibitatea litzateke. Barnekoa berriz AMPz bidean
gertatutako up-regulation delakoa eta CREB-aren indukzioa da. Gainera osagai hau bide
mesolinbikoan abstinentzian azaldutako emozio-egoera negatiboaren arduraduna da
(Nestler, 2001).
3.4. Menpekotasuna eta barne sistema opioidea:
70. hamarkadan gure NSZ-an hartzailez eta hauenganako afinitatea duten peptido
endogenoz osotzen zen barne sistema opioide bat geneukala aurkitu zenetik hona,
opiazeoekiko menpekotasunaren zergatiak ulertzeko egindako ikerketak oso ugariak izan
dira eta fenomeno hau ezagutzeko egindako aurrerapausuak etengabekoak. Gaur egun
menpekotasun psikikoan eta fisikoan eragin nagusia duten NSZ-ko atalak definituta daude
eta ikertzaile gehienen eritziz droga psikoaktibo guztiek era batera edo bestera gune
berdinetan eragiten dute.
Ikusi denez menpekotasun psikikoan sistema mesolinbikoaren aktibazioa da abusu
drogen ekintza nagusia. Sistema honen neurotransmisore garrantzitsuena dopamina den
arren, zirkuitu mesolinbiko hau bere modulazioan eragina duten zuntz opioidergiko anitzez
osatuta dago. Gehienak neurona laburrak dira, entzefalinak edo dinorfinak askatzen
dituztenak, eta zuntz luzeren bat ere badago (dinorfina eta endorfinak) (Nestler, 2001).
Droga kontsumoa kronikoa egin denean lehen azaldutako neuroegokitze prozesua
dela eta drogazaleak droga horren beharrizana azalduko du (craving), bakoitzean dosi
handiagoetan (tolerantzia) bere egoera higuingarri kronikoa gainditzeko. Egoera horren
neurotransmisore arduradun ez-zuzena barne peptido opioide bat dugu (dinorfina). Era
berean, beste NSZ-ko atal batzuetan eta hazkuntza zeluletan deskribatu den bezala,
menpekotasun fisikoa azaltzen duten hartzaile-osteko fenomeno ezberdinen ondorioz
proteina askoren (entzimak, transkripzio faktoreak, erretenak, e.a.) espresioa handitu egiten
dela nahiko argi dago.
Tesi honen helburuetariko bat morfina edo heroinak barne peptido opioideen
metabolismoan zein eratan eragiten duen ezagutzea da. Menpekotasunari buruz hitzegitean
ikusi bezala, opiazeoak hartzean hartzaileen dentsitatea aldatu daitekeen teoriak kontrako
Sarrera
Doktore-Tesia
44
eritzi asko ditu (Harrison eta lank., 1998) eta azken urteotan gizaki heroinazaleen garun
laginetan eginiko ikerketak hartzaileen dentsitate galtzerik ez dagoela frogatu dute (Schmidt
eta lank., 2000 eta 2001). Beraz menpekotasun fisikoaren mekanismo molekular nagusiak
hartzaile-osteko proteinen eraginez gertatzen direnaren bidea da gaur egun jarraituena.
Bide honetan murgilduta morfina edo heroinak barne peptido opioideen sintesian
zein eratan eragiten duten ezagutzeko lan mordoa aurkeztu dira. Edozein pertsona edo
animaliak opiazeoak era jarraian hartzean bere opioide endogenoen ekoizpenean (edo
askapenean) erregulazioren bat egon behar lukeela nahiko logikoa da (Bergstrom eta
Terenius, 1979). Are gehiago, zeluletan substantzia arrotz bat hartzearen ondorioz
sortutako oreka patologiko honetan (tolerantzia eta abstinentziaren lokarria) opioide
endogenoen askapena edo sintesia murriztuta egotea litzateke ulergarriena; gainera egoera
honek droga dosi altuagoak hartu behar hori ulertzen lagunduko liguke (barneko opioidea
jaitsiz gero, kanpotik gehiago hartu behar) (Trujillo eta Akil, 1991). Barne opioideen
erregulazio honetan hauen katabolismoan zerbait gertatzea ere ez litzateke harrigarria
izango.
Baina azkeneko 25 urteotan hari honi oratuz egindako ikerketek, ikusiko den bezala,
emaitz kontrajarri ugari azaldu dituzte:
Morfinarekiko menpekotasuna zuten animalietan entzefalina mailen neurketak
lehenengoz 1976. urtean deskribatu ziren. Lehenengo datu hauetan morfina-
menpekotasuna zuten arratoietan entzefalina maila altuak deskribatu ziren (Simantov eta
Snyder, 1976). Hala ere, ikerlari berdinek (Childers-ekin batera), radioinmunoentseiuz
eginiko esperimentuetan ez zuten entzefalina maila aldaketarik nabaritu morfina-
menpekotasuna zuten arratoietan (Childers eta lank., 1979). 1977an Fratta eta lankideek
NSZ-ko atal ezberdinetan met-entzefalina mailak egonkor mantentzen zirela adierazi zuten.
Shani eta lankideek (1979) Fratta eta bere taldearen lana zerbait zehazten zuten emaitzak
izan zituzten. Ikerlan honetan 72 ordutan zehar morfinazko pelletak ezarrita zeramatzaten
arratoietan leu eta met-entzefalina mailak nabarmenki jaisten zirela ikusi zuten,
menpekotasun fisikoaren hastapenetan entzefalina kontzentrazioaren erregulazioren bat
egon behar zuela eta epe erdi-luzean mailak baldintza normaletara bueltatzen zirela
proposatuz. Urte berberean, µ-hartzaileen deskribapena lehenengoz egin zuen taldeetariko
Sarrera
Doktore-tesia
45
batek arratoia espontaneoki abstinentzia egoeran sartzen denean estriatuko entzefalina
mailen gutxitzea ematen dela argitaratu zuen (Bergstrom eta Terenius, 1979). Datu hau
kontrajarriz, Wüster-en taldeak (1980) naloxonarekin eraginiko abstinentzian estriatuko
met-entzefalina mailak igo egiten direla argitaratu zuen.
β-Endorfinei dagokionez, BPO hauen mailak morfina tratamendu kronikoekin ez
direla aldatzen adierazi zuten Höllt eta lankideek (1978) hipotalamo, hipofisi eta plasman
egindako jarraipenetan. Hurrengo urtean Przewlockiren taldeak (1979) morfina tratamendu
luzeetan arratoi burmuinean eta hipofisian endorfina mailak murrizten direla argitaratu
zuten. Dinorfinei dagokionez, burmuinean eta hipofisian morfina-menpekotasunean
peptido hauen mailak egonkor mantentzen direla deskribatu zen (Ho eta lank., 1982).
Heroinarekin egindako ikerketak eskasagoak dira. 1987an azaldutako lan batean,
animalietan 72 ordutarako heroinazko pelletak ezarri ondoren menpekotasuna zuten
arratoien NSZ-ko atal ezberdinetan entzefalina eta dinorfinen maila igotze handiak ikusi
ziren (Weissman eta Zamir, 1987). Ikus daitekenez, lan honen emaitzak ez datoz bat Shani
eta lankideak (1979) morfina pelletekin lortutako emaitzekin. 1999an egindako ikerlan
batean, Cappendijk eta lankideek heroinaz tratatutako animalien (autohornikuntza
esperimentuak) estriatuan dinorfina eta entzefalina mailak altuak direla ikusi zuten. Ikerketa
berberean kokaina animalia taldeak ere bazituzten eta ez zituzten aldaketa berdinak ikusi,
BPO-en erregulazioa hartzaile opioideen bitartezko ekintza izan behar duela proposatuz
(Cappendijk eta lank., 1999).
Gai berdinean sakondu nahian baina planteamendua aldatuz, beharbada ikuspegi
terapeutiko batekin, barne peptido ezberdinez eginiko tratamenduak morfina edo heroinak
eragindako abstinentzia sindromea leundu zezakeen ala ez jakiteko frogak egin dira. 1976an
animalia ikerketetan β-endorfinak abstinentzia murriztu dezakela deskribatu zuten Tseng
eta lankideek; eta ez zen efektu berbera ikusi entzefalina eta dinorfinekin, beharbada
peptido hauen in vivo inaktibazio azkarrarengatik. Gizakiarekin egindako ikerketetan,
adibidez entzefalinen analogo sintetikoa den FK 33-824-rekin eginiko froga klinikotetan
konposatu honek heroinazaleen abstinentzia sintomak murriztu zitzakeela ikusi zen. Hala
ere, murrizketa hau morfinak sortutakoa baino txikiagoa zen (Holmstrand eta Gune, 1980).
Hiru urte beranduago abstinentziadun heroinazaleetan β-endorfina, entzefalina edo
Sarrera
Doktore-Tesia
46
dinorfina prestakinak benabidetik eman eta gero sindrome honetako sintomen murrizketa
gertatzen dela deskribatu zen (Wen eta lank., 1983). Clement-Jones-en taldeak (1979)
ikerlan interesgarri bat egin zuen gizaki heroinazaleekin, akupunturazko terapiak
abstinentzia sintomak murriztu zitzakeela frogatuz. Elektroakupunturak likido
zefalorrakideoko barne peptido hauen maila igotzeak eragiten zituela ikusi ondoren, efektu
terapeutiko honen azpian met-entzefalinaren askapena zegoela proposatu zuten.
Entzefalinen aurkikuntzaren (Hughes eta lankideak 1975an) hurrengo hamar
urteetan opiazeoekiko menpekotasuna eta barne peptido opioide mailak zuzenean
erlazionatzeko eginiko ikerketetan gauzak argiegi ez ziren gelditu. Gai honetan sakonduz
80. hamarkadaren bigarren erdian hasita, menpekotasun egoeran peptido opioideen
bioeraldaketan edo turn-overrean gertatutakoak ulertu nahian, peptido hauen proteina
aitzindarietan eta hauek kodifikatzen dituzten geneetan oinarritzen diren hainbat ikerlan
aurkeztu dira.
Lehenengo datuek, arratoietan morfina kronikoki ematean hipotalamoko
proopiomelanokortina (POMC: endorfinen aitzindaria) sistemaren gutxitzea edo down-
regulation delakoa eragiten dela diote, aitzindari hau kodifikatzen duen RNA mezulariaren
maila txikiagotzeak ikusi ondoren (Mocchetti eta Costa, 1986). Talde berberak hipotesi hau
ziurtatzeko hipotalamoko POMC-aren edukina eta baita aitzindari honen eratorriak diren
peptido batzuena ere jaitsi egiten dela deskribatu zuten; hala ere, β-endorfina mailetan ez
zuten aldaketarik adierazi (Mocchetti eta lank., 1989). Urte berberean Bronstein eta
lankideek (1989), arratoietan egindako 7 eguneko morfina tratamendu ostean, antzeko
emaitzak ikusi zituzten, baina aldaketa txiki batekin: tratamenduaren 3.egunean β-endorfina
immunoerreaktibotasuna kontrolena baino handiago zen, hurrengo egunetan maila hauek
berriro egoera normalera jaitsiz. Talde honen ustez, neurona endorfinergiko hauetan
morfinaren eraginez peptido honen askapenaren inhibizioa gertatzen denez lehenengo
egunetan β-endorfina maila intrazelularrak handiagoak dira. Baina hurrengo egunetako
BPO honen mailen egonkortzea POMC RNAm-ren sintesi erregulazioaren ondorioz
gertatzen da (Bronstein eta lank., 1989).
Entzefalinen aitzindari edo hauen RNAm-ari dagokionez, lehenengo emaitzak
hipotalamoan azaldu ziren. Lightman-en taldeak (1987) estresak zein eratan eragiten dion
Sarrera
Doktore-tesia
47
entzefalinen aitzindarien RNAm-ari deskribatu zuen. Estres estimuluetariko bat
opiazeoekiko abstinentzia sindromea izan zen eta egoera honetan proentzefalinaren RNA-
ren maila igotzeak ikusi ziren. Hurrengo urtean estriatuan egindako ikerketetan, tolerantzia
eta abstinentzia sindromean alderantzizko emaitzak azaldu ziren, estriatuan
preproentzefalina (PPE) RNAm maila jaisteak alegia (Uhl eta lank., 1988). 1992an Childers-
en taldeak agonista opioideak sortutako adenilil ziklasaren beheranzko erregulazioaren
ondorioetariko bat PPE RNAm mailen gutxitzea zela adierazi zuen. Urte bete beranduago
Basheer eta Tempel-ek (1993) morfina tratamendu kronikoaren ondorioz emaitza
ezberdinak jaso zituzten NSZ-ko atalen arabera. Estriatuan eta kortex frontalean PPE-ren
RNAm mailak jaitsi egin ziren. Ordea, hipokanpoan gorakada nabarmena jasan zuten.
1995an Trujillo eta lankideak estriatuko atal ezberdinetan egindako frogetan morfina
tratamenduak PPEren mailak ez dituela aldatzen azpimarratu zuten.
Dinorfinen sistemari dagokionez, morfinazko tratamendu kronikoak
prodinorfinen mailen igotzea eragiten duela estriatuan (Trujilo eta Akil, 1990), eta bere
RNAm-ak beherantzko erregulazioa jasaten duela estriatuan eta hipokanpoan (1Romualdi
eta lank., 1990) edota hipotalamoan (Basheer eta Tempel, 1993) deskribatu da.
Ikus daitekeenez, orain arte deskribatutakoarekin ez da erraza opiazeo
menpekotasuna eta BPO-en erregulazioaren arteko erlazioaren eskema orokor bat egitea.
Urteetan agertutako emaitzak eta proposaturiko hipotesiak ez datoz guztiak bat. Baina
behintzat zerbait argi gelditu bada zera da: hastapenetan uste zena zehaztuz, zuzenean
neuropeptido aktiboei baino bere metabolismoari eragiten diola opiazeoen tratamendu
kronikoak.
Egile askoren eritziz opiazeoak jarraian hartzean, droga hauen feed-back negatiboaren
ondorioz, peptido hauek kodifikatzen dituzten RNAm-aren sintesia murrizten da.
Biosintesiaren inhibizio hau aitzindari edo BPO aktiboen mailari ez eragiteak paradoxikoa
dirudien arren feed-back-aren hipotesiak nahiko errez azaltzen duela diote ikerlari hauek.
Izan ere, morfinak sorturiko inhibizioak BPO-ak dituzten neuronetan peptido hauen
askapena modulatzen du, eta horregatik nahiz eta biosintesia inhibitzen hasia egon, BPO
edo aitzindarien mailak altu edo egonkor diraute. Egoera hau nahiko ixila mantentzen da
morfinaren eraginpean, baina droga exogenoa hartzeari uztean (abstinentzia) neurona
Sarrera
Doktore-Tesia
48
opioidergikoen hiperaktibitate egoerak BPO-en biltegiak azkar agortu ditzake, biosintesia
inhibituta baitago. Biosintesia normalizatu ahala ordu edo egun batzutan egoera baldintza
fisiologikoetara bueltatuko litzateke (Trujillo eta Akil, 1991).
Atal honekin bukatzeko, komenigarria da tolerantzia edo abstinentzia
fenomenoarekin eta barne opioide sistemarekin erlazioa duen gai bati buruzko aipamen
berezia egitea: Peptido “antiopioideak” (AOP):
Opiazeoen eraginez sortutako neuroegokitze mekanismoen artean orain arte
azaldutako fenomeno nagusiak hartzaile mailan eta hartzaile-ostekoak izan dira; azken
hauen artean, BPO-en biosintesiaren beheranzko erregulazioaren hipotesia. Baina azpiatal
honetan kokatuta, ikerlari askoren ustez, ekintza antiopioidea duten peptido batzuk morfina
tolerantzia edo abstinentzia fenomenoan eragina izan dezakete.
Baldintza fisiologikoetan jakina da BPO-ek dituzten ekintza nagusien artean
nozizepzioaren kontrola dagoela. Urteetan zehar aurkeztutako lan ezberdinek gure NSZ-an
BPO “klasikoen” eta opiazeo exogenoen ekintzak modulatzen dituzten peptidoak
sintetisatzen direla frogatu dute. Hala ere peptido ezberdin hauen artean batzuk propietate
opioide eta antiopioideak dituztela frogatu denez, “antiopioide” hitza nahiko zalantzazkoa
da eta “opioiden modulatzaile” bezala deitzea komenigarriagoa litzateke (Cesselin F, 1995).
Propietate “antiopioideak” edo “opioide modulatzaileak” dituzten peptidoen
adibideak hauek dira (Rothman RB, 1992; Harrison eta lank., 1998): Neuropeptido FF,
Orfanina FQ edo nozizeptina, Tyr-MIF peptidoak, CCK-8, TRH-a, α-MSH eta baita BPO
batzuk ere (dinorfina 1-13, dinorfina 1-17, β-endorfina 1-27, e.a). Hauen artean batzuk
morfinaren antinozizepzioa leuntzen dute (Tyr-MIF, CCK-8 edo NPFF-ak), morfinarekiko
tolerantzia murriztu dezakete (α-MSH, TRH), abstinentzia prezipitatu dezakete (NPFF),
e.a.
Gai hau oraindik sakontzeko dagoen arren, morfinarekiko tolerantzia eta
abstinentzia prozesuetan peptido hauek eraginen bat izan dezaketela argitzen ari da. Izan
ere, animali ereduetan nabaria zen zenbat eta tolerantzia sakonagoa izan hainbat eta
naloxona dosi txikiagoa behar izana abstinentzia sindromea eragiteko. Orokorki azalduz,
Sarrera
Doktore-tesia
49
AOP batzuk morfina eman ahala gehiago sintetisatu edo askatzen dira, tolerantzia
fenomenoa azkartuz. Era berean, morfina emateari uztean, AOP-en askapen ez-arrunt hori
abstinentziaren efektuen arduradunetariko bat izan daiteke (Rothman, 1992). Hipotesi
honen adibide bezala, NPFF-ak abstinentzia prezipitatu dezakeela edota bere aurkako
antigorputzekin naloxonak eraginiko abstinentzia leundu dezakeela deskribatu da (Harrison
eta lank., 1998). Murphy eta lankideek (1996) arratoien sistema mesolinbikoko atal
konkretu batean orfanina FQ jartzeak NAC-ean dopamina askapen gutxitzea eragiten duela
deskribatu zuten. Hari berean, duela gutxiko ikerlan batek morfina tratamendu kronikoak
bide mesolinbikoan proorfanina FQ/nozizeptinaren gene aktibazioa eragiten duela
deskribatu zuen (Romualdi eta lank., 2002). Urte berean, Pommierren taldeak (2002) CCK-
2 hartzailearekiko knock-out saguen neuronetan BPO sistemaren goranzko erregulazioa
gertatzen dela adierazi zuten.
Ikus daitekenez, AOP-en sistemak nozizepzioa, menpekotasun psikikoa, tolerantzia
edo abstinentziaren mekanismo molekularrekin zerikusia duenaren teoriak gero eta indar
gehiago dauka eta fenomeno konplexu hauek ulertzeko bide berri bat izan daiteke, baita
terapeutikaren ikuspegitik ere.
3.5. Menpekotasuna eta BPO-en anderakuntza:
Lehengo atalean azaldu bezala, BPO-ak opiazeoekiko menpekotasunean duten
funtzioari buruzko ikerlan ugari zaldu dira azkeneko 25 urteetan. Emaitza nahiko
ezberdinak deskribatu diren arren, ideia amankomun bat dago opiazoen tratamendu
kronikoak BPO-en biosintesian beheranzko erregulazioa eragiten duela dioena; hau da,
peptido hauen sintesiaren hastapenetan feed-back negatiboa gertatzen dela (Trujillo eta
Akil, 1991; Trujillo eta lankideak 1995).
Baina morfina edo heroinarekiko menpekotasunean BPO-en katabolismoan
gertatzen denari buruz ezer gutxi idatzi da. Orain arte peptido hauek hidrolisatzeko gai
diren entzimei eta opiazeoen ekintzari buruzko ikerlan gehienak entzima hauen inhibitzaile
sintetikoen aurkikuntza eta nozizepzioarekin erlazionatutakoak izan dira. Zentzu honetan,
Sarrera
Doktore-Tesia
50
Roques-en taldeak lan mordoa aurkeztu ditu, endopeptidasa neutroa 24.11 (entzefalinasa)
edo aminopeptidasa N-an eta hauen inhibitzaileetan oinarritutako esperimentuak azalduz.
BPO-en anderakuntza azaltzen den atalean ikusi bezala, entzefalinasa eta
aminopeptidasa N, PSA-rekin batera, peptido hauen anderatzaile nagusiak dira. Tiorfana,
entzefalinasa eta APN-aren inhibitzailea, morfinarekiko abstinentzia sindromea leuntzeko
gai dela ikusi eta erabilpen honetarako medikamendu bezala proposatu da (Maldonado eta
lank., 1992; Roques eta Noble, 1995). Tiorfana, kelatorfana eta RB101 (entzefalinasa eta
APN inhibitzaileak ere) nozizepzio aurkako ahalmena dutela deskribatu da (Roques eta
lank., 1999). RB101-ak hain zuzen, morfinaren analgesia erabat potentziatzen du eta
zertxobait ere ibuprofenoa eta az.azetil salizilikoarena (hanturaurkako ez-esteroideoak)
(Nieto eta lank., 2001). Ahobidetik eman daitekeen RB120-ak ere min mota ezberdinak
murrizteko gaitasuna duela ere frogatu zen (Noble eta lank., 1997). Hau dela eta,
inhibitzaile hauek analgesiko berri bezala edota analgesian opiazeoen laguntzaile bezala
proposatu dira, morfinaren kontrako efektuak gutxituko lituzketelako (Roques eta lank.,
1999; Ortega-Alvaro eta lank., 1998; Noble F eta lank., 1999, Boudinot eta lank., 2001).
Egia esan inhibitzaile hauek tetrahidrokannabinolak sortutako antinozizepzioa
potentziatzen duela ere frogatu da, sistema opioidea eta kannabinoideak mina erregulatzeko
dituzten bideak erlazionatuta daudela adieraziz (Reche eta lank., 1998). Urte batzuk
lehenago Maldonado eta lankideek (1993) RB101-a CCK-B hartzailearen antagonista
batekin batera ematean nozizepzio aurkako efektu boteretsua lortzen dela deskribatu zuten.
Datu bezala, orain urte bi Noble eta lankideak (2001) beste inhibitzaile bat, RB129
(iodo erradioaktiboz markatua), APN-aren NSZ-ko banaketa hobeto ezagutzeko erabili
zuten.
Analgesiarekin erlazionatuz, endopeptidasa neutroaren genea ezabatuta duten
saguetan plaka beroaren frogan estimulu mingarri honekiko erresistentzia handiagoa
azaltzen zuten knock-out saguek (Saria eta lank., 1997). Talde berberak,
drogamenpekotasunen gaian sartuaz, sagu mutante hauetan kontroletan baino etanol
kontsumo handiagoa ikusi zituen (Siems eta lank., 2000). Emaitza hau 4 urte lehenagoko
beste ikerlan batekin ez dator bat. Izan ere, Szczepanska eta lankideek (1996)
Sarrera
Doktore-tesia
51
aminopeptidasa N-ren inhibitzailea den bestatinak, alkohol kontsumoa murrizten duela
deskribatu zuten.
Morfinak BPO-en katabolismoan duen eraginari buruzko lanak oso eskasak dira.
Malfroy eta lankideak morfina tratamenduak entzefalinen anderakuntza handitzen zuela
deskribatu zuten 1978an. Hiru urte beranduago Hui eta lankideak (1981) morfina kronikoki
ematean naloxonarekin itzulezina zen entzefalinen anderakuntzaren handitzea ikusi zuten.
Hala ere, esperimentu berbera in vitro egitean naloxonak anderakuntza hau inhibitzen duela
adierazi zuten. 1987an entzefalinasa eta APN aktibitatearen inhibitzaileak diren felorfana
eta tiorfanarekin animali ereduetan egindako ikerketa interesgarri bat argitaratu zen.
Farmako hauek naloxona bitartez eraginiko abstinentzia sindromearen sintoma batzuk
murrizten zituztela ikusirik, abstinentziaren tratamendurako proposatu zituzten (Hahhmans
eta lank., 1987). 1998an urte Fukunaga eta lankideek beste peptidasen inhibitzaile batzuk
substantzia gris periakueduktalean mikroinjektatuz naloxona bitarteko abstinentziaren
leuntzea deskribatu zuten. Gainera entzefalinen analogoa den [D-Ala2, Met5]-
entzefalinamida injektatzeak ere abstinentziaren sintoma batzuk gutxitu zituenez, autore
hauen ustez PAG-an entzefalinen maila igotzeak abstinentzia sindromea leundu litzakeela
proposatu zuten.
Endo-oligopeptidasa (EC 3.4.22.9), entzefalina edukina duten peptidoak anderatuz
entzefalinak ekoizteko gai den entzima, naloxona bitarteko abstinentziadun arratoien NSZ-
an maila altuetan agertzen dela ikusi da (Paik eta lank., 1994).
Lan berberean maila periferikoan, gongoil linfatiko eta timoan, entzima honen
mailak abstinentzian igo egiten direla adierazi zuten Paik eta lankideak (1994). Urte batzuk
lehenago Korányi eta lankideek (1989) T linfozitoetako dipeptidil-peptidasa IV entziman
morfinak naloxonarekin itzulgarria den dosi-menpeko aktibazioa eragiten duela deskribatu
zuten. Giza granulozitoetan ere morfinak endopeptidasa neutroaren aktibazioa,
naloxonarekin itzulgarria dena, eragiten duela deskribatu da (Stefano eta lank., 1994). Maila
periferikoan ere, aortako zelula endotelialetan hain zuzen, morfinak Leu-entzefalinaren
anderakuntza aktibatzen duela deskribatu zen. Ekintza hau APN-a edo entzefalinasa baino,
angiotentsinaren entzima bihurtzailearen (AEB) aktibazioak eragina dela adierazi zuten
Melzig eta lankideak (1998).
Sarrera
Doktore-Tesia
52
Ikus daitekeenez NSZ-an edo maila periferikoan opiazeoak zuzenean BPO-en
entzima anderatzaileengain duten eraginari buruzko ikerlanak nahiko eskasak dira.
Dirudienez, neurtutako entzimetan morfina tratamendu kronikoak hauen aktibazioa
eragiten du, kasu batzutan naloxonarekin itzultzen den efektua. Baina oraindik gai honetan
hutsune asko daude, eta are gehiago heroinarekin eginiko lanetan. Horregatik, tesi honen
helburuetariko bat BPO sistemaren katabolismoan opiazeoekiko tolerantzia edo
abstinentzia sindromean agertu litezkeen aldaketen deskribapen sakona egitea izan da; bai
gizaki zein animalietan.
3.6. Menpekotasuna, beste neuropeptidoak eta
hauen anderakuntza:
Tesi honetan aztertuko diren peptidasak BPO-ak ez diren beste peptido batzuen
inaktibazioaren arduradunak dira; hauen artean ezagunenak TRH-a, basopresina, hormona
sexualen askatzaileak, angiotentsina II eta III, bradikininak, P substantzia, e.a. direlarik.
TRH-a eta opiazeoak erlazionatzen dituzten lanak ez dira gutxi izan. TRH-ak
morfina abstinentzia sindromean agertutako hipotermia itzultzen duela frogatu da
(Bhargava HN, 1980). Morfina tratamenduak sortzen duen analgesiarekiko tolerantzia
TRH-ak murriztu egin dezakeela ere deskribatu da (Ramarao eta Bhargava, 1990). Morfina
abstinentzia sindromean PAG-an TRH-aren aitzindariak eta beren RNAm mailak
handitzen direla deskribatu da, sindromearen modulatzaile papera izan lezaketela
proposatuz (Ghan eta Sevarino, 1996; Legradi eta lank., 1996). 2002an, hipotalamo
lateralean TRH mailak abstinentzia sindromean handitu egiten direla ikusi da (Nillni eta
lank., 2002). Hormona honen anderakuntzan zerikusia duten entzima bi, prolil-
endopeptidasa eta dipeptidil-peptidasa IV, abstinentzia sindromean hipotalamoan aktibitate
handiagoa azaltzen dutela deskribatu da (Idänpään-Heikkilä eta lank., 1995).
Sarrera
Doktore-tesia
53
Opiazeoen beste ekintza batzuen artean ezaguna da drogazaleetan morfinak eta
heroinak sistema endokrinoan sortutako asaldurak. Adibidez, ACTH-a edo hipotalamoko
faktore askatzaileen (GnRH-ak) ekoizpen inhibizioa eta basopresina eta prolaktina sintesi
aktibazioa (Lorenzo eta lank., 1999).
Bradikinina eta P substantzia hantura eta minarekin erlazionaturiko bitartekari
zelularrak dira. Lehenengoak sortutako nozizepzioa morfinarekin itzul daiteke. Efektu hau
protein kinasa C-aren bitarteko ekintza bezala deskribatu zen duela gutxi (Inoue eta Ueda,
2000). P substantziari dagokionez, morfinarekiko abstinentzian NSZ-ko atal ezberdinetan
bere anderakuntza igo egiten dela deskribatu zuten Zhou eta lankideek (2001).
Angiotensina II peptido basopresoreari dagokionez, egile batzuk substantzia
antiopioideen artean kokatzen dute. Izan ere, morfinak arratoietan eraginiko analgesia
itzultzeko gai dela deskribatu da (Han eta lank., 2000). Melzig eta lankideek (1998) aortako
zelula endotelialetan morfinak AEE-aren aktibitatea handitzen duela ikusi zuten.
Nahiko argi ikus daitekeenez, opiazeoekiko tolerantzia edo abstinentzia prozesuetan
peptido askoren anderakuntzari buruzko ikerlanak oso eskasak dira. Tesi honen beste
helburuetariko bat opiazeoekiko menpekotasunak peptido ezberdinen entzima
anderatzaileen aktibitatean eraginik duen ala ez deskribatzea izan da, bai gizaki zein animalia
ereduetan.
II. Helburuak
Helburuak
Doktore-tesia
55
Peptidasak, peptido ezberdinen apurketa hidrolitikoaren katalisatzaileak dira.
Angiotensina eraldatzen duen entzima edo peptidasaren inhibitzaileak hipertentsio-
kontrako boterea dutela ikusi zenetik (Ondetti eta lank., 1977) entzima hauekiko interesa
asko suspertu zen. Aspalditik onartuta dago neuropeptidoen inaktibazioa batez ere
peptidasen bitartez egiten dela (Iversen, 1987), eta ildo honetan neuropeptidoen
anderatzaileak diren peptidasa ugari deskribatu dira hainbat espezieren NSZ-an eta beste
ehun ezberdinetan, bai zelulen mintzan eta bai zitosolean (Turner, 1987; Hersh, 1982;
Mantle, 1992; Taylor, 1993; O’Cuinn, 1997).
Lan honetan 7 peptidasa ezberdinen aktibitateak aztertu ditugu gizaki eta
arratoiaren garunean: Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa, APN, prolil-
endopeptidasa, arginil-AP, leuzil-AP, piroglutamil-peptidasa eta aspartil-AP. Sarreran
azaldu bezala, entzima hauek neuropeptido ugariren hidrolisian parte hartzen dute; euren
artean, barne peptido opioideak, TRH-a eta angiotentsina II eta III. Nurotransmisore edo
hormona funtzioa duten peptido hauen erregulazioaren ezagutzan zerbait laguntzeko
asmoz egindako azterketa deskriptibo hau baldintza fisiologikoetan eta egoera patologiko
konkretu batean egin da, helburu hauei jarraituz:
1. Gizakiaren eta arratoiaren garun kortexean peptidasen banaketa
azpizelularra ezagutu:
Garuneko neuropeptidoen metabolismoari dagokionez, nahiko ezarrita dago mintz
plasmatikoari lotutako peptidasen funtzioa neuropeptidoen – neurotransmisore edo
hormona ezberdinen – metabolismoan (Turner, 1986). Baina ezer gutxi dakigu peptidasa
askoren kokapen intrazelularrari buruz, eta are gutxiago zatiki solugarrian dauden
peptidasen funtzioari buruz (Mantle, 1992).
Peptidasen banaketa azpizelularraren ikerketak neuropeptidoen aktibitatearen
erregulazioa zelula mailan ulertzen lagun diezaguke. Hori dela eta, peptidasa solugarrien eta
mintzari lotutakoen aktibitateak nukleo, mitokondria, mikrosoma (lisosomak eta erretikulu
endoplasmikoa), zitosol eta sinaptosometan neurtu dira gizaki eta arratoiaren garun
kortexean.
Helburuak
Doktore-tesia
56
2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren eta arratoiaren garuneko atal
ezberdinetan ezagutu, espezie arteko ezberdintasunak azpimarratuz.
Peptidasak mikroorganismo, landare eta animalia mota edo espezie ugaritan eta
ehun ezberdinetan isolatu dira (Taylor, 1993). Gainera, onartuta dago entzima hauek
neuropeptido edo beste peptidoen anderakuntzan ez dutela espezifikotasun osoz ekiten;
hau da, peptidasek sustratu bat baino gehiagoren gain eragin dezaketela (Kenny, 1986).
Tesi honetarako aukeratutako peptidasak zenbait neuropeptidoren anderakuntzan
parte hartzen dutela ikusirik, beren aktibitateak garuneko atal ezberdinetan nolakoak diren
ezagutzeak entzima hauen funtzio fisiologikoa ulertzen zerbait lagun diezaguke. Era berean,
gizakia eta arratoiaren garunean ikerketa egiteak, ebolutiboki NSZ-ren garapen maila
ezberdina duten espezien arteko peptidasa eta neuropeptidoen aktibitate ezberdintasunik
dagoenentz argituko liguke. Tesi honetarako aztergai izan diren garuneko atalak hurrengo
hauek izan dira: Garun kortexa, amigdala, hipokanpoa, hipotalamoa eta estriatua
(kaudatua).
3. Opiazeoekiko menpekotasunean gizaki eta arratoi garuneko peptidasen
aktibitateak aldaketarik jasaten duen ezagutu.
Morfina eta heroina menpekotasuna sortzen duten substantzien adibide
garrantzitsuenak dira, drogarekiko premia edo beharrizan bortitza (menpekotasun
psikikoa), tolerantzia azkarra eta abstinentzia sindrome bizia (menpekotasun fisikoa)
sortzeko gai baitira.
Menpekotasun psikikoaren substratu neuronala garuneko sari-zirkuitu bezala
ezagututako bide mesolinbiko dopaminergikoan kokatzen da. Opiazeoek bide honen
errefortzu edo aktibazio patologikoa eragiten dute, drogazaleetan craving delako premia hori
eraginez (Koob eta Nestler, 1997). Sari-sistema honen oinarrizko guneak barneko gune
tegmentala, accumbens nukleoa, kortex prefrontala eta amigdala dira eta beste atal
askorekin dituzte konexioak. Adibidez, kaudatu-putamena (estriatua), hipotalamoa,
hipokanpoa, substantzia gris periakueduktala, e.a. Gainera, sistema konplexu honetan
neurona dopaminergikoez gain beste askok ere parte hartzen dute; adibidez, neurona
Helburuak
Doktore-tesia
57
entzefalinergikoak edota dinorfina azaltzen dutenak (Koob eta Nestler, 1997; Nestler,
2001).
Tolerantzia eta abstinentzia, opiazeoen kontsumo errepikatuak eragindako
neuroegokitzearen ondorioz gertatzen dira. Maila zelularrean ezarritako oreka patologiko
honen lokarrietariko bat hartzaile osteko fenomenoak dira eta bertan proteina ezberdinen
metabolismoaren aldaketa ugari deskribatu dira (Nestler eta Aghajanian, 1997). Hauen
artean, barne peptido opioideen (BPO) erregulazioari dagozkion ikerlanak nahiko
kontrajarriak izan dira eta hutsune ugari daude. Hala ere, zerbait gertatzen dela argi dago,
behintzat biosintesi prozesuari dagokionez (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995).
Katabolismoari dagokionez, APN edo endopeptidasa neutroaren inhibitzaileekin egindako
ikerlanak izan dira ugarienak. Tiorfana, kelatorfana, RB-101, e.a. inhibitzaileren botere
analgesikoa eta abstinentzia sintoma aurkakoa frogatzen dituztenak, alegia (Maldonado eta
lank., 1992; Roques eta Noble, 1995; Roques eta lank., 1999).
Hutsune hauek betetzen joateko helburuarekin, gizaki heroinazaleen eta tolerantzia
edo abstinentzia duten animalia ereduen garuneko peptidasa ezberdinen modulaziorik
gertatzen denentz deskribatzea proposatu da. Gizakiaren kasuan garun kortex prefrontala
eta nukleo kaudatua izan dira aztergai. Arratoietan berriz, garun kortexa (prefrontala
adibidez), amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa eta kaudatua.
Sistema opioidearen erregulazioak opiazeoekiko menpekotasunean duen eragina
hobeto ulertzeko, ikerlan honetan BPO-en anderakuntzan garrantzitsuenak diren
aminopeptidasa biak (PSA eta APN-a) aztertu dira.
Bestalde, opiazeoen kontsumo errepikatuak beste neuropeptido askoren
katabolismoan sortutako eraginari buruzko ikerlanak oraindik eskasagoak direnez; TRH-a,
angiotentsina, bradikinina, basopresina, e.a. neuropeptidoren aderatzaileak diren entzimen
aktibitateak neurtu dira.
III. Materiala eta
Metodoak
Materiala
Doktore-tesia
59
Doktoretza-tesi honen alderdi esperimental guztia Medikuntza eta Odontologia
Fakultateko Fisiologia Sailari esleitutako Neurokimika Laborategietan egin da (UPV/EHU),
Jon Irazusta Astiazaran Saileko Katedradunaren zuzendaritzapean.
1. Materiala
1.1. Esperimentazio animaliak eta talde esperimentalak:
Animaliak:
Erabilitako animaliak Sprague Dawley anduiko eta barietate albinoko arratoi harrak izan
ziren, 225-300 gramo eta 6 – 9 asteko adinekoak hain zuzen ere.
Talde guztiak plastiko polikarbonatuzko kaioletan eduki ziren Euskal Herriko
Unibertsitateko abeltegian argitasun / iluntasun (12h / 12h), hezetasun (50%) eta
tenperatura (24ºC) baldintza arruntetan. Animaliak ad libitum elikatu ziren ura eta UAR 104
motako dieta estandarrarekin (Panlab®). Edukina: gluzidoak (%58), proteinak (%17),
lipidoak (%3), zelulosa (%5), mineralak (%5) eta hezetasuna (%12).
Taldeak:
I. Lan honetan, helburuan azaldu bezala, lehenengo fase batean animalia tratatugabeetan
peptidasa ezberdinen deskribapen orokorra egin zen garuneko zati ezberdinetan eta garun
kortexeko zatiki azpizelularretan. Azken honen purutasuna zehazteko frogak ere egin ziren.
Hau guztirako ondoren adierazten diren animalia erabili ziren:
Nerbio sistema zentraleko atal ezberdinetan (n= 12).
Garuneko kortexaren zatiki azpizelularretan (n= 12).
Zatiki azpizelularren purotasun frogak (n = 8).
Materiala
Doktore-tesia
60
II. Bigarren fasean berriz, morfinarekiko menpekotasuna eta abstinentzi sindromea zuten
arratoiak erabili ziren:
Morfina taldea (n=20): tolerantzia aurkezten zuten arratoien taldea.
Morfina – kontrol taldea (n= 20): morfinaren ordez suero fisiologikoa zeramatenak.
Abstinentzia taldea (n=20): abstinentzi sindromea eragiten zitzaien arratoi taldea.
Abstinentzia – kontrol taldea (n= 20): suero fisiologikoa + naloxona zeramatenak.
1.2. Gizaki garun laginak, postmortem:
Gizaki laginak Bilboko Auzitegi Mediku Instituto Anatomikoan eginiko autopsia
judizialetan lortu ziren.
Lagin guztiak bat-bateko heriotza izan zuten pertsonetan dute jatorria auzitegi medikuek
istripu, erailketa eta opiazeo gaindosi bezala definituak.
Kasu honetan ere bereizi egin behar dira ikerketaren fase biak:
I. Peptidasen deskribapen orokorra gizaki arruntetan: Kasu honetan historia medikoan
gaixotasun nerbiosorik azaltzen ez zituztenen garun laginak erabili ziren. Bai gizon eta bai
emakumeek osatzen zuten taldea eta adina eta hil ondorengo atzerapenaren (postmortem delay
delakoa) bataz besteak 34 + 2.5 urte eta 30.6 + 2 ordukoak ziren hurrenez hurren.
Banaketa erregionala (n= 12)
Banaketa azpizelularra (n= 12)
Banaketa azpizelularraren purutasun frogak (n=12)
II. Peptidasak opiazeoekiko menpekotasuna azaltzen zuten gizaki eta hauen kontroletan:
Menpekotasun taldea (n= 8) heroina edo morfinarekiko menpekotasun historia
zuten gizabanakoek osatua. Beraiekin eginiko ikerketa mediko legalak beste
Materiala
Doktore-tesia
61
psikofarmakoren baten eraginpean ez zeudela frogatu zuen. Guztiak ziren
gizonezkoak eta adina eta PM delay-a XXX urte eta XX ordukoa izan zen.
Kontrol taldea (n= 8) gizaki osasuntsuek osatua. Lehenengo taldeko gizaki
bakoitzarekin adina, sexua eta hil ondorengo atzerapenarentzat parekatuak daude
(XXX urte eta XX ordu).
1.3. Ekipamendua:
Tefloizko enbolodun homogeneizagailua, Heidolph.
Abiadura handiko zentrifugagailu errefrigeragarria Sorvall RC 28S.
Angelu finkozko Sorvall-en SM-24 errotorea, polietilenozko hodiekin.
CPS-240A zelula-kokagailu termokontrolagarria.
FL500 espektrofluorofotometroa.
Shimadzu UV-2401 PC espektofotometroa.
Kontron-en CENTRIKON T2070 ultrazentrifugagailua.
Angelu finkoko KONTRON-en TFT 45.6 errotorea polietilenozko hodi
eta titaniozko tapoiekin.
Selecta-ren Hotcod S, 0–60ºC bitarteko inkubagailua.
JEOL 100SX mikroskopio elektronikoa.
Sartorius-en zehaztasunezko R180D pisua.
Mettler LV-2 dosifikadore elektrikoa.
Tefloizko enbolodun, Heidolph PZR 50 homogeneizagailua.
Selectaren Reax 2000 hodien eskuzko irabiagailua.
Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa, Agimatic.
Micro – pH 2001 eta 2002, Crison pH – metroak.
Bolumen aldakorreko mikropipeta kapilarrak.
Bolumen aldakorreko pipeta automatiokak, Nichiryo eta Brand.
1 – 5 ml-ko dispentsadoreak, Eppendorf Multipipette 4870.
Espektrofluorometriarako Fluoronunc plastikozko plakak.
Espektrofotometriarako plastikozko kubetak (3ml), IZASA.
Homogeneizatzeko beirazko ontziak.
3ml-ko plastikozko saiodiak, Eurotubo.
Materiala
Doktore-tesia
62
Bolumen ezberdinetako pipeta – puntak, Beortek.
Gradilak, Beortek.
Material kirurgikoa.
Beirazko materiala (ontziak, probetak, matrazak, e.a).
1.4. Produktu kimikoak:
Azetato sodikoa, Merck.
Azido Klorhidrikoa, Probus S.A.
Azido azetiko glaziala, Probus S. A.
Azido ortofosforikoa %85ean, Merck.
Behi – seroalbumina, Sigma Chemical Co.
Coomasie G-250 urdin distiratsua, Sigma Chemical Co.
Manganeso kloruroa, Merck.
Sodio kloruroa, Merck.
DAG (N-Dansyl-D-Ala-Gly), Sigma Chemical Co.
DAGNPG (N-Dansyl-D-Ala-Gly-p-nitroPhe-Gly), Sigma Chemical Co.
Dimetil sulfoxidoa (DMSO), Sigma Chemical Co.
DL – Ditrioteitola (DTT), Sigma Chemical Co.
EDTA, Merck.
Etanol absolutua, Probus S.A.
Ficolla.
Fosfato sodiko monobasikoa, Merck.
Fosfato sodiko dibasikoa, Merck.
Kloral hidratoa, Merck.
Magnesio sulfatoa, Merck.
Manitola, Merck.
Sodio zitratoa, Merck.
β-Naftilamina, Sigma Chemical Co.
Alanil – β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Arginil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Materiala
Doktore-tesia
63
Aspartil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Leucil– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Piroglutamil – β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Z-Glizil-Prolil-– β-Naftilamida, Sigma Chemical Co.
Propilen – glikola, Panreac.
Puromizina, Sigma Chemical Co.
Rotenonea, Sigma chemical co.
NADPH, Sigma chemical co.
C zitokromoa, Sigma chemical co.
Hoeschst 33258 erreaktiboa, Sigma chemical co.
Zekorraren timoko DNA. Sigma chemical co.
DCIP. Sigma chemical co.
Azida sodikoa. Sigma chemical co.
Sukzinatoa. Sigma chemical co.
1.5. Soluzioak:
1.5.1. Soluzio indargetzaileak:
Tris HCl 0.2 M indargetzailea (pH = 7.4):
1000 ml egiteko, 24.22 gr Trizma base hartzen dira eta ur distilatua gehitzen zaio
bolumenera heldu arte. pH-a HCl-arekin egokitzen da.
Tris – Sakarosa HCl 0.25 M (pH= 7.4):
100 ml prestatzeko 8.435gr sacarosa eta 0.0606gr Trizma base ur destilatuan disolbatu, pH-
a doitu eta azken bolumena lortu arte ur destilatuarekin berdintzen da.
Materiala
Doktore-tesia
64
Fosfato 0.2 M indargetzailea (pH = 7.4):
A soluzioa: fosfato sodiko monobasikoaren (0.2 M) 27.6gr, 1l ur destilatuan
disolbatu.
B soluzioa: fosfato sodiko dibasikoaren (0.2 M) 28.6gr, 1l ur destilatuan disolbatu.
Fosfato 0.2 M indargetzailearen litro bat egin nahi bada A soluzioaren 190 ml, B
soluzioaren 810 ml-rekin nahastukoa dira.
Azetato indargetzailea 0.1 M, (pH = 4.2):
A soluzioa (azido azetikoa 0.2 M): 11.55 ml azido azetiko hartu eta ur destilatua
gehituz 1l-ra daramagu.
B soluzioa (azetato sodikoa 0.2 M): 27.6 gr azetato sodiko 1l ur destilatuan
disolbatzen da.
Litro bat azetato indargetzailea 0.1 M prestatzeko A soluzioaren 368 ml eta B soluzioaren
132 ml nahastuko dira, azken bolumenera ur destilatuarekin eramanez.
1.5.2. Entseiu entzimatikoentzako substratu soluzioak:
Alanina aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):
Alanina–β–naftilamida 0.125 mM.
DTT 0.65 mM.
Behi albumina 10mg/100ml.
Fosfato indargetzailea 50mM.
Materiala
Doktore-tesia
65
Puromizinarekiko sentikorra ez den alanil aminopeptidasa aktibitatea (APN)
neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):
Puromizina 20 µM.
Alanina–β–naftilamida 0.125 mM.
DTT 0.65 mM.
Behi albumina 10mg/100ml.
Fosfato indargetzailea 50mM.
Prolil endopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):
Z- Gly – Pro-β–naftilamida 0.125 mM.
DTT 2 mM.
Behi albumina 10mg/100 ml.
Fosfato indargetzailea 50 mM.
Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):
pGlu –β–naftilamida 0.125 mM.
DTT 5 mM.
EDTA 2 mM.
Behi albumina 10mg/100 ml.
Fosfato indargetzailea 50 mM.
Aspartil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 7.4):
Aspartil–β–naftilamida 0.125 mM.
MnCl2 1 mM.
Behi albumina 10mg/100 ml.
Fosfato indargetzailea 50 mM.
Materiala
Doktore-tesia
66
Arginil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 6.5):
Arginil–β–naftilamida 0.125 mM.
Puromizina 20 µM.
NaCl 0.15 M.
Behi albumina 10mg/100 ml.
Fosfato indargetzailea 50 mM.
Leuzil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko substratu soluzioa (pH 9.5):
Leuzil–β–naftilamida 2 mM.
Puromizina 20 µM.
MnCl2 0.5 mM.
Glizina 375 mg / 100ml
Behi albumina 10mg/100 ml.
Fosfato indargetzailea 50 mM.
Sukzinato deshidrogenasa aktibitatea:
Manitola 0.3 M
KCl 0.01 M
MgCl2 0.005 M
KH2PO4 0.002 M
Azida sodikoa 0.26 gr/100ml
DCIP 0.014 gr/100ml
Sukzinatoa 5.4 gr/100ml
Zitokromo C erreduktasa aktibitatea:
Fosfato potasiko indargetzailea 40 nM
NaCN 0.45 mM
C Zitokromoa 0.1 mM
Materiala
Doktore-tesia
67
Rotenone 13 µM
β-NADPH 0.13 mM
DNA-ren neurketa:
Hoeschst erreaktiboa 1.5 µM
Sodio (III) Zitratoa 0.441 gr/100ml
NaCl 0.9 gr/100ml
DNA (Calf thymus DNA) 1mg/ml
2’-3’- nuleotido zikliko fosfodiesterasa aktibitatea.
2’-3’- nuleotido zikliko fosfodiesterasa
Bromotimol urdina
Imidazol-HCL
Laktato deshidrogenasa aktibitatea:
NADH
Pirubatoa
1.5.3. Beste soluzio batzuk:
Bradford-en erreaktiboa:
Coomasie urdin disdiratsua 0.117 mM.
Etanola %5-ean.
Azido ortofosforikoa %15-ean.
Prestaketa: 1l Bradford erreaktiboa prestatzeko 100 mg Coomasie urdina 50 ml etanoletan
disolbatu eta 100 ml azido ortofosforiko gehitzen zaizkio, azken bolumenera ur
distilatuarekin eraman arte. Ordu 2-tan zehar irabiatu eta birritan iragazi beharko da.
Metodoak
Doktore-tesia
69
2. Metodoak
2.1. Tratamenduak:
2.1.1. Morfinarekin egindako tratamendua:
Heroinarekiko menpekotasuna duten gizakiekin eginiko ikerketa osatzeko
helburuarekin, animalia ereduetan morfinak peptidasen gain zein eragin izan zezakeen
ikustea proposatu genuen.
Morfinarekin egindako 5 eguneko tratamendu kronikoa Busquets eta lankideen (1995)
protokoloa jarraituz egin zen. Arratoiak opiazeo honekin egunean 3 bider ziztatuak
(peritoneo-barnetikoa) izan ziren dosiak honela handituz zihoazelarik:
1. eguna: 10, 10 eta 10 mg/kg.
2. eguna: 10, 10 eta 20 mg/kg.
3. eguna: 20, 20 eta 40 mg/kg.
4. eguna: 40, 40 eta 80 mg/kg.
5. eguna: 80, 80 eta 100 mg/kg.
Protokolo hau jarraituz morfinarekiko menpekotasuna zeukaten arratoiak lortu ziren.
Taldearen erdia, morfina taldea, morfina maila altuak odolean zeuzkatela, hurrengo eguneko
goizean sakrifikatu ziren. Besteari, abstinentzia taldeari, naloxona antagonista opioidea eman
zitzaion (5 mg/kg p.b) eta abstinentzia sindromea agertu zela baloratu ondoren
sakrifikatuak izan ziren.
Era berean talde bakoitzak bere kontrol taldea izan zuen. 5 egunetan zehar ordutegi
berbera jarraituz suero fisiologikoa ziztatu zitzaien (p.b) eta 6. egunean morfina taldearen
kontrolak zuzenean sakrifikatuak izan ziren einean abstinentzia taldearen kontrolak
naloxona hartu eta gero hil ziren.
Metodoak
Doktore-tesia
70
2.1.2. Abstinentzia sindromearen gogortasunaren neurria arratoietan.
Esperimentu konduktualak:
Abstinentzia taldeko arratoiei 5 mg/kg naloxonarekin (p.b) abstinentzi sindromea eragin
eta 5 minutu ondoren sindrome hori definitzen duten seinu ezberdinen behaketari ekin
genion Ulibarri eta lankideek (1987) deskribatutako eskala jarraituz. Tratamenduaren
banaketa ezagutzen ez zuen pertsona batek animalia bakoitza 10 minututan zehar
metakrilatozko kaiola garden batean behatu zuen, “itsu bikoitza” diseinua jarraituz. Era
berean, protokolo berdina jarraitu zen kontrol taldearekin.
Arratoi bakoitzean zera izan zen kontutan puntuaketa egiteko:
Zeinu zenbatuak edo gertakariak zenbat bider azaltzen ziren: Esplorazioa,
jauziak, astinaldiak, hortz-haginen karraska eta mastekapena.
Zeinu presenteak. Hau da, beste seinu konkretu batzuk bazeuden ala ez:
Rinorrea, negarra, begi injektatuak, irrintziak, maneiatzean areriotasuna,
erekzioa, eiakulazioa, beheranzkoa, ile–zutitzea, jarrera anormalak eta belarri
zurixkak. Seinu bakoitza agertuz gero puntu bat ematen zitzaion eta ez balego 0
puntu.
Azkenean zeinu zenbatu eta presenteen batuketa egin eta hori izan zen animali bakoitzaren
puntuaketa orokorra. Gero puntuaketa orokorrak batu eta abstinentzia taldea eta kontrol
taldearen arteko konparaketa egin zen (emaitzen atalean aipatuko dena).
2.2. Teknika kirurgikoak:
Aktibitate entzimatikoen deskribapena burutzeko animalien hilketa eta garunaren
erauzketa ezinbestekoa zen.
Animalien abeltegiko egonaldi, erabilketa eta hilketa prozesuetan Europear
Komunitatearen aginduak (1986ko Martxoaren 24-eko EEE-ko kontseiluaren; 609 agindua
Metodoak
Doktore-tesia
71
– 86/609/CEE agindua) eta Espainiako aginduak (1988-ko Martxoaren 14eko 223 erret
dekretua – R.D 223/88), animalien eskubideei dagokionez, bete izan dira.
Lan honen kasuan, talde mota guztiak, hau da, baldintza normaletako arratoiak,
menpekotasun eta abstinentzia ereduak eta hauen kontrolak dekapitazio teknikaren bitartez
sakrifikatuak izan ziren. Ondoren garezurra agerian utzi eta, garuna era egokian erauzteko,
kalota kontu handiz zabaltzen zen kako batzuen bitartez. Jarraian garuna izozgailura
eramaten zen (-70 ºC), ebaketarako prest geldituz.
Ebaketa egiteko entzefaloa milimetro bateko lodierako ebakidura koronaletan zatitzen
zen. Aukeratutako garun atalak Köening eta Klippel-en (1970) atlas estereoataxikoa
jarraituz lortu ziren.
I. Banaketa azpizelularrerako kortex laginak hartu ziren.
II. Banaketa erregionalerako aukeratutako atalak hauek izan ziren:
Garun kortexa: prefrontala, parietala eta okzipitala.
Amigdala.
Hipotalamoa.
Hipokampoa.
Kaudatua
III. Giza garunen kasuan ere banaketa azpizelularrerako garun kortex laginak erabili ziren
eta garun zati ezberdinen ikerketarako goian aipaturiko atal berberak aukeratu ziren,
Nieuwenhuys eta lankideak (1988) eta Haines-en teknikari (1995) jarraituz.
2.3. Zatiki azpizelularren lorpena:
Antolamendu zelularra maila molekularrean ulertzeko teknika erabilgarrienetariko bat
banaketa azpizelularra da. Teknika honen bidez ehun gehienetako zelulak ingurune
Metodoak
Doktore-tesia
72
isoosmotiko batean homogeneizazio batzuen bitartez banatu egiten dira eta zentrifugazio
diferentzialen bitartez nahiko ondo banatzen dira zelula barneko atalak (nukleoak,
mitokondriak, zitoplasma, erretikulu endoplasmikoa,…).
Garunaren kasuan, zatiki mitokondrialean mitokondriaz gain mielina eta nerbio
bukaerak azaltzen dira. Garun ehuna banatzean neuronen axoia nerbio bukaeratik hurbil
apurtu eta itxi egiten da, sinaptosoma izeneko egitura sortuz. Nerbio bukaera hauek
morfologia ezberdineko neuronenak dira. Era berean, beste zatiki zelularrek jatorri
neuronalaz gain gliala ere izan dezakete. Baina arazo hauek aintzat hartu arren, teknika
honek zatiki zelularretan aktibitate entzimatikoaren banaketa zein den nahiko ondo
ezagutarazten digu (Whitaker eta lank., 1969).
Tesi honen helburuetariko bat gizaki eta arratoien garun kortexeko aminopeptidasa
aktibitate ezberdinak zatiki azpizelularretan zeintzuk diren ikertzea izan da. Horretarako
Gray eta Whittakerren metodoa (1962), Krueger eta lankideen aldaketekin (1977), jarraitu
da:
Garun kortexaren 0.3gr 2ml sakarosa disoluzioan homogeneizatu (sakarosa 0.32M eta
Tris-HCl 4mM, pH 7.4 eta 4ºC-tan) 450 rpm-tan eta 30 seg-tan. Lortutako
homogenatutik 100µl geroko tratamendurako bereizi eta beste zatiari 1ml sakarosa
disoluzioa erantsi ondoren 1000 g-tan zentrifugatzen zen 10 minututan zehar.
Sobrenadantea beste hodi batzuetan bereizi eta pellet-a edo hauspeakina 1ml sakarosa
soluzioan homogeneizatuz gero beste 10 minutu zentrifugatzen zen 1000 g-tan. Lortutako
hauspeakina zatiki nuklearrari zegokion eta geroko tratamendurako uzten zen.
Lehengo sobrenadantea eta azkenengoa nahastu eta berriro zentrifugatzen ziren 1000 g-
tan 10 minututan zehar. Kasu honetan hauspeakina bota eta sobrenadantea 15 minutu
12.500 g-tan zentrifugatzen zen.
Oraingoan sobrenadantea bereizi eta pellet-a 2ml sakarosa soluzioan homogeneizatzen
zen, berriro beste 15 min 12.500 g-tan zentrifugatuz. Lortutako hauspeakinari zatiki
sinaptosomal gordina deritzogu eta bertan mitokondriak, mielina eta sinaptosomak daude.
Metodoak
Doktore-tesia
73
Sobrenadantea aurreko etapakoarekin nahasten zen eta ultrazentrifugako hodietan jarri
ondoren 120 minututan zehar 100.000 g-tan zentrifugatuz gero zatiki mikrosomala
(hauspeakina) eta zatiki zitosolikoa (sobrenadantea) lortzen zen. Orokorrean zatiki
mikrosomala erretikulu endoplasmiko mota biak eta Golgi aparatuaren zatikiz eraturiko
materiale hetereogeneoa dela esan dezakegu.
Zatiki sinaptosomal gordina 0.5 ml sakarosa soluzioan eseki eta 1.5ml ficoll %19
gehitzen zitzaion (sakarosa soluzioarekin nahastean %14-era gutxitzen zen). 2 ml hoietatik
0.5 ml bota eta beste 1.5ml-ak ultrazentrifugako hodira eramaten ziren, bertan dentsitatezko
gradiente ez jarrai bat sortzeko. Horretarako 1.5 ml hoien gainean 1ml ficoll (%7.5-ean) ezarri
eta honen gainean 0.5 ml sakarosa soluzio jartzen ziren, guztia 120 min-tan zehar eta
100.000 g-tan zentrifugatuz. Sakarosa – ficoll %7.5 tartean zegoen materiala zatiki
mielinikoari zegokion; ficoll %14 eta %7.5 interfasean agertutakoa zatiki
sinaptosomalari eta hauspeatutakoa zatiki mitokondrialari.
Purutasun handiagoa lortzeko zatiki sinaptosomala eta mielinikoak banandu ondoren,
bakoitza 2ml sakarosa disoluzioan berreseki 60min eta 100.000 g-ko zentrifugazioa egiten
zen, azkenean zatiki hauek haupeatzen zirelarik.
Azaldutako prozesua eskematikoki ikus daiteke 1. irudian.
Metodoak
Doktore-tesia
74
Garun kortexa
Homogenizatu
Sobrenadantea Hauspeakina (Pellet-a)
Sobrenadantea Hauspeakina Sobrenadantea Pellet-a
Pellet-a Sobrenadantea Berresekitu Bota Zatiki Nuklearra
Zatiki Mikrosomala Zitosola Ficoll gradientea
Pellet-a Banda Banda
Zatiki Mitokondriala Pellet-a Pellet-a
Zatiki Sinaptosomala Zatiki Mielinikoa
1. Irudia. Banaketa azpizelularraren teknikaren eskema.
Metodoak
Doktore-tesia
75
2.4. Zatiki azpizelularren purutasunaren froga:
Zatiki zelular ezberdinen purutasuna frogatzeko asmoz esperimentu ezberdinak egin
ziren bai gizaki zein arratoi garun kortexean. Sinaptosomen purutasunaren frogaren kasuan
izan ezik beste esperimentu guztietan zatikiak bata bestearekin konparatuz frogatu ziren
hauen purutasunak, emaitzen atalean ikusiko den bezala.
2.4.1. Entzima markatzaileak:
Zatiki zitosolikoaren purutasuna. Laktato deshidrogenasa aktibitatea (Berguemeyer
eta Brent, 1972) NADH-a eta pirubatoarekin laginak inkubatu ondoren
determinatu zen. Lagin bakoitzarentzako erreakzio denbora aldakor baten
ostean, NADH galpena espektrofotometroan neurtu zen 340nm-tan.
Zatiki mitokondrialaren purutasuna. Sukzinato deshidrogenasa aktibitatea neurtzeko
(Reddy eta Weber, 1986) sukzinatoa eta zianatoa zeraman disoluzio batekin
inkubatu ziren laginak. Entzima horren eraginez dikloroindofenolaren agerpenak
sortutako kolorazioa espektrofotometroaren neurtu zen 600 nm-tan.
Zatiki mikrosomalaren purutasuna. NADPH C zitokromo oxidasa aktibitatea
(Graham eta Ford, 1984) rotenonearen presentzian entzima horren erredukzioa
aztertuz egin zen neurketa, espektrofotometroaren bidez (550 nm).
Zatiki mielinikoaren purutasuna. 2’-3’ nukleotido zikliko fosfodiesterasa aktibitatea
(Nishizawa eta lank., 1980) lagina bromotimol urdina eta imidazol-HCL
indargetzailearekin inkubatu ondoren neurtu zen espektrofotometrikoki.
2.4.2. Zatiki nuklearra.
DNA edukina (Cesarone eta lank., 1979) lagina ilunpean 33258 Hoechst-arekin inkubatu
ondoren neurtu zen fluorimetrikoki.
Metodoak
Doktore-tesia
76
2.4.3. Zatiki sinaptosomala.
Hauspeakin sinaptosomalak lortu eta tratatu ondoren mikroskopio elektronikoa erabili zen
hauek konfirmatzeko.
2.5. Peptidasen aktibitatearen determinazio fluorimetrikoa.
Fluoreszentzia molekula askok duten ezaugarri fisikoa da. Zenbait molekulak behar
baino energia gehiago jasotzean (egitura elektronikoa kitzikatzean) ohiko egoera
energetikora berriz bilakatzeko argia igortzen dute. Ahalmen honi fluoreszentzia deritzogu
eta ezaugarri honek molekula hoiek oso erabilgarriak bihurtzen ditu ikerkuntzarako.
Peptidasen ikerketarako sustrato artifizialen artean erabilienak β–naftilaminaren eratorri
aminoazidikoak dira, non aminoazidoa amida lotura batez lotzen zaion sustrato artifizialari.
Aminoazil-β–naftilamida molekula honen gain aminopeptidasa jakin batek eragitean,
askatutako β–naftilamina ziklatu egiten da ahalmen fluoreszentea bereganatuz.
Gure esperimentuetan erreakzio entzimatikoa ikertzeko, agertzen zen β–naftilamina
(produktu fluoreszentea) 345 nm-ko uhin luzera duen argi igorpen batez kitzikatu eta,
412nm-ko uhin luzeran β–naftilamina honek, egonkortzeko, igortzen duen fluoreszentzia
neurtzen genuen. Lortutako fluoreszentziaren balio numerikoak, β–naftilamina
kontzentrazio jakinez egindako fluoreszentzia patroi-zuzen batean interpolatzen genituen,
erreakzioan zehar sortu den β–naftilamina kantitatea kalkulatzeko (Greenberg, 1962) (Alba
eta lank., 1989).
Neurtu beharreko laginari sustratoa gehitu eta 37º C-tan (giza tenperatura fisiologikoan)
30 minututan zehar inkubatzen uzten da. Laginean dauden aminopeptidasek sustratoa
(aminoazil-β–naftilamida) anderatuko dute eta askatutako fluoreszentzia plakazko
fluorimetroaren bitartez neurtuko zen.
Metodoak
Doktore-tesia
77
Plaketako ontzitxoetan jarri beharreko lagin eta sustratu kantitateak eta aminoazil-β–
naftilamida motak ezberdinak ziren neurtu nahi zen aminopeptidasaren arabera:
Alanil aminopeptidasa, APN (edo APM) eta AP MII aktibitateak neurtzeko: 10
µl lagin eta 290 µl sustrato (alanil-β–naftilamida).
Prolil endopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 30 µl lagin eta 270 µl sustrato (prolil-
β–naftilamida).
Arginil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 10 µl lagin eta 290 µl sustrato
(arginil-β–naftilamida).
Leuzil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 30 µl lagin eta 270 µl sustrato
(leuzil-β–naftilamida).
Piroglutamil peptidasa aktibitatea neurtzeko: 60 µl lagin eta 240 µl sustrato
(piroglutamil-β–naftilamida).
Aspartatil aminopeptidasa aktibitatea neurtzeko: 60 µl lagin eta 240 µl sustrato
(aspartil-β–naftilamida).
Entzima batzuen aktibitateak izatez txikiagoak direnez, sortutako fluoreszentzia
neurgarria izan zedin, lagin kantitate handiagoak erabili behar izan genituen. Gainera aldez
aurretik kalkulatuta izan genuen kantitate eta denbora hauekin aktibitatea kurbaren zati
linealean zegoela.
Aminopeptidasen aktibitatearen balioak Peptidasa Aktibitate – Unitateetan (PAU)
ematen dira. Unitate hauek sustrato fluorogenikoaren pikomol bat minutuko hidrolisatzen
duen entzima kantitatea adierazten dute. Azkenengo emaitza aktibitate espezifiko bezala
ematen da; hau da, PAU mg proteina bakoitzeko (PAU/mg proteina).
Metodoak
Doktore-tesia
78
2.6. Proteinen neurketa:
Laginetan dagoen proteina kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie urdin
disdiratsu izeneko koloranteak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da (Bradford,
1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia zurgatzeko
duten gaitasunean oinarritzen da.
Kolorantea proteinekin lotu eta gai kimiko horren zurgapenaren uhin luzeran aldaketa
bat gertatzen da, 465 nm-tik 595 nm-tara pasaz. Zurgapen gehikuntza, kolorantea
saturantea izanik, proteina kontzentrazioarekiko zuzenki proportzionala da. Honela,
absortzioaren gehikuntza espektrofotometro edo kolorimetro batean neurtuz proteina
kantitate ezagunekin egindako zurgapen patroi-zuzen batean interpola daiteke.
Gure esperimentuetan 10 ml lagin 2 ml Bradford erreaktiborekin inkubatu (5 min) eta
sahodi bakoitzeren edukinaren absorbantzia fotometroan neurtzen genuen, absortzioaren
uhin-luzera kontrolatzen duen monomarkadorea 595 nm-tan finkatuz.
Patroi-zuzena egiteko, behi-seroalbuminaz prestatutako kontzentrazio jakineko
alikuotaren µl ezberdinak jarri eta bakoitza Bradford erreaktiboaren 2ml-rekin inkubatzen
genituen. Lortutako absorbantziaren emaitzak, kontzentrazioarekiko proportzionaltasun
zuzena azaltzen duen Y= aX + b funtzio zuzen batera doitzen direla ikusi eta zuzen
horretan gure laginekin lortutako absorbantzia balioak interpolatzen genituen.
2.7. Metodo estatistikoa
Tesi honetan, egindako neurketa eta planteatutako talde moten arabera metodo
estatistiko ezberdinak erabili dira konparaketen esangarritasuna jakiteko:
Metodoak
Doktore-tesia
79
Zatiki azpizelularren aktibitate peptidasikoek emandako datuak eta baita
purotasunaren frogaren datuak bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA)
bitartez tratatu ziren.
NSZ-aren atal ezberdinetako peptidasa aktibitateak (gizaki eta arratoi garunean)
bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez tratatu ziren. Espezie arteko
konparaketa berriz, parekatu gabeko T Student test-aren bitartez egin zen.
Gizaki heroinazaleen garunaren peptidasa aktibitateak beraien kontrolekin
konparatu ziren neurri errepikatutako bariantza analisiaren (ANOVA) bitartez.
Opiazeoekin tratatutako animalien aktibitate entzimatikoak (morfina eta
naloxona taldeak) beraien kontrolekin konparatu ziren parekatutako T Student test-
aren bidez.
Erabilitako programa estatistikoak SPSS 11.0, Instat eta Kyplot 2..0 izan dira.
IV. Emaitzak
Emaitzak
Doktore-tesia
81
1. Gizaki eta arratoiaren garun kortexeko peptidasa
ezberdinen banaketa azpizelularra:
Hurrengo 11 tauletan eta dagozkien 22 irudietan gizaki eta arratoi tratatugabeen garun
kortexeko zatiki azpizelularretako aktibitate peptidasikoak azaltzen dira. Aukeratutako
zatikiak sinaptosomak (Sp), mitokondriak (Mt), mikrosomak (Mr), nukleoa (N), zitosola
(Zit) eta zatiki mielinikoa (Miel) izan dira.
Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira
(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.
Datuen konparaketa bide bateko bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da.
Lortutako probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05, P< 0.01 edo P< 0.005 datu
esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak zirenean.
Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atal batean zatiki solugarriko peptidasen
aktibitateak azaltzen dira eta bigarren atalean mintzari lotutako entzimen aktibitateak.
Hirugarren zatian zatiki azpizelularren purotasuna frogatzeko egindako entseiuen
emaitzak aurkezten dira. Laugarrenean hil-osteko atzerapena edo postmortem delay-ak eta
laginen izozte denborak aktibitate entzimatikoaren gain eragiten duen jakiteko egindako
korrelazio ikerketaren datuak agertzen dira.
1.1. Peptidasa solugarriak:
1.1 Taulan eta 1.1 eta 2.2 irudietan PSA solugarriak (EC 3.4.11.14) zatiki azpizelular
ezberdinetan emandako baloreak azaltzen dira. Banaketa bai gizakian eta bai arratoian
nahiko homogeneoa eta antzekoa izan arren balore altuenak sinaptosoma eta zitosol mailan
ikusi dira. Aktibitate txikiena mikrosometan eman da (ANOVA: P< 0.05, gizakian;
P<0.005 arratoian).
1.2 Taulan eta 1.3-4. irudian prolil endopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.21.26) aktibitateak
deskribatzen dira. Nahiko homogeneoki banatzen da entzima hau zatikietan eta espezie
Emaitzak
Doktore-tesia
82
arteko antzekotasuna dago banaketari dagokionez. Zitosolean azaldu dira aktibitate
nagusiak eta zatiki mikrosomalean txikienak (ANOVA: P< 0.05, gizakian; P< 0.05
arratoian).
1.3. Taulan eta 1.5-6. irudietan arginil aminopeptidasaren edo APB-aren (EC 3.4.11.6)
banaketa azpizelularrak aurkezten dira gizaki eta arratoi garun kortexean. Espezie bietan
banaketa patroi antzekoa ikusi dugu; aktibitate nagusiak sinaptosoma eta mitokondrietan
eta baxuenak mikrosometan neurtu dira (ANOVA: P< 0.01, gizakian; P<0.01 arratoian).
1.4. Taulan eta 1.7-8. irudietan leuzil aminopeptidasa aktibitatearen (EC 3.4.11.1) banaketa
azpizelularra azaltzen dira. Kasu honetan ere espezie bietan ia banaketa berbera ikus
daiteke, sinaptosometako aktibitatea beste zatiki azpizelular bakoitzean baino bi bider
handiagoa delarik (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005 arratoian).
1.5. Taulan eta 1.9-10. irudietan piroglutamil peptidasa I solugarriaren (EC 3.4.19.3)
aktibitateak aurkezten ditugu gizaki zein arratoien garun kortexaren zatiki azpizelularretan.
Espezie bietan sinaptosometako aktibitatea zatiki guztien ia erdia dela ikusi da. Aktibitate
baxuenak nukleo eta zitosolean agertu dira (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005
arratoian).
1.6. Taulan eta 1.11-12. irudietan aspartil aminopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.11.7)
banaketa azpizelularra ikus daiteke. Kasu honetan ere sinaptosometako aktibitateak oso
altuak dira sinaptosometan eta baxuenak berriro azaltzen dira nukleo eta zitosolean
(ANOVA: P< 0.005, gizakian; P<0.005 arratoian).
Laburbilduz beraz, peptidasa solugarrien banaketari dagokionez espezie bietan
zatikietako banaketa – patroi antzekoa ikusi dugu, aktibitate altuenak sinaptosoma mailan
agertu direlarik, prolil endopeptidasaren kasuan izan ezik.
1.2. Mintzari lotutako peptidasak:
1.7. Taulan eta 1.13-14. irudietan mintzari lotutako PSA (AP MII edo EC 3.4.11.14)
aktibitateak azaltzen dira. Bai gizakian eta bai arratoian banaketa azpizelularra nahiko
homogeneoa da, baina kasu honetan espezie bien arteko antzekotasun txikiagoa dago.
Emaitzak
Doktore-tesia
83
Gizakiaren kasuan zatiki mikrosomalean ikusi dira balore altuenak eta mitokondriatan
txikienak (ANOVA: P<0.05). Arratoian berriz, nahiz eta sinaptosoma mailan agertu balore
altuenak eta mitokondrietan txikienak konparaketa ez da esangarria izan (ANOVA: P >
0.05).
1.8. Taulan eta 1.15-16. irudietan puromizinarekiko erresistentea den alanil
aminopeptidasa N-ren (EC 3.4.11.2) banaketa azpizelularra deskribatzen da. Oraingo honetan
banaketa nahiko homogeneoa eta antzekoa espezie artean gertatu da. Nukleoetan eman dira
aktibitate handienak eta mitokondrietan txikienak (ANOVA: P< 0.01, gizakian; P< 0.05
arratoian).
1.9. Taulan eta 1.17-18. irudietan mintzari lotutako prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26)
aktibitateak deskribatzen dira. Bai gizaki zein arratoian aktibitate handienak zatiki
sinaptosomala eta mielinikoan agertu dira, beste zatikietakoa baino %10-15 handiagoa
delarik (ANOVA: P<0.05, gizakian; P< 0.05 arratoian).
1.10. Taulan eta 1.19-20. irudietan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I entzimaren
(EC 3.4.19.13) banaketa azpizelularra aurkezten da. Bai gizakian eta arratoian banaketa
antzekoa gertatu da, mielina eta sinaptosometako aktibitateak beste zatikietakoa baino %15
handiagoa delarik (ANOVA: P< 0.005, gizakian; P< 0.005 arratoian).
1.11. Taulan eta 1.21-22. irudietan mintzari lotutako aspartil aminoeptidasaren (EC 3.4.11.7)
banaketa azpizelularra agertzen da. Kasu honetan espezie arteko antzekotasun handia
azaldu da eta banaketa oso homogeneoa gertatu da. Konparaketak ez dira esangarriak izan
(ANOVA: P>0.05 gizakian eta arratoian).
Laburbilduz, mintzari lotutako peptidasen banaketa entzima motaren arabera
ezberdintsuagoa izan da eta konparaketa ez esangarri gehiago azaldu dira, nahiz eta hemen
ere espezie arteko antzekotasuna gutxi gora behera mantendu izan.
Emaitzak
Doktore-tesia
84
PSA solugarria (Banaketa azpizelularra)
1.1. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien PSA solugarriaren aktibitate balioak
aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.
Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak
batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren
analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan
daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 49287 9902 43034 6441
Mitokondriak 37233 4965 29820 2458
Mikrosomak 31943 2718 21782 1854
Nukleoa 34145 2289 30892 1679
Zitosola 45250 3008 40165 3806
ANOVA P<0.05 ANOVA P<0.001
Emaitzak
Doktore-tesia
85
PSA solugarria
(Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp25%
Mt19%
Mr16%
N 17%
Zit23%
1.1. Irudia
Arratoia
Sp26%
Mt18%
Mr13%
N 19%
Zit24%
1.2. Irudia
1.1–1.2 Irudiak. Zatiki solugarriko PSA aktibitateari dagozkion emaitzen irudiak.
Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
86
Prolil endopeptidasa solugarria (Banaketa azpizelularra)
1.2. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien prolil endopeptidasa solugarriaren
aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki
azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa
bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria
(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 21755 8340 8340 1217
Mitokondriak 23035 8870 8870 1221
Mikrosomak 16124 6019 6019 1307
Nukleoa 21500 6430 6430 292
Zitosola 27642 10002 10002 1382
ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.01
Emaitzak
Doktore-tesia
87
Prolil endopeptidasa solugarria
(Banaketa azpizelularra)
GizakiaSp
20%
Mt21%
Mr15%
N 20%
Zit24%
1.3. Irudia
Arratoia
Sp21%
Mt22%
Mr15%
N 16%
Zit26%
1.4. Irudia 1.3–1.4 Irudiak. Zatiki solugarriko prolil endopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen
irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
88
Arginil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)
1.3. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien arginil aminopeptidasaren aktibitate
balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki
azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa
bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria
(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 23648 3199 43569 6052
Mitokondriak 21673 3677 36024 7506
Mikrosomak 3470 1001 6599 1830
Nukleoa 9432 1277 25433 2881
Zitosola 14370 2330 33004 5468
ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.01
Emaitzak
Doktore-tesia
89
Arginil aminopeptidasa
(Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp32%
Mt30%
Mr5%
N 13%
Zit20%
1.5. Irudia
Arratoia
Sp29%
Mt25%
Mr5%
N 18%
Zit23%
1.6. Irudia 1.5–1.6 Irudiak. Zatiki solugarriko arginil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen
irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
90
Leuzil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)
1.4. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien leuzil aminopeptidasaren aktibitate
balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki
azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa
bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria
(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 1139 260 1526 320
Mitokondriak 480 137 721 120
Mikrosomak 416 62 533 90
Nukleoa 378 72 406 94
Zitosola 405 50 504 93
ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005
Emaitzak
Doktore-tesia
91
Leuzil aminopeptidasa
(Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp41%
Mt17%
Mr15%
N 13%
Zit14%
1.7. Irudia
Arratoia
Sp41%
Mt20%
Mr14%
N 11%
Zit14%
1.8. Irudia 1.7–1.8 Irudiak. Zatiki solugarriko leuzil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen
irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
92
Piroglutamil peptidasa I solugarria (Banaketa azpizelularra)
1.5. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien piroglutamil peptidasa I
solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun
kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman
dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau
esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo
p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 2956 648 3203 868
Mitokondriak 1597 332 1170 274
Mikrosomak 1184 438 757 155
Nukleoa 602 109 533 113
Zitosola 653 138 720 123
ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005
Emaitzak
Doktore-tesia
93
Piroglutamil peptidasa I solugarria
(Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp42%
Mt23%
Mr17%
N 9%
Zit9%
1.9. Irudia
Arratoia
Sp51%
Mt18%
Mr12%
N 8%
Zit11%
1.10. Irudia 1.9–1.10 Irudiak. Zatiki solugarriko piroglutamil peptidasa I aktibitateari dagozkion
emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak
azaltzen dira: Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta
Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
94
Aspartil aminopeptidasa solugarria (Banaketa azpizelularra)
1.6. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien aspartil aminopeptidasa solugarriaren
aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki
azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa
bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria
(e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Sinaptosomak 1241 142 1425 286
Mitokondriak 490 87 505 80
Mikrosomak 297 44 337 39
Nukleoa 179 18 146 15
Zitosola 188 32 165 24
ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005
Emaitzak
Doktore-tesia
95
Aspartil aminopeptidasa solugarria
(Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp53%
Mt20%
Mr12%
N 7%
Zit8%
1.11. Irudia
Arratoia
Sp55%
Mt20%
Mr13%
N 6%
Zit6%
1.12. Irudia 1.11–1.12 Irudiak. Zatiki solugarriko aspartil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion
emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak
azaltzen dira: Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr), Nukleoa (N) eta
Zitosola (Zit).
Emaitzak
Doktore-tesia
96
Mintzari lotutako PSA (AP MII) (Banaketa azpizelularra)
1.7. Taula. Taula honetan hurrengo irudiari dagozkion AP MII-aren aktibitate balioak
aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.
Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak
batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren
analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan
daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Mielina 14211 1855 12083 1467
Sinaptosomak 13568 2524 9182 1303
Mitokondriak 8471 1516 7436 1086
Mikrosomak 15789 2386 8500 970
Nukleoa 8769 1483 8061 1439
ANOVA P<0.05 ANOVA e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
97
Mintzari lotutako PSA (AP MII) (Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp22%
Mt14%
Mr27%
N14%
Miel23%
1.13. Irudia
Arratoia
Sp20%
Mt16%
Mr19%
N18%
Miel27%
1.14. Irudia 1.13–1.14 Irudiak. Mintzari lotutako PSA (AP MII) aktibitateari dagozkion emaitzen
irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).
Emaitzak
Doktore-tesia
98
Alanil aminopeptidasa N (APN) (Banaketa azpizelularra)
1.8. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien APN-aren aktibitate balioak
aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun kortxeko zatiki azpizelularretan.
Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak
batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa bariantzaren
analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan
daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Mielina 2486 229 1979 224
Sinaptosomak 2662 340 2068 402
Mitokondriak 1958 282 1850 322
Mikrosomak 3146 398 1973 298
Nukleoa 4622 847 3617 751
ANOVA P<0.01 ANOVA P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
99
Alanil aminopeptidasa N (APN) (Banaketa azpizelularra)
GizakiaSp
18%
Mt13%
Mr21%
N31%
Miel17%
1.15. Irudia
Arratoia
Sp18%
Mt16%
Mr17%
N32%
Miel17%
1.16. Irudia 1.15–1.16 Irudiak. Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN) aktibitateari
dagozkion emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki
azpizelularrak azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt),
Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).
Emaitzak
Doktore-tesia
100
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitatea (Banaketa azpizelularra)
1.9. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako prolil
endopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun
kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman
dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau
esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo
p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Mielina 4826 319 2483 249
Sinaptosomak 5181 631 2156 241
Mitokondriak 3059 436 1127 79
Mikrosomak 3902 562 1140 172
Nukleoa 2636 380 1185 261
ANOVA P<0.05 ANOVA P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
101
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitatea (Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp26%
Mt16%
Mr20%
N13%
Miel25%
1.17. Irudia
Arratoia
Sp27%
Mt14%
Mr14%
N15%
Miel30%
1.18. Irudia 1.17–1.18 Irudiak. Mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitateari dagozkion emaitzen
irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak azaltzen dira:
Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta Nukleoa (N).
Emaitzak
Doktore-tesia
102
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (Banaketa azpizelularra)
1.10. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako piroglutamil
peptidasa I -en aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun
kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman
dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau
esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo
p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Mielina 527 83 399 65
Sinaptosomak 396 85 358 47
Mitokondriak 239 29 198 25
Mikrosomak 229 35 209 33
Nukleoa 245 39 224 30
ANOVA P<0.005 ANOVA P<0.005
Emaitzak
Doktore-tesia
103
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp24%
Mt15%
Mr14%
N15%
Miel32%
1.19. Irudia
Arratoia
Sp26%
Mt14%
Mt15%
N16%
Miel29%
1.20. Irudia 1.19–1.20 Irudiak. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I aktibitateari dagozkion
emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak
azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta
Nukleoa (N).
Emaitzak
Doktore-tesia
104
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)
1.11. Taula. Taula honetan hurrengo irudiei dagozkien mintzari lotutako aspartil
aminopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien garun
kortxeko zatiki azpizelularretan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman
dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa bariantzaren analisiaren (ANOVA) bitartez egin da eta hau
esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo
p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
Zatiki
azpizelularra Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+)
Mielina 342 70 334 87
Sinaptosomak 334 68 341 96
Mitokondriak 255 78 258 51
Mikrosomak 253 50 256 32
Nukleoa 232 46 269 43
ANOVA e.e ANOVA e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
105
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (Banaketa azpizelularra)
Gizakia
Sp24%
Mt18%
Mr18%
N16%
Miel24%
1.21. Irudia
Arratoia
Sp23%
Mt18%
Mr18%
N18%
Miel23%
1.22. Irudia 1.20–1.22 Irudiak. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa aktibitateari dagozkion
emaitzen irudiak. Abszisa ardatzean ikertutako garun kortexeko zatiki azpizelularrak
azaltzen dira: Mielina (Miel), Sinaptosomak (Sp), Mitokondriak (Mt), Mikrosomak (Mr) eta
Nukleoa (N).
Emaitzak
Doktore-tesia
106
1.3. Markatzaile azpizelularrak:
Aztertutako zatiki azpizelularren purotasuna ezagutzeko zatiki bakoitzarekiko
espezifikoak diren entzimen aktibitateak neurtu dira.
1.12. Taulan gizaki eta arratoian entzima hauen banaketa azpizelularra azaltzen da. Kasu
honetan garun kortexaren homogenatuak emandako balorea %100-tzat hartuz beste
zatikietako aktibitate baloreak homogenatu honekiko portzentaietan eman dira.
Konparaketak bide bateko bariantzaren analisiarekin (ANOVA) egin dira.
Zatiki sinaptosomalaren purotasuna azaltzeko mikroskopio elektronikoz eginiko
argazkia aurkezten da (1. Argazkia).
1.4. Aktibitate entzimatikoa, hil-osteko atzerapena eta izozte denbora:
Gizakiaren garunen kasuan, organu hau atera baino lehen pasatutako hil-osteko
atzerapenak eta izozkailuan pasatutako denborak aktibitate entzimatikoaren gain eragiten
duenentz ziurtatzeko korrelazio ikerketa estatistiko bat egin da. PSA solugarria eta APB-a
entzima aktibitateak lagintzat hartuz, baldintza fisiko hauek aktibitate entzimatikoan
eraginik ez dutela ikus daiteke 1.13-1.14 eta 1.15-1.16 tauletan. (PSA: R= 0.115, P= 0.505
pm delay-aren kasuan eta R= 0.034, P= 0.851 izozte denboraren kasuan. APB: R= 0.016, P=
0.934 eta R= 0.045, P= 0.823).
Em
aitz
ak
Dok
tore
-tes
ia
107
Sukz
inat
o de
shid
roge
nasa
DN
A
C Z
itokr
omo
erre
dukt
asa
Lak
tato
de
shid
roge
nasa
2’-3
’ Zik
liko
nukl
otid
asa
Giza
kia
Arra
toia
Giza
kia
Arra
toia
Giza
kia
Arra
toia
Giza
kia
Arra
toia
Giza
kia
Arra
toia
Hom
ogen
atu
a (S
/M
) %
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
S 74
68
25
18
58
80
26
1 24
4 -
- Si
napt
osom
akM
108
120
30
24
64
77
- -
140
134
S 71
76
45
45
29
28
11
9 10
8 -
- M
itoko
ndri
akM
174
200
14
32
39
44
- -
35
57
S 19
25
40
30
55
60
55
60
-
- M
ikro
som
ak
M28
34
19
32
22
3 24
8 -
- 11
0 10
7 S
32
28
19
24
32
35
32
35
- -
Nuk
leoa
M
84
84
260
176
26
33
- -
100
71
Zito
sola
60
44
11
12
45
43
25
0 16
7 -
- M
ielin
a 70
48
60
63
40
54
-
- 30
0 42
9
AN
OV
A: P
<
< 0
.005
<
0.0
05
< 0
.005
<
0.0
05
< 0
.005
<
0.0
05
< 0
.005
<
0.0
05
< 0
.005
< 0
.005
1.12
. Tau
la
Emaitzak
Doktore-tesia
108
1. Argazkia. Arratoiaren garuneko prestakin baten zatiki sinaptosomalen argazkia.
Mintzez inguraturiko egitura gehienak (%70) sinaptosomak dira (bixikula sinaptikoak edo
SV). Ikus daitezkeen beste egiturak lotura sinaptikoak dira (SJ). Eskala: 1mm. Handipena:
x10.000.
Emaitzak
Doktore-tesia
109
1.13-1.14 Taulak
PSA solugarria
0
25000
50000
75000
100000
0 10 20 30 40 50 60
Hil-osteko atzerapena (orduak)
PA
U/m
g pr
otei
na
PSA solugarria
0
25000
50000
75000
100000
0 5 10 15 20 25 30
Izozte denbora (hilabeteak)
PA
U/m
g pr
otei
na
Emaitzak
Doktore-tesia
110
1.15-1.16 Taulak
APB
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 10 20 30 40 50 60
Hil-osteko atzerapena (orduak)
PA
U/m
g pr
otei
na
APB
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 10 20 30 40 50 60
Izozte denbora (hilabeteak)
PA
U/m
g pr
otei
na
Emaitzak
Doktore-tesia
111
2. Gizaki eta arratoiaren NSZ-ko peptidasa ezberdinen
banaketa erregionala.
Hurrengo 11 tauletan eta dagozkien grafikatan gizaki eta arratoi tratatugabeen NSZ-ko
atal ezberdinetako aktibitate peptidasikoak azaltzen dira. Aukeratutako garun guneak 7 izan
ziren, amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K), kortex prefrontala
(PF), okzipitala (O) eta parietala (P) hain zuzen.
Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira
(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.
Taula eta grafiketan adierazten diren konparaketak gizakia eta arratoiaren arteko
aktibitate peptidasikoena da. Konparaketa horretarako parekatu gabeko T Student-a erabili
dugu tresna estatistiko bezala. Lortutako probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (*),
P< 0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak
zirenean.
Banaketa erregionalean aldakuntza esangarriak gertatu diren kasuetan (guneetako
aktibitateak ANOVA bitartez konparatuz), hauek tauletan adierazten dira. Banaketa
homogeneoa edo berezitasun esangarririk egon ez den kasuetan ez da ezer adierazi tauletan.
Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atal batean zatiki solugarriko peptidasen
aktibitateak azaltzen dira eta bigarren atalean mintzari lotutako entzimen aktibitateak.
2.1. Peptidasa solugarriak:
2.1 Taulan eta 2.1 grafikan PSA solugarriak (EC 3.4.11.14) NSZ-ko atal ezberdinetan
emandako baloreak azaltzen dira. Aktibitatea bai gizakian eta bai arratoiaren garuneko atal
guztietan ikusi den arren, gizakiaren kasuan kortexean agertutako baloreak beste
guneetakoa baino txikiagoak izan dira (ANOVA: P < 0.05).
Alderantziz, aktibitate espezifikoa gizakiaren kasuan arratoiarena baino handiagoa dela
atal guztietan ikusi dugu; hipotalamoaren kasuan adibidez, ia %46 handiagoa.
Emaitzak
Doktore-tesia
112
2.2 Taulan eta 2.2 grafikan prolil endopeptidasa solugarriaren (EC 3.4.21.26) banaketa
erregionala deskribatzen da. Kasu honetan, giza garuneko kortexean PEP aktibitatea
aztertutako beste ataletan baino askoz handiagoa da (ANOVA: P< 0.005). Arratoi
garunean berriz, banaketa nahiko homogeneoa ikusi dugu.
Bestalde gizakiaren prolil endopeptidasa aktibitatea arratoiarenaren hirukoitza edo
laukoitza dela ikus daiteke (T student: P<0.005, atal guztietan).
2.3 Taulan eta bere grafikan arginil aminopeptidasa edo APB-aren (EC 3.4.11.6)
aktibitateak ikus daitezke. Entzima hau aztertutako garuneko atal guztietan banatzen da,
baina giza garun kortexeko mailak beste guneetakoa baino txikiagoak izan dira (ANOVA:
P< 0.05).
Kasu honetan, lehenengo bietan ez bezala, arratoi garunean azaldutako aktibitateak
gizakiarenak baino ia %50 handiagoak direla ikusi da (T student: P<0.005 atal guztietan
hipokanpoan izan ezik, non P< 0.05).
2.4 Taulan eta dagokion grafikan leuzil aminopeptidasaren (EC 3.4.11.1) banaketa
erregionala aurkezten da. Orokorrean, entzima atal guztietan banatzen da eta espezie arteko
konparaketan aipagarriena gizakiaren kortexeko aktibitate handiagoa izan da (T Student: P<
0.05 kortex parietalean).
2.5. eta 2.6 Tauletan eta grafiketan piroglutamil peptidasaren (EC 3.4.19.3) eta aspartil
aminopeptidasa (EC 3.4.11.17) solugarrien banaketa erregionala azaltzen da, hurrenez
hurren. Entzima hauetan ez zen ezberdintasun esangarririk ikusi ezta banaketan ezta
espezie arteko konparaketan.
Laburtuz eta espezie arteko konparaketari dagokionez, aipatu beharra dago gizakian
agertutako prolil endopeptidasa eta PSA aktibitate altuagoak eta arratoian ikusitako arginil
aminopeptidasa aktibitate handiagoa. Era berean aipagarria da, gizakiaren garunean emandako
PEP-ren banaketa, non kortexean beste ataletan baino aktibitate askoz handiagoak neurtu
ziren; eta alderantziz, gizaki atal berbereko PSA eta APB maila eskasagoak.
Emaitzak
Doktore-tesia
113
2.2. Mintzari lotutako peptidasak:
2.7 Taulan eta dagokion grafikan mintzari lotutako PSA (AP MII, PSA edo EC
3.4.11.14) aktibitateak aurkezten dira. Banaketari dagokionez kortexeko aktibitatea beste
atal batzuetan (amigdala, hipotalamoa eta hipokanpoa) baino pixkat txikiagoak izan dira
(ANOVA: P<0.005, gizakian). Espezie artean kasu honetan ere gizaki garunean aktibitatea
handiagoa izan da (T student: P< 0.01 hipotalamo eta hipokanpoan; P<0.05 kortex
frontalean).
2.8. Taula eta grafikan alanil aminopeptidasa N (APN edo EC 3.4.11.2) aktibitateak
azaltzen dira, non ez den ikusten berezitasun esangarririk ezta banaketa erregionalean ezta
espezie arteko konparaketan.
2.9. Taula eta grafikan mintzari lotutako prolil endopeptidasaren (EC 3.4.21.26) banaketa
erregionala azaltzen da. Hemen ere aktibitatea askoz handiagoa da gizakian (T student:
P<0.005 atal guztietan) eta gizakiaren NSZ-ko banaketari dagokionez, kortexean aktibitate
handiagoak aurkezten dira (ANOVA: P< 0.005).
2.10 eta 2.11 Tauletan eta dagozkien grafiketan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa
(EC 3.4.19.13) eta aspartil aminopeptidasaren (EC 3.4.11.7) banaketa erregionala deskribatzen
dira. Kasu hauetan banaketak oso homogeneoak direla ikusi da eta ez da espezie arteko
konparaketa esangarririk azaldu.
Mintzari lotutako peptidasei dagokionez berriro errepikatzen dira giza garunean prolil
endopeptidasaren banaketa berezia, mintzari lotutako PSA-rena (esangarritasun
txikiagoarekin) eta baita entzima honen eta PEP-aren aktibitate handiagoak arratoiarekiko.
Emaitzak
Doktore-tesia
114
PSA solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.1. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion PSA solugarriaren aktibitate
balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan.
Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak
batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student
test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo
kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 63676 4811 46798 3608 P<0.05
Hipotalamoa 69905 4431 38247 2630 P<0.005
Hipokanpoa 67187 2837 48148 2117 P<0.005
Kaudatua 69193 2117 47751 2839 P<0.005
Prefrontala 55079 2839 37603 2748 P<0.005
Okzipitala 57083 2748 39916 3287 P<0.01
Parietala 55399 3287 40831 3021 P<0.05
ANOVA (P< 0.05)
Emaitzak
Doktore-tesia
115
PSA solugarria
(NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
A Ht Hc K PF O P
APU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
****
******
*** ***
2.1.Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean
ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),
hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta
parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
116
Prolil endopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.2 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion prolil endopeptidasa solugarriaren
aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 8004 1200 3116 440 P< 0.005
Hipotalamoa 7118 856 2230 220 P< 0.005
Hipokanpoa 6650 660 3061 400 P< 0.005
Kaudatua 7999 880 3110 422 P< 0.005
Prefrontala 12888 1130 3111 419 P< 0.005
Okzipitala 14001 1133 2889 411 P< 0.005
Parietala 13536 1688 2996 200 P< 0.005
ANOVA (P< 0.005)
Emaitzak
Doktore-tesia
117
Prolil endopeptidasa solugarria
(NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
A Ht Hc E PF O P
APU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia***
*** ***
***
***
***
*** ***
2.2.Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa
ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
118
Arginil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.3. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion arginil aminopeptidasaren
aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 20951 2765 34671 2042 P<0.005
Hipotalamoa 18983 1911 28612 2053 P<0.005
Hipokanpoa 22596 2445 30861 2619 P<0.05
Kaudatua 20378 1520 32624 2728 P<0.005
Prefrontala 16291 1083 28062 1985 P<0.005
Okzipitala 16843 1308 30556 3068 P<0.005
Parietala 15139 1275 27875 2308 P<0.005
ANOVA (P<0.05)
Emaitzak
Doktore-tesia
119
Arginil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
***
****
***
*** ******
2.3.Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean
ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),
hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta
parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
120
Leuzil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2..4 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion leuzil aminopeptidasaren aktibitate
balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan.
Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak
batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student
test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo
kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 503 35 457 42 e.e
Hipotalamoa 477 87 386 39 e.e
Hipokanpoa 346 49 478 77 e.e
Kaudatua 447 90 450 65 e.e
Prefrontala 442 44 350 45 e.e
Okzipitala 523 71 349 34 e.e
Parietala 481 60 323 36 P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
121
Leuzil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
100
200
300
400
500
600
700
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
*
2.4.Grafika. Leuzil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa
ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
122
Piroglutamil peptidasa I solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.5 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion piroglutamil peptidasa I
solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 500 51 448 49 e.e
Hipotalamoa 496 56 504 77 e.e
Hipokanpoa 542 77 483 74 e.e
Kaudatua 411 80 482 65 e.e
Prefrontala 306 50 438 79 e.e
Okzipitala 464 67 415 49 e.e
Parietala 381 37 378 42 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
123
Piroglutamil peptidasa I solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
100
200
300
400
500
600
700
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
2.5.Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa
ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
124
Aspartil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.6. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion aspartil aminopeptidasa
solugarriaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 213 51 210 30 e.e
Hipotalamoa 200 30 185 25 e.e
Hipokanpoa 167 24 174 19 e.e
Kaudatua 205 25 197 23 e.e
Prefrontala 172 30 164 21 e.e
Okzipitala 185 26 164 22 e.e
Parietala 154 30 181 21 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
125
Aspartil aminopeptidasa solugarria (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
50
100
150
200
250
300
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
2.6.Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa
ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
126
Mintzari lotutako PSA (AP MII) (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.7 Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion AP MII-aren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 17974 1088 13540 2722 e.e
Hipotalamoa 12158 1240 6731 832 P<0.01
Hipokanpoa 14337 1363 7568 1783 P<0.01
Kaudatua 11256 2131 9620 3091 e.e
Prefrontala 10445 1196 6130 1015 P<0.05
Okzipitala 9232 1137 8805 1731 e.e
Parietala 11302 933 8630 1047 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
127
Mintzari lotutako PSA (AP MII) (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
5000
10000
15000
20000
25000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia**
**
*
2.7 Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri (AP MII) dagozkion emaitzen grafika. Abszisa
ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
128
Alanil aminopeptidasa N (APN) (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.8. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion APNaren aktibitate balioak
aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen
unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta
beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin
da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05,
p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 2878 615 3318 364 e.e
Hipotalamoa 2352 260 2706 368 e.e
Hipokanpoa 2476 356 3905 839 e.e
Kaudatua 2159 210 2776 424 e.e
Prefrontala 2931 707 2690 398 e.e
Okzipitala 2948 729 2776 478 e.e
Parietala 2468 480 2929 785 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
129
Alanina aminopeptidasa N (APN) (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
A Ht Hc K PF O P
APU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
2.8 Grafika. Mintzari lotutako APN-ari dagozkion emaitzen grafika. Abszisa ardatzean
ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht),
hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta
parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
130
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.9. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako prolil
endopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 1155 182 800 164 P< 0.01
Hipotalamoa 955 102 400 67 P< 0.005
Hipokanpoa 800 124 488 94 P< 0.005
Kaudatua 1044 136 444 93 P< 0.005
Prefrontala 1600 156 467 80 P< 0.005
Okzipitala 1622 209 464 93 P< 0.005
Parietala 1533 173 412 44 P< 0.005
ANOVA (P<0.005)
Emaitzak
Doktore-tesia
131
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
A Ht Hc E PF O P
APU
/pro
tein
a m
g
GizakiaArratoia
**
******
***
******
***
2.9.Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika.
Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
132
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.10. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako piroglutamil
peptidasa I-ren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 345 41 436 88 e.e
Hipotalamoa 440 62 458 59 e.e
Hipokanpoa 482 101 517 81 e.e
Kaudatua 417 75 496 82 e.e
Prefrontala 465 84 414 47 e.e
Okzipitala 388 57 343 51 e.e
Parietala 388 39 417 43 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
133
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
100
200
300
400
500
600
700
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
2.10 Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-ari dagozkion emaitzen grafika.
Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
134
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
2.11. Taula. Taula honetan hurrengo grafikari dagozkion mintzari lotutako aspartil
aminopeptidasaren aktibitate balioak aurkezten dira, aztertutako gizaki edo arratoien NSZ-
ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Gizakia Arratoiak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 256 58 327 61 e.e
Hipotalamoa 266 49 323 47 e.e
Hipokanpoa 210 40 296 42 e.e
Kaudatua 225 34 300 42 e.e
Prefrontala 228 28 267 36 e.e
Okzipitala 221 39 291 56 e.e
Parietala 226 27 276 35 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
135
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa (NSZ-ko gune ezberdinetan)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g GizakiaArratoia
2.11 Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika.
Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A),
hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF),
okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**),
P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
136
Emaitzak
Doktore-tesia
137
3. Heroinaren efektua giza garunaren kortex prefrontaleko
eta nukleo kaudatuko peptidasa ezberdinen gain.
Hurrengo 11 taula eta dagozkien grafiketan heroinazale eta beraien kontrolen garunen
aktibitate peptidasiko ezberdinak deskribatzen dira. Aztertutako atalak kortex prefrontala
eta nukleo kaudatua izan dira eta heroinak entzima hauen gain eraginik duenentz jakiteko
heroina taldea eta kontrolen arteko konparaketa egin da.
Kasuen kopurua nahiko txikia zenez (n= 8 kortexarentzako eta n= 5 kaudatuentzako),
BPO-ak anderatzen dituzten entzimen azterketarako, kasu bakoitzarekin esperimentu bat
baino gehiago egin da eta datu guztien tratamendurako Neurri Errepikatuko Bariantzaren
Analisia (ANOVA) erabili dugu. Kasu kopuruaren muga horri lagin kantitatearen eskasia
gehitu behar zitzaion; hori dela eta beste peptidasa talde hetereogenoaren artean guretzat
aipagarrienak direnekin ere (prolil endopeptidasa eta arginina aminopeptidasa) entseiuak
errepikatu ditugu eta tratamendu estatistiko berbera egin diegu. Besteekin berriz (Leu-AP,
ASP-AP eta Piroglutamil-P), n bakoitzeko esperimentu bakarra egin da eta heroina taldea
eta kontrolen arteko konparaketa egiteko parekatu gabeko T Student-a aplikatu dugu.
Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira
(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik. Bai
ANOVA eta T Student-aren probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (* batekin
grafikan), P< 0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez
esangarriak zirenean.
Datuen irakurketa errazteko, lehenengo atalean BPO-ak anderatzen dituzten
aminopeptidasa aktibitateak jarri ditugu eta bigarrenean beste peptidasa talde heterogeneoa
azaltzen dira.
3.1. BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasak:
3.1. Taula eta 3.1. grafikan PSA (EC 3.4.11.2) solugarriaren aktibitatea azaltzen da. Bai
kortex prefrontalean bai kaudatuan heroina taldeko aktibitate entzimatikoa kontrolena
Emaitzak
Doktore-tesia
138
baino handiagoa dela ikusi dugu. Kortex prefrontalean %20 handiagoa da (ANOVA:
P<0.05).
3.2 - 3.3 Taula eta grafiketan mintzari lotutako PSA (AP MII edo EC 3.4.11.14) eta APN-
ak (EC 3.4.11.2) emandako baloreak aurkezten dira. Aktibitate hauek nahiko antzekoak
izan dira heroinazale eta kontrolen artean (ANOVA: e.e).
3.2 Beste peptidasak:
3.4.- 3.5 Tauletan eta dagozkien grafiketan prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26) solugarria
eta mintzari lotutakoaren aktibitateak deskribatzen dira. Kortex prefrontalean azaldutako
aktibitateak pixkat nahasiak izan dira, mintzari lotutako entzimaren mailak kontroletan
esangarriki altuagoak baitira (ANOVA: p<0.05) eta solugarriaren kasuan joera
alderantzizkoa baita (e.e). Kaudatuan berriz, kontroletan prolil endopeptidasa aktibitatea
handiagoa dela ikus daiteke (ANOVA: P<0.05 prolil endopeptidasa solugarrian).
3.6. Taulan eta bere grafikan arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6) aktibitatea azaltzen da.
Entzima honen aktibitateak nahiko berdintsuak dira heroina taldean eta kontroletan
(ANOVA: P>0.05).
3.7. Taulan eta dagokion grafikan leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) aktibitatea ikus
daiteke. Ez da balore esangarririk azaldu nahiz eta kortex prefrontalean heroina taldean
aktibitate handiagoak azaldu (T student: P>0.05).
3.8 – 3.9 Taula eta beraien grafiketan piroglutamil peptidasa I (EC 3.4.19.3) solugarriak eta
mintzari lotutakoak emandako baloreak azaltzen dira. Orokorrean ezin da ezberdintasun
handirik aipatu, entzima solugarriaren mailak heroinazaleen kortexean altuagoak izan arren
(T student: P>0.05).
3.10 – 3.11 Taula eta grafiketan aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) solugarria eta
mintzari lotutakoa azaltzen dira. Kasu honetan ere ez da ezberdintasun esangarririk
agertzen (T student: P>0.05).
Guztiak laburtuz, datu esangarrienak PSA solugarrian eta prolil endopeptidasa entzimetan
azaldu dira. Lehenengoaren kasuan heroinazaleek aktibitate altuagoak azaldu dituzte
Emaitzak
Doktore-tesia
139
(P<0.05 kortex prefrontalean) eta bigarrenaren kasuan kontroletan agertu dira aktibitate
handiagoak (P<0.05: solugarria kaudatuan eta mintzari lotutakoa kortexean).
Emaitzak
Doktore-tesia
140
PSA solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.1. Taula. Taula honetan PSA solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar
erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko
hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri
errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)
eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 51452 3892 42003 2597 P<0.05
Kaudatua 54279 4178 46635 3769 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
141
PSA solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
*
3.1. Grafika. Grafika honetan PSA solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar
erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
142
Mintzari lotutako PSA (Heroinazaleen NSZ-a)
3.2. Taula. Taula honetan mintzari lotutako PSA-aren aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar
erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko
hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri
errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)
eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 9026 616 9140 677 e.e
Kaudatua 8267 710 9093 1015 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
143
Mintzari lotutako PSA
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.2. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako PSA (AP MII) aktibitateak heroinazaleen
eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta
estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza
esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
144
Mintzari lotutako alanina aminopeptidasa N (APN)
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.3. Taula. Taula honetan mintzari lotutako APN aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta estandar
erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU) minutuko
hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa neurri
errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**)
eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 1333 103 1199 82 e.e
Kaudatua 1099 86 1114 106 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
145
Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN)
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.3. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N-ren (APN)
aktibitateak heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus
daitezke. Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira.
ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***).
Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
146
Prolil endopeptidasa solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.4. Taula. Taula honetan prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen eta
hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta
estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)
minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa
neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01
(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 17624 1073 16606 753 e.e
Kaudatua 8813 570 10405 631 P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
147
Prolil endopeptidasa solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola*
3.4. Grafika. Grafika honetan prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen
eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta
estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza
esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
148
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.5. Taula. Taula honetan mintzari lotutako prolil endopeptidasaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.
Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa
Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako
metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 926 94 1250 148 P<0.05
Kaudatua 1694 118 2016 174 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
149
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
500
1000
1500
2000
2500
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
*
3.5. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako prolil endopeptidasa aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.
Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA
klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez
esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
150
Arginil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.6. Taula. Taula honetan arginil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen
eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta
estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)
minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa
neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01
(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 23045 1124 21993 873 e.e
Kaudatua 21066 1387 22885 1244 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
151
Arginil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.6. Grafika. Grafika honetan arginil aminopeptidasa aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar
erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
152
Leuzil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.7. Taula. Taula honetan leuzil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak heroinazaleen
eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta
estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)
minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa
neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01
(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 554 38 451 32 e.e
Kaudatua 392 88 390 91 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
153
Leuzil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
100
200
300
400
500
600
700
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.7. Grafika. Grafika honetan leuzil aminopeptidasa aktibitateak heroinazaleen eta hauen
kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke. Batazbestekoak eta estandar
erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
154
Piroglutamil peptidasa I solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.8. Taula. Taula honetan piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak heroinazaleen
eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira. Batazbestekoak eta
estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa Unitatea (PAU)
minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako metodo estatistikoa
neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01
(**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 132 20 112 9 e.e
Kaudatua 69 3 67 8 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
155
Piroglutamil peptidasa I solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.8. Grafika. Grafika honetan priroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.
Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA
klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez
esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
156
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.9. Taula. Taula honetan mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-ren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.
Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa
Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako
metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 184 14 183 11 e.e
Kaudatua 131 11 137 7 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
157
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
50
100
150
200
250
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.9. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako priroglutamil peptidasa I-en aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.
Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA
klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez
esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
158
Aspartil aminopeptidasa solugarria (EC 3.4.11.7)
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.10. Taula. Taula honetan aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.
Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa
Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako
metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 145 22 119 18 e.e
Kaudatua 95 17 90 10 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
159
Aspartil aminopeptidasa solugarria
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.10. Grafika. Grafika honetan aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.
Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA
klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez
esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
160
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
3.11. Taula. Taula honetan mintzari lotutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan azaltzen dira.
Batazbestekoak eta estandar erroreak (S.E) PAU/ proteina mg–tan eman dira. Peptidasa
Unitatea (PAU) minutuko hidrolizatutako sustrato pikomolei deritzogu. Erabilitako
metodo estatistikoa neurri errepikatutako ANOVA izan da. Klabeak: Emaitza esangarrietan
P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez esangarriak (e.e).
Heroina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batazbestekoa S.E
(+)Batazbestekoa S.E
(+)Probabilitatea
Kortexa 316 27 318 20 e.e
Kaudatua 188 13 232 24 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
161
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa
(Heroinazaleen NSZ-a)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Kortexa Kaudatua
PAU
/pro
tein
a m
g HeroinaKontrola
3.11. Grafika. Grafika honetan mintzari lotutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak
heroinazaleen eta hauen kontrolen kortex prefrontalean eta kaudatuan ikus daitezke.
Batazbestekoak eta estandar erroreak PAU/ proteina mg–tan azaltzen dira. ANOVA
klabeak: Emaitza esangarrietan P<0.05 (*), P<0.01 (**) eta P<0.005 (***). Emaitza ez
esangarriak (e.e).
Emaitzak
Doktore-tesia
162
Emaitzak
Doktore-tesia
163
4. Morfinarekiko tolerantzia eta abstinentzi sindromearen
efektua arratoiaren NSZ-ko gune ezberdinetako peptidasen
gain.
Atal honetan morfinarekin eta morfina eta naloxonarekin tratatutako arratoien eta
beraien kontrolen NSZ-ko 7 gune ezberdinetako peptidasa aktibitateak deskribatuko dira.
Aukeratutako garuneko atalak amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua
(K), kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P) izan dira.
Aktibitateen baloreak mg proteinako peptidasa aktibitate unitateetan eman dira
(PAU/mg proteina), batazbestekoak eta estandart erroreak (S.E) azaltzen direlarik.
Konparatutako datuak morfina edo abstinentzia taldearenak eta beraien kontrolenak
izan dira eta horretarako parekatutako T Student test-a erabili dugu, talde bikote bakoitzaren
tratamenduak eta neurketa entzimatikoak baldintza eta momentu bereberean egin baitziren.
T Student-aren probabilitateak honela adierazi dira: P< 0.05 (* batekin grafikan), P<
0.01 (**) edo P< 0.005 (***) datu esangarrientzako, eta (e.e.) batekin ez esangarriak
zirenean.
Datuen irakurketa errazteko, lehenengo puntuan BPO-ak anderatzen dituzten
aminopeptidasa aktibitateak deskribatuko ditugu eta bigarrenean beste peptidasa talde
heterogeneoa aurkeztuko da.
Azkenengo puntuan abstinentzia taldea eta beraien kontrolekin abstinentzia
sindromearen gogortasuna neurtzeko eginiko esperimentu konduktualetan, bakoitzak
izandako puntuaketa orokorraren konparaketa aurkeztuko da. T student test-a erabil dugu
horretarako.
4.1. BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasak:
4.1 – 4.2 Tauletan eta dagozkien grafiketan morfina taldean eta abstinentzia taldean
neurtutako PSA (EC 3.4.11.14) solugarriaren aktibitateak deskribatzen dira hurrenez
hurren. Morfinarekin tratatutako arratoien garunean kontroletan baino aktibitate
Emaitzak
Doktore-tesia
164
handiagoak neurtu dira, esangarriak kortex prefrontalaren kasuan (T Student: P< 0.005).
Berriz, abstinentzia sindromea jasan duten arratoietan joera aldatu eta kontrolen garunean
baino aktibitate txikiagoa agertu dira (T Student: P< 0.05 estriatuan eta kortex guztietan).
4.3 – 4.4 Taula eta grafiketan mintzari lotutako PSA-ren (AP MII edo EC 3.4.11.14)
aktibitateak ikus daitezke. Kasu honetan entzima honen forma solugarriak duen joera argia
ez da ikusi (T student: P>0.05, atal guztietan).
4.5 – 4.6 Taula eta grafiketan APN-aren (EC 3.4.11.2) aktibitateak aurkezten dira.
Entzima honen neurketan berriro ikusi da morfina taldearen aktibitate handiagoa
kontrolekiko (T student: P<0.01 amigdala eta estriatuan; P<0.05 hipotalamoan) eta berriro
joera aldaketa berbera abstinentzia sindromea jasan duten animalietan (T Student: P< 0.01,
hipokanpoan).
Emaitzak
Doktore-tesia
165
Emaitzak
Doktore-tesia
166
PSA solugarria Morfina taldea.
4.1. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako PSA solugarriaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 32270 2574 29802 1692 e.e
Hipotalamoa 30660 2117 28711 1575 e.e
Hipokanpoa 37042 2086 35974 1651 e.e
Estriatua 38975 1986 37793 1505 e.e
Prefrontala 34638 1423 30263 1580 P<0.005
Okzipitala 33881 1804 32727 1740 e.e
Parietala 35220 1883 33390 1732 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
167
PSA solugarria Morfina taldea
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g MorfinaKontrola
***
4.1. Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea eta
kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:
Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex
prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05
(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
168
PSA solugarria
Abstinentzia taldea
4.2. Taula. Taula honetan abstinentzi sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako PSA solugarriaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 28047 1716 27873 2116 e.e
Hipotalamoa 25979 1767 26410 2108 e.e
Hipokanpoa 33419 2332 33843 2161 e.e
Kaudatua 35025 1850 38036 1997 P<0.05
Prefrontala 28211 1393 31745 1709 P<0.05
Okzipitala 29686 1648 31892 2077 P<0.05
Parietala 30027 1945 32983 2433 P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
169
PSA solugarria Abstinentzia taldea
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
* * *
*
4.2. Grafika. PSA solugarriari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia taldea eta
kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:
Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex
prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05
(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
170
Mintzari lotutako PSA (AP MII) Morfina taldea.
4.3. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako AP MII-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 7118 1492 6812 1339 e.e
Hipotalamoa 5704 762 6890 1067 e.e
Hipokanpoa 7280 1082 7003 897 e.e
Kaudatua 7092 1049 6921 766 e.e
Prefrontala 7327 822 6883 679 e.e
Okzipitala 8026 986 7901 808 e.e
Parietala 7790 943 6932 720 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
171
Mintzari lotutako PSA (AP MII)
Morfina taldea
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g MorfinaKontrola
4.3. Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea
eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:
Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex
prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05
(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
172
Mintzari lotutako PSA (AP MII) Abstinentzia taldea
4.4. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako AP MII-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 5589 1034 5854 1015 e.e
Hipotalamoa 5541 985 5937 906 e.e
Hipokanpoa 5483 818 5757 888 e.e
Kaudatua 6780 1025 6747 907 e.e
Prefrontala 5362 476 6474 911 e.e
Okzipitala 6916 750 5984 580 e.e
Parietala 6061 648 6087 996 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
173
Mintzari lotutako PSA (AP MII)
Abstinentzia taldea
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/mg
prot
eina
AbstinentziaKontrola
4.4. Grafika. Mintzari lotutako PSA-ri dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia
taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak
azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun
kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:
P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
174
Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N (APN) Morfina taldea.
4.5. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako APN-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 1684 214 1286 247 P<0.01
Hipotalamoa 1670 281 1351 218 P<0.05
Hipokanpoa 1289 134 1190 156 e.e
Kaudatua 1555 156 1219 103 P<0.01
Prefrontala 1720 298 1544 172 e.e
Okzipitala 1649 232 1573 158 e.e
Parietala 1927 320 1702 334 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
175
APN Morfina taldea
0
500
1000
1500
2000
2500
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g MorfinaKontrola
****
*
4.5. Grafika. Mintzari lotutako alanil aminopeptidasa N-ri dagozkion emaitzen
grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
176
APN Abstinentzia taldea
4.6. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako APN-aren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune
ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren
baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T
student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke.
Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 1680 219 1927 230 e.e
Hipotalamoa 1439 164 1649 258 P<0.01
Hipokanpoa 1021 162 1760 288 e.e
Kaudatua 1503 189 1650 220 e.e
Prefrontala 1781 215 1777 308 e.e
Okzipitala 1852 251 1924 383 e.e
Parietala 1949 271 1793 218 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
177
APN
Abstinentzia taldea
0
500
1000
1500
2000
2500
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
**
4.6. Grafika. Mintzari lotutako alanina aminopeptidasa N-ri dagozkion emaitzen
grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
178
Emaitzak
Doktore-tesia
179
4.2. Beste peptidasak:
4.7 – 4.8. Tauletan eta dagozkien grafiketan prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26) solugarriak
emandako baloreak azaltzen dira. Orokorrean, bai morfina taldean eta bai abstinentzia
taldean, kontrolek aktibitate entzimatiko handiagoa azaldu dute (T Student: P<0.05,
naloxona taldearen kortex parietalean).
4.9 – 4.10. Taula eta beraien grafiketan mintzari lotutako prolil endopeptidasa (EC
3.4.21.26) azaltzen da. Entzima honek ez ditu aldaketa esangarririk jasan ezta morfina ezta
abstinentzia taldean (T student: P>0.05, atal guztietan).
4.11 – 4.12. Taula eta grafiketan arginil aminopeptidasa (EC 3.4.11.6) aktibitateak
deskribatzen dira. Hemen, aipagarriena garun kortexean gertatutako joera aldaketa izan
liteke, morfina taldean pixkat handiagoa den aktibitateak abstinentzia taldean buelta ematen
baitu (T student: P<0.05 naloxona taldearen kortex parietalean).
4.13 – 4.14 taulak eta grafikak leuzil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) aktibitatea aurkezten
dute. Entzima honek ez du bariazio esangarririk jasan (T student: P> 0.05, atal guztietan)
nahiz eta joera aldaketaren bat ikusi garun kortex mailan.
4.15 – 4.18 tauletan eta dagozkien grafiketan piroglutamil peptidasa (EC 3.4.19.3)
aktibitateak azaltzen dira (solugarriak eta mintzari lotutakoak). Ez dira morfina taldean ezta
abstinentzia taldean aldaketa esangarririk gertatu (T Student: P>0.05, talde eta atal
guztietan).
4.19 – 4.22 taula eta grafiketan aspartil aminopeptidasa (EC 3.4.11.7) aktibitateak aurkezten
dira (solugarria eta mintzari lotutakoak). Kasu honetan ere neurtutako aktibitateak ez dira
oso ezberdinak izan talde bakoitzean (beraien kontrolekiko) (T Student: P>0.05, talde eta
atal guztietan).
Emaitzak
Doktore-tesia
180
Prolil endopeptidasa solugarria Morfina taldea.
4.7. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 2936 413 3180 378 e.e
Hipotalamoa 2230 326 2479 334 e.e
Hipokanpoa 3214 412 3564 470 e.e
Kaudatua 3210 450 3568 516 e.e
Prefrontala 3356 531 3456 611 e.e
Okzipitala 3798 605 3901 582 e.e
Parietala 3880 501 4184 619 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
181
Prolil endopeptidasa solugarria Morfina taldea
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.7. Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika (morfina
taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak
azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun
kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:
P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
182
Prolil endopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea
4.8. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako prolil endopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 3043 316 3241 290 e.e
Hipotalamoa 2232 210 2427 214 e.e
Hipokanpoa 3186 269 3452 340 e.e
Kaudatua 3208 245 3520 295 e.e
Prefrontala 3485 267 3843 338 e.e
Okzipitala 3684 299 4026 319 e.e
Parietala 3501 310 4085 416 P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
183
Prolil endopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/mg
prot
eina
AbstinentziaKontrola
*
4.8.Grafika. Prolil endopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika
(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
184
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Morfina taldea.
4.9 Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako prolil endopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten
dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-
tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)
dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 504 100 468 70 e.e
Hipotalamoa 407 78 384 45 e.e
Hipokanpoa 419 62 439 46 e.e
Kaudatua 420 42 395 35 e.e
Prefrontala 424 40 445 37 e.e
Okzipitala 456 50 456 38 e.e
Parietala 406 43 434 56 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
185
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Morfina taldea
0
100
200
300
400
500
600
700
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.9. Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika
(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
186
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Abstinentzia taldea
4.10. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako prolil endopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten
dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-
tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)
dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Naloxona Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 456 96 626 134 e.e
Hipotalamoa 409 55 470 59 e.e
Hipokanpoa 400 57 422 55 e.e
Kaudatua 366 46 437 57 e.e
Prefrontala 393 46 464 52 e.e
Okzipitala 461 55 472 60 e.e
Parietala 455 59 495 74 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
187
Mintzari lotutako prolil endopeptidasa Abstinentzia taldea
0
100
200
300
400
500
600
700
800
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
4.10. Grafika. Mintzari lotutako prolil endopeptidasari dagozkion emaitzen grafika
(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
188
Arginil aminopeptidasa Morfina taldea.
4.11. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako arginil aminopeptidasa aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-
ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 35070 2894 32288 2438 e.e
Hipotalamoa 29865 2961 29193 2298 e.e
Hipokanpoa 33958 2589 33421 2659 e.e
Kaudatua 33933 2630 32649 2359 e.e
Prefrontala 33403 2495 31293 2638 e.e
Okzipitala 36988 3601 36494 3273 e.e
Parietala 34130 2097 33551 3343 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
189
Arginil aminopeptidasa Morfina taldea
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.11. Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea
eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:
Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta garun kortex
prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05
(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
190
Arginil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
4.12. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako arginil aminopeptidasaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako
NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira.
Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 31100 2995 31342 3160 e.e
Hipotalamoa 27267 2746 25691 299 e.e
Hipokanpoa 31566 3182 31364 3523 e.e
Kaudatua 31583 2278 34010 3443 e.e
Prefrontala 28817 1965 32556 3218 e.e
Okzipitala 32833 2529 34648 3395 e.e
Parietala 28092 2097 31837 3343 P<0.05
Emaitzak
Doktore-tesia
191
Arginil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
A Ht Hc K FP O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
*
4.12. Grafika. Arginil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia
taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak
azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (F) eta garun
kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:
P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
192
Leuzil aminopeptidasa Morfina taldea.
4.13. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako leuzil aminopeptidasa aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-ko
gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 415 43 357 46 e.e
Hipotalamoa 456 51 387 42 e.e
Hipokanpoa 411 48 411 45 e.e
Kaudatua 475 43 482 42 e.e
Prefrontala 371 48 384 52 e.e
Okzipitala 438 55 382 55 e.e
Parietala 423 45 411 50 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
193
Leuzil aminopeptidasa Morfina taldea
0
100
200
300
400
500
600
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g MorfinaKontrola
4.13. Grafika. Leuzina aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (morfina taldea
eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak azaltzen dira:
Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun kortex
prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea: P<0.05
(*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
194
Leuzil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
4.14. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako leuzil aminopeptidasaren aktibitateak aurkezten dira aztertutako NSZ-
ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan eman dira. Azaltzen
diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira. Emaitzen
konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez esangarria (e.e)
izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko da taulan.
Naloxona Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 441 63 461 89 e.e
Hipotalamoa 341 54 414 83 e.e
Hipokanpoa 405 46 405 65 e.e
Kaudatua 443 42 487 72 e.e
Prefrontala 355 52 397 72 e.e
Okzipitala 365 62 358 76 e.e
Parietala 378 41 506 92 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
195
Leuzil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
0
100
200
300
400
500
600
700
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
4.14. Grafika. Leuzil aminopeptidasari dagozkion emaitzen grafika (abstinentzia
taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko guneak
azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta garun
kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren probabilitatea:
P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
196
Piroglutamil peptidasa I solugarria Morfina taldea.
4.15. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 85 21 76 23 e.e
Hipotalamoa 78 36 76 20 e.e
Hipokanpoa 59 11 61 9 e.e
Kaudatua 59 10 68 18 e.e
Prefrontala 65 16 60 14 e.e
Okzipitala 65 9 71 18 e.e
Parietala 95 18 85 16 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
197
Piroglutamil peptidasa I solugarria Morfina taldea
0
20
40
60
80
100
120
A Ht Hc E PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g MorfinaKontrola
4.15. Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika
(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
198
Piroglutamil peptidasa I solugarria
Abstinentzia taldea
4.16. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 64 18 56 16 e.e
Hipotalamoa 54 5 60 11 e.e
Hipokanpoa 69 11 74 5 e.e
Kaudatua 68 23 54 14 e.e
Prefrontala 81 12 93 7 e.e
Okzipitala 68 3 72 4 e.e
Parietala 121 6 133 7 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
199
Piroglutamil peptidasa I solugarria Abstinentzia taldea
0
20
40
60
80
100
120
140
A Ht Hc E PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
NaloxonaKontrola
4.16. Grafika. Piroglutamil peptidasa I solugarriari dagozkion emaitzen grafika
(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
200
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa Morfina taldea.
4.17. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten
dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-
tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)
dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 89 29 86 21 e.e
Hipotalamoa 94 29 145 28 e.e
Hipokanpoa 127 30 117 31 e.e
Kaudatua 87 16 78 19 e.e
Prefrontala 85 19 83 18 e.e
Okzipitala 86 18 90 20 e.e
Parietala 127 36 147 26 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
201
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I Morfina taldea
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.17. Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-i dagozkion emaitzen
grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
202
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa Abstinentzia taldea
4.18. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako piroglutamil peptidasa I aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten
dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-
tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)
dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 175 43 205 46 e.e
Hipotalamoa 151 39 159 36 e.e
Hipokanpoa 221 46 223 36 e.e
Kaudatua 173 34 180 30 e.e
Prefrontala 200 60 205 21 e.e
Okzipitala 211 41 237 33 e.e
Parietala 277 34 361 26 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
203
Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I Abstinentzia taldea
0
50
100
150
200
250
300
350
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
4.18. Grafika. Mintzari lotutako piroglutamil peptidasa I-i dagozkion emaitzen
grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
204
Aspartil aminopeptidasa solugarria Morfina taldea.
4.19. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 93 24 82 16 e.e
Hipotalamoa 69 11 94 16 e.e
Hipokanpoa 70 15 79 20 e.e
Kaudatua 100 16 100 16 e.e
Prefrontala 95 14 84 14 e.e
Okzipitala 80 17 83 15 e.e
Parietala 125 13 130 5 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
205
Aspartil aminopeptidasa solugarria Morfina taldea
0
20
40
60
80
100
120
140
160
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.19. Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika
(morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
206
Aspartil aminopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea
4.20. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa solugarriaren aktibitateak aurkezten dira
aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-tan
eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E) dira.
Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 120 33 114 33 e.e
Hipotalamoa 74 22 97 14 e.e
Hipokanpoa 88 17 94 22 e.e
Kaudatua 107 19 104 11 e.e
Prefrontala 124 20 131 5 e.e
Okzipitala 92 20 110 4 e.e
Parietala 137 13 156 5 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
207
Aspartil aminopeptidasa solugarria Abstinentzia taldea
0
20
40
60
80
100
120
140
160
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
4.20. Grafika. Aspartil aminopeptidasa solugarriari dagozkion emaitzen grafika
(abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema zentraleko
guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc), kaudatua (K) eta
garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student test-aren
probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
208
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Morfina taldea.
4.21. Taula. Taula honetan morfinarekiko tolerantzia aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasaren aktibitateak (mintzari lotutakoan)
aurkezten dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU /
proteina mg-tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar
erroreak (S.E) dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau
esangarria edo ez esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo
p<0.005 den azalduko da taulan.
Morfina Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 140 24 101 24 e.e
Hipotalamoa 131 10 135 53 e.e
Hipokanpoa 134 13 130 19 e.e
Kaudatua 145 20 125 14 e.e
Prefrontala 153 18 132 12 e.e
Okzipitala 132 14 155 21 e.e
Parietala 171 21 187 20 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
209
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Morfina taldea
0
50
100
150
200
250
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
MorfinaKontrola
4.21. Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen
grafika (morfina taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
210
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
4.22. Taula. Taula honetan abstinentzia sindromea aurkezten duten arratoiak eta euren
kontrolek azaldutako aspartil aminopeptidasa aktibitateak (mintzari lotutakoa) aurkezten
dira aztertutako NSZ-ko gune ezberdinetan. Aktibitatearen unitateak PAU / proteina mg-
tan eman dira. Azaltzen diren baloreak batazbestekoak eta beraien estandar erroreak (S.E)
dira. Emaitzen konparaketa T student test-aren bitartez egin da eta hau esangarria edo ez
esangarria (e.e) izan daiteke. Lehenengo kasuan p<0.05, p<0.01 edo p<0.005 den azalduko
da taulan.
Abstinentzia Kontrolak
NSZ-ko
gunea Batezbestekoa S.E (+) Batezbestekoa S.E (+) Probabilitatea
Amigdala 184 34 190 53 e.e
Hipotalamoa 125 29 179 20 e.e
Hipokanpoa 188 30 189 28 e.e
Kaudatua 180 21 195 26 e.e
Prefrontala 202 19 188 19 e.e
Okzipitala 158 19 204 37 e.e
Parietala 239 28 271 32 e.e
Emaitzak
Doktore-tesia
211
Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasa Abstinentzia taldea
0
50
100
150
200
250
300
350
A Ht Hc K PF O P
PAU
/pro
tein
a m
g
AbstinentziaKontrola
4.22. Grafika. Mintzari lotutako aspartil aminopeptidasari dagozkion emaitzen
grafika (abstinentzia taldea eta kontrolak). Abszisa ardatzean ikertutako nerbio sistema
zentraleko guneak azaltzen dira: Amigdala (A), hipotalamoa (Ht), hipokanpoa (Hc),
kaudatua (K) eta garun kortex prefrontala (PF), okzipitala (O) eta parietala (P). T Student
test-aren probabilitatea: P<0.05 (*), P<0.01 (**), P<0.005 (***).
Emaitzak
Doktore-tesia
212
4.3. Abstinentzia sindromearen gogortasuna neurtzeko esperimentu
konduktualen puntuaketa orokorrak:
4.23 grafikan abstinentzia taldea eta kontrol taldeko arratoien puntuaketa orokorren
(zeinu zenbatu eta presenteak) arteko konparaketa ikus daiteke. Abstinentzia taldean, hau
da, morfina eta naloxona zeramaten arratoietan abstinentzia sindromea argia azaldu zen
bitartean sueroa eta naloxona zeramatenetan (kontrol taldea) ez zen sindrome honen zeinu
esangarririk agertu. Beraz jarraitutako tratamendu protokoloa egokia izan zela konfirmatu
genezake (T Student: P<0.005).
0
2
46
8
10
1214
1618
1
Abstinentzia sindromea
Punt
uake
ta o
roko
rra Abstinentzia
Kontrolak
***
4.23 Grafika. Abstinentzia sindromearen gogortasuna. “Y” ardatzean puntuaketa
orokorraren batazbestekoak eta erroreak azaltzen dira. “X” ardatzean naloxona taldea eta
kontrolen baloreak azaltzen dira. T student test-aren probabilitatea: (***) P< 0.005.
V. Eztabaida
Eztabaida
Doktore-tesia
213
Tesi honetan neuropeptido ezberdinak anderatzen dituzten peptidasen
deskribapena egin da gizaki eta arratoiaren garunetan lagin bezala hartuz. Deskribapena
ahalik eta zabalena izan zedin, lehenengoz maila azpizelularrean entzima hauen banaketa
aztertu da. Hurrengo pausuan, baldintza normaletan garuneko atal ezberdinetan entzima
hauen aktibitate banaketa zein den ikusi da, espezie arteko berezitasunak azpimarratuz.
Azkenengo etapan opiazeoekiko menpekotasun fenomenoan gizaki eta arratoien garuneko
atal konkretuetan aktibitate peptidasikoen modulaziorik gertatzen den analizatu da.
Ikerlanean jasotako emaitzak hurrengo hiru puntu hauetan eztabaidatuko dira:
1. Peptidasen banaketa azpizelularra gizaki
eta arratoiaren garun kortexean.
Ugaztun zeluletan peptidoen anderakuntza proteinen katabolismoaren azkenengo
faseetan kokatzen da. Proteina sintesia mintzei lotutako edo aske dauden erribosometan
egiten den bitartean, proteina edo peptidoen anderakuntza maila azpizelularreko gune
ezberdinetan ematen da, mekanismo ezberdinen bidez gertatuz. Edozein organismo
eukariotako zeluletan bezala, garuneko zelulak proteinen bioeraldaketa edo turn-over delakoa
eragiteko mekanismoak dituzte. Hauek proteina anormal edo minduak, egitura proteinak,
proteina erregulatzaileak edo entzimatikoak eraldatzeko beharrezkoak dira eta gune
azpizelular ezberdinetan deskribatu dira (O’Cuinn, 1997).
Neuropeptidoen inaktibazioa nagusiki peptidasen anderakuntzaren ondorioz
gertatzen dela ezarrita dago (Iversen, 1987). Peptidasen zelula kokapenari dagokionez,
mintzekoak edo zitosolikoak daudela dakigu. Lehenengoak ezagunagoak dira eta zentru
aktiboa gune extrazelularrerantz (gune sinaptikorantz) edo barnerantz dutenak bereiz
daitezke (Turner eta lank., 1987; Maroux, 1987; Dyer eta lank., 1991). Peptidasa solugarriak
gutxiago ezagutzen dira baina aktibitate altua azaltzen dutenez ekintza fisiologiko
ezberdinetan funtzio garrantzitsuak izan ditzaketela deskribatu da (Mantle, 1992; O’Cuinn,
1997).
Eztabaida
Doktore-tesia
214
Lan honetarako aukeratutako peptidasen zelula-barneko aktibitateak ezagutzeko
aspaldi deskribatutako banaketa zelularraren teknika erabili dugu. Teknika honen bitartez
lortutako zatiki azpizelularrak sinaptosomak, mielina, mitokondriak, mikrosomak, nukleoa
eta zitosola izan dira. Euren artean aipagarria da sinaptosoma bezala ezagututako egituren
lorpena. Hauek neuronen bukaera sinaptikoz sortutako egiturak dira. Bixikula hauen
edukinaren zati handi bat zitosolikoa da –zitosol edukin guztiarengandik bananduta
geratzen dena –, bertan aurkitutako LDH aktibitate altuak adierazten duten bezala (Gray
eta Whitaker, 1962).
Tesi honetan teknika horren bitartez lortutako zatiki azpizelularren purotasun
frogak egin ziren. Gure datuak Gray eta Whitakerrek sinaptosoma mailan
deskribatutakoarekin bat datoz. Bai gizakia zein arratoi kortex laginekin egindako banaketa
azpizelularraren ondorioz lortutako zatiki sinaptosomalean eta zitosolean LDH maila altuak
daude; beste zatikiekin konparatuz, bikoitza baino gehiago.
Bestalde, sinapsietatik eratorriko egitura hauek morfologikoki zein funtzionalki
nahiko egonkorrak direla dakigu. 70. hamarkadaren bukaeran egindako ikerlan batean,
gizaki eta arratoi garun kortex laginak hozkailuan biltegiratu ondoren, lagin freskoekin
konparatuz antzeko propietateak mantentzen dituztela ikusi zen. Propietate hauen artean,
kaltzio-bitarteko kinadak erabiliz sinaptosometatik neuropeptidoen askapena eragin
zitekeela aipatu zuten Dodd eta lankideek (1979).
Ildo honekin jarraituz, peptidasa aktibitateen gain hil ondorengo atzerapenak
(postmortem delay) edo laginen izozte denborak eraginik duenentz jakiteko korrelazio ikerketa
egin da tesi honetan. PSA solugarria eta arginil aminopeptidasa (APB-a) adibide bezala
hartuz, ez zen erlazio esanguratsurik ikusi baldintza fisiko hoiek eta aktibitate peptidasikoen
artean.
Era berean, beste zatikien isolamenduari dagokionez, hau egokia izan zela
adierazten diguten emaitzak jaso genituen (emaitzen atalean 12. taulan adierazitakoak).
Eztabaida
Doktore-tesia
215
Neuropeptidoen zelula berneko erregulazio mekanismoen ezagutzak oraindik
hutsune asko ditu. Peptidoen aktibitatearen kontrol fisiologikoa egiten duten peptidasak
mintz sinaptikoan lotutako ektopeptidasak izan behar dutela proposatu da (Schwartz eta
lank., 1981). Egia esan, mintzari lotutako aminopeptidasak neurotransmisore peptidikoen
kontrolean eragina dutela aspaldidanik deskribatu da (Turner, 1986). Hala ere, gizaki eta
animalien ehun ezberdinen zelulen zatiki solugarrian peptidasa aktibitatea oso ugaria dela
ikusi da, entzima hauen funtzioa zein den oraindik oso argi egon ez arren.
Tesi honetarako eginiko esperimentuetan aktibitate peptidasikoa zatiki azpizelular
guztietan aurkitu da eta banaketa patroia oso antzekoa izan da gizakia zein arratoiaren
garunen kortexean. Gainera, entzima solugarrien aktibitatea mintzari lotutakoena bezain
bestekoa edo handiagoa dela ikusi da.
1.1. Peptidasa solugarriei dagokionez, prolil endopeptidasa izan ezik
beste guztien aktibitate handiena zatiki sinaptosomalean aurkitu dugu bai gizaki zein
arratoiaren garun kortexean.
Aipatzekoa da piroglutamil peptidasa I (PG I) eta aspartil aminopeptidasa (APA)
aktibitate espezifikoen zati handi bat amaiera sinaptikoan azaldu izana.
Lehenengoari dagokionez, gure taldeak duela gutxi adin ezberdineko arratoien
zerebeloan nerbio sistema zentrala (NSZ) heldu ahala sinaptosometako PG I aktibitatea
bikoiztu egiten dela deskribatu zuen. Arratoi helduetan, zatiki azpizelularrak konparatuz
gero, aktibitate nagusia maila sinaptomalean agertu zen bai PG I solugarrian zein mintzari
lotutakoan. Gainera, zatiki zitosolikoaren PG I aktibitateak arratoiak heldu ahala
ikusgarrizko beherakada jasaten duela ikusi zen (Gandarias eta lank., 2000). Tesi honetan
banaketa azpizelularrerako gizaki eta arratoi helduen garun kortex laginak erabili ditugu eta
PG I entzimaren banaketa azpizelular berdina agertu da; hau da, maila sinaptosomal altuak
eta zitosoliko baxuak. Beraz, entzima honen forma solugarriaren ekintza azpizelular nagusia
maila sinaptikoan gertatzen dela esan genezake.
APA-ren kasuan ere aktibitate nagusia sinaptosometan azaltzen da gizaki eta
arratoiaren garun kortexean. Portzentai txikiagoan baina hala ere nagusiki, leuzil
Eztabaida
Doktore-tesia
216
aminopeptidasaren aktibitate handienak zatiki azpizelular honetan aurkitzen dira. Era
berean, PSA solugarriaren eta arginil aminopeptidasaren (APB) banaketa homogeneoagoa
izan arren, zatiki sinaptosomalean aktibitate altuak ikus daitezke gizaki eta arratoiaren garun
kortexean.
Kokapen nagusi honen zergatia ulertzea ez da errazegia gaur arte ditugun datuekin
behintzat. 1987an Hersh eta lankideak peptidasa batzuk bere funtzioa sinapsi inguruan izan
dezaketela deskribatu zuten; neuropeptidoen zelula barneko katabolismoak sinapsietatik
hurbil peptido hauen kontzentrazio gradientea mantentzen lagundu lezaketela proposatuz.
Autore batzuen eritziz, entzima hauen kokapena nahiz eta zelula-barnekoa izan
neuropeptidoen anderakuntzan era bitan parte hartu lezakete: neuropeptidoak bere
hartzailearekin konplexu bat sortu eta zelulan barneratu ondoren, edota peptidasak gune
sinaptikora askatuz gero (Gibson eta lank., 1989). Ideia honi lagunduz, duela gutxi PSA-ren
sinapsirainoko garraio axonala frogatzen duen lan bat aurkeztu da, entzima honen
neuropeptido anderatzaile funtzioa bukaera edo gune sinaptikoan gertatzen dela
proposatuz (Yamamoto eta lank., 2002). APB-aren kasuan ere, arratoiaren guruin
adrenaleko feokromozitoma zeluletan entzima honen jariaketa deskribatu da (Balogh eta
lank., 1998). Beraz, entzima solugarri hauen aktibitate nagusia zelula barnean gertatzen dela
argi egon arren, sinapsi inguruan proportzio handietan azaltzeak zergatia bat baino gehiago
izatea posible litzateke, ezin daitekelarik entzimen askapenaren hipotesia baztertu.
Bestalde, zelula arteko komunikazioan eragina duten peptidoak kontuan hartu gabe,
proteina ezberdinen apurketaren ondorioz eratutako peptidoen anderakuntza nagusiki
zelula barnean gertatzen dela onartuta dago; zitosolean batipat (O’Cuinn, 1997).
Tesi honetan deskribatutako entzima solugarri guztietan zatiki sinaptosomalean eta
zitosolikoan azaldutako aktibitateak batera aztertuko bagenitu – azken finean
sinaptosometako edukina zitosola baita – aktibitate espezifiko guztiaren erdia edo gehiago
zelularen zitosolean ematen dela adierazi genezake. Aktibitate hauen artean PSA solugarria,
APB-a eta prolil endopeptidasa solugarriarenak (gizakian) beste entzimenak baino askoz
handiagoak izan dira. PSA-ren kasuan adibidez, aminopeptidasa hau garunean aurkitzen
den ugariena dela eta bere aktibitatearen %80-a zatiki solugarrian ematen dela dakigu
(McLellan eta Lank., 1988). Beraz deskribatutako aktibitate zitosoliko handia kontuan
Eztabaida
Doktore-tesia
217
hartuz, zitosolean gertatutako peptido ezberdinen anderakuntzan entzima hauek funtzioren
bat izan behar dutela pentsatzera eramaten gaitu. Izan ere, puntu honen bukaeran azalduko
den bezala, peptidasa solugarri hauek aktibitate intrakrinoa duten neuropeptidoen
anderakuntzan eragin lezakete.
Peptidasa aktibitatea nahiko kantitate esanguratsuan aurkitu dugun beste zatiki bat,
mitokondriak izan dira. Batez ere PSA, APB eta PEP solugarria portzentai garrantzitsuetan
azaldu dira organulu azpizelular hauetan. Zatiki honetan entzima hauek izan lezaketen
funtzioa argiegi ez dagoen arren, badira beste ehun batzuetako zeluletan eginiko ikerlanak
non mitokondrietan peptidasa aktibitateak isolatu diren (Serizawa eta lank., 1995). Duela
gutxiko lan batetan mitokondriako proteina eta aitzindari polipeptidiko askoren
proteolisian eragiten duten hiru peptidasa isolatu dira. Hauek eboluzio maila ezberdineko
espezietan (gizakia barne) egitura eta funtzioa mantendu dutela diote ikerlariek (Gakh eta
lank., 2002). 1992an azaldutako artikulu batean, arratoiaren giltzurruneko zelula
tubularretako mikrosoma eta mitokondrietan PSA dagoela deskribatu zuten Kettmann eta
lankideek. Zentzu honetan, guk garun kortexean egindako esperimentuetan
mitokondrietako PSA aktibitatea nahiko altua dela ikusi dugu. Era berean, mikrosometakoa
ez da bestea baino askoz txikiagoa izan.
Beraz, peptidasa solugarrien banaketa azpizelularrean zerbait azpimarratzekotan,
entzima hauen zelula barneko aktibitatea handia dela eta zatiki sinaptosomaleko edo
zitosoleko (bere osotasunean) peptidasa mailak altuenak direla esan behar da.
1.2. Mintzari lotutako peptidasei dagokionez, hauek ere zatiki
azpizelular guztietan aurkitu daitezke, bai arratoi zein gizakiaren garun kortexean.
Mintzari lotutako entzimen analisian banaketa azpizelularraren teknikari esker zatiki
mielinikoa isolatu da. Bertan peptidasa aktibitateak altuak aurkitu ditugu. PG I eta PEP-
aren kasuan aktibitate mielinikoa guztiaren %30-ekoa da. Gainera, beste peptidasena ere
%17-27-koa dela ikusirik (nahiz eta beste zatikiekiko ezberdintasunak esanguratsuak ez
diren), maila honetan peptidasek funtzioren bat izan behar dutela susmagarria da.
Eztabaida
Doktore-tesia
218
Zentzu honetan ez dira ikerlan ugariegi agertu, baina badago baten bat. Adibidez,
1970an Frey eta lankideek akuriaren (guinea-pig) garunean mielinizazio garaian peptidasa
aktibitatea deskribatu zuten. 21 urte beranduago Kioussi eta Matsasek (1991) NSZ-eko
neuronen axoiak eztaltzen dituen mielina ekoizten duten Schwann zeluletan endopeptidasa
24.11 entzima (entzefalinasa) isolatu zuten. Kokapen honek nerbioen garapenean edo
birsorkuntzarekin zerikusiren bat izan behar duela proposatu zuten. Hildu honetan nerbio
sistema periferikoko neuronen endekapen mota berezi batean entzefalinasa, APN eta
angiotentsina eraldatzen duen entzima (AEE) bezalako peptidasa ezberdinen aktibitate
aldaketak deskribatu dira (Kenny eta Bourne, 1991).
Beraz, gaur egun arte deskribatutakoaren arabera, zatiki mielinikoan kokatutako
peptidasen zeregina nerbioen garapen edo endekapenarekin erlazionatuta egotea posible
litzateke. Egia esan, gure taldeak garunaren garapenean peptidasek izan lezaketen funtzioari
buruzko ikerketa lerro tinko bat zabaldu du eta horretan dirau (Gandarias eta lank., 1992;
1994; 1997; 1998; Irazusta eta lank., 1999; 2000; Agirregoitia eta lank., 2003).
Zatiki sinaptosomalean esangarriki handiagoak izan diren aktibitateen artean
mintzari lotutako PG I eta PEP aktibitatea ditugu:
PG I-ari dagokionez, bere aktibitatea nagusiki solugarria dela deskribatu den arren
(Cummings eta lank., 1998), mintzari lotutako aktibitatea ere azaltzen dela deskribatu da
(Alba eta lank., 1995); eta lan honetan aurkitutakoaren arabera, gune sinaptikoan funtzioren
bat izan behar duela esan genezake. Sarreran azaltzen den bezala, PG I-a espektru zabaleko
entzima da eta piroglutamiko hondarra duten peptido gehienak anderatu ditzake (Browne
eta lank., 1983); Euren artean TRH-a, LHRH-a, bonbesina, neurotensina, e.a.
Bai gizakia eta bai arratoiaren garun kortexeko sinaptosometan PEP-aren aktibitate
esangarriak aurkitu ditugu. Emaitza hauek O’Leary-ren taldeak (1995; 1996) behi-garunean
deskribatutakoarekin bat datoz. Ikerlari hauek mintzari lotutako PEP aktibitatea
sinaptosometan isolatu zuten. Maila honetan entzima honek izan lezaken funtzioa TRH-a,
ADH-a, P substantzia, e.a peptidoren hidrolisia egitea izan daiteke (Welches eta lank.,
1993).
Eztabaida
Doktore-tesia
219
Mintzari lotutako beste hiru entzimen (AP MII, APN eta APA) aktibitate
sinaptosomala ere kontuan hartzekoa izan da, nahiz eta beste zatikiekiko ezberdintasuna
esangarria ez izan. Lehengo biek barne peptido opioideen anderakuntzan duten funtzioa eta
APA-k angiotentsina II-aren eraldaketan duena zelularen maila honetan gertatu behar duela
pentsatzea da bidezkoena.
Beste datu aipagarrien artean zatiki nuklearrean azaldutako peptidasa aktibitateak
izan dira, esangarriki altuak APN-aren kasuan. Aminopeptidasa honen ekintza ezagunena
entzefalinen anderakuntza da (Giros eta lank., 1985) eta neuropeptido hauek
neurotransmisore/neuromodulatzaile funtzioa dutela jakinik, APN-aren kokapen
nuklearraren esanahia ulertzea ez da erraza.
Entzefalinak neurona eta beste zelulen hazkuntza eta bereizketan eragina dutela
aspaldidanik deskribatu da (Zagon eta lank., 1987). Egia esan, met-entzefalinari hazkuntza-
faktore opioide bezala ezagutzen zaio (opioid growth factor edo OGF) eta zelulen garapenean,
birsorkuntzan, zaurien orbaintzetan, angiogenesian eta minbizian peptido modulatzailea
dela deskribatu da. Ekintza hau hartzaile baten bitartez egiten duela deskribatu da, mintz
nuklearran kokatzen den OGFr hartzailearen bitartez alegia (Zagon eta lank., 2002). Gure
ikerlanean ikusitako APN-aren kokapenaren herena nukleoan agertu izanak (bai gizakia
zein arratoiaren garun kortexean) OGF-aren zelula-barneko ekintza posible horrekin
zerikusia izan lezake.
Era berean, baina maila txikiago batetan, entzefalinen anderakuntza egiten duten
PSA solugarria eta mintzari lotutakoak kokapen nuklearra dutela ikusi dugu tesi honetan
(aktibitate azpizelularraren %14 – 19). Constam eta lankideak (1995) ere PSA aktibitate
nuklearra dagoela ikusi zuten, zelula hazkuntza prozesuetan gertatutako proteolisi
fenomenoetan parte hartzen duela proposatuz.
Duela urte batzuk beste ikerlari talde batek PEP aktibitate nuklearra dagoela
deskribatu zuten, entzima honek ugaztunen DNA sintesian funtzioren bat izan dezakela
proposatuz (Ishino eta lank., 1998). Tesi honetan PEP solugarriaren aktibitate nuklearra ia
sinaptosometakoa bezain bestekoa dela ikusi dugu. Beraz, gure esperimentuetan ikusitakoa
Ishinoren taldeak deskribatutakoarekin bat datorrela esan genezake.
Eztabaida
Doktore-tesia
220
Orokorrean mintzari lotutako peptidasen banaketa azpizelularra gizakian eta
arratoian antzekoa izan den arren, aipagarria da giza garun kortexean AP MII aktibitate
handiena zatiki mikrosomalean aurkitu izana. Gizakian entzima honen isoforma
solugarriaren zelula-barneko kokapenari buruz lan batzuk badauden arren, ezer gutxi esan
daiteke mintzari lotutakoari buruz. Grdisa eta Vitalek (1991) gizakiaren odoleko zelula zuri
ezberdinen mikrosometan espezifizitate zabaleko aminopeptidasa aktibitateak isolatu
zituzten, zatiki honetan funtzio bereziren bat izan behar luketela adieraziz. Urte batzuk
lehenago ere gizakiaren karenako mikrosometan aminopeptidasa aktibitatea duen entzima
bat purifikatu zen (Kurauchi eta lank., 1986).
Zatiki mikrosomalean aurkitzen diren organulu nagusiak erretikulu endoplasmikoa
eta Golgi aparatua dira. Toki hauetan proteinen eta peptidoen ekoizpenean garrantzitsuak
diren prozesuak gertatzen direla aspaldidanik dakigu. Hauen artean, Golgi aparatuan
neuropeptidoen aitzindariak diren peptido handiagoen prozesamendua gertatzen da
(O’Cuinn, 1997). Beharbada, zatiki mikrosomalean proportzio ezberdinetan organulu
hauetan aurkitzen diren peptidasa hauek neuropeptidoen prozesamenduan funtzioren bat
izan lezakete.
Laburbilduz, mintzari lotutako peptidasa aktibitateen banaketa azpizelularrari
dagokionez, entzima hauek maila zelularrean organulu eta toki ezberdinetan azaltzen direla
esan behar da. Kokapenak oso ezberdinak izan diren arren, aipatzekoa da mielina eta
sinaptosometako aktibitate altua PG I eta PEP-aren kasuan, eta nukleoan azaldutako APN
aktibitate handia.
Mintzari lotutako garuneko peptidasen funtzioa jariatutako molekula
erregulatzaileen (hormona edo neurotransmisoreak adib.) metabolismoan nahiko ondo
ezarrita dagoen arren (Turner, 1987), peptidasa solugarrien zeregina zelula barnean ez dago
batere argi (Mantle, 1992). Arrazoi honegatik normalean mintzari lotutako eta zatiki
solugarriko entzimen funtzioa bata bestearengandik bananduta azaltzen dira. Baina ikerlan
askotan eta tesi honetan ikusitakoaren arabera, azpimarratzekoa da bai aktibitate solugarriak
zein mintzari lotutako aktibitate gehienak (sinaptosometakoa kontuan hartu gabe),
zelularen peptidasa aktibitate osoaren zati handiena direla eta maila azpizelularrean
Eztabaida
Doktore-tesia
221
gertatzen dela. Azken finean, aztertutako peptidasa ezberdinek neuropeptido edo beste
peptido askoren anderakuntzan parte hartzen dutela deskribatu da hainbat ikerlanetan;
baina peptidasa hauen zati handiena zelula barnean kokatzen dela jakinik, entzima hauen
ekintza mekanismoari buruzko hutsune zabal bat dagoela ikus dezakegu.
Peptidasa zitosolikoen eztabaidan entzima hauek Euren funtzio ezberdinak zelulatik
kanpora jariatu ondoren edo beren substratua diren peptidoak zelulan barneratu ondoren
egin litzaketela proposatu da (Gibson eta lank., 1989). Proposamen hau gune aktiboa zelula
barnera begira duten mintzari lotutako entzimentzako baliagarria da, AP MII-a adibidez
(Dyer eta lank., 1990).
Azkenengo urteotan hormona peptidiko edo hazkuntza faktore batzuk zelula
barnean ekintza intrakrino bat izan dezaketenaren hipotesia jarri da agerian. Peptido hauek
zelula kanpotik barneratu ondoren edo barnean atxikita gelditu ondoren zelularen aktibitate
ezberdinak modulatu ditzaketela proposatu da (geneen transkripzioa edo zelula bereizketa
adibidez) (Re, 2002; 2003). Hildu honetan hipofisiko hormona peptidiko batzuk edo
angiotentsina II-ak aktibitate intrakrinoa izan dezaketela deskribatu da (Houben eta Denef,
1994; De Mello eta Danser, 2000; Schuijt eta Danser, 2002).
Tesi honen helburuetariko bat NSZ-an peptido ezberdinen anderatzaileak diren
peptidasen aktibitate azpizelularra deskribatzea izan da. Ikus dezakegunez, entzima hauek
aztertutako zatiki azpizelular guztietan agertzen dira eta zelula barnean aktibitate handia
daukate. Emaitza hauek hipotesi intrakrino hau osotzen lagundu gaitzakete; azken finean,
ekintza intrakrinoa duten peptidoen erregulazioan peptidasek funtzioren bat izatea posible
baita.
Peptidasen banaketa azpizelularraz gain, entzima hauek NSZ-eko atal ezberdinetan
zein eratan banatzen diren ezagutzeak beraien funtzioari buruzko datu gehiago biltzen
lagun ziezagukeenez, tesiaren bigarren fasean gizaki eta arratoi arrunten (baldintza
normaletan daudenak) garuneko gune ezberdinetan 7 peptidasa hoien aktibitateak neurtu
genituen:
Eztabaida
Doktore-tesia
222
2. Peptidasa aktibitateak gizakiaren eta
arratoiaren garuneko atal ezberdinetan.
Peptidasak mikroorganismo, landare eta animalia mota edo espezie ugaritan eta
ehun ezberdinetan isolatu dira (Taylor, 1993). Organo periferikoen artean, gibela,
giltzurrunak, birikak, odol zelulak, gihar eskeletikoa, e.a. organo edo ehunetan peptidasa
aktibitatea azaltzen dela deskribatu da (Mantle, 1992; Goossens eta lank., 1996; Irazusta eta
lank., 2001; Fernández eta lank., 2002).
Lan honetarako aukeratutako entzima guztiak gizakia edo animalien NSZ-ko atalen
batean isolatu izan dira (Kato eta lank., 1980; Kelly eta lank., 1983; Hersh eta lank., 1985;
Gros eta lank., 1985; Matsas eta lank., 1985;…).
Ikerketa deskriptibo honetan lan hauek osatzeko asmoz garuneko 7 atal ezberdin
aukeratu dira beste hainbeste peptidasen aktibitateak gune guztietan hedatzen direnentz eta
nola egiten duten jakiteko. Aukeratutako guneak amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa,
estriatuaren nukleo kaudatua eta garun kortexa (prefrontala, parietala eta okzipitala) izan
dira. Aukeraketa honek zergatia bat baino gehiago izan ditu:
I. Alde batetik, atal ezberdin bat baino gehiagotan neurtu nahi izan da, ikerketa
deskriptiboa izanik, peptidasen aktibitateak entzefaloaren hedaduran zehar analizatzea
zentzuzkoena baita. Gainera atal hauen artean, garapen ebolutiboari dagokionez garun
kortexaren kasuan garapen hau ez da berdina izan gizakiaren edo arratoiaren kasuan.
II. Bestetik, gune hauetan peptidasek hidrolisatutako neuropeptidoak azaltzen
direla, proportzio ezberdinetan, deskribatu da (begiratu sarreran).
III. Esperimentuetarako erabilitako teknikak eskatzen dituen lagin kantitateak
mugak jartzen dizkigunez (batez ere arratoi laginekin) aipatutako 7 garun gune hoiek
aukeratu ditugu.
Eztabaida
Doktore-tesia
223
IV. Gainera, gune hauek menpekotasunari dagokion punturako egokiak iruditu
zitzaizkigunez, egoera fisiologikoetan neurtutako garun atalak eta hurrengo fasean egoera
patologikoan aztertutakoak berdinak izatea pentsatu dugu.
Orokorrean, ikertutako peptidasa aktibitateen banaketa erregionala bai gizaki zein
arratoiaren garunean nahiko homogenoa izan da, PEP, PSA solugarria eta APB-an
agertutako ezberdintasun esangarriak kontuan hartu gabe. Zazpi entzimen aktibitateak
espezie bietan aztertutako garun gune guztietan ikusi dira.
Gainera, aztertutako 3 peptidasen aktibitateetan (PEP, PSA eta APB-a) espezie
arteko ezberdintasun esangarriak azaldu dira. Beste aktibitateetan joera adierazgarri batzuk
ikusi arren, ezberdintasunak ez dira esangarriak izan.
2.1. Prolil endopeptidasa peptido ezberdinen (adibidez TRH-a eta
ADH-a) anderakuntza eragin dezakeen entzima bezala deskribatu da (Welches eta lank.,
1993). Sinapsi mailan neuropeptido ezberdinen inaktibazioa hauen prolil aminoazidoak
hidrolisatuz eragiten duela dakigu (Walter eta lank., 1971; O’Leary eta lank., 1996). Bere
kokapena arratoi eta gizakiaren NSZ-ean ezaguna da (Kato eta lank., 1980; Wilk, 1983;
Kalwant eta lank., 1991) eta gure esperimentuetan horrela dela baieztatu dugu.
Baina PEP-aren aktibitatean, bai solugarrian zein mintzari lotutakoan, adierazgarriak
iruditu zaizkigun emaitza bi azpimarratu behar dira:
2.1.1. Arratoiaren garunean PEP-aren banaketa nahiko homogeneoa dela azaldu
den bitartean (amigdalan ikusitako joera salbu), giza garun kortexean beste guneetan baino
aktibitate esangarriki handiagoak azaltzen dira. Emaitza hauek Kato eta lankideak (1980)
giza garun homogenatuetan ikusitako PEP solugarriaren emaitzekin bat dator.
Griffiths eta lankideek (1985) TRH-aren anderakuntza mailak kortexean beste
ataletan baino nabariagoak direla deskribatu zuten. Gure lanean azaldutako kortexeko 3 atal
ezberdineko (PF, O eta P) PEP isoforma bien maila altuak lan horretan azaldutakoa
sostengatzen dute, PEP-a TRH-aren inaktibazioan zerikusia duela deskribatu baita
(Welches eta lank., 1993). Hipotalamoko hormona peptidiko honek, TSH-a edo hormona
Eztabaida
Doktore-tesia
224
tiroideen askapenean duen eraginaz gain, eragin trofiko zuzenak dituela deskribatu da
(Banda eta lank., 1985 eta 1987; Bauer, 1987). Beraz, PEP aktibitatea NSZ-an filogenetikoki
eboluzionatuago dauden guneetan azaltzeak oraindik hain ezezaguna den ehun honen
garapenean entzima honek funtzioren bat izan behar duen susmopean jartzen gaitu. Egia
esan, emaitza interesgarri hauek, espezie gehiagoren filogenesian PEP-aren funtzioa zein
izan daitekeen ulertzeko asmoz, ikerketa lerro berri bat zabaldu dute gure taldean
(Agirregoitia eta lank., 2003).
Hildu honetan, ikerlan anitzetan PEP-a oroimena, ezagutza eta ikaskuntza
funtzioarekin erlazionatu da (Shishido eta lank., 1998); garun kortexarekin erlazio zuzena
duten funtzioekin alegia (Coyle eta lank., 1983; Araujo eta lank., 1988). Are gehiago,
azkeneko hamarkadan Alzheimer, Parkinsona, Huntington, e.a. endekapenezko gaixotasun
neurologikoetan entzima honen aktibitate aldaketak ikusi dira. Alzheimerraren kasuan PEP
garun kortexean soilik agertzen dela eragindua deskribatu da (Ichai eta lank., 1994; Mantle
eta lank., 1996). Gainera, entzima honek oroimenarekin zerikusia duela eta, gaur egun PEP-
ren inhibitzaileekin azterketa preklinikoak egiten hasi dira karraskari, tximino eta gizakian
(Schneider eta lank., 2002; Morain eta lank., 2002) emaitza onak agertu direlarik.
Inhibitzaile hauek garun kortexean eragin gehiago dutela ere deskribatu da (Toide eta lank.,
1995).
Beraz datu hauek ikusita eta argitaratuko ikerlanak kontuan hartuz, gizakiaren garun
kortexaren fisiologian PEP-ak funtzioren bat izan dezakela proposatu daiteke.
2.1.2. Peptidasa honen analisian ikusitako beste berezitasun bat espezie arteko
aktibitate maila hain ezberdinak izan dira. Izan ere, giza garuneko PEP aktibitatea
arratoiarena baino handiagoa dela aurkitu dugu aztertutako garuneko atal guztietan eta
entzimaren isoforma bietan. Baina espezie bien kortexeko PEP mailak konparatuz, gizakian
entzima honen aktibitatea arratoian baino 3-4 bider handiagoa dela ikusi dugu.
Beharbada, emaitza hau goian eztabaidatutakoaren Hildu berberean kokatu
genezake. Garun kortexaren garapenarekin eta gune honekin zerikusia duten funtzio
bereziekin erlazionatu den entzima hau gizakiaren kortexean arratoian baino maila askoz
altuagoetan agertzeak badu bere logika.
Eztabaida
Doktore-tesia
225
2.2. Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasa
(PSA) garunean azaltzen den aminopeptidasa ugariena dela deskribatu da (Hersh eta
lank., 1987). Entzima honek mintzari lotutako eta solugarria den isoforma bi dituela
deskribatu da, bigarrenaren aktibitatea askoz handiagoa delarik (McLellan eta lank., 1988).
Mintzari lotutako entzefalina anderatzaileen artean AP MII-a APN-a baino aktiboagoa dela
deskribatu da (Giros, 1985). Gainera mintzari lotutako PSA edo AP MII garunarekiko
espezifikoa den bitartean, isoforma solugarria eta APN-a beste ehun askotan isolatu dira
(Solhonne eta lank., 1987; Mantle, 1992; Yamamoto eta lank., 1998, Shimizu eta lank.,
2002). 1997an Tobler-en taldeak gizakiaren neuronetako PSA klonatu zuen.
Gure esperimentuetan, PSA espezie bietan azaldu da. Gainera, aminopeptidasa
honen aktibitatea ikertutako peptidasa guztien artean handiena dela ikusi dugu. Era berean,
mintzari lotutako peptidasa aktibitateen artean AP MII-arena izan da nagusia. Beraz
emaitza hauek beste argitarapenek diotenarekin bat datoz.
Banaketa erregionalari dagokionez, proentzefalina eta prodinorfina eta hauen
eratorriak NSZ eta periferikoko gune askotan isolatu dira, adibidez estriatua, hipokanpoa,
kortexa, hipotalamoa, e.a. (Roques, 1999). BPO batzuen hidrolisia sor dezakeen PSA garun
atal hoietan maila altuetan azaldu da. Hala ere, giza garun kortexean ikusitako PSA
solugarriaren aktibitatea beste ataletakoa baino eskasagoa izan da. Arratoi garunean ez da
berezitasun hau nabaritu.
Espezie arteko konparaketari dagokionez, giza garunean PSA-ren aktibitatea
arratoiarenean baino esangarriki handiagoa dela ikusi dugu. PSA solugarrian aztertutako atal
guztietan, eta AP MII-aren kasuan atal gehienetan azaldu dira emaitza hauek. Gainera,
hurrengo puntuan ikusiko dugun bezala APB aktibitatearen alderantzizko emaitzak izan
dira.
2.3. Arginil aminopeptidasa edo APB gizakia eta animalietan
isolatutako eta substratu bezala N-muturrean arginina edo lisina duten peptidoak
Eztabaida
Doktore-tesia
226
anderatzen dituen entzima da (Hopsu eta lank., 1966; Piesse eta lank., 2002). Entzima
solugarri bezala ezagutzen den peptidasa honek bere aktibitate egokia pH pixkat azidoan
daukanez (Mantle, 1992; O’Cuinn, 1997) barrunbe azpizelularretara hobeto egokitzen dela
eta bertan fenomeno fisiologiko ezberdinetan partaide dela deskribatu da (Foulon eta lank.,
1999).
Lan honetan garun atal ezberdinetako homogenatuen zatiki solugarrian aztertutako
APB-ak espezie bietan aktibitate handia duela ikusi dugu. PSA solugarriaren ostean
handiena. Gainera, arratoi garuneko APB aktibitatea era esangarrian gizakian baino
handiagoa dela ikusi dugu. Aktibitate garai hau zelula barnean gertatzeak APB-aren funtzioa
zein izan daitekeen jakitea zailagotu egiten digu. Bere ekintzen artean, hantura prozesuetan
sortutako bitartekari peptidikoen edota propeptido batzuen prozesamendua dagoela
proposatu da (Yasothornsikul eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999). Prozesu hauetan eta
beste batzuetan APB-ak nola eta non eragiten duen ezagutzan oraindik hutsune asko daude
eta ikerketa gehiago beharrezkoak izango dira.
Bestalde, APB eta baita PSA-ren balioak gizakiaren garun kortexean beste ataletan
baino txikiagoak izan dira. Emaitza hauek PEP-rekin ikusitakoaren alderantzizkoak izan
dira, atal arteko balore ezberdintasunak askoz txikiagoak diren arren. Zentzu honetan
azaldutako argitarapen eskasiak datu hauen esanahia zein izan daitekeen jakitea zailago
egiten duen arren, garunaren filogenesiarekin erlazioren bat izan dezakela susmatzera
eramaten gaitu.
Laburtuz, banaketa erregionalean azaldutako emaitza adierazgarrienak PEP, PSA
eta APB-ak jaurtitakoak izan dira.
2.4. Beste peptidasen banaketari dagokionez, nahiko homogeneoki
gertatzen da atal guztietan; eta espezie bietan ikusi ditugu peptidasa aktibitateak. Kasu
batzuetan joeraren bat ikusi den arren, ez da ezberdintasun esangarririk agertu garuneko
atalen artean.
APN-ak hurrengo puntuan zeresana duenez, bere banaketari buruzko azalpen txikia
egitea komeni da. Izan ere, entzima hau NSZ-an nagusiki bertako hodien endotelioan
Eztabaida
Doktore-tesia
227
kokatzen dela deskribatu da (Solhonne eta lank., 1987), baina duela gutxi Noble eta
lankideak (2001) egindako ikerlan batean aminopeptidasa hau NSZ-ko gune neuronal
askotan azaltzen dela deskribatu zuten. Entzima honen inhibitzailea den RB129 tritiatua
erabiliz, hipotalamoan, talamoan, hipokanpoan, estriatuan, kortexean, e.a. ataletan APN-a
neurrizko edo kantitate altuetan aurkitu du talde honek. Gure esperimentuetan ikusitakoa
datu hoiekin bat dator. Zerbait gehitzekotan, gure esperimentuetan amigdalan ere APN
aktibitatea agertzen dela esan behar.
Beste emaitza aipagarri bat, leuzil aminopeptidasaren aktibitate espezifikoa
kortexean arratoiarena baino handiagoa dela izan dugu (esangarria kortex parietalean).
Entzima solugarri honen funtzioa zein den oso ondo ez dakigun arren (BPO-ekiko ekintza
txiki bat omen du), ehun askotan hedatuta dagoenez proteinen bioeraldaketan
erantzunkizun nabaria izan lezakeela proposatu da (Gibson eta lank., 1991). Gure lan
honetan giza kortexean ikusitako berezitasun hori aipatzea adierazgarria iruditzen zaigu.
Laburbilduz, ikertutako peptidasa guztiak garunean zehar hedatzen direla esan
daiteke. Gainera, aktibitate altuena PSA solugarriak eta APB-ak daukate. Bestalde, PSA eta
PEP aktibitatea gizakian arratoietan baino handiagoa den bitartean, arratoi garunean APB-a
gizakiarena baino altuagoa da. Era berean, PEP, PSA solugarria eta APB-aren aktibitatea
giza garunean ez da homogeneoki banatzen (emaitza bereziki adierazgarria PEP-aren
kasuan).
Eztabaida
Doktore-tesia
228
3. Garuneko peptidasa aktibitateak
opiazeoekiko menpekotasunean.
Orain arte azaldutako guztia baldintza normaletan zeuden gizaki edo arratoien
garunetan eginiko ikerketak izan dira. Tesiaren azken puntuan neuropeptidoen
anderakuntzan opiazeoekiko menpekotasunak eraginik izan dezakeen aztertzen da.
Horretarako heroinarekiko tolerantzia zuten giza garunak eta morfinarekiko tolerantzia eta
abstinentziadun animali ereduen garunak izan ditugu aztergai.
Ikerketa fase honen helburu nagusia barne peptidoen anderakuntzan opiazeoen
erabilpen kronikoak aldaketarik sortzen duen jakitea izan da. Azken finean, morfina edo
heroinarekiko tolerantzia edo abstinentzia fenomenoak BPO sisteman izan lezakeen
eraginari buruzko ikerlan ugari azaldu dira, baina ezer gutxi dakigu peptido opioide hauen
katabolismoan zer gertatzen den egoera patologiko ezagun honetan. Zentzu honetan, BPO-
en anderakuntzan eragiten duten aminopeptidasa nagusiak (APN eta PSA) (Gros, 1985;
McLellan eta lank., 1988) ikertu ditugu.
Bestalde, beste peptidasen azterketak neuropeptido gehiagoren metabolismoan
opiazeoek duten eragina ezagutzen lagundu diezagukenez, PEP, APB, LAP, APA eta PGI
entzimak ere aztertu ditugu.
Gizaki heroinazaleen (eta hauen kontrolen) kasuan, lortu ahal izan den garun lagin
kantitatea eta barietatea mugatua izan da. Aztertutako atalak kortex prefrontala eta
estriatuko nukleo kaudatua izan dira. Morfinarekin tratatutako animalien kasuan berriz,
garun gune hoiez gain, amigdala, hipotalamoa, hipokanpoa, kortex parietala eta okzipitala
izan dira aukeratutakoak. Honen zergatia bigarren puntuan azaldutakoaz gain, opiazeoek
sortutako efektuak eta neuroegokitzeak aukeratutako garun gune gehienetan eragin berezia
duelako izan da. Adibidez, menpekotasun psikikoaren substratu neurala den sari-zirkuitu
edo sistema mesolinbikoak kortex prefrontalarekin, amigdala, hipokanpo, hipotalamo eta
estriatuarekin konexioak ditu (Koobs eta Nestler, 1997). Era berean, abstinentziaren
sintomen eragile garrantzitsuena mesentzefaloko locus coeruleus-a den arren, menpekotasun
Eztabaida
Doktore-tesia
229
fisikoan agertutako neuroegokitze fenomenoak aipatutako sari sistemako neuronetan eta
beste zelula askotan deskribatu dira (Nestler eta Aghajanian, 1997; Nestler, 2001).
3.1. Opiazeoekiko menpekotasuna eta BPO-en
katabolismoa:
Sarreran azaldu den bezala, gure nerbio sistema zentralean barne sistema opioidea
dagoela ezagutzean opiazeoen kontsumo kronikoak sistema honen alderdi ezberdinetan
nola eragiten duen ezagutzeko ikerketak gelditu gabeak izan dira. Morfina edo heroinaren
erabilpenak NSZ-ko gune ezberdinetan oreka patologiko berri bat ezartzen du.
Neuroegokitze prozesu honen lokarrietariko bat hartzaile-osteko fenomenoak direnaren
teoria tinko bat dago, non proteina ezberdinen metabolismoaren aldaketa ugari deskribatu
diren (Nestler eta Aghajanian; 1997).
Zentzu honetan aztertutako puntuetariko bat peptido opioideen erregulazioarena
izan da. Agertutako emaitzak eta proposamenak (batez ere peptido aktiboei dagokionez)
askotan kontrajarriak izan diren arren, neuropeptido hauen biosintesian beheranzko
erregulazio bat dagoela uste da (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995). Berriz,
BPO-en katabolismoaren erregulazioari buruz hutsune nabarmena daukagu.
Tesiaren puntu honetarako aztertutako aminopeptidasen artean APN-a izan da
entzefelina anderatzaile “in vivo” bezala onartutena (Gros, 1985). Hala ere, puromizinak
naloxona-bitartez itzulgarria den analgesia sor dezakela ikusi da (Herman eta lank., 1985)
eta esperimentu zuzenetan PSA-k entzefalinak anderaten dituela baieztatu da (McLellan eta
lank., 1988; Gibson eta lank., 1989; Mantle, 1992; e.a.). Gainera, aminopeptidasa biak beste
BPO edo hauen zati txikien hidrolisia (dinorfina antzeko peptido txikiak adibidez) egiten
duela deskribatu da (Taylor, 1993).
Gure ikerlanetan opiazeoek bai APN eta bai PSA aktibitatearen gain eragina dutela
ikusi dugu:
Eztabaida
Doktore-tesia
230
3.1.1. Alanina aminopeptidasa N-ari (APN) dagokionez, aurkitutako aldaketa
esangarriak opiazeoekiko menpekotasun animalia ereduetan azaldu dira, bai tolerantzia
taldean (morfina soilik) zein abstinentzia taldean (morfina + naloxona).
Lehenengo eta behin, aipatzekoa da tolerantzian dauden arratoien garuneko atal
guztietan APN aktibitatea arratoi-kontrolena baino handiagoa izan dela eta abstinentzia
agertu duten animalietan kontrako joera ikusi dela. Emaitza hauek atal batzuetan
esangarriak izan dira.
I. Morfinarekiko tolerantzia taldeko arratoien amigdalan, hipotalamoan eta
kaudatuan APN-aren aktibitatea kontroletakoa baino esangarriki altuagoa izan da. Datu
hauek Malfroy eta lankideak (1978) eta Hui eta lankideak (1981) deskribatutakoarekin bat
datoz, autore hauek morfinazko tratamendu kronikoak entzefalinen anderakuntza
handitzen duela adierazi baitzuten. Gure esperimentuetan APN aktibitate aldaketak izan
dituzten gune hoiek era batera edo bestera opiazeoekiko menpekotasunaren substratu
neuronalarekin erlazionatu dira (Koob eta Nestler, 1997).
Gune hauetan APN aktibitate altuak entzefalina mailetan eraginen bat izatea
esperogarria litzateke. Zentzu honetan 2Gudehithlu eta lankideak (1991) hipotalamoan,
hipofisian, amigdalan, e.a. gunetan endorfina eta entzefalina maila jaisteak deskribatu
zituzten tolerantziadun arratoietan. BPO-en beherapenak agertzen dituzten lan gehiago ere
azaldu dira (Shani eta lank., 1979; e.a) baina aldaketarik gertatzen ez dela edo mailak igo
egiten direla dioten beste lan asko ere badira (Simantov eta Snyder, 1976; Fratta eta lank.,
1977; Childers eta lank., 1979; e.a.). Beraz, gure esperimentuetan jasotako emaitzen
esanahia ulertzea nahiko zaila dela esan genezake.
Kaudatuan aurkitutako APN aktibitate igotzeak aipamen berezia merezi du. Izan
ere, estriatuan proentzefalina edo prodinorfinadun neuronen dentsitatea nahiko altua dela
deskribatu da eta BPO-ek ekintza motibazionaletan eragina dutela idatzi da (Trujillo eta
lank., 1995). Gainera, gune honek sistema dopaminergikoetatik (substantzia beltza edo sari-
zirkuituak adibidez) projekzio ugari jasotzen ditu (1Gudehithlu eta lank., 1991; Koob eta
Nestler, 1997; Nestler, 2001). Neurona hauek estriatuko met-entzefalinen metabolismoa
modulatzen dutela deskribatu da, dopamina-antagonista den haloperidolak edo dopamina
Eztabaida
Doktore-tesia
231
biltegien agortzea eragiten duen MPTP-ak met-entzefalina edo “antzeko” peptido txikien
mailak igoarazten dituztela ikusi baita (Houdi eta Van Loon, 1990; 1Gudehithlu eta lank.,
1991). Ideia honi helduz, Konkoy eta Waters-en taldeek (biek 1996an) haloperidolak
estriatuan eta garun kortexean APN-aren aktibitatea gutxitzen duela ikusi zuten, farmako
honek estriatuan sortutako met-entzefalinen maila igotzeak entzima hau inhibituz gertatu
litezkeela proposatuz. Argitaratu berria den ikerlan batean, gizakiaren plasman eginiko “in
vitro” esperimentuetan fenotiazina ezberdinek (dopamina antagonistak) leu-entzefalinen
anderakuntza inhibitu dezaketela ikusi dute (Mosnaim eta lank., 2003).
Opiazeoek eta beste droga menpekotasun sortzaileek ezaugarri fisiopatologiko
amankomun bat dute; bide mesolinbiko dopaminergikoaren (sari-zirkuituen) aktibazioa
(Nestler, 2001; Fernández-Espejo; 2002). Beharbada, gure esperimentuetan morfinarekin
kronikoki tratatutako arratoien estriatuan azaldutako APN aktibitate altua dopamina
hiperaktibitatearen efektu ez-zuzena izan liteke. Hala ere, hipotesi hau baieztatzeko beste
ikerketa espezifikoagoak egitea beharrezkoa dela iruditzen zaigu.
II. Naloxonarekin eragindako abstinentziadun arratoietan APN-aren aktibitateak
tolerantzian zeudenen kontrako joera agertu du. Kasu honetan esangarria izan da
hipokanpoan agertutako APN aktibitatearen gutxitzea.
APN-ak entzefalinen anderakuntzan duen funtzio kontutan hartuz, entzima honen
aktibitate gutxitzeak gune honetako peptido opioideen erabilgarritasuna handitzea eragin
beharko luke abstinentzia sindromean. Zentzu honetan, BPO-en katabolismoaren
inhibitzaileekin egindako ikerketetan konposatu hauek naloxonaz eragindako abstinentzia
sintomak leundu ditzaketela deskribatu da (Maldonado eta lank., 1992; Roques eta Noble,
1995). Bestalde, entzefalinen ekoizpenean eragina duen endo-oligopeptidasa aktibitatea
handituta azaldu zen naloxonaz eragindako abstinentziadun arratoien hipokanpoan (Paik
eta lank., 1994).
Datu hoiek kontuan hartuz, posible litzateke abstinentzian agertutako APN maila
gutxitzeak erregulazio mekanismo bat izatea abstinentzia sintomen murrizketa eragiteko.
Hala ere, emaitza honen irakurketa ez da batere erraza, opiazeoekiko abstinentzia
Eztabaida
Doktore-tesia
232
sindromea eta entzefalina mailak erlazionatzen dituzten ikerlanetan ez dagoelako
adostasunik (Wüster eta lank., 1980; Bergstrom eta Terenius, 1979; Uhl eta lank., 1988).
3.1.2. Puromizinarekiko sentikorra den aminopeptidasari (PSA) dagokionez,
aurkitutako aldaketa esangarriak heroinazaleetan eta opiazeoekiko menpekotasun animalia
ereduetan (tolerantzia eta abstinentzia taldeetan) azaldu dira; baina soilik PSA solugarrian.
Kasu honetan ere animalietan APN-arekin ikusitako joera azaldu da. Tolerantzian
zeuden arratoietan PSA-ren aktibitatea kontrolena baino handiagoa izan den bitartean,
abstinentziadunetan kontrako joera aurkitu dugu. Aktibitate mailen arteko ezberdintasunak
handiegiak ez diren arren, bai gizakia eta arratoiaren garuneko atal konkretu batzuetan
esangarriak izan dira.
I. Opiazeoekiko tolerantzia egoeran bai gizakia heroinazale eta bai arratoi
“morfinazaleen” garun kortex prefrontalean PSA solugarriaren aktibitatea altuagoa dela
ikusi da. Emaitza hau espezie bietan eta garun gune konkretu honetan gutxituta aurkitu
izanak bere garrantzia izan lezake; kortex prefrontala menpekotasunaren gune
garrantzitsuenetarikoa baita, bertara sistema mesolinbiko dopaminergikoko neurona ugari
heltzen direlako (Nestler eta Aghajanian, 1997; Nestler, 2001).
Heroina eta BPO-a erlazionatzen dituzten ikerlanak eskasagoak dira; are gutxiago
gizakietan egindakoak. Gure esperimentuetan heroinazaleetan aurkitutako aktibitate
handitzeak Weissman eta Zamir-ek (1987) eta Cappendijk eta lankideak (1999)
adierazitakoarekin kontrajartzen direla esan daiteke. Ikerlari hauek diotenez heroina
tratamendu kronikoak entzefalina eta dinorfina mailak igotzea eragiten du. Hala ere,
emaitza hauek animalia ereduetan eta NSZ-ko beste gune batzuetan aurkitu ziren.
II. Abstinentzia sindromeari dagokionez arratoien garunean PSA solugarriaren
aktibitatea kontrolena baino txikiagoa dela ikusten da; kortexean eta estriatuan datuak
esangarriak direlarik.
Eztabaida
Doktore-tesia
233
Zentzu honetan, entzefalina, dinorfina edo endorfinak zuzenki edo era ez-zuzenean
abstinentzian dauden heroinazaleei edo animaliei ematean sindrome horren sintomatologia
murriztu egiten dela deskribatu da (Tseng eta lank., 1976; Clement-Jones eta lank., 1979;
Wen eta lank., 1983). Beharbada PSA-ren murrizketak zentzuren bat izan lezake
abstinentzia prozesuan.
Dena den, PSA-k BPO-en anderakuntzan eta (ondorioz) menpekotasunaren
fisiopatologian zein eratan eta non eragin dezakeen asmatzea nahiko zaila da, gehienbat
entzima zitosolikoa baita. Puromizinak entzefalinen anderakuntza inhibitu dezakeela eta
PSA-k BPO ezberdinak anderatzen dituela ezarrita dago (Chailet, 1983; Taylor, 1993) baina
bere funtzio fisiologikoa oraindik oso eztabaidatua da.
Sarreran, emaitzetan eta eztabaida honetan ikusi den bezala opiazeoekiko
menpekotasunak BPO-en anderatzaileak diren aminopeptidasa nagusienetan eraginen bat
badu. Baina BPO-en katabolismoaren aldaketa hauei ez dizkiete zuzenean peptido hoien
maila gutxitze (tolerantzian) edo handitzeak (abstinentzian) jarraitzen; edo behintzat zentzu
honetan datuak kontrajarriak dira (Trujillo eta Akil, 1991; Trujillo eta lank., 1995). Baina
honek ez du esan nahi neurona opioidergikoetan erregulazioren bat gertatzen ez denik.
Azken finean, neurona hauen barneko peptido edukina prozesu ezberdinen menpe baitago.
Alegia, biosintesia, askapena eta anderakuntzaren menpe. Adibidez, Saria eta lankideak
(1997) neutral endopeptidasa 24.11-ren genea ezabatuta zeukaten saguetan leu eta met-
entzefalina mailak igo beharrean jaitsita daudela ikusi zuten. Emaitza hau paradoxikoa
dirudien arren, sagu hauetan entzefalinen biosintesiaren feed-back negatiboa gertatzearen
ondorioz peptido hauen mailak jaisten direla adierazi zuten.
Antzeko arrazonamenduarekin Trujillo eta Akilek (1991) morfinaren eraginpean
BPO-en biosintesiaren feed-back negatiboa gertatzen dela adierazi zuten. Biosintesiaren
beherakada hau nahiko ixila mantentzen da morfinaren efektupean (tolerantzia), opiazeoen
efektuetariko bat neuronengain neurotransmisoreen askapen inhibizioa baita (Lorenzo eta
lank., 1999). Abstinentzian neurona opioidergikoen hiperaktibitate egoerak BPO biltegiak
azkar agortu litzake, biosintesia inhibituta egon baita.
Eztabaida
Doktore-tesia
234
PSA solugarrian ikusitako aldaketek BPO-en biosintesiaren beheranzko
erregulazioaren hipotesian izan dezaketen kokapena asmatzea ez da erraza. Cummins eta
O’Connor-ek (1998) entzima solugarrien funtzioetariko bat zelula barnean neuropeptidoen
edukina gehiegizkoa denean hauek anderatzea izan daitekeela proposatu zuten. Beharbada
morfinak edo heroinak neurona opioidergikoetan eragindako neuropeptidoen askapenaren
inhibizioaren ondorioz zelula barnean pilatutako BPO edo “antzeko” peptido txikien gain
PSA solugarriak eraginen bat izan dezake.
Laburbilduz, tesi honen azken helburu nagusia opiazeoekiko tolerantzia eta
abstinentzia egoerak BPO-ak anderatzen dituzten aminopeptidasetan eraginik duenentz
jakitea izan da. Bai APN-a eta PSA solugarriaren kasuan aktibitate entzimatiko hauek
garuneko gune ezberdinetan aldaketak jasaten dituztela aurkitu dugu; beraz fenomeno
patologiko hauetan zerikusiren bat izan lezaketela proposatzen dugu. Hala ere, oraindik gai
honetan dauden hutsuneak oso nabariak dira eta hauek betetzeko beste ikerlan gehiago eta
sakonagoak beharrezkoak izango dira.
3.2. Opiazeoekiko menpekotasuna eta beste peptido
batzuen anderakuntza:
Tesiaren azkenengo etapan heroinak edo morfinak 1. eta 2. puntuetan azaldutako
beste peptidasengain (PEP, APB, LAP, APA eta PG I) efekturik izan dezakeen ikustea izan
da, opiazeoen kontsumoak hainbat neuropeptido ezberdinen biosintesia edo askapenaren
gain eragina duela deskribatu baita (Lorenzo eta lank., 1999).
Hildu honetan peptidasa hauek eta beste batzuei buruz azaldutako ikerlanak oso
eskasak izan dira. Morfinarekin egindako tratamenduei dagokionez, ehun ezberdinetan
PEP, dipeptidil-peptidasa IV, angiotensina eraldatzen duen entzima, e.a. peptidasen
aktibazioa deskribatu da (Idänpään-Heikkilä eta lank., 1995; Korányi eta lank., 1989; Melzig
eta lank; 1998). Beste droga psikoaktibo batzuen artean, etanolak garunean guk aztertutako
peptidasen gain aldaketak eragiten dituela adierazi dute Mayas eta lankideek (2001 eta
2002).
Eztabaida
Doktore-tesia
235
Gure esperimentuetan jasotako emaitza gehienetan ez dugu peptidasen aktibitatean
aldaketa esangarririk aurkitu ezta gizakia ezta arratoiaren garunean. Hala ere, gizakiaren
garunean PEP-aren aldaketak azaldu dira eta arratoiaren garun kortexean PEP eta APB-
aren aktibitate aldaketaren bat aurkitu dugu.
I. Lehenengoaren kasuan gizakian eta arratoiaren garunean azaldutako emaitzak
pixkat paradoxikoak iruditu zaizkigu. Gizakiek tolerantzia egoeran daudela PEP-aren
aktibitate txikiagoa azaltzen baitute eta emaitza berdina abstinentziadun arratoien garun
kortexean (parietala) agertu baita. Emaitza hauen kokapena opiazeoek eragindako
prozesuetan ez dirudi errezegia, egoera patologiko honetan entzima honi buruzko ikerlanik
ia ez baitago. PEP-ak TRH-aren eta beste peptido batzuen anderakuntza eragiten duela
ezarrita dago (Welches eta lank., 1993). TRH-ak opiazeoekiko abstinentzia sindromearen
modulazio funtzioren bat izan lezakeen ikerlan ugari agertu dira, egoera honetan bere
sintesia igo egiten dela deskribatu baita (Ghan eta Sevarino, 1996; Legradi eta lank., 1996;
Nillni eta lank., 2002). Gure esperimentuetan ikusitakoa PEP-aren aktibitate aldaketak
erregulazio bide honetan kokatuta egon litezke.
II. APB-ari dagokionez, tolerantzia egoeran ez da inolako aldaketarik azaldu, baina
abstinentziadun arratoietan garun kortexean aktibitate txikiagoak aurkitu ditugu. Zelula
barneko aktibitate altua duen entzima honek proentzefalina, prokolezistokinina e.a.
propeptido edo aitzindariren prozesamenduan eraginen bat izan lezakeela proposatu da
(Yasothornsrikul eta lank., 1998; Foulon eta lank., 1999). Zentzu honetan, posible litzateke
APB-ak erregulazioren bat jasatea abstinentzia egoeran gertatutako fenomenoen barnean.
III. Beste peptidasei dagokionez (LAP, APA eta PG I), morfinaren efektupean
hauen substratua diren neuropeptido batzuen erregulazioak gertatzen direla ezaguna den
arren (Lorenzo eta lank., 1999), gure esperimentuetan ez dugu emaitza azpimarragarririk
ikusi.
Eztabaida
Doktore-tesia
236
VI. Ondorioak
Ondorioak
Doktore-tesia
237
I. Ikertutako peptidasa aktibitateak (PSA, APN, PEP, APB, LAP, APA eta PG I)
gizakia eta arratoiaren garunean aztertutako atal eta zatiki azpizelular guztietan aurkitzen
dira. Gainera, peptidasa aktibitate solugarria mintzari lotutakoa baino handiagoa izan da, eta
handiena PSA solugarriak eta APB-ak izan dute..
II. Peptidasa solugarrien banaketa azpizelularra gehienbat zitosolikoa da, baina zati
handi bat bukaera sinaptikoan (sinaptosometan) ematen da. Aktibitate maila altua denez,
zatiki hauetan peptidoen erregulazioan funtzio garrantzitsuren bat daukatela esan behar da.
III. Mintzari lotutako peptidasa aktibitate nagusiak (APN-a izan ezik) zatiki
mielinikoan eta sinaptosomalean agertu dira. Kokapen mielinikoak nerbioen garapen edo
endekapen prozesuekin erlazioa izan lezake. Era berean, kokapen sinaptosomalak, gune
sinaptikoan neuropeptido aktiboen anderakuntzarekin erlazioa dauka.
IV. APN aktibitate azpizelular nagusia nukleoan azaldu da. Aktibitate hau met-
entzefalinak (opioid growth factor edo OGF bezala ezagutua) zelulen garapenean duen
funtzioarekin erlazionatuta egon daiteke.
V. Giza garuneko PEP eta PSA-ren aktibitateak arratoiarenak baino esangarriki
handiagoak dira; berriz, APB aktibitate gehiago dago arratoi garunean.
VI. PEP aktibitatea gizakiaren kortexean ebolutiboki atzeratuagoak dauden
guneetan baino askoz altuagoa da. Alderantziz, PSA solugarria eta APB-aren kortexeko
aktibitateak eskasagoak dira (maila txikiago batean). Peptidasa hauek, batez ere PEP-ak,
garun kortexaren garapenean eta fisiologian ekintza bereziren bat izan dezaketela
proposatzen dugu.
VII. Barne peptido opioideak (nagusiki entzefalinak) anderatzen dituzten
aminopeptidasen artean aktibitate altuenak PSA solugarriak eta txikienak APN-ak azaltzen
dituzte bai gizakia zein arratoiaren garunean.
Ondorioak
Doktore-tesia
238
VIII. APN aktibitatea tolerantziadun arratoien garunean igo egiten den bitartean
(esangarriki amigdala, hipotalamoa eta kaudatuan), abstinentzian jaitsi egiten da
(hipokanpoan esangarria).
IX. PSA solugarriaren aktibitatea tolerantziadun gizakia eta arratoietan igo egiten
den bitartean (esangarria bien garunaren kortex prefrontalean) abstinentziadun arratoietan
jaitsi egiten da (kortexean eta estriatuan esangarria). Opiazeoen efektupean bai APN eta
PSA-ren aktibitate aldaketa hauek menpekotasunean gertatuko fenomeno ezberdinetan
eraginen bat izan dezakete.
X. Opiazeoekiko tolerantzia edo abstinentzian PEP aktibitate aldaketak aurki
daitezke gizakiaren garun kortexean, eta PEP-a eta APB-arenak arratoiaren garun
kortexean. Beharbada, opiazeoek opioideak ez diren neuropeptidoen erregulazioan ere
eragina izan lezakete.
VII. Bibliografia
Bibliografia
Doktore-tesia
239
Alreja M, Aghajanian GK. Opiates supress a resting sodium-dependent inward current and
activate an outward potassium current in locus coeruleus neurons. J Neurosci. 13: 3525-3532.
1993.
Aghajanian GK. Tolerance of locus coeruleus neurones to morphine and supression of withdrawal
response by clonidine. Nature. 276: 186-188. 1978.
Aghajanian GK, Kogan JH, Moghaddam B. Opiate withdrawal increases glutamate and
aspartate efflux in the locus coeruleus: an in vivo microdialysis study. Brain Res. 636: 126-130.
1994.
Agirregoitia N, Irazusta A, Ruiz F, Irazusta J, Gil J. Ontogeny of soluble and particulate
prolyl endopeptidase activity in several areas of the rat brain in the pituitary gland. Dev. Neurosci.
(onartua).
Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC, Fessard MA. Comparison chez le rat entre l’analgesie
induite par stimulation de la substance gris peri-aqueductale et l’analgesie morphinique. Acad. Sci.
Paris Ser.D 274: 3603-3605. 1972.
Akil H, Mayer DJ, Liebeskind JC. Antagonism of stimulation-produced analgesia by
naloxone, a narcotic antagonist. Science. 191: 961-962. 1976.
Akil-H, Owens-K, Gutstein-H, Taylor-L, Curran-E, Watson-S. Endogenous opioids:
overview and current issues. Drug and alcohol dependence. 51: 127-140. 1998.
Alba F, Arenas JC, Lopez MA. A fluorimetric method for the determination of brain
aminopeptidases. Arch. Neurobiol., 52: 169-173. 1989.
Alba F, Arenas JC, Lopez MA. Comparison of soluble and membrane-bound pyroglutamyl
peptidase I activities in rat brain tissues in the presence of detergents. Neuropeptides. 29: 103-107.
1995.
Bibliografia
Doktore-tesia
240
Alvarez VA, Arttamangkul S, Dang V, Salem A, Whistler JL, Von Zastrow M,
Grandy DK, Williams JT. Mu-opioid receptors: Ligand-dependent activation of potassium
conductance, desensitization and internalization. J Neurosci. 22: 5769-5776. 2002.
American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
(DSM-IV). Fourth edition. Washington, D.C.: American Psychiatric Press. 1994.
American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
DSM-IV-TR (Text Revision). Fourth edition. 2000.
Amodeo P, Lopez Mendez B, Guerrini R, Salvadori S, Temussi PA, Tancredi T.
Pain peptides. Solution structure of orphanin FQ2. FEBS Lett. 473(2): 157-160. 2000.
Appleyard SM, Celver J, Pineda V, Kovoor A, Wayman GA, Chavkin C. Agonist
dependent desensitization of the kappa opioid receptor by G protein receptor kinase and beta-arrestin. J
Biol. Chem. 274: 23802-7. 1999.
Araujo DM, Lapchak PA, Robitale Y, Gautheir S, Quirion R. Differential alteration of
various cholinergic markers in cortical ans subcortical regions of human brain Alzheimer’s disease.
Neurochemis. Neurochem. 50: 1914-1923. 1988.
Arvidsson U, Riedl M, Chakrabarti S, Vulchanova L, Lee JH, Nakano AH, Lin X,
Loh HH, Law PY, Wessendorf MW. The kappa-opioid receptor is primarily postsynaptic:
combined inmunohistochemical localization of the receptor and endogenous opioids. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 92(11): 5062-5056. 1995.
Banda RW, Means M, Fitzgerald M, Scherch H. Trophic effect of thyrotropin releasing
hormone on neuronal process in culture. Neurology. 37: 285-295. 1987.
Banda RW, Means M, Samaha F. Trophic effect of thyrotropin releasing hormone on murine
ventral horn neurons in culture. Ann. Neurol. 35: 93-97. 1985.
Bibliografia
Doktore-tesia
241
Balogh A, Cadel S, Foulon T, Picart R, Der garabedian A, Rousselet A, Tougard C,
Cohen P. Aminopeptidase B: a processing enzyme secreted and associated with the plasma membrane
of rat pheochromocytoma (PC12) cells. J. Cell. Sci. 111: 161-169. 1998.
Basheer R, Tempel A. Morphine-induced reciprocal alterations in Gαs and opioid peptide
mRNA levels in discrete brain regions. J Neurosci Res. 36: 551-557. 1993.
Bauer K. Adenohypophyseal degradation of thyrotropin releasing hormone regulated by thyroid
hormones. Nature. 330: 375-377. 1987.
Bauer K. Integrative neuroendocrinology: Molecular, cellular and clinical aspects. McCann and
weiner (Eds.). pp 102-114. 1987.
Beckett AH, Casy AF. Stereochemestry of certain analgesics. Nature. 173: 1231-1232. 1954.
Beitner D, Duman RS, Nestler EJ. A novel action of morphine in the rat locus coeruleus:
persistent decrease in adenilate cyclase. Mol. Pharmacol. 35: 559-564. 1989.
Belluzi JD, Grant N, Garsky V, Sarantakis D, Wise CD, Stein D. Analgesia induced in
vivo by central administration of enkephalin in rat. Nature. 260: 625-626. 1976.
Bergström L, Terenius L. Enkephalin levels decrease in rat striatum during morphine
abstinence. Eur J Pharmacol. 60: 349-352. 1979.
Berguemeyer HU, Brent E. UV assay with piruvate and NADH. Methods in enzymatic
analysis. Academic press, London. 2: 574-577. 1972.
Bhargava HN. The effects of thyrotropin-releasing hormone on the central nervous system
responses to chronic morphine administration. Psychopharmacology (Berl). 68: 185-189. 1980.
Bishop GB, Cullinan WE, Curran E, Gutstein HB. Abused drugs modulate RSG4
mRNA levels between acute drug treatmen and drug chalenge after chronic treatment. Neurobiol
Dis. 10: 334-343. 2002.
Bibliografia
Doktore-tesia
242
Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov KP, Caron MG, Lin FT. Enhanced morphine
analgesia in mice laking –arrestin 2. Science. 286: 2405-2498. 2405-2498. 1999.
Bongianni F, Carla V, Moroni F, Pellegrini Giampietro DE. Calcium channel inhibitors
supress the morphin-withdrawal syndrome in rats. Br.J.Pharmacol. 88: 561-567. 1986.
Boudinot E, Morin-Surun M, Foutz AS, Fournié-Zaluski M, Roques BP, Denavit-
Saubié M. Effect of the potent analgesic enkephalin-catabolizing enzyme inhibitors RB101 and
kelatorphan on respiration. Pain. 90: 7-13. 2001.
Bradford HF. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram of protein
utilizing the principle of the protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254. 1976.
Bronstein DM, Przewlocki R, Akil H. Effects of morphine treatment on pro-opiomelanocortin
systems in rat brain. Brain Res. 519: 102-111. 1990.
Browne P, O’Cuinn G. An evaluation of the role of a pyroglutamyl peptidase, a post-proline
cleaving enzyme and a postproline dipetidyl aminopeptidase, each purified from the soluble fraction of
guinea-pig brain, in the degradationof thyroliberin in vitro. Eur. J. Biochem. 137: 75-87. 1983.
Busquets X, Escriba PV, Sastre M, Garcia-Sevilla JA. Loss of protein kinase C-alpha beta
in brain of heroin addicts and morphine – dependent rats. J Neurochem. 64: 247-252. 1995.
Calo G, Guerrini R, Salvadori S, Regoli D. Pharmacology of nociceptin and its
receptor: a novel terapeutic agent. Br. J. Pharmacol. 129(7): 1261-1283. 2000.
Cappendijk SLT, Hurd YL, Nylander I, van Ree JM, Terenius L. A heroin-, but not
cocaine-expecting, self administration state preferentially alters endogenous brain peptides. Eur. J
Pharmacol. 365: 175-182. 1999.
Cesarone CF, Bolognesi C, Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in
biological material using 33258 Hoechst. Anal.Biochem. 100: 188-197. 1979.
Bibliografia
Doktore-tesia
243
Cesselin F. Opioid and anti-opioid peptides. Fundam Clin. Pharmacol. 9: 409-433. 1995.
Chaillet P, Coulaud A, Zajac JM, Fournie-Zaluski MC, Costentin J, Roques BP. The
µ rather than de δ subtype of opioid receptors appears to be involved in the enkephalin induced
analgesia. Eur. J. Pharmacol. 101: 83-90. 1984.
Chaillet P, Marcais-Collado H, Costentin J, Yi CC, De la Baume S, Schwartz JC.
Inhibition of enkephalin metabolism and antinociceptive activity of bestatin, an aminopeptidase
inhibitor. Eur. J. Pharmacol., 86: 329-336. 1983.
Chang JY, Janak PH, Woodward DJ. Comparison of mesocorticolimbic neuronal responses
during cocaine and heroin self-administration in freely moving rats. J. Neurosci. 18: 3098-3115.
1998.
Chang KJ, Cuatrecasas P. Multiple opiate receptors: enkephalins and morphine bind to
receptors of diferent specificity. J. Biol. Chem. 254: 2610-2618. 1979.
Chang KJ, Miller RJ, Cuatrecasas M. Interaction of enkephalin with opiate receptors in intact
cultured cells. Mol. Pharmacol. 14: 961-970. 1978.
Chieng B, Bekkers JM. GABAB, opioid and α2 receptor inhibition of calcium channels in
acutely-dissociated locus coeruleus neurones. Br.J.Pharmacol. 127: 1533-1538. 1999.
Childers SR. Opioid receptor-coupled second messenger systems. Life Sciences. 48: 1991-2003.
1991.
Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D, Pacheco M, Sexton T, Ward S.
Opioid and cannabinoid receptor inhibition of adenylyl cyclase in brain. Ann Y Acad. Sci. 654: 33-
51. 1992.
Childers SR, Simantov R, Snyder SH. Enkephalin: radioinminoassay and radioreceptor
assay in morphine dependents rats. Eur J Pharmacol. 46: 289-293. (1979).
Bibliografia
Doktore-tesia
244
Christie MJ, Williams JT, North RA. Cellular mechanism of opioid tolerance: studies in single
brain neurons. Mol. Pharmacol. 32: 633-638. 1987.
Civelli O, Machida C, Bunzow J, Alber P, Hanneman E, Salon J, Bidlack J, Grandy
D. The next frontier molecular biology of the opioid system. The opioid receptors. Mol. Neurobiol.
1: 373-391. 1987.
Clement-Jones V, McLoughlin L, Lowry PJ, Besser GM, Rees LH, Wen HL.
Accupunture in heroin addicts; changes in met-enkephalin and beta-endorphin in blood and
cerebrospinal fluid. Lancet. 2: 380-383. 1979.
Comb M, Seeburg PH, Adelman J, Eiden L, Herbert E. Primary structure of the human
Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295, 663-666. 1982.
Constam DB, Tobler AR, Resinghel A, Kemler Y, Hersh LB, Fontana A. Puromycin
sensitive aminopeptidase: sequence and analysis, expression and functional characterization. J Biol
Chem. 270: 26931-26939. 1995.
Coven E, Ni Y, Winell KL, Chen J, Walker WH, Habener JF, Nestler EJ. Cell type-
specific regulation of CREB gene expression: mutational analisis of CREB promoter activity. J
Neurochem. 71: 1865-1874. 1998.
Coyle JT, Donald LP, Delong MR. Alzheimer’s disease; a disorder of cortical cholinergic
innervation. Science. 219: 1184-1189. 1983.
Cruciani RA, Dvorkin B, Morris SA, Crain SM, Makman MH. Direct coupling of opioide
receptors to both stimulatory and inhibitory guanine nucleotide-binding proteins in F-11
neuroblastoma-sensory neuron hybrid cells. Proc. Natl. acad. Sci. USA. 90(7): 3019-3023. 1993.
Cummins PM, O’Connor B. Pyroglutamyl peptidase: an overview of the three known
enzymatic forms. Bichim. Biophys. Acta 1429: 1-17. 1998.
Bibliografia
Doktore-tesia
245
Dando PM, Fortunato M, Strand GB, Sith TS, Barrett AJ. Pyroglutamyl-peptidase I:
cloning, sequencing, and characterisation of the recombinant human enzyme. Prot. Expr. and Purif.
28: 111-119. 2003.
Danielson PB, Hoversten MT, Fitzpatrick M, Schreck C, Akil H, Dores RM. Sturgeon
orphanin: A molecular "Fossil" that bridges the gap between the opioids and orphanin FQ/N. J.
Biol. Chem. 276:25. 22114-22119. 2001.
De Mello WC, Danser AH. Angiotensin II and the heart: on the intracrine renin-angiotensin
system. Hypertension. 35: 1183-1188. 2000.
Dhawan, BN, Cesselin F, Raghubir R, Reisine T, Bradley PB, Portoghese PS and
Hamon M.. International Union of Pharmacology. XII. Classification of Opioid Receptors.
Pharmacol. Rev. 48, 567 - 592. 1996.
Dresdner K, Burker LA, Orlowski M, Wilk S. Subcellular distribution of prolyl
endopeptidase and cation-sensitive neutral endopeptidase in rabbit brain. J. Neurochem. 36: 1151-
1156. 1982.
Dodd PR, Hardy JA, Bradford HF, Benett GW, Edwardson JA, Harding BN.
Metabolic and secretory processes in nerve-endings isolated from post-mortem brain. Neuroscience
Letters. 11: 87-92. 1979.
Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ. Acute and chronic opiate regulation of adenilate cyclase
in rat brain: specific effects in locus coeruleus. J. Pharmacol. Exp. Ther. 246: 1033-1039. 1988.
Delfs JM, Kong H, Mestek A, Chen Y, Yu L, Reisine T, Chesselet MF. Expression of
mu opioid receptor mRNA in rat brain: an in situ hybridisation study at the single cell level. J.
Comp. Neurol. 345: 46-68. 1994.
Bibliografia
Doktore-tesia
246
Dingledine R, Velentino RJ, Bostock E, King ME, Chang KJ. Downregulation of delta
but not mu opioid receptors in the hippocampal slice associated with loss of physiological response. Life
Sci. 33: 333-336. 1983.
Douglas WW. How do neurones secret peptides? Exocitosis and its consequences, including
synaptic vesicle formation, in the hypothalamo – neurohypophysial system. Prog. Brain Res. 39: 21-
39. 1973.
Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ. Acute and chronic opiate-regulation of adenilate cyclase
in brain: specific effects in locus coeruleus. J Pharmacol. Exp. Ther. 246: 1033-1039. 1988.
Dyer SH, Slaughter CA, Orth K, Moomaw CR, Hersh LB. Comparison of the soluble
and membrane-bound forms of the puromycin-sensitive enkephalin aminopeptidases from rat. J
Neurochem. 54: 547-554. 1990.
Elde R, Arvidsson U, Riedl M, Vulchanova L, Lee JH, Dado R, Nakano A,
Chakrabarti S, Zhang X, Loh HH. Distribution of neuropeptide receptors. New views of
peptidergic neurotransmission made possible by antibodies to opioid receptors. Ann. N. Y. Acad. Sci.
757:390-404. 1995.
Elzo J, Comas D, Laespada MT, Salazar L, Vielva I. La cultura de las drogas en los
jóvenes: Ritos y fiestas. Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco. 2000.
Escohotado A. Historia general de las drogas. Editorial Espasa. 1999.
Fan XL, Zhang JS, Zhang XQ, Yue W, Ma L. Differential regulation of beta-arrestin 1 and
beta-arrestin 2 gene expression in rat by morphine. Neuroscience 117: 383-389. 2003.
Fernández D, Valdivia A, Irazusta J, Ochoa C, Casis L. Peptidase activities in human
semen. Peptides. 23: 461-468. 2002.
Fernández-Espejo E. ¿Cómo funciona el nucleus accumbens?. Rev Neurol. 30: 845-849.
2000.
Bibliografia
Doktore-tesia
247
Fernández-Espejo E. Bases neurobiológicas de la drogadicción. Rev. Neurol. 34: 659-654.
2002.
Florez J. Farmacología humana. Ed. Masson (3ª ed). Barcelona (1998).
Foote SL, Bloom FE, Aston-Jones G. Nucleus locus coeruleus: new evidece of anatomical
and physiological specificity. Physiol. Rev. 63: 844-914. 1983.
Foulon T, Cadel S, Cohen P. Aminopeptidase B (EC 3.4.11.6). Int. J. Biochem. And
Cell. Biol. 31: 747-750. 1998.
Fournié-Zaluski MC, Perdrisot R, Gacel G, Swerts JP, Roques BP, Schwartz JC.
Inhibitory potency of various peptides on enkephalinase activity from mouse estriatum. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 91: 130-135. 1979.
Fox-Threlkeld J.A.E.T, Daniel EE, Christnick, F, Hruby VJ, Cipris S, Woskowska
Z. Identification of mechanisms and sites of action of mu and delta receptor activation in the canine
intestine. J.Pharmacol. Exp. Ther. 268:689-700. 1994.
Fratta W, Yang HY, Hong J, Costa E. Stability of Met-enkephalin content in brain
structures of morphine-dependent or foot shock-stressed rats. Nature. 268: 452-453. 1977.
Freedman NJ, Lefkowitz RJ. Desensitization of G-protein coupled receptors. Recent. Prog.
Horm . Res. 51: 319-353. 1996.
Frey HJ, Riekkinen PJ, Rinne Uk, Arstila AU. Peptidase activity of myelin during the
myelination period in guinea-pig brain. Brain Res. 22: 243-248. 1970.
Frost JJ, Wagner H.N.J., Dannals RF, Ravert HT, Links JM, Wilson AA, Burns HD,
Wong DF, McPherson RW, Rosenbaum AE, Kuhar MJ, Snyder SH. Imaging opiate
receptors in the human brain by positron tomography. J. Comput. Asist. Tomo. 9: 231-236.
1985.
Bibliografia
Doktore-tesia
248
Fukuda K, Kato S, Mori K, Nishi M, Takeshima H, Iwabe N, Myiata T, Houtani T,
Sugimoto T. cDNA cloning and regional distribution of a novel member of the opioid receptor
family. FEBS lett. 343: 42-46. 1994.
Fukunaga Y, Inoue N, Miyamoto M, Kishioka S, Yamamoto H. Effects of peptidase
inhibitors, [D-Ala2. Met5]-enkephalinamide and antiserum to methionine-enkephalin microinjected
into the caudal periacueductal gray on morphine withdrawal in rats. Jpn J Pharmacol. 78: 455-
461. 1998.
Gakh O, Cavadini P, Isaya O. Mitochondrial processing peptidases. Biochim
Biophys Acta. 1592: 63-77. 2002.
Gandarias JM, Casis O, Echevarria E, Irazusta J, Casis L. Pyroglutamyl peptidase I
activity in the cortex of the cat brain during development. Int J Dev Biol. 36: 355-337. 1992.
Gandarias JM, Gil J, Valdivia A, Larrinaga G, Artola D, Casis L. Subcellular distribution
of pyroglutamyl-peptidase activity in the developing rat cerebellum. Dev. Neurosci. 22: 264-27.
2000.
Gandarias JM, Irazusta J, Fernández D, Varona A, Casis L. Developmental changes of
pyroglutamyl-peptidase I activity in several regions of the female and male rat brain. Int J Neurosci.
77: 53-60. 1994.
Gandarias JM, Irazusta J, Gil J, Gallego M, Casis O, Casis L. Subcellular analysis of tyr-
aminopeptidase activities in the developing rat cerebellum. Dev Brain Res. 99: 66-71. 1997.
Gandarias JM, Irazusta J, Silio M, Saitua N, Gil J, Casis L. Soluble and membrane-bound
pyroglutamyl-peptidase I activity in developing cerebellum and brain cortex. Int J Dev Biol. 42: 103-
106. 1998.
García-Sevilla JA. Monografías de neurociencias: Raceptores para neurotransmisores.
Ediciones en Neurociencias. Barcelona. 1996.
Bibliografia
Doktore-tesia
249
Garzón J, Rodriguez-Diaz M, López-Fando A, Sánchez-Blázquez P. RSG9 proteins
facilitate acute tolerance to mu-opioid effects. Eur J Neurosci. 13: 801-811. 2001.
Garzón J, Rodriguez-Diaz M, López-Fando A, García-España A, Sánchez-Blázquez
P. Glucosilated phosducin-like protein long regulates opioid receptor function in mouse brain.
Neuropharmacology. 42:813-828. 2002.
Ghan LG, Sevarino KA. Prepothyrotropin-releasing hormone mRNA in the rat central grey is
strongly and presistenly induced during morphine withdrawal. Neuropeptides. 30: 207-212. 1996.
Gibson AM, McDermott JR, Lauffart B, Mantle D. Specificity of action of human brain
alanyl aminopeptidase on leu-enkephalin and dynorphin-related peptides. Neuropeptides. 13: 259-
262. 1989.
Gibson AM, Biggins JA, Lauffart B, Mantle D, McDermott JR. Human brain leucyl
aminopeptidase: Isolation, characterization and specificity against some neuropeptides.
Neuropeptides. 19: 163-168. 1991.
Giros B, Gros C, Solhonne B, Schwartz JC. Characterization of aminopeptidases
responsible for inactivating endogenous met-enkephalin in brain slices using peptidase inhibitors and
anti-aminopeptidase M antibodies. Mol. Pharmacol. 29: 281-287. 1985.
Goldstein A, Tachibana S, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood L. Dynorphin (1-13), an
extraordinary potent opioid peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 6666-6670. 1979.
Goldstein A, Fischli W, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood I. Porcine pituitary
dynorphin: Complete amino acid secuence of the biologically active heptadecapeptide. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 78: 7219-7223. 1981.
Goossens F, De Meester I, vanhoof G, Scharpé S. Distribution of prolyl oligopeptidase in
human peripheral tissues and body fluids. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34: 17-22. 1996.
Bibliografia
Doktore-tesia
250
Graham J, Ford TC. Marker enzymes and chemical assays for the analysis of subcelular
fractions. In: Rickwood, D. Ed., Centrifugation: A practical aproach. 2nd Edition. IRL
Press, Washimgton DC, pp. 307- 333. 1984.
Gray EG, Whittaker VP. The isolation of nerve endings from rat brain. J. Anat., 96: 79-88.
1962.
Greenberg LJ. Fluorimetric measurement of alkaline phosphatase and aminopeptidase activities
in the order of 10-14 mole. Biochem Biophys. Res. Commun., 9: 430-435. 1962.
Griffiths EC, Baris C, Visser TJ, Klootwijk W. Tyrotroping-releasing hormone inactivation
by human postmortem in brain. Reg. Pept. 10: 145-155. 1985.
Gros C, Giros B, Schwartz JC. Identification of aminopeptidase M as an enkephalin-
degrading enzyme in rat cerebral membranes. Biochemestry. 24: 2179-2185. 1985.
1Gudehithlu KP, Duchemin AM, Tejwani GA, Neff NH, Hadjiconstantinou M.
Preproenkephalin and methionine-enkephalin increase in mouse striatum after 1-methyl-4-phenyl-
1,2,3,6-tetrahydropyridine treatment. J Neurochem. 56: 1043-1048. 1991.
2Gudehithlu KP, Tejwani GA, Bhargava HN. Beta-endorphin and methionine-enkephalin
levels in discrete brain regions, spinal cord, pituitary gland and plasma of morphine tolerant-dependent
and abstinent rats. Brain Res. 553: 284-290. 1991.
Grdisa M, Vitale L. Types and localization of aminopeptidases in different human blood cells.
Int J Biochem. 23: 339-345. 1991.
Grudt TJ, Williams JT. Kappa-opioid receptors also increase potassium conductance. Proc.
Natl. acad. Sci. USA. 90(23): 11429-32. 1993.
Guitart X, Nestler EJ. Identification of morphine and cyclic AMP-regulated phosphoproteins
(MARPPs) in the locus coeruleus and other regions of the rat brain: regulation by acute and chronic
morphine. J Neurosci. 9: 4371-4387. 1989.
Bibliografia
Doktore-tesia
251
Guitart X, Thompson MA, Mirante GK, Greenberg NE, Nestler EJ. Regulation of
cyclic AMP response element-binding protein (CREB) phosphorylation by acute and chronic morphine
in the rat locus coeruleus. J Neurochem. 58: 1168-1171. 1992.
Haffmans J, Walsum MV, van Amsterdam JC, Dzoljic MR. Phelorphan, an inhibitor of
enzymes involved in the biodegradation of enkephalins, affected the withdrawal symtoms in chronic
morphine-dependent rats. Neuroscience. 22: 233-266. 1987.
Haines DH. Neuroanatomy: an atlas of structures, sections and systems. Williams and
Wilkins, Baltimore. 1995.
Han NL, Bian ZP, Han JS. Synergistic effect of cholecystokinin octapeptide and angiotensin II
in reversal of morphine induced analgesia in rats. Pain. 85: 465-469. 2000.
Harris GC, Williams JT. Transient homologous mu-opioid receptor desensibilization in rat locus
coeruleus neurons. J Neurosci. 11: 2574-2581. 1991.
Harrison LM, Kastin AJ, Zadina JA. Opiate tolerance and dependence: Receptors, G-Proteins
and Antipopiates. Peptides. 19(9): 1603-1630. 1998.
Hayward MD, Duman RS, Nestler EJ. Induction of the c-fos protooncogene during opiate
withdrawal in the locus coeruleus and other regions of rat brain. Brain. Res. 525: 256-266. 1990.
Hersh LB. Characterization of membrane-bound aminopeptidases from rat brain: identificationof
the enkephalin-degrading aminopeptidase. J. Neurochem. 44: 1427-1435. 1985.
Hersh LB. Degradation of enkephalins. The search for a enkephalinase. Moll Cell. Biochem.
47: 35-43. 1982.
Hersh LB, Aboukhair N, Watson S. Inmunohistochemical localization of aminopeptidase M
in rat brain and perphery: relationship of enzyme localization and enkephalin metabolism. Peptides.
8: 523-532. 1987.
Bibliografia
Doktore-tesia
252
Ho WKK, Wan CC, Chan WY, Cheung WK, Kwok KY, Wen HL. Morphine addiction
does not alter brain or pituitary unmunoreactive dynorphin level. Pharmacol Res Comm.14: 861-
866. 1982.
Höllt V, Przewlocki R, Herz A. β-endorphin-like inmunoreactivity in plasma, pituitaries and
hypothalamus of rats following treatment with opiates. Life Sci. 23: 1057-1066. 1978.
Holmstrand J, Gunne LM. Application of a synthetic enkephalin analogue durin heroin
withdrawal. Pharmakopsychiatr. Neuropsychopharmakol. 13: 68-71. 1980.
Hopsu VK, Kantonen UM, Glenner GG. A peptidase from rat tissues selectively
hydrolysing N-terminal arginine and lysine residues. Life Sci 3: 1449-1453. 1964.
Hopsu VK, Mäkinen KK, Glenner GG. Characterization of aminopeptidase B: substrate
especificity and effector studies. Arch. Biochem. Biophys. 144: 567-575. 1966.
Houben H, Denef C. Bioactive peptides in anterior pituitary cells. Peptides. 15: 547-582.
1994.
Houdi AA, Van Loon GR. Haloperidol-induced increase in striatal concentration of the
tripeptide, tyr-gly-gly, provides an index of increased enkephalin release in vivo. J Neurochem. 54:
1360-1365. 1990.
Hughes J, Smith TW, Kosterlitz HW, Fothergill LA, Morgan BA, Morris HR.
Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature.
258: 541-546. 1975.
Hughes J. Opioid peptides: Introduction. Br. Med. Bull. 39: 17-24. 1983.
Hui KS, Wang YJ, Lajtha A. Purification and characterization of an enkephalin
aminopeptidase from rat brain membranes. Biochemestry. 22: 1062-1067. 1983.
Bibliografia
Doktore-tesia
253
Hui KS, Wang YJ, Tsai H, Wong KH, Lajtha A. The effect of naloxone on enkephalin
catabolism. Peptides. 1: 89-94. 1981.
Hsia J, Moss J, Hewlett EL, Vaughan M. Requirement for both choleragen and pertussis
toxin to obtain maximal activation of adenylate cyclase in cultured cells. J. Biol. Chem. 229: 1086-
1090. 1984.
Idänpään-Heikkila JJ, Rauhala P, Tuominen RK, Tuomainen P, Nikolai Zotolov,
Männistö PT. Morphine withdrawal alters pituitary hormone secretion, brain endopeptidase activity
and brain monoamine metabolism in the rat. Pharmacology and toxicology. 78: 129-135.
1996.
Inoue M, Ueda H. Protein kinase C-mediated acute tolerance to peripheral mu-oppioid in the
bradykinin-nociception test in mice. J Pharmacol. Exp. Ther. 293: 662-669. 2000.
Irazusta J, Silveira PF, Gil J, Varona A, Casis L. Effects of hydrosaline treatments on prolyl
endopeptidase activity in rat tissues. Regul. Pept. 101: 141-147. 2001.
Ishino T, Ohtsuki S, Homma K, Katori S. cDNA cloning of mouse prolyl endopeptidase
and its involvement in DNA synthesis by swiss 3T3 cells. J Biochem. 123: 540-545. 1998.
Iversen LL. Overview: peptides in the nervous system. “Neuropeptides and their
peptidases”-en. AJ Turner Ed. Ellis Horwood Ltd., Chichester, U.K. 1987.
Kakidani H, Furutani Y, Takahashi H, Noda M, Morimoto Y, Hirose T, Asai M,
Inayama S, Nakanishi S, Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-
endorphin/dynorphin precursor. Nature 298, 245-249. 1982.
Kalwant S, Porter AG. Purification and characterization of human brain prolyl endopeptidase.
Biochem. J. 276: 237-244. 1991.
Kato T, Okada M, Nagatsu T. Distribution of post-proline cleaving enzyme in human brain
and the peripheral tissues. Moll. Cell. Biochem. 32: 117-121. 1980.
Bibliografia
Doktore-tesia
254
Kelly JA, Neidle EL, Neidle A. An aminopeptidase from mouse brain cytosol that cleaves N-
terminal acidic aminoacid residues. J. Neurochem. 40: 1727-1734. 1983.
Kenny AJ. Cell surface peptidases are neither peptide nor organ specific. Trends Biochem. Sci.,
11: 40-42. 1986.
Kenny AJ, Bourne A. Cellular reorganisation of membrane peptidases in Wallerian
degeneration of pig peripheral nerve. J Neurocytol. 20: 875-885. 1991.
Kettmann U, Humbel B, Holzhausen HJ, Bahn H, Aurich H. Inmunoelectron
microscopion localization of microsomal alanine aminopeptidase. Acta Histochem. 93: 333-340.
1992.
Kimes AS, Vaupel DB, London ED. Attenuation of some signs of opioid withdrawal by
inhibitors of nitric oxide synthase. Psychpharmacology. 112: 521-524. 1993.
Kimura A, Matsui H, Takahashi T. Expression and localization of prolyl oligopeptidase in
mouse testis and its posible involvement in sperm motility. Zoolog. Sci. 19: 93-102. 2002.
Kioussi C, Matsas R. Endopeptidase-24.11, a cell-surface peptidase of central nervous system
neurons, is expressed by Schwann cells in the pig peripheral nervous system. J Neurochem. 57: 431-
440. 1991.
Kish SJ, Kalasinsky KS, Derkatch P, Schmunk GA, Guttman M, Ang L, Adams V,
Furukawa Y, JW Haycock. Striatal dopaminergic and serotoninergic markers in human
heroin users. Neuropsychopharmacology. 24: 561-567. (2001).
Köening JFR, Klippel RA. The rat brain: a stereoataxic atlas of the forebrain and lower parts
of the brainstem. Robert E. Grieger Ed. 1970.
Kohno H, Kanda S, Kanno T. Immunoaffinity purification and characterization of leucine
aminopeptidase from human liver. J. Biol. Chem. 261: 10744-10748. 1986.
Bibliografia
Doktore-tesia
255
Konkoy CS, Waters SM, Davis TP. Subchronic haloperidol administration decreases
aminopeptidase N activity and [Met5] enkephalin metabolism in rat striatum and cortex. Eur J
Pharmacol. 297: 47-51. 1996.
Koob GF, Nestler EJ. The neurobiology of drug addiction. J Neuropsychiatry and Clinical
Neurosciences. 9: 482-497. 1997.
Koob GF, Sanna PP, Bloom FE. Neuroscience of addiction. Neuron. 21: 467-476. 1998.
Korányi L, Walentin S, Hepp J, Endröczi E. Changes of dipeptidyl peptidase (DP IV)
activity in the T lymphocites of rats following administration of ACTH, dexametasone and opiates.
Exp. Clin. Endocrinol. 93: 61-68. 1989.
Kosterlitz HW, Waterfield AA. In vitro models in the study of structure-activity relationships
of narcotic analgesics. Annu. Rev. Pharmacol. 15:29-47. 1975.
Kovoor A, Celver JP, Wu A, Chavkin C. Agonist induced homologous desensitization of mu-
opioid receptors mediated by G-protein-coupled receptor kinases is dependent on agonis efficacy. Mol.
Pharmacol. 54: 704-711. 1998.
Kovoor A, Douglas JH, Chavkin C. Agonist-induced desensitization of the mu-opioid
receptor coupled potassium channel (GRK1). J. Biol. Chem. 270: 589-595. 1995.
Krueger BK, Forn J, Greengard P. Despolarization-induced phosphorilation of specific
proteins mediated by calcium ion influx, in rat brain synaptosomes. J. Biol. Chem., 252 (8): 2764-
2773. 1979.
Kurauchi O, Mizutani S, Okano K, Narita O, Tomoda Y. Purification and
characterization of human placental microsomal aminopeptidase: immunological difference between
placental microsomal aminopeptidase and pregnancy serum cystyl-aminopeptidase. Enzyme. 35: 197-
205. 1986.
Bibliografia
Doktore-tesia
256
Lane-Ladd SB, Pineda J, Boundy VA, Pfeuffer T, Krupinski J, Aghajanian GK,
Nestler EJ (1997). CREB (cAMP response element binding protein) in the locus coeruleus:
biochemical, physiological and behavioral evidence for a role in opiate dependence. J Neurosci. 17:
7890-7901. 1997.
Legradi G, Rand WM, Hiltz S, Nillni EA, Jackson IM, Lechan RM. Opiate withdrawal
increases proTRH gene expression in the ventrolateral column of the midbrain periacueductal grey.
Brain Res. 729: 10-19. 1996.
Lemaire S, Magnan J, Regoli D. Rat vas deferens: A specific bioassay for endogenous opioid
peptides. Br. J. Pharmacol. 64: 327-329. 1978.
Leshner AI. Drug abuse and addiction treatment research. Archives of General Psychiatry.
54: 691-694. 1997.
Li CH, Chung D. Isolation and structure of an untriakontapeptide with opiate activity from
camel pituitary glands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73: 1145-1148. 1976.
Lightman SL, Young WS. Changes in hypothalamic preproenkephalin A mRNA following
stress and opiate withdrawal. Nature. 328: 643-645. 1987.
Ling GSF, Mc Leod JM, Lee S, Lochart SH, Pasternak GW. Separation of morphine
analgesia from physical dependence. Science. 226: 462-464. 1984.
Ling GSF, Spiegel K, Lochart SH, Pasternak GW. Separation of morphine’s analgesic and
respiratory depression: evidence for different receptor mechanisms. J. Pharmacol. Exp. Ther. 232:
149-155. 1985.
Ling GSF, Spiegel K, Nishimura SL, Pasternak GW. Dissociation of morphine’s analgesic
and respiratory depressant actions. Eur. J. Pharmacol. 86: 487-488. 1983.
Bibliografia
Doktore-tesia
257
Lord J, Waterfield A, Hughes J, Kosterlitz H, 1977. Endogenous opioid peptides: Multiple
agonists and receptors. Nature. 267: 495-499. 1977.
Lorenzo P, Ladero JM, Leza JC, Lizasoain I. Drogodependencias. Editorial
Panamericana. 1999.
Lynch DR, Snyder SH. Neuropeptides: multiple molecular forms, metabolic pathways and
receptors. Annu. Rev. Biochem. 55: 773-779. 1986.
Maldonado R, Blendy JA, Tzavara E, Gass P, Roques BP, Hanoune J, Schültz G.
Reduction of morphine abstinence in mice with a mutation in the gene encoding CREB. Science.
273: 657-659. 1996.
Maldonado R, Derrien M, Noble F, Roques BP. Association of the peptidase inhibitor RB
101 and a CCK-B antagonist strongly enhances antinociceptive responses. Neuroreport 4: 947-
950. 1993.
Maldonado R, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Attenuation of the morphine withdrawal
syndrome by inhibition of catabolism of endogenous enkephalins in the periacueductal gray matter.
Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 345: 466-472. 1992.
Malfroy B, Swerts JP, Guyon A, Roques BP, Schwartz JC. High-affinity enkephalin-
degrading peptidase in mouse brain and its enhanced activity following morphine. Nature. 276: 523-
526. 1978.
Mansour A1, Fox CA, Burke S, Meng F, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. Mu,
delta, and kappa opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: an in situ hybridisation study.
J. Comp. Neurol. 350(3): 412-438. 1994.
Mansour A2, Fox CA, Burke S, Meng F, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. Mu-
opioid receptor mRNA expression in the rat CNS: comparison to mu-receptor binding. Brain Res.
643: 245-265. 1994.
Bibliografia
Doktore-tesia
258
Mantle D, Falkous G, Ishiura S, Blanchard PJ, Perry EK. Comparison of proline
endopeptidase activity, in brain tissue from normal cases and cases with Alzheimer’s disease, Lewy
body dementia, Parkinson’s disease anh Hungtinton’s disease. Clin. Chim. Acta. 249: 129-139.
1996.
Maroux S. Structural and topological aspects. “Mammalian Ectoenzymes”. 15-45. Kenny
AJ eta Turner AJ eds. Elsevier Science publisher, Amsterdam, The Netherlands. 1987.
Martin WR, Eades C, Thompson J, Huppler R, Gilbert P. The effects of morphine and
nalorphine-like drugs in nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog. J. Pharmacol.
Exp. Ther. 197: 517-532. 1976.
Matsas R, Stephenson SL, Hryszko J, Kenny AJ, Turner AJ. The metabolism of
neuropeptides: phase separation of synaptic membrane preparations with Triton X-114 reveals the
presence of aminopeptidase N. Biochem. J. 231: 445-449. 1985.
Mayas MD, Ramírez-Expósito MJ, García MJ, Ramírez M, Martínez-Martos JM.
Ethanol modifies differently aspartyl- and glutamyl-aminopeptidase activities in mouse frontal cortex
synaptosomes. Brain. Res. Bull. 57: 195-203. 2002.
Mayas MD, Ramírez-Expósito MJ, García MJ, Ramírez M, Martínez-Martos JM.
Influence of alcohol on brain aminopeptidases. An in vitro study. Rev. Neurol. 32: 1031-1041.
2001.
McLellan S, Dyer SH, Rodriguez G, Hersh LB. Studies on the tissue distribution of the
puromycin-sensitive enkephalin-degrading aminopeptidases. J. Neurochem. 51: 1552-1559. 1988.
Melzig MF, Heder H, Siems EW, Zipper J. Stimulation of endothelial angiotensin-converting
enzyme by morphine via non-opioid receptor mediated processes. Pharmazie. 53: 634-637. 1998.
Mentzel S, Dijkman HB, Van Son JP, Koene RA, Assmann KJ. Organ distribution of
aminopeptidase A and dipeptidyl peptidase IV in normal mice. J. Histochem. Cytochem. 44:
445-461. 1996.
Bibliografia
Doktore-tesia
259
Meunier JC, Mollereau C. Toll L. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid
receptor-like ORL-1 receptor. Nature. 377: 532-535. 1995.
Mocchetti I, Costa E. Down regulation of hypothalamic proopiomelanocortin system during
morphine tolerance. Clin Neuropharmacol. 4: 125-127. 1986.
Mocchetti I, Ritter A, Costa E. Down-regulation of proopiomelanocortin synthesis and beta-
endorphin utilization in hypothalamus of morphine-tolerant rats. J Mol Neurosci. 1: 33-38. 1989.
Mogenson GJ, Jones DL, Jim CY. From motivation to action: functional interface between the
limbic system and the motor system. Prog. Psychobiol. 14: 607-697. 1980.
Morain P, Lastage P, De Nanteuil G, Jochemsen R, Robin JL, Guez D, Boyer PA. S
17092: a prolyl endopeptidase inhibitor as potential therapeutic drug for memory imparment.
Preclinical and clinical studies. CNC Drug Rev. 8: 31-52. 2002.
Mosnaim AD, Puente J, Saavedra R, Diamond S, Wolf ME. In vitro human plasma
leucine(5)-enkephalin degradation is inhibited by a select number of drugs with the phenotiazine
molecule in their chemical structure. Pharmacology. 67: 6-13. 2003.
Murphy NP, Ly HT, Maidment NT. Intracerebroventricular orphanin FQ/nociceptin
supresses dopamine release in the nucleus accumbens of anaesthetized rats. Neuroscience 75: 1-4.
1996.
Naghettini AV, Nogueira pC, Juliano M, Bueno AA, Casarini DE, de Abreu
Carvalhaes JT. Tubular urinary enzymes in acute post-infectous glomerulonephritis. Pediatr.
Nephrol. 16: 719-722. 2001.
Nakanishi N, Inoue A, Kita T. Nucleotide sequence of clones cDNA for bovine corticotropin-
beta-lipotropin precursor. Nature 278. 1979.
Nestler EJ. Molecular mechanisms of drug addiction. J. Neurosci. 12: 2439-2450. 1992.
Bibliografia
Doktore-tesia
260
Nestler EJ. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nature Reviews
Neuroscience. 2: 119-128. 2001.
Nestler EJ, Aghajanian GK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 278: 58-63.
1997.
Nestler EJ, Tallman JF. Chronic morphine treatment increases cyclic AMP-dependent protein
kinase activity in the rat locus coeruleus. Mol. Pharmacol. 33: 127-132. 1988.
Nieto MM, Wilson J, Walker J, Benavides J, Fournié-Zaluski MC, Roques BP,
Noble F. Facilitation of enkephalins catabolism inhibitor-induced antinociception by drugs classically
used in pain management. Neuropharmacology. 41: 496-506. 2001.
Nieuwenhuys R, Voogd J, van Huijzen C. The human nervous system: a sinopsis atlas.
Springer. Berlin. 1988.
Nillni EA, Lee A, Legradi G, Lechan RM. Effect of precipitated morphine withdrawal on
post-translational processing of prothyrotropin releasing hormone (proTRH) in the ventrolateral column
of the midbrain periacueductal grey. J Neurochem. 80: 874-884. 2002.
Nishimura SL, Recht LD, Pasternak GW. Biochemical characterization of high-affinity 3H-
opioid binding. Further evidence for µ1 sites. Mol. Pharmacol. 25: 29-37. 1984.
Nishizawa Y, Kurihara T, Takahasi Y. Spectrophotometric assay, solubilization and
purification of brain 2’-3’-cyclic nucleotide-3’-phosphodiesterase. Biochem J. 191: 71-82. 1980.
Noble F, Banisadr G, Jardinaud F, Popovici T, Lai-Kuen R, Chen H, Bischoff L,
Parsadaniantz SM, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. First discrete autoradiographic
distribution of aminopeptidase N in various structures of rat brain and spinal cord using the selective
iodinated inhibitor [125I] RB 129. Neuroscience. 105: 479-488. 2001.
Bibliografia
Doktore-tesia
261
Noble F, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Enkephalin catabolism inhibitors and antalgics
of the future: from preclinical research to clinical trials. Therapie. 54: 121-133. 1999.
Noble F, Smadja C, Valverde O, Maldonado R, Coric C, Turcaud S, Fournié-Zaluski
MC, Roques BP. Pain-supressive effects on various nociceptive stimuli (thermal, chemical, electrical
and inflamatory) of the first orally active enkephalin-metabolizing enzyme inhibitor RB120. Pain. 73:
383-391. 1997.
North RA. Opioid receptor types and membrane ion channels. Trends in Neurosci. 9: 114-
117. 1993.
North RA, Williams JT, Suprenant A, Christie MJ. Mu and delta receptors belong to a
family of receptors that are coupled to potassium chanels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 5487-
5491. 1987.
O’Connor B, O’Cuinn G. Purification and kinetic studies on a narrow specificity synaptosomal
membrane pGlu-aminopeptidase from guinea-pig brain. 144: 271-278. 1985.
O’Cuinn G, O’Connor B, Elmore M. Degradation of thyrotropin-releasing hormone and
luteinizing hormone by enzymes of brain tissue. J Neurochem. 54: 1-13. 1990.
O’Leary RM, O’Connor B. Identification and localisation of a synaptosomal membrane prolyl
endopeptidase from bovine brain. Eur. J. Biochem. 227: 277-283. 1995.
O’Leary RM, Gallagher SP, O’Connor B. Purification and characterizaton of a novel
membrane-bound form of prolyl endopeptidase from bovine brain. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 28:
441-449. 1996.
Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. Design of specific inhibitors of angiotensine-converting
enzyme: New class of orally active antihypertensive agents. Science, 196: 441 – 444. 1977.
Bibliografia
Doktore-tesia
262
Ortega-Alvaro A, Chover-González AJ, Lai-Kuen R, Mico JA, Giber-Rahola J,
Fournié-Zaluski MC, Roques BP, Maldonado R. Antinociception produced by the peptidase
inhibitor, RB101, in rats with adrenal medullary transplant into the spinal cord. Eur J Pharmacol.
356: 139-148. 1998.
Ozaita A, Escribá PV, Vebtanyol P, Murga C, Mayor F, García-Sevilla JA. Regulation
of G-protein coupled receptor kinase 2 in brains of opiate-treated rats and human opiate addicts. 70:
1249-1257. 1998.
Paik SH, Camarao GC, Bauer JA, Leite PE, Oliveira ES, Camargo AC, Farges RC.
Effects of morphine withdrawal syndrome on endo-oligopeptidase (EC 3.4.22.19) activity. Eur J
Pharmacol. 253: 101-106. 1994.
Palczewski K, Benovic JL. G-protein coupled receptor kinases. Rends Biochem Sci. 16: 387-
391. 1991.
Pasternak GW. Múltiple morphine and enkephalin receptors: Biochemical and pharmacological
aspects. Ann. NY. Acad. Sci. 467: 130-139.
Peckys D, Landwehrmeyer GB. Expression of mu, kappa, and delta opioid receptor
messenger RNA in the human CNS: a 33P in situ hybridization study. Neuroscience. 88(4):
1093-1135. 1999.
Pert C, Pert A, Chang JK, Fong BTW. [D-Ala2-] – Met-enkephalinamide: A potent, long-
lasting synthetic pentapeptide analgesic. Science. 194: 330332. 1976.
Pert C, Snyder S. Opiate receptor; demonstration in nervous tissue. Science. 179: 1011-1014.
1973.
Pilapil C, Welner, Magnan J, Gauthier S, Quirino R. Autoradigraphic distribution of
multiple classes of opioid receptor binding sites in human forebrain. Brain. Res. Bull. 19: 611-615.
1987.
Bibliografia
Doktore-tesia
263
Pineda-Ortiz Joseba. Bases neurobiológicas y clínicas de la dependencia a opiáceos. Cuadernos
de Ciencias Médicas, Osasunaz-4, Eusko Ikaskuntza. 159-176. 2001.
Pommier B, Beslot F, Simon A, Pophillat M, Matsui T, Dauge V, Roques BP, Noble
F. Deletion of CCK2 receptor in mice results in an upregulation of the endogenous opioid system. J
Neurosci. 22: 2005-2011. 2002.
Porter JN, Hewitt RI, Hesseltine CW, Krupka G, Lowery JA, Wallace WS, Bohonos
N, Williams JH. Antibiot. and Chemotherapy. 2: 409. 1952.
Propst F, Hamprecht B. Opioids, noradrenaline and GTP analogs inhibit cholera toxin
activated adenylate cyclase in neuroblastoma x glioma hybrid cells. J. Neurochem. 36: 580-588.
1981.
Przewlocki R, Höllt V, Duka T, Kleber G, Gramsch C, Haarmann I, Herz A. Long-
term morphine treatmen decreases endorphin levels in rat brain and pituitary. Brain Res. 174: 357-
361. 1979.
Punch LJ, Self DW, Nestler EJ, Taylor JR. Opposite modulation of opiate withdrawal
behaviors on microinfusion of a protein kinase A inhibitor versus activator into the locus coeruleus or
periacueductal grey. J Neurosci. 17: 8520-8527. 1997.
Ramarao P, Bhargava HN. Effect of tyrotropin releasing hormone in the development of
tolerance to the analgesic and hyperthermic actions of morphine in rat. Neuropeptides. 15: 213-
217. 1990.
Ramírez-Expósito Mj, Martínez JM, Prieto I, Alba F, Ramírez M. Comparative
distribution of glutamyl and aspartyl aminopeptidase activities in mouse organs. Horm. Metab. Res.
32: 161-163. 2000.
Rasmussen K, Aghajanian GK. Withdrawal-induced activation of locus coeruleus neurons in
opiate-dependent rats: attenuation by lesions of the nucleus paragigantocellularis. Brain Res. 505:
346-350. 1989.
Bibliografia
Doktore-tesia
264
Re RN. The origins of intracrine hormone action. Am J Med Sci. 323: 43-48. 2002.
Re RN. The intracrine hypothesis and intracellular peptide hormone action. Bioessays. 25: 401-
409. 2003.
Reaux A, Fournie-Zaluski MC, David C, Zini S, Roques BP, Corvol P, Llorens-
Cortes C. Aminopeptidase A inhibitors as potential central antihypertensive agents. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 96: 13415-13420. 1999.
Reche I, Ruiz-Gayo M, Fuentes JA. Inhibition of opioid-degrading enzymes potentiates
delta9-tetrahydrocannabinol-induced antinociception in mice. Neuropharmacology. 37: 215-222.
1998.
Reddy TL, Weber MM. Solubilization, purification and characterization of succinate
dehidrogenase from membranes of mycobacterium phlei. J. Bacteriol. 167: 1-6. 1986.
Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A. Orphanin FQ: a neuropeptide that activates
an opioid-like G-potein-coupled receptor. Science. 270: 792-794. 1995.
Reinscheid RK, Nothacker H, Civelli O. The orphaninFQ/nociceptin gene: structure, tissue
distribution of expression and functional implications obtained from knockout mice. Peptides 2000.
21(7): 901-906. 2000.
Relton JM, Gee NS, Matsas R, Turner AJ, Kenny AJ. Purification of endopeptidase 24.11
(enkephalinase) from pig brain by inmunoadsorbent chromatography. Biochem. J. 215: 519-523.
1983.
Romualdi P, Landuzzi D, D’addario C, Candeletti S. Modulation of proorphanin FQ/N
gene in the rat of mesocorticolimbic system. Neuroreport. 13: 645-648. 2002.
Romualdi P, Lesa G, Ferri S. Chronic opiate agonists down-regulate prodynorphin gene
expression in rat brain. Brain Res. 563: 132-136. 1991.
Bibliografia
Doktore-tesia
265
Roques BP, Fournie-Zaluski, Soroca E, Lecomte JM, Malfroy B, Llorens C,
Schwartz JC (1980). The enkephalinase inhibitor tiorphan shows antinociceptive activity in mice.
Nature, 288: 286-288. 1980.
Roques BP, Noble F. Dual inhibitors of enkephalin-degrading enzymes (neutral endopeptidase
24.11 and aminopeptidase N) as potential medications in the management of pain and opioid
addiction. NIDA Res Monogr. 147: 104-145. 1995.
Roques BP, Noble F, Fournie-Zaluski MC. Endogenous opioid peptides and analgesia. In
“Opioids in pain control. Basic and clinical aspects”. Ed. Stein C. Cambridge University
Press, 1999.
Rothman RB. A review of the role of anti-opioid peptides in morphine tolerance and dependence.
Synapse. 12: 129-138. 1992.
Safavi A, Hersh LB. Degradation of dynorphin-related peptides by the puromycin-
sensitive aminopeptidase and aminopeptidase M. J. Neurochem. 65: 389-395. 1995.
Santillán R, Hurle MA, Armijo JA, De los mozos R, Florez J. Nimodipine-enhanced
opiate analgesia in cancer patients requiring morphine dose escalation: a double-blind, placebo-
controlled study. Pain. 76: 17-26. 1998.
Saria A, Hauser KF, Traurig HH, Turbek CS, Hersh L, Gerard C. Opioid-related
changes in nociceptive threshold and in tissue levels of enkephalins after target disruption of the gene for
neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) in mice. Neuroscience Letters. 234: 27-30. 1997.
Sharma SK, Niremberg M, Klee WA. Morphine receptors as regulators of adenylate cyclase
activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 590-594.
Scharrer B. Facts and trends. Gen. Comp. Endocrinol. 34:50-62. 1978.
Bibliografia
Doktore-tesia
266
Schmidt P, Schmolke C, Musshoff F, Menzen M, Prohaska C, Madea B. Numerical
density of delta-opioid expressing neurons in the frontal cortex of drug related fatalities. Forensic Sci
Int. 113: 423-433. 2000.
Schmidt P, Schmolke C, Musshoff F, Menzen M, Prohaska C, Madea B. Numerical
density of mu-opioid expressing neurons in the frontal cortex of drug related fatalities. Forensic Sci
Int. 115: 219-229. 2001.
Schmitmeier S, Thole H, Bader A, Bauer K. Purification and characterization of the
tyrotropin-releasing hormone (TRH)-degrading serum enzyme and its identification as a product of
liver origin. Eur. J. Biochem. 269: 1278-1286. 2002.
Schneider JS, Giardiniere M, Morain P. Effects of the prolyl endopeptidase inhibitor S17092
on cognitive deficits in chronic low dose MPTP-treated monkeys. Neuropsychofarmacology. 26:
176-182. 2002.
Schomburg L, Turwitt S, Prescher G, Lohmann D, Horthemke B, Bauer K. Human
TRH-degrading ectoenzyme cDNA cloning, functional expression, genomic structure and chromosomal
assignment. Eur. J. biochem. 265: 415-422. 1999.
Schroeder JE, Fischbach PS, Zheng D, McCleskey EW. Activation of mu opioid receptors
inhibits trasient high and slow threshold C2+ currents, but spares a sustained current. Neuron 6: 13-
20. 1991.
Schujit MP, Danser AH. Cardiac angiotensin II: an intracrine hormone?. Am J Hypertens.
15: 1109-1116. 2002.
Schwartz JC,. Metabolism of enkephalin and the inactivating neuropeptide concept. Trends
Neurosci., 6: 45-48. 1983.
Schwartz JC, Malfroy B, De la Baume S. Biological inactivation of enkephalins and the role
of enkephalin dipeptdyl-carboxipeptidase as neuropeptidase. Life Sci. 29: 1715-1740. 1981.
Bibliografia
Doktore-tesia
267
Seward E, Hammond C, Henderson G. Mu-opioid receptor-mediated inhibition of the N-
type calcium chanel current. Proc. Roy. Soc. London B 244: 129-135. 1991.
Serizawa A, Dando PM, Barrett AJ. Characterization of a mitochondrial metallopeptidase
reveals neurolysin as a homologue of thimet oligopeptidase. J Biol Chem. 270: 2092-2098. 1995.
Shan L, Molberg O, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C.
Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science. 297: 2275-2279. 2002.
Shani J, Azov R, Weissman BA. Enkephalin levels in rat brain after various regimens of
morphine administration. Neurosci Lett. 12: 319-322. 1979.
Sharma SK, Nirenberg M, Klee WA. Morphine receptors as regulators of adenylate cyclase
activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 590-594. 1975.
Shimizu T, Tani K, Ogawa H, Huang L, Shinomiya F, Sone S. CD13 / aminopeptidase
N-induced lymphocyte involvement in inflamed joints of patients with rheumathoid arthritis. Arthritis
Reum. 46: 2330-2338. 2002.
Shippenberg TS, Herz A, Spanagel R, Bals-Kubik R, Stein C. Condioting of opioid
reinforcement: neuroanatomical neurochemical substrates. Ann. N. Y. Acad Sci. 654: 347-356.
1992.
Shippenberg TS, Rea W. Sensitization to the behavioral effects of cocaine: modulation by
dynorphin and kappa-opiod receptor agonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 57: 449-455. 1997.
Shishido Y, Furushiro M, Tanabe S, Taniguchi A, Hashimoto S, Yokokura T,
Shibata S, Yamamoto T, Watanabe S. Effect of ZTTZ, a prolyl endopeptidase inhibitor, on
memory impairment in a passive avoidance test of rats with basal forebrain lesions. Pharm Res. 15:
1907- 1910. 1998.
Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW, Molinoff PB. Basic neurochemestry. 331-368.
Raven press, New York. 1993.
Bibliografia
Doktore-tesia
268
Siems W, Maul B, Krause W, Gerard C, Hauser KF, Hersh LB, Fischer HS, Zerning
G, Saria A. Neutral endopeptidase and alcohol consumption, experiments in neutral endopeptidase-
deficien mice. Eur J Pharmacol. 397: 327-334. 2000.
Simantov R, Snyder SH. Elevated levels of enkephalin in morphine-dependent rats. Nature.
262: 505-507. 1976.
Simon E, Hiller J, Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic 3H-
etorphine to rat brain homogenate. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 70: 1947-1949. 1973.
Simonin F, Befort K, Gavériaux-Ruff C, Matthens H, Nappey V, Lannes B,
Micheletti G, Kieffer B. The human delta-opioid receptor: Genomic organization, cDNA cloning,
functional expression, and distribution in human brain. Mol. Pharmacol. 46(6): 1015-21. 1994.
Snyder SH. Drogas y cerebro. Biblioteca Scientific American.1993.
Solhonne B, Gros C, Pollard H, Schwartz JC. Major localization of aminopeptidase M in
rat brain microvessels. Neuroscience. 22: 225-232. 1987.
Stefano GB, Kushnerik V, Rodríguez M, Bilfinger TV. Inhibitory effect of morphine on
granulocyte stimulation by tumor necrosis factor and substance P. Int J Inmunopharmacol. 16:
329-334. 1994.
Stein C. Peripheral mechanisms of opioid analgesia. Anesth. Analg. 76:182-191. 1993.
Sternini C, Spann M, Anton B, Keith DEJ, Bunnett NW, Von Zastrow M, Evans C,
Brecha NC. Agonist-selective endocytosis of mu opioid receptor by neurons in vivo. Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 9241-9246. 1996.
Suprenant KM, Chien CC, Whalestedt C, Brown GP, Pasternak GW. Inhibition of
calcium currents by noradrenaline, somatostatin and opioids in guinea-pig submucosal neurons. J.
Physiol. 431:585-608. 1990.
Bibliografia
Doktore-tesia
269
Szczepanska R, Harding S, Grupp LA. Characterization of the decline in alcohol
consumption by aminopeptidase inhibition. Drug Alcohol Depend. 43: 133-141. 1996.
Taylor A. Aminopeptidases: towards a mechanism of action. Trends Bichem. Sci. 18: 167-
171. 1993.
Tempel A, Habas J, Paredes W, Barr GA. Morphine-induced downregulation of mu-opioid
receptors in neonatal rat brain. Brain Res. 469: 129-133. 1988.
Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a presynaptic plasma
membrane fraction of rat brain cortex. Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh.). 32:317-320.
1973.
Terenius L, Wahlström A. Inhibitors of narcotic receptor binding in brain extracts and
cerebrospinal fluid. Acta Pharmacol. 35 (suppl 1): 15. 1974.
Terwilliger RZ, Beitner-Johnson D, Sevarino KA, Crain SM, Nestler EJ. A general
role for adaptations in G-proteinsand the cyclic AMP system mediating the chronic actions of porphine
and cocaine on neuronal function. Brain Res. 548: 100-110. 1991.
Terwilliger RZ, Ortiz J, Guitart X, Nestler EJ. Chronic morphine administration increases
β-adrenergic receptor kinase (βARK) levels in the rat locus coeruleus. J. Neurochem. 63: 1983-
1986. 1994.
Thorn NA, Russell JT, Torp-Pedersen C, Treiman M. Calcium and neurosecretion. Ann.
N. Y. Acad. Sci. 307: 618-639. 1978.
Tobler AR, Constam DB, Schmitt-Gräff A, Malipiero U, Schlapbach R, Fontana A.
Cloning of the human puromycin-sensitive aminopeptidase and evidence for expression in neurons. J.
Neurochem. 68: 889-897. 1997.
Bibliografia
Doktore-tesia
270
Toide K, Iwamoto Y, Fujiwara T, Abe H. JTP-4819: a novel prolyl endopeptidase inhibitor
with potential as cognitive enhancer. J Pharmacol. Exp. Therapeutics. 274: 1370-1378. 1995.
Trujillo KA, Akil H. Pharmacological regulation of striatal prodynorphin peptides. Prog. Clin.
Biol. Res. 328: 223-226. 1990.
Trujillo KA, Akil H. Opiate tolerance and dependence: recent findings and synthesis. Th e New
Biologist. 10: 915-923. 1991.
Trujillo KA, Bronstein DM, Sánchez IO, Akil H. Effects of chronic opiate and opioid
antagonist treatment on striatal opioid peptides. Brain Res. 698: 69-78. 1995.
Tseng LF, Loh HH, Li CH. β-Endorphin: cross tolerance to and cross physical
dependence on morphine. Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 4187-4189. 1976.
Turner AJ, Matsas R, Kenny AJ. Are there neuropeptide specific peptidases? Biochem.
Pharmacol. 34: 1347-1356. 1985.
Turner AJ. Processing and metabolism of neuropeptides. Essays Biochem. 22: 69-119. 1986.
Turner AJ. Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. “Neuropeptides and their
peptidases”. Turner AJ, Ellis Horwood Ltd., Chichester, U.K. 1987.
Turzynski A, Mentlein R. Prolyil aminopeptidase from rat brain and kidney. Action on
peptides and identification as leucyl aminopeptidase. Eur. J. Biochem. 190: 509-515. 1990.
Uhl GR, Ryan JP, Schwartz JP. Morphine alters preproenkephalin gene expression. Brain
Res. 459: 391-397. 1988.
Ulibarri I, García-Sevilla JA, Ugedo L. Modulation of brain α2– adrenoceptor and µ– opioid
receptor densities during morphine dependence and spontaneus withdrawal in rats. Naunyn –
Schmied. Arch. Pharmacol. 336: 530-537. 1987.
Bibliografia
Doktore-tesia
271
Vallee BL, Galdes A. The metallobiochemestry of zinc enzymes. Adv. Enzimol. 56: 283-
430. 1984.
1Vaupel DB, Kimes AS, London ED. Comparison of 7-nitroindazole with other nitric oxide
synthase inhibitors as attenuators of opioid withdrawal. Psychopharmacology. 118: 361-368.
1995.
2Vaupel DB, Kimes AS, London ED. Nitric oxide synthase inhibitors. Preclinical studies of
potential use for treatment of opioid withdrawal. Neuropsychopharmacology. 13: 315-322.
1995.
Ventanyol P, Busquets X, García-Sevilla JA. Modulation of unmunoreactive protein kinase
C-alpha and beta isoforms and G proteins by acute and chronic treatments with morphine and other
opiate drugs in rat brain. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol. 355: 491-500. 1997.
Vincent B, Beaudet A, Dauch P, Vincent JP, Checler JF. Distinct properties of neuronal
and astrocytic endopeptidase 3.4.24.16: a study on differentiation, subcellular distribution, and
secretion processes. J. Neurosci. 16: 5049-5059. 1996.
Wagner GW, Tavianini MA, Herrmann Km, Dixon JE. Purification and characterization
of an ekephalin aminopeptidase from brain. Biochemestry, 20: 3884-3890. 1981.
Walter R, Shlank H, Glass JD, Schwartz YL, Kerenyi TD. Leucylglycinamide released
from oxytocin by human enzyme. Science. 173: 827-829. 1971.
Waksman G, Boboutou R, Devin J, Bourgoin S, Cesselin F, Hamon M, Fournié-
Zaluski MC, Roques BP. In vivo and in vitro effects of kelatorphan on enkephalin metabolism in
rodent bbrain. Eur. J. Pharmacol. 117: 233-243. 1985.
Waksman G, Hamel E, Fournié-Zaluski MC, Roques BP. Autoradiographic comparison
of the neutral endopeptidase “enkephalinase” and of mu and delta opioid receptors in rat brain. Proc.
Natl.Acad. Sci. U.S.A. 83: 1523-1527. 1986.
Bibliografia
Doktore-tesia
272
Waters SM, Konkoy CS, Davis TP. Haloperidol and apomorphine differentialy affect
neuropeptidase activity. J Pharmacol Exp Ther. 277: 113-120. 1996.
Weissman BA, Zamir N. Differential effects of heroin on opioid levels in the rat brain. Eur J
Pharmacol. 139: 121-123. 1987.
Welche WR, Brosniham KB, Ferrario CM,. A comparison of the properties and enzymatic
activities of three angiotensin processing enzymes: angiotensin converting enzyme, prolyl endopeptidase
and neutral endopeptidase 24.11. Life Sci. 52: 1461-1480. 1993.
Wen HL, Ho WK, Wen PY. Comparison of the effectiveness of diferent opioid peptides in
supressing heroin withdrawal. Eur J Pharmacol. 100: 155-162. 1984.
Whittaker VP. Structure and function of neurones tissue. B.H. Bourne ed. 3: 1-24. 1969.
Wickelgren I. Teaching the brain to take drugs. Science. 280: 2045-2046. 1997.
Wilk S. Prolyl endopeptidase. Life Sci. 33: 2149-2157. 1983.
Wilk S, Wilk E, Magnusson RP. Purification, characterization and cloning of a cytosolic
aspartyl aminopeptidase. J. Biol. Chem. 273: 15961-15970. 1998.
Wilk S, Wilk E, Magnusson RP. Identification of histidine residues important in the catalysis
and structure of aspartyl aminopeptidase. Arch. Biochem. Biophys. 407: 176-183. 2002.
Wise RA. Addictive drugs and brain stimulation reward. Annu. Rev. Neurosci. 19: 319-
340. 1990.
Wimpey TL, Chavkin C. Opioids activate both and inward rectifier a novel voltage-gated
potassium conductance in the hippocampal formation. Neuron. 6: 281-289.1991.
Wüster M, Schultz R, Herz A. Inquiry into endorphinergic feedback mechanism during the
development of opiate tolerance/dependence. Brain Res. 189: 403-11. 1980.
Bibliografia
Doktore-tesia
273
Xu Y, Wellner D, Scheinberg DA. Substance P and bradykinin are natural inhibitors of
CD13 / aminopeptidase N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 208: 664-674. 1995.
Yamamoto M, Chikuma T, Yajima R, Hirano H, Yamamoto Y, Nishi K, Ohkubo I,
Kato T. Axonal transport of puromycin-sensitive aminopeptidase in rat sciatic nerves. Neurosci.
Res. 42: 133-140. 2002.
Yasothornsrikul S, Toneff T, Hwang SR, Hook VY. Arginine and lysine aminopeptidase
activities in chromaffin granules of bovine adrenal medulla: relevance to prohormone processing. J.
Neurochem. 70: 153-163. 1998.
Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ. A potent and selective endogenous agonist for the
µ-opiate receptor. Nature. 386: 499-502. 1997.
Zadina JE, Martin-Schild S, Gerall AA, Kastin AJ, Hackler L, Ge LJ, Zhang X.
Endomorphins: novel endogenous mu-opiate receptor agonists in regions of high mu-opiate receptor
density. Ann. Y. Acad. Sci. 897: 136-144. 1999.
Zagon IS, McLaughlin PJ. Endogenous opioid systemsregulate cell proliferation in the
developing rat brain. Brain Res. 412: 68-72. 1987.
Zagon IS, Verderame MF, McLaughlin PJ. The biology of the opioid growth factor receptor
(OGFr). Brain Res Rev. 38: 351-376. 2002.
Zhou Q, Karlsson K, Liu Z, Johansson P, Le Greves M, Kiuru A, Nyberg F.
Substance P endopeptidase-like activity is altered in various regions of the rat central nervous system
during morphine tolerance and withdrawal. Neuropharmacology. 41: 246-253. 2001.